CN104673721B - 耐氧夏普氏菌及其在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用 - Google Patents

耐氧夏普氏菌及其在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种耐氧夏普氏菌Aeroto‑AUH‑JLD21，保藏号为CGMCC No.9976及其在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用。属于微生物技术领域。应用包括以下步骤：（1）耐氧夏普氏菌Aeroto‑AUH‑JLD21的培养；（2）底物甘草素与耐氧夏普氏菌Aeroto‑AUH‑JLD21共培养：将耐氧夏普氏菌Aeroto‑AUH‑JLD21的种子液转接到发酵培养基中，同时加入甘草素进行共培养；（3）代谢产物达维荚蒾苷元的分离纯化。本发明耐氧菌株Aeroto‑AUH‑JLD21能够在有空气氧条件下将甘草素高效转化为达维荚蒾苷元，转化性能稳定，且方法简单，生产成本低，解决了达维荚蒾苷元难于在有空气氧条件下规模化生产的难题。

Description

耐氧夏普氏菌及其在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域。
背景技术
甘草（Licorice roots）是一味古老的中药材，具有保肝、祛痰止咳、清热解毒、补脾益气、抗菌消炎、抗癌、降糖、免疫调节、神经保护等多种功效，临床上主要用于治疗呼吸系统、消化系统和免疫系统等疾病。甘草中的黄酮和酚类是甘草中的标志性化合物，甘草苷（Liquiritin）是甘草中含量较高的黄酮成分之一，有研究表明，甘草苷在酸性条件下或在人肠道微生物菌群产生的葡萄糖苷酶作用下，可被水解为甘草素（Liquiritigenin，简称LG）。LG是Akt蛋白激酶抑制剂，也是有较高选择性的雌激素受体激动剂，对肝细胞等具有保护作用。甘草不论是做成中成药还是作为汤药熬服，最终都要经口服进入体内，甘草中的众多药理活性成分具有被寄居在胃肠道的微生物菌群降解为不同代谢产物的可能性。
1998年，Li 等（Biol Pharm Bull, 1998, 12:1251-1257）在人尿液检测到了甘草代谢产物达维荚蒾苷元（Davidigenin，简称DG），而DG在天然甘草提取物中未能检测到，故推测人体肠道微生物菌群可将LG转化为DG。此后，Zuo等的研究结果进一步证实LG可被人肠道微生物菌群代谢为DG（Biol Pharm Bull, 2002, 25:558-563）。由于DG资源匮乏，有关其生理活性方面研究报道较少，但从目前已有研究结果看，DG除具有与LG相似的生理功能，如止咳、降糖等外，还表现出不同于LG的一些生理功能，如抑制人肺细胞纤维化，抗过敏和抗痉挛等。随着DG生理功能研究的不断深入，这意味着DG今后极有可能开发为不同于目前甘草药效的其他新药。此外，体外抗氧化试验结果表明，产物达维荚蒾苷元对二苯代苦味酰基自由基（DPPH）的体外清除率极显著高于相同浓度的底物甘草素（药学学报，2012，47(5):664-669）。
目前虽在某些植物中，如Viburnum davidii Franch，Caprifoliaceae等，有分离得到天然DG的报道，但天然DG在植物细胞中的含量极低，试图从天然植物中大规模化提取DG几乎是不可能的。有关DG的化学合成方法已有报道，但大多是通过在无氧条件下提供昂贵的化学催化剂钯经化学加氢来完成（Biomed Chromatogr, 1997, 11:125-231），所需成本高，且易造成环境污染。
专利文献CN102367424 B公开了一种红椿菌AUH-Julong21及其在达维荚蒾苷元生物合成中的应用，该红椿菌AUH-Julong21在厌氧条件下可将0.8毫摩尔/升的底物甘草素高效转化为产物达维荚蒾苷元，平均转化率91.3%。然而，细菌菌株AUH-Julong21为严格厌氧菌株，该菌株只能在严格厌氧条件下生长和完成转化过程，这增加了DG的生产成本，不利于DG的规模化生产。文献“牛瘤胃耐氧细菌菌株Aeroto-Niu-O16对中药甘草主要活性成分甘草素的开环转化”中，用耐氧突变株Aeroto-Niu-O16在有空气氧条件下转化底物甘草素为DG，但能高效转化底物甘草素的最大浓度为 0.8毫摩尔/升，且平均转化率仅为71%~78%；当底物甘草素浓度升至1.2毫摩尔/升时，平均转化率仅为53.6%（药学学报，2012，47(5):664-669）。由于耐氧突变株Aeroto-Niu-O16在有氧条件下生长时，会在其菌体外壁形成一层以多糖为主要成分的抗氧化“保护膜”结构（Appl Microbiol Biot, 2011，92(4), 803-813），该抗氧化“保护膜”会阻碍底物进入菌体内被转化，也会阻碍产物从菌体内运出。因而，耐氧菌株Aeroto-Niu-O16尽管在耐氧能力上明显增强，但在有空气氧条件下的转化效率仍较低，不利于产物DG的高效规模化生产。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21及其在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用。该菌株能够在自然条件下（即有空气氧条件下）将底物甘草素高效转化为达维荚蒾苷元，且转化性能稳定，解决了达维荚蒾苷元在有空气氧条件下难于规模化生产且成本过高的问题，对达维荚蒾苷元新药理活性研究及新药研发具有极大的推动作用。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种耐氧夏普氏菌（sharpea sp.）Aeroto-AUH-JLD21，保藏号为CGMCC No.9976。
