CN112979840B - 一种分离纯化灵芝β-葡寡糖的方法 - Google Patents

一种分离纯化灵芝β-葡寡糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分离纯化灵芝β‑葡寡糖的方法，该方法是通过逐级醇沉法将灵芝β‑葡寡糖溶液分离为不同聚合度的寡糖片段；利用高效凝胶排阻色谱、高效阴离子色谱及质谱法对分离所得片段进行分析，确定各产物的聚合度信息。本发明提供的分离纯化灵芝β‑葡寡糖的方法可以有效提高灵芝β‑葡寡糖分离纯化的效果，得到聚合度分布较窄的寡糖片段，并在体外免疫实验中确定了灵芝β‑葡寡糖的活性片段。

Description

一种分离纯化灵芝β-葡寡糖的方法
技术领域
本申请属于天然药物化学技术领域，具体的说涉及一种分离纯化灵芝β-葡寡糖的方法。
背景技术
灵芝自古就有“仙草”、“瑞草”之称，在古代灵芝常被人们认为可以延年益寿，灵芝营养丰富，药用价值很高，在我国已经有了超过4000年的中医药应用历史。灵芝β-葡聚糖作为灵芝中最丰富的成分之一，具有广泛的药理作用，如免疫调节、抗癌及抗炎等。灵芝β-葡寡糖是由灵芝β-葡聚糖降解得到的一系列分子量较低、水溶性较好的片段。β-葡寡糖的生物活性通常与其分子量、连接方式及聚合度等结构特征存在着较大的相关性，因此研究降解后的灵芝β-葡寡糖的活性尤为重要。由于所得灵芝β-葡寡糖的聚合度分布较广，且不同聚合度寡糖结构差异较小，导致其分离纯化较困难。
因此，需要研究开发一种高效的分离纯化灵芝β-葡寡糖的方法。
发明内容
本发明目的在于提供一种分离纯化灵芝β-葡寡糖的方法，包括如下步骤：
(1)先向灵芝β-葡寡糖溶液中加入无水乙醇至乙醇终浓度为90％，搅拌均匀后于4℃下静置4h，离心收集上清；减压浓缩除去乙醇得到GLPW-A组分
(2)步骤(1)中的沉淀中加入去离子水，搅拌至完全溶解，向溶液中加入无水乙醇至乙醇终浓度为85％，搅拌均匀后于4℃下静置4h，离心收集上清；减压浓缩除去乙醇得到GLPW-B组分；
(3)步骤(2)中的沉淀中加入去离子水，搅拌至完全溶解，向溶液中加入无水乙醇至乙醇终浓度为80％，搅拌均匀后放置于4℃下4h，离心分离沉淀和上清，上清部分减压浓缩除去乙醇得到GLPW-C组分；
(4)步骤(3)中的沉淀部分以去离子水复溶，除去乙醇冷冻干燥得到GLPW-D组分；
其中，所述灵芝β-葡寡糖溶液的浓度为30-50mg/mL。
应用本发明提供的分离纯化灵芝β-葡寡糖的方法得到的四种灵芝β-葡寡糖组分，可以采用高效凝胶排阻色谱、高效阴离子色谱及质谱法对分离所得片段进行分析，确认得到特定聚合度的寡糖片段。
本发明通过采用逐级醇沉法对灵芝β-葡寡糖分离纯化，利用苯酚硫酸法测定产物纯度，高效凝胶排阻色谱法测定其分子量，高效阴离子色谱和质谱分析分离产物的聚合度分布，并提供了其在体外免疫方面的活性信息，体外药理实验表明，聚合度较高的片段与Dectin-1受体相结合激活细胞免疫功能的活性较强，聚合度较低的片段抗炎活性较佳，可以应用于药品或保健品中。
本发明所具有的有益效果如下：
1)通过上述逐级醇沉法分离得到的灵芝β-葡寡糖重现性好，产品质量稳定。
2)本发明得到的寡糖产物的纯度好，得率高。
3)与传统的寡糖分离纯化法相比，本发明中逐级醇沉分离法可以有效提高灵芝β-葡寡糖分离纯化的效果，得到聚合度分布较窄的寡糖片段。
4)本发明为不同聚合度寡糖片段的免疫活性评价奠定了基础。
附图说明
图1、实施例1中逐级醇沉分离灵芝β-葡寡糖产物的高效凝胶排阻色谱图。
图2、实施例2中逐级醇沉分离灵芝β-葡寡糖产物的高效阴离子色谱图。
图3、实施例3中逐级醇沉分离得到GLPW-A的质谱图
图4、实施例3中逐级醇沉分离得到GLPW-B的质谱图
图5、实施例3中逐级醇沉分离得到GLPW-C的质谱图。
图6、实施例5中逐级醇沉分离灵芝β-葡寡糖产物增强免疫活性的测试结果
图7、实施例6中逐级醇沉分离灵芝β-葡寡糖产物的抗炎活性测试结果
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本申请，但不以任何方式限制本申请。除非另有说明，本申请中使用的试剂均为常用的商购试剂。
下列实施例中所用的灵芝β-葡寡糖是通过如下方法制备得到的：
用专利文献(CN105175575B，一种灵芝β-葡聚糖及其制备方法和用途)说明书中实施例1的方法制备得到的灵芝β-葡聚糖，配制成5mg/mL的灵芝β-葡聚糖溶液。将灵芝β-葡聚糖溶液置于微波消解仪中，设置微波功率为1000w，在140℃下降解40min，降解产物用离心机以8000rpm转速离心20分钟，取出上清液，冷冻干燥得到所需的灵芝β-葡寡糖(GLPW)。
实施例1：灵芝β-葡寡糖的逐级醇沉分离纯化
称取灵芝β-葡寡糖GLPW 300mg加入10mL蒸馏水，配成30mg/mL的灵芝β-葡寡糖溶液，充分搅拌至溶解。
灵芝β-葡寡糖GLPW的逐级醇沉分离：向溶液中缓慢加入90mL无水乙醇至乙醇终浓度为90％(v/v)，充分搅拌均匀后于4℃下静置4h，离心收集上清，沉淀加50mL90％(v/v)乙醇洗涤，离心取上清，重复3遍之后合并上清，减压浓缩除去乙醇得到GLPW-A组分，冷冻干燥。上述沉淀加10mL去离子水，充分搅拌至完全溶解，向溶液中缓慢加入57mL无水乙醇至乙醇终浓度为85％(v/v)，充分搅拌均匀后于4℃下静置4h，以10000rpm离心20min，收集上清，沉淀以85％(v/v)乙醇洗涤三遍，离心合并上清，减压浓缩除去乙醇，冷冻干燥得到GLPW-B组分。上述沉淀中继续加10mL去离子水，充分搅拌至完全溶解，向溶液中缓慢加入40mL无水乙醇至乙醇终浓度为80％(v/v)，搅拌均匀后放置于4℃下4h，离心分离沉淀和上清，沉淀采用80％(v/v)乙醇继续洗涤3次，合并上清部分，减压浓缩除去乙醇得到GLPW-C组分，沉淀部分以去离子水复溶后除去乙醇冷冻干燥得到GLPW-D组分。
实施例2：灵芝β-葡寡糖的逐级醇沉分离纯化
称取灵芝β-葡寡糖GLPW 500mg加入10mL蒸馏水，配成50mg/mL的灵芝β-葡寡糖溶液，充分搅拌至溶解。
灵芝β-葡寡糖GLPW的逐级醇沉分离：向溶液中缓慢加入90mL无水乙醇至乙醇终浓度为90％(v/v)，充分搅拌均匀后于4℃下静置4h，离心收集上清，沉淀加50mL90％(v/v)乙醇洗涤，离心取上清重复3遍之后合并上清，减压浓缩除去乙醇得到GLPW-A组分，冷冻干燥。上述沉淀加10mL去离子水，充分搅拌至完全溶解，向溶液中缓慢加入57mL无水乙醇至乙醇终浓度为85％(v/v)，充分搅拌均匀后于4℃下静置4h，此时溶液中已有明显沉淀生成，以10000rpm离心20min，收集上清，沉淀以85％(v/v)乙醇洗涤三遍，离心合并上清，减压浓缩除去乙醇，冷冻干燥得到GLPW-B组分。上述沉淀中继续加10mL去离子水，充分搅拌至完全溶解，向溶液中缓慢加入40mL无水乙醇至乙醇终浓度为80％(v/v)，搅拌均匀后放置于4℃下4h，使沉淀充分析出，离心分离沉淀和上清，沉淀采用80％(v/v)乙醇继续洗涤3次，合并上清部分，减压浓缩除去乙醇得到GLPW-C组分，沉淀部分以去离子水复溶后除去乙醇冷冻干燥后得到GLPW-D组分。
实施例3：灵芝β-葡寡糖的逐级醇沉分离纯化