耐氧夏普氏菌sharpea sp. Aeroto-AUH-JLD21是由保藏号为CGMCC No.5306的严格厌氧红椿菌Coriobacterium sp.AUH-Julong21（EU919864）经过长期耐氧驯化后得到的、既能在有空气氧条件下生长又能高效转化甘草素为达维荚蒾苷元的耐氧突变株。红椿菌Coriobacterium sp.AUH-Julong21是从人粪便中分离得到的一株革兰氏阳性严格厌氧细菌菌株，该菌株在厌氧工作站内能将甘草素高效转化为达维荚蒾苷元。
本发明中的耐氧夏普氏菌sharpea sp. Aeroto-AUH-JLD21菌株（简称耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21）已于2014年11月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，保藏号为CGMCC No.9976。中国科学院微生物研究所菌种保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
耐氧夏普氏菌sharpea sp. Aeroto-AUH-JLD21的分类学特征为：
菌落发黄，菌落外围无透明圈；菌体在BHI液体培养基中呈长丝状，交织在一起，生长12小时后大部分菌体沉落在试管底部。
该菌株淀粉水解酶活性阳性，吲哚反应阴性，脲酶阴性，可发酵葡萄糖产酸产气，能利用乳糖、甘露糖、蔗糖、水杨苷、纤维二糖和棉籽糖等，不能利用鼠李糖、甘露醇、山梨醇、松叁糖等。
经刚果红染色及电镜观察，耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21菌体外壁几乎看不到抗氧化“保护膜”结构。
本发明还提供了耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用。
应用包括下述步骤：
（1）耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的培养
将低温冷冻保存的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21融化并按10～15%接种量接种到添加0.05%L-半胱氨酸的新鲜BHI液体培养基中，37℃活化培养24 小时；再以10%接种量将上述活化后的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21转接到新鲜的BHI液体培养基中，培养4～8小时作为种子液；
（2）底物甘草素与耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21共培养
将上述耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的种子液转接到发酵培养基中，同时加入甘草素进行共培养；
（3）代谢产物达维荚蒾苷元的分离纯化。
优选的，步骤（2）中将耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的种子液按10～15%接种量转接到发酵培养基中，同时加入母液浓度为40～60毫摩尔/升的底物甘草素，使甘草素在培养基中的终浓度为1.6～2.0毫摩尔/升，在37℃恒温培养箱内培养2～3天；发酵培养基为添加5.93克/升NaH2PO4和22.21克/升Na2HPO4的BHI液体培养基， pH值为7.0～7.3，为方便描述，将其记为发酵培养基A。
耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在发酵培养基A中对底物甘草素的最大转化浓度为2.0 毫摩尔/升，是原出发菌株红椿菌Coriobacterium sp.AUH-Julong21在厌氧工作站内最大转化浓度的2.5倍。
优选的，步骤（2）中将耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的种子液按15～20%接种量转接到发酵培养基中，同时加入母液浓度为40～60毫摩尔/升的底物甘草素，使甘草素在培养基中的终浓度为1.2～1.4毫摩尔/升，在37℃恒温培养箱内培养2～3天；发酵培养基的配方为7.5克/升葡萄糖、10克/升蛋白胨、1.2克/升L-半胱氨酸、10克/升氯化钠，调节pH值为7.0，再向其中加入3.59克/升NaH2PO4，27.58克/升Na2HPO4。为方便描述，将其记为发酵培养基B。发酵培养基B的成本比发酵培养基A降低大约13倍。
耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在发酵培养基B中对底物甘草素的最大转化浓度为1.4 毫摩尔/升，是原出发菌株红椿菌Coriobacterium sp.AUH-Julong21在BHI培养基中最大转化浓度的1.75倍。
优选的，步骤（3）中分离纯化方法为：用等体积的乙酸乙酯萃取发酵液2次，将萃取液合并后过滤、蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离得到代谢产物达维荚蒾苷元。
其中，所述耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的获得包括下述步骤：