称取灵芝β-葡寡糖GLPW 400mg加入10mL蒸馏水，配成40mg/mL的灵芝β-葡寡糖溶液，充分搅拌至溶解。
灵芝β-葡寡糖GLPW的逐级醇沉分离：向β-葡寡糖溶液中缓慢加入90mL无水乙醇至乙醇终浓度为90％(v/v)，充分搅拌均匀后于4℃下静置4h，离心收集上清，沉淀加50mL90％(v/v)乙醇洗涤，离心取上清重复3遍之后合并上清，减压浓缩除去乙醇得到GLPW-A组分，冷冻干燥。上述沉淀加10mL去离子水，充分搅拌至完全溶解，向溶液中缓慢加入57mL无水乙醇至乙醇终浓度为85％(v/v)，充分搅拌均匀后于4℃下静置4h，此时溶液中已有明显沉淀生成，以10000rpm离心20min，收集上清，沉淀以85％(v/v)乙醇洗涤三遍，离心合并上清，减压浓缩除去乙醇，冷冻干燥得到GLPW-B组分。上述沉淀中继续加10mL去离子水，充分搅拌至完全溶解，向溶液中缓慢加入40mL无水乙醇至乙醇终浓度为80％(v/v)，搅拌均匀后放置于4℃下4h，使沉淀充分析出，离心分离沉淀和上清，沉淀采用80％(v/v)乙醇继续洗涤3次，合并上清部分，减压浓缩除去乙醇得到GLPW-C组分，沉淀部分以去离子水复溶后除去乙醇冷冻干燥后得到GLPW-D组分。
实验例4：灵芝β-葡寡糖的逐级醇沉分离纯化产物的分析
取实施例1中制备得到的GLPW-A、GLPW-B、GLPW-C、GLPW-D四种组分进行如下试验。
1.测定方法
1.1组分得率测定
各组分得率基于以下进行计算：Y＝A1/A2×100％，式中：A1为组分干燥后质量；A2为投入醇沉分离样品的总质量；Y为得率(％)
1.2苯酚硫酸法测定糖含量
标准曲线的测定：称取10mg葡萄糖加至100mL容量瓶中定容至刻度，配制成0.1mg/mL葡萄糖标准液，准确吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mL，加水补足至1mL，分别加0.5mL5％的苯酚、2.5mL浓硫酸，混合均匀后，100℃水浴加热15min，490nm处检测紫外-可见吸光度。以紫外吸光度对葡萄糖标准溶液浓度作图，得葡萄糖浓度标准曲线及回归方程。
样品糖含量测定：分别称取1.0mg样品加入10mL超纯水配制成0.1mg/mL样品溶液，准确吸取1mL加入5％苯酚0.5mL，浓硫酸2.5mL，混合均匀后，100℃水浴加热15min，冷却至室温，490nm处检测紫外-可见吸光度。根据葡萄糖标准曲线回归方程计算样品糖含量。
1.3高效凝胶排阻色谱法测定产物分子量
分别称取5mg获得的寡糖片段GLPW-A、GLPW-B、GLPW-C、GLPW-D，加入1mL超纯水，采用高效凝胶排阻色谱对分子量进行测定。
具体条件为：示差检测器，色谱柱：TSK-GEL系列G3000PWXL和G2500PWXL(7.8mm×300mm，日本TOSOH公司)串联，流动相：0.15mol/L硝酸钠，0.05mol/L磷酸二氢钠，0.02％叠氮钠；柱温：30℃；流速：0.5mL/min；上样量：100μL
1.4高效阴离子色谱法分析降解产物组成
取上述5mg/mL寡糖溶液分别用超纯水稀释10倍，取1mL以高效阴离子色谱分析产物组成。
具体条件为：色谱柱：CarbopacTM PA-100柱(4mm×250mm，美国Dionex公司)，洗脱液：流动相A：150mmol/L氢氧化钠；流动相B：150mmol/L NaOH和500mmol/L醋酸钠；柱温和脉冲安培检测器的温度维持在30℃；进样量：25μL。梯度洗脱程序如下：0-5min，A/B，90/10(v/v)；5-30min，A/B，80/20(v/v)；30-30.1min，A/B，30/70(v/v)；30.1-40min，A/B，0/100(v/v)；40-45min，A/B，90/10(v/v)。