（1）严格厌氧红椿菌Coriobacterium sp. AUH-Julong21的活化培养
在厌氧工作站中，将低温冷冻保存的严格厌氧红椿菌Coriobacterium sp. AUH-Julong21（保藏号为CGMCC No.5306，以下简称红椿菌AUH-Julong21）融化并按10%～15% 接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，37℃下培养24小时；再以10% 接种量将试管中的严格厌氧红椿菌AUH-Julong21重新转接到新鲜BHI液体培养基中，培养24小时作为种子液。
（2）红椿菌AUH-Julong21的耐氧驯化
将在厌氧工作站内培养18～24小时生长至对数期的严格厌氧红椿菌AUH-Julong21以10% 接种量接种到事先准备好的驯化培养基中。初始的驯化培养基组成为：BHI培养基中添加0.15% L-半胱氨酸和0.15% 抗坏血酸（Vc）。菌株在初始驯化培养基中生长稳定后（转接5～10次），降低培养基中的L-半胱氨酸和Vc的添加量（每次均降低0.01～0.02%），待菌株生长稳定后（转接5～10次），再转接到下一个梯度继续驯化，还原剂L-半胱氨酸和Vc的降低幅度仍为每次0.01～0.02%，依次类推，最终将培养基中L-半胱氨酸和Vc含量降低为零。在转接过程中，加入底物甘草素与驯化菌共培养，用高效液相（HPLC）跟踪测定，检测底物甘草素被转化情况。最终获得在有空气氧条件下既能生长又能将甘草素高效转化为达维荚蒾苷元的耐氧突变株，将其命名为耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21，以下简称菌株Aeroto-AUH-JLD21，菌株Aeroto-AUH-JLD21与耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21或耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21为同一菌株。
（3）耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21的纯化培养与菌种保藏
将耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21在BHI琼脂培养基上划线培养，长出单菌落后，再对长出的单菌落进行划线，至少重复两次。对划出的形态一致的单菌落进行转化活性测定，将有转化活性的单一菌落进行液体培养并保藏。具体方法为：将在液体培养基中生长至对数期的耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21取400微升，加入到盛有400微升事先已灭菌的10% 脱脂奶粉的冻存管中，混匀后在其表面加2毫米厚事先已灭菌的液体石蜡，再将其保藏在−80ºC的超低温冰箱中，对低温保藏的功能微生物菌株定期进行复壮培养和转化活性测定。
（4）对分离出的特定功能微生物菌株进行菌种鉴定
以单一功能微生物菌株菌体总DNA为模板，以通用引物27F/1492R
（27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；
1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）为引物，对16S rDNA序列进行PCR扩增，PCR扩增产物送交上海生物工程有限公司进行DNA测序，测序结果经BLAST比对与GenBank数据库其他菌株进行相似性分析。通过BLAST比对，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21与菌株Sharpea azabuensis strain HM250, Sharpea azabuensis strain ST18和Sharpea azabuensis strain HM244的16S rDNA序列相似性均高达99%。
在进行耐氧驯化时使用的原出发菌株为严格厌氧红椿菌Coriobacteriumsp.AUH-Julong21，该菌株的16S rDNA序列与红椿菌Coriobacteriumsp. strain CCUG33918相似性高达99%。然而，原出发菌株严格厌氧红椿菌AUH-Julong21经长期的耐氧驯化后得到的耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21发生了跨属突变。耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21的16S rDNA序列变得与红椿菌属菌株相似性低于90%，而与夏普氏菌属菌株的相似性高达99%。因而，将该耐氧突变株初步鉴定为夏普氏菌属菌株。
夏普氏菌属（Sharpea）是日本学者Morita等于2008年在国际系统进化微生物杂志上命名的一个新细菌属（Morita et al 2008，Int J Syst Microbiol, 58:2682-2686）。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21能够在有空气氧条件下将甘草素高效转化为达维荚蒾苷元，转化性能稳定，且方法简单，生产成本低，解决了达维荚蒾苷元难于在有空气氧条件下规模化生产的难题。
附图说明
图1为本发明实施例1中耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21转化底物甘草素的高效液相色谱图；
图2为耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21转化底物甘草素生成产物的紫外吸收图谱；
图3为应用发酵培养基A，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21对底物甘草素的转化动态曲线；
图4为应用发酵培养基A，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21对不同浓度底物甘草素转化能力的比较；
图5为应用发酵培养基B，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21对底物甘草素的转化动态曲线；
图6为应用发酵培养基B，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21对不同浓度底物甘草素转化能力的比较。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
1、耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的获得
（1）严格厌氧红椿菌Coriobacterium sp. AUH-Julong21的活化培养
在厌氧工作站中，将低温冷冻保存的严格厌氧红椿菌Coriobacterium sp. AUH-Julong21（保藏号为CGMCC No.5306，以下简称红椿菌AUH-Julong21）融化并按10%～15% 接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，37℃下培养24小时；再以10% 接种量将试管中的红椿菌AUH-Julong21重新转接到新鲜BHI液体培养基中，培养24小时作为种子液。
（2）红椿菌AUH-Julong21的耐氧驯化
将在厌氧工作站内培养18～24 小时生长至对数期的严格厌氧红椿菌AUH-Julong21以10% 接种量接种到事先准备好的驯化培养基中。初始的驯化培养基组成为：BHI培养基中添加0.15% L-半胱氨酸和0.15% 抗坏血酸（Vc）。菌株在初始驯化培养基中生长稳定后（转接5～10次），降低培养基中的L-半胱氨酸和Vc的添加量（每次均降低0.01～0.02%），待菌株生长稳定后（转接5～10次），再转接到下一个梯度继续驯化，还原剂L-半胱氨酸和Vc的降低幅度仍为每次0.01～0.02%，依次类推，最终将培养基中L-半胱氨酸和Vc含量降低为零。在转接过程中，加入底物甘草素与驯化菌共培养，用高效液相（HPLC）跟踪测定，检测底物甘草素被转化情况。最终获得在有空气氧条件下既能生长又能将甘草素转化为达维荚蒾苷元的耐氧突变株，将其命名为耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21。
底物甘草素的制备同专利文献CN102367424 B。
（3）耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21的纯化培养与菌种保藏
将耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21在BHI琼脂培养基上划线培养，长出单菌落后，再对长出的单菌落进行划线，至少重复两次。对划出的形态一致的单菌落进行转化活性测定，将有转化活性的单一菌落进行液体培养并保藏。具体方法为：将在液体培养基中生长至对数期的耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21取400微升，加入到盛有400微升事先已灭菌的10% 脱脂奶粉的冻存管中，混匀后在其表面加2毫米厚事先已灭菌的液体石蜡，再将其保藏在−80ºC的超低温冰箱中，对低温保藏的功能微生物菌株定期进行复壮培养和转化活性测定。
（4）对分离出的特定功能微生物菌株进行菌种鉴定
以单一功能微生物菌株菌体总DNA为模板，以通用引物27F/1492R
（27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；
1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）为引物，对16S rDNA序列进行PCR扩增，PCR扩增产物送交上海生物工程有限公司进行DNA测序，测序结果经BLAST比对与GenBank数据库其他菌株进行相似性分析。通过BLAST比对，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21与菌株Sharpea azabuensis strain HM250, Sharpea azabuensis strain ST18和Sharpea azabuensis strain HM244的16S rDNA序列相似性均高达99%。
在进行耐氧驯化时使用的原出发菌株为严格厌氧红椿菌Coriobacteriumsp.AUH-Julong21，该菌株的16S rDNA序列与红椿菌Coriobacteriumsp. strain CCUG33918相似性高达99%。然而，原出发菌株严格厌氧红椿菌AUH-Julong21经长期的耐氧驯化后得到的耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21发生了跨属突变。耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21的16S rDNA序列变得与红椿菌属菌株相似性低于90%，而与夏普氏菌属菌株的相似性高达99%，因而，将该耐氧突变株初步鉴定为夏普氏菌属菌株。