1.5质谱法分析产物的聚合度分布
取1μL待测样品与1μL基质混合均匀，吸取1μL混合液置于干净的MALDI点样板上，室温条件下等待溶剂挥发后置于质谱系统中。
具体条件为：正离子模式；基质为：DHB基质(10mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸溶于0.1％的TFA中)；扫描分子量范围：200-4000g/mol。
2.分离后寡糖片段的测定结果
根据上述测定结果，对实施例1制备的各分子量段的灵芝β-葡寡糖分别进行测定，分离产物的得率及含量结果如表1所示，各组分的糖含量及得率均较高，其中GLPW-B、GLPW-C、GLPW-D组分的糖含量均高于90％以上，表明分离过程中无明显杂质引入，且过程中寡糖损失较少。
对各片段的分子量特征进行分析，结果如表2所示，分离产物的聚合度特征如图1-5所示，可知所得的灵芝β-葡寡糖片段GLPW-A、GLPW-B、GLPW-C、GLPW-D在高效凝胶排阻色谱及阴离子色谱中的出峰时间表现出明显的差异，尽管各组分之间聚合度分布仍有交叉，但总体达到了分离效果，对其聚合度进行分析，其中GLPW-A的平均分子量分别为1608.64g/mol，203.98g/mol，主要片段的聚合度为2-14；GLPW-B的平均分子量为2726.24g/mol，主要片段的聚合度为6-21；GLPW-C的平均分子量分别为1.19×104g/mol，4417.05g/mol，主要片段的聚合度为11-24；GLPW-D组分已经超过阴离子色谱柱的分离范围，表明组分的聚合度较高，高效凝胶排阻色谱法测得其平均分子量分别为1.34×104g/mol，6594.47g/mol。质谱结果与液相及阴离子色谱的结果相符，均表明醇沉分离达到了对灵芝β-葡寡糖GLPW粗分离为段的效果。
表1逐级醇沉产物的含量测定
Figure BDA0003038240540000061
表2醇沉分离产物的分子量特征
Figure BDA0003038240540000071
实验例5：寡糖片段体外激活免疫活性分析
1.样品的配制
精密称取样品约5mg，加入定量的无菌水溶液使其充分溶解后，以0.22μm的无菌水相滤膜除菌，稀释成一系列浓度备用。
2.细胞培养
HEK-Blue hDectin-1a细胞(购自InvivoGen公司)在含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、100μg/mL Normocin的DMEM完全培养基(美国Gibco公司)中，37℃、含5％CO2条件下培养两代转入选择培养基(50mL DMEM完全培养基中含200mL HEK-BlueCLR Selection(美国Invitrogen公司))，培养至对数生长期，计数并用检测培养基(HEK-Blue Detection溶于50mL无菌水中)稀释成3×105个/mL的细胞液，每孔加入180μL细胞悬液和20μL不同浓度的样品(10μg/mL、50μg/mL、200μg/mL)，以20μL无菌水为阴性对照，以20μL作用浓度为100μg/mL的硬葡聚糖(法国Elicityl-oligotech公司)为阳性对照，共同培养24h，在630nm处测定吸光度值。
3.实验结果
特定聚合度寡糖片段的体外刺激细胞增强免疫活性的测试结果如图6所示，较低聚合度的寡糖片段的免疫活性基本消失，而大分子量的寡糖片段表现出明显的活性，这表明样品与Dectin-1受体结合增强免疫的活性与其聚合度存在着较大的关系，总体来讲聚合度越大，免疫活性越好。