2、耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用
（1）耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21的培养
将低温冷冻保存的耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21融化并按15%接种量接种到添加0.05%L-半胱氨酸的新鲜BHI液体培养基中，37℃活化培养24 小时；再以10%接种量将活化的耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21重新转接到新鲜的BHI液体培养基中，培养6小时作为种子液。
（2）底物甘草素与耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21共培养
将上述种子液按12%的接种量接种到发酵培养基A中，同时加入母液浓度为50毫摩尔/升的底物甘草素，使甘草素在培养基中的终浓度为1.6毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养2天，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21可将底物甘草素高效转化为达维荚蒾苷元。
其中发酵培养基A为添加5.93克/升NaH2PO4和22.21克/升Na2HPO4的BHI液体培养基，初始pH值为7.0。
（3）用HPLC检测底物甘草素被耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21转化情况
取上述发酵液100微升至1.5毫升的EP管中，加1000微升乙酸乙酯进行萃取，静置离心后取出上层乙酸乙酯800微升，在离心浓缩仪中蒸干后加入80微升100%甲醇溶液，经HPLC检测底物转化情况（见图1）。
（4）代谢产物的分离纯化和结构鉴定：经HPLC检测如果底物转化良好，用等体积的乙酸乙酯将发酵液萃取2次，将萃取液合并后过滤，并在旋转蒸发仪上蒸干，然后加入100%甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离制备，用干净三角瓶收集代谢产物峰。
将收集的代谢产物峰蒸干后，在分析型高效液相色谱仪上测定其纯度，再分别测定代谢产物的紫外吸收谱、质谱、核磁共振氢谱和碳谱。结果表明，该代谢产物分别在278纳米和317纳米处有最大紫外吸收（见图2），这与文献中报道的达维荚蒾苷元（DG）的紫外吸收图谱相吻合；质谱测定结果表明，该代谢产物分子量为258，这恰好与DG 分子式C15H14O4 相吻合。根据产物的紫外吸收图谱和分子量可将其初步鉴定为DG。为进一步准确解析该代谢产物的化学结构，对纯化后的代谢产物的核磁共振氢谱（1H-NMR）和碳谱（13C-NMR）分别进行了测定(Bruker AVANCE 400型超导核共振波谱仪)。通过谱图解析并与文献报道中的DG 的核磁共振谱进行对比分析，最终将该代谢产物准确鉴定为DG。代谢产物的1H-NMR 和13C-NMR结果如下：
1H NMR (MeOD, 400 MHz,): δ7.67 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-6′), 7.05 (2H,d, J = 8.0 Hz, H-2,6), 6.68 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3,5), 6.32 (1H, d, J = 8.8Hz, H-5′), 6.24 (1H, s, H-3′), 3.15 (2H, t, J = 7.6 Hz, H-β), 2.88 (2H, t, J= 7.6 Hz, H-α); 13C NMR(MeOD, 100MHz): δ 204.3 (C=O), 165.1 (C-2′), 165.1 (C-4′), 155.5 (C-4), 132.5 (C-6′), 131.9 (C-1), 129.2 (C-2, 6), 114.9 (C-3, 5),112.8 (C-1′), 107.9 (C-5′), 102.5 (C-3′), 39.7(C-β), 29.8 (C-α)。
（5）耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21对底物甘草素的转化动态
为了解耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21转化底物甘草素的速度，以便确定最佳转化时间，对耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21转化底物甘草素的转化动态进行了测定，具体方法如下：
将事先培养好的种子液（培养方法同上所述）按10%接种量接种到盛有100毫升发酵培养基A的250毫升输液瓶内培养，同时加入40 毫摩尔/升的甘草素1毫升，分别在普通生化培养箱内培养0小时、12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时后取培养物100微升，用1000微升的乙酸乙酯萃取，取萃取液800微升，萃取液蒸干后加入80微升100%甲醇溶液，并用HPLC检测底物被转化情况。根据不同培养时间底物和产物浓度绘制菌株转化动态（见图3），由图3可知：底物与菌株共培养开始后即开始有产物DG生成；底物加入12小时后有80%以上产物DG被生成；培养至36小时后，所加入的底物甘草素几乎全部被转化为DG，继续培养至48小时产物量基本不再上升。
（6）耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21对不同浓度底物甘草素转化能力测定
以10%接种量将事先准备好的耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21的种子液（培养方法同上所述）接种在发酵培养基A中培养6小时后，加入不同浓度的底物甘草素，并继续在普通生化培养箱内共同培养48小时，然后用等体积乙酸乙酯对培养物进行萃取，萃取液蒸干后加入100%甲醇溶液，用HPLC检测底物甘草素被转化情况，并根据标准曲线和出峰面积计算转化率（转化率=产物浓度/（剩余底物浓度+产物浓度）×100%）。
结果表明，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21对浓度为1.2毫摩尔/升和1.6毫摩尔/升的甘草素的平均转化率分别为99.43%和99.32%；当底物浓度增至2.0毫摩尔/升时，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21对底物甘草素的转化效率有所降低，平均转化率为81.92%；而当所加入的底物浓度为2.4毫摩尔/升时，耐氧突变株Aeroto-AUH-JD21对底物甘草素转化能力急剧下降，平均转化率仅为43.21%（见图4）。
实施例2
耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21的获得方法同实施例1。
耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用，包括下述步骤：
（1）耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21的培养
将低温冷冻保存的耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21融化并按12%接种量接种到添加0.05%L-半胱氨酸的新鲜BHI液体培养基中，37℃活化培养24 小时；再以10%接种量将活化的耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21重新转接到新鲜的BHI液体培养基中，培养8小时作为种子液。
（2）底物甘草素与耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21共培养
将上述种子液按17%的接种量接种到发酵培养基B中，同时加入母液浓度为60毫摩尔/升的底物甘草素，使甘草素在培养基中的终浓度为1.2毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养3天，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21可将底物甘草素高效转化为产物达维荚蒾苷元。
其中发酵培养基B的配方为7.5克/升葡萄糖、10克/升蛋白胨、1.2克/升L-半胱氨酸、10克/升氯化钠，调节pH值为7.0，再向其中加入3.59克/升NaH2PO4，27.58克/升Na2HPO4。
（3）耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21对底物甘草素的转化动态的测定方法同实施例1，其中，将实施例1中的发酵培养基A替换为发酵培养基B，其他操作不变。根据不同培养时间底物和产物浓度绘制菌株转化动态（见图5），由图5可知：当菌种与底物共培养至48小时后，所加入的底物甘草素几乎全部被转化为DG，继续培养至72小时产物量基本不再上升。
（4）耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21对不同浓度底物甘草素转化能力的测定方法同实施例1，其中，将实施例1中的发酵培养基A替换为发酵培养基B，其他操作不变。结果表明，耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21对浓度为1.0毫摩尔/升和1.2毫摩尔/升的甘草素的平均转化率分别为99.64%和99.39%；当底物浓度增至1.4毫摩尔/升时，耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21对底物甘草素的转化效率有所降低，平均转化率为93.54%；而当所加入的底物浓度为1.6毫摩尔/升时，耐氧菌株Aeroto-AUH-JD21对底物甘草素转化能力急剧下降，平均转化率仅为37.53%（见图6）。
实施例3
耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21的获得方法同实施例1。
耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用，包括下述步骤：
（1）耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21的培养