实验例6：寡糖片段体外抗炎活性分析
1.样品的配制
精密称取样品约5mg，加入定量的无菌水溶液使其充分溶解后，以0.22μm的无菌水相滤膜除菌，稀释成一系列浓度(10μg/mL、50μg/mL、200μg/mL)备用。
2.THP-1细胞培养及巨噬细胞的诱导
细胞株THP-1(购自中国科学院上海细胞库)在含10％胎牛血清，1％青霉素、链霉素和0.5％β-巯基乙醇的RPMI1640完全培养基(美国Gibco公司)中，37℃、含5％CO2条件下培养到对数期后，计数并用无色1640培养基(美国Gibco公司)稀释成5×105个/mL的细胞液。将细胞液按照每孔199μL的体积转入96孔板中，加入1μL 6μg/mL PMA(美国Sigma公司)处理40h诱导细胞成巨噬细胞。
3.THP-1细胞诱导的巨噬细胞上清液中TNF-α含量的测定及比较
将上述诱导成巨噬细胞的培养液上清弃去，每孔加入160μL的RPMI-1640培养基、20μL作用浓度为50ng/mL的LPS和20μL不同浓度的样品液，共同培养24h后取上清，利用北京四正柏公司的TNF-α测定用ELISA试剂盒测定上清液中TNF-α的含量。
4.实验结果
特定聚合度寡糖片段的体外抗炎活性测试结果如图7所示，较低聚合度的寡糖片段的抗炎能力明显高于较高聚合度的寡糖片段。此外除GLPW-B组分，其余片段随着样品作用浓度的增加，抗炎活性不断增强，呈现出剂量依赖。
在对寡糖片段的体外免疫活性研究中发现，分离后的片段中聚合度较高的GLPW-D片段刺激Dectin-1细胞的免疫活性最好，而较低聚合度的寡糖片段GLPW-A表现出较好的体外抗炎活性。
本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本申请的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。

Claims (1)

1.一种具有免疫活性的灵芝β-葡寡糖的分离纯化方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）先向灵芝β-葡寡糖原料溶液中加入无水乙醇至乙醇终浓度为90%，搅拌均匀后于4℃下静置4h，离心收集上清；减压浓缩除去乙醇得到GLPW-A组分；
其中灵芝β-葡寡糖原料是通过如下方法制备得到的：配制5mg/mL的灵芝β-葡聚糖溶液，将灵芝β-葡聚糖溶液置于微波消解仪中，设置微波功率为1000w，在140℃下降解40min，降解产物用离心机以8000rpm转速离心20分钟，取出上清液，冷冻干燥得到所需的灵芝β-葡寡糖GLPW；
其中灵芝β-葡寡糖原料溶液的浓度为30-50 mg/mL;
（2）步骤（1）中的沉淀中加入去离子水，搅拌至完全溶解，向溶液中加入无水乙醇至乙醇终浓度为85%，搅拌均匀后于4℃下静置4h，离心收集上清；减压浓缩除去乙醇得到GLPW-B组分；
（3）步骤（2）中的沉淀中加入去离子水，搅拌至完全溶解，向溶液中加入无水乙醇至乙醇终浓度为80%，搅拌均匀后放置于4℃下4h，离心分离沉淀和上清，上清部分减压浓缩除去乙醇得到GLPW-C组分；
（4）步骤（3）中的沉淀部分以去离子水复溶，除去乙醇冷冻干燥得到GLPW-D组分；
所述具有免疫活性的灵芝β-葡寡糖为GLPW-C组分和GLPW-D组分。
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Citations (5)

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