将低温冷冻保存的耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21融化并按10%接种量接种到添加0.05%L-半胱氨酸的新鲜BHI液体培养基中，37℃活化培养24 小时；再以10%接种量将活化的耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21重新转接到新鲜的BHI液体培养基中，培养4小时作为种子液。
（2）底物甘草素与耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21共培养
将上述种子液按10%的接种量接种到发酵培养基A中，同时加入母液浓度为40毫摩尔/升的底物甘草素，使甘草素在培养基中的终浓度为1.8毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养3天，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21可将底物甘草素高效转化为达维荚蒾苷元。
其中发酵培养基A为添加5.93克/升NaH2PO4和22.21克/升Na2HPO4的BHI液体培养基，初始pH值为7.2。
（3）代谢产物达维荚蒾苷元的分离纯化
用等体积的乙酸乙酯萃取发酵液2次，将萃取液合并后过滤、蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离得到代谢产物达维荚蒾苷元。
实施例4
耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21的获得方法同实施例1。
耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用，包括下述步骤：
（1）耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21的培养
将低温冷冻保存的耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21融化并按13%接种量接种到添加0.05%L-半胱氨酸的新鲜BHI液体培养基中，37℃活化培养24 小时；再以10%接种量将活化的耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21重新转接到新鲜的BHI液体培养基中，培养8小时作为种子液。
（2）底物甘草素与耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21共培养
将上述种子液按15%的接种量接种到发酵培养基A中，同时加入母液浓度为60毫摩尔/升的底物甘草素，使甘草素在培养基中的终浓度为2.0毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养3天，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21可将底物甘草素高效转化为达维荚蒾苷元。
其中发酵培养基A为添加5.93克/升NaH2PO4和22.21克/升Na2HPO4的BHI液体培养基，初始pH值为7.3。
（3）代谢产物达维荚蒾苷元的分离纯化
用等体积的乙酸乙酯萃取发酵液2次，将萃取液合并后过滤、蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离得到代谢产物达维荚蒾苷元。
实施例5
耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21的获得方法同实施例1。
耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用，包括下述步骤：
（1）耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21的培养
将低温冷冻保存的耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21融化并按15%接种量接种到添加0.05%L-半胱氨酸的新鲜BHI液体培养基中，37℃活化培养24 小时；再以10%接种量将活化的耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21重新转接到新鲜的BHI液体培养基中，培养4小时作为种子液。
（2）底物甘草素与耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21共培养
将上述种子液按15%的接种量接种到发酵培养基B中，同时加入母液浓度为40毫摩尔/升的底物甘草素，使甘草素在培养基中的终浓度为1.4毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养2天，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21可将底物甘草素高效转化为达维荚蒾苷元。
其中发酵培养基B的配方为7.5克/升葡萄糖、10克/升蛋白胨、1.2克/升L-半胱氨酸、10克/升氯化钠，调节pH值为7.0，再向其中加入3.59克/升NaH2PO4，27.58克/升Na2HPO4。
（3）代谢产物达维荚蒾苷元的分离纯化
用等体积的乙酸乙酯萃取发酵液2次，将萃取液合并后过滤、蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离得到代谢产物达维荚蒾苷元。
实施例6
耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21的获得方法同实施例1。
耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用，包括下述步骤：
（1）耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21的培养
将低温冷冻保存的耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21融化并按10%接种量接种到添加0.05%L-半胱氨酸的新鲜BHI液体培养基中，37℃活化培养24 小时；再以10%接种量将活化的耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21重新转接到新鲜的BHI液体培养基中，培养7小时作为种子液。
（2）底物甘草素与耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21共培养
将上述种子液按20%的接种量接种到发酵培养基B中，同时加入母液浓度为50毫摩尔/升的底物甘草素，使甘草素在培养基中的终浓度为1.3毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养2天，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21可将底物甘草素高效转化为达维荚蒾苷元。
其中发酵培养基B的配方为7.5克/升葡萄糖、10克/升蛋白胨、1.2克/升L-半胱氨酸、10克/升氯化钠，调节pH值为7.0，再向其中加入3.59克/升NaH2PO4，27.58克/升Na2HPO4。
（3）代谢产物达维荚蒾苷元的分离纯化
用等体积的乙酸乙酯萃取发酵液2次，将萃取液合并后过滤、蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离得到代谢产物达维荚蒾苷元。

Claims (5)

1.一种耐氧夏普氏菌（sharpea sp.）Aeroto-AUH-JLD21在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用，所述的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21保藏号为CGMCC No.9976。
2.根据权利要求1所述的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用，其特征在于包括以下步骤：
（1）耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的培养
将低温冷冻保存的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21融化并按10～15%接种量接种到添加0.05%L-半胱氨酸的新鲜BHI液体培养基中，在37℃恒温培养箱内活化培养24 小时；再以10%接种量将上述活化后的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21转接到新鲜的BHI液体培养基中，培养4～8小时作为种子液；
（2）底物甘草素与耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21共培养
将上述耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的种子液转接到发酵培养基中，同时加入甘草素进行共培养；
（3）代谢产物达维荚蒾苷元的分离纯化。
3.根据权利要求2所述的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用，其特征在于所述步骤（2）中将耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的种子液按10～15%接种量转接到发酵培养基中，同时加入母液浓度为40～60毫摩尔/升的底物甘草素，使甘草素在培养基中的终浓度为1.6～2.0毫摩尔/升，在37℃恒温培养箱内培养2～3天；所述发酵培养基为添加5.93克/升NaH2PO4和22.21克/升Na2HPO4的BHI液体培养基，pH值为7.0～7.3。
4.根据权利要求2所述的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用，其特征在于所述步骤（2）中将耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的种子液按15～20%接种量转接到发酵培养基中，同时加入母液浓度为40～60毫摩尔/升的底物甘草素，使甘草素在培养基中的终浓度为1.2～1.4毫摩尔/升，在37℃恒温培养箱内培养2～3天；所述发酵培养基的配方为7.5克/升葡萄糖、10克/升蛋白胨、1.2克/升L-半胱氨酸、10克/升氯化钠，调节pH值为7.0，再向其中加入3.59克/升NaH2PO4，27.58克/升Na2HPO4。
5.根据权利要求2所述的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用，其特征在于所述步骤（3）中分离纯化方法为：用等体积的乙酸乙酯萃取发酵液2次，将萃取液合并后过滤、蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离得到代谢产物达维荚蒾苷元。
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