CN107502599A

CN107502599A - 一种酶法合成3‑o‑葡萄糖基甘草次酸的方法

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Publication number: CN107502599A
Application number: CN201710950480.1A
Authority: CN
Inventors: 李春; 刘啸尘; 张良; 倪江平; 刘护
Original assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Current assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Priority date: 2017-08-03
Filing date: 2017-10-13
Publication date: 2017-12-22
Anticipated expiration: 2037-10-13
Also published as: CN107502599B

Abstract

本发明公开了一种酶法合成3‑O‑葡萄糖基甘草次酸的方法，属于生物工程与技术领域。本发明通过克隆或化学合成来自植物甘草、欧洲山芥或拟南芥的糖基转移酶基因Unigene14953、Unigene20323UGT73C11、UGT73C5和UGT73C6，优选大肠杆菌为宿主菌，构建含有糖基转移酶的基因工程菌。以重组糖基转移酶作用于底物甘草次酸和尿苷二磷酸葡萄糖，在pH5.0～11.0、温度25～55℃条件下，可以高效合成3‑O‑葡糖基甘草次酸。

Description

一种酶法合成3-O-葡萄糖基甘草次酸的方法

技术领域：

本发明涉及一种合成3-O-葡萄糖基甘草次酸的方法，属于生物工程与技术领域。

背景技术：

甘草次酸属于五环三萜类齐墩果烷型天然产物，主要来源于植物甘草的根茎。甘草次酸具有多种药理和生物活性，所以被广泛应用于医药领域。在临床医药领域因其具有抗肿瘤、抗炎，抗病毒、抗溃疡、抗过敏、抗氧化和肾上腺皮质激素样等多种药理作用而被广泛应用。甘草次酸还能够与肝细胞结合抑制肝脏细胞凋亡和细胞坏死。但是，甘草次酸因其结构特点在临床应用时常会遇到类醛固酮增多症，水溶性差，生物利用度低等问题。因此，研究人员一直致力于以甘草次酸为前体物，对其进行一定的结构修饰来改善这些缺点，从而获得更加低毒、稳定、高效的新型药物目标分子或新功能新化合物。

目前，人们对甘草次酸的结构改造主要集中在甘草次酸的碳3位的羟基，碳11位的酮基和碳30位的羧基等位置。修饰的方式主要有改变甘草次酸的某些官能团，与金属化合物或小分子化合物作用，引入金属离子或小分子化合物修饰甘草次酸。甘草次酸衍生物主要包括甘草次酸盐类，甘草次酸酯类，甘草次酸酰胺类和甘草次酸其他类衍生物。

糖基化修饰作为一种重要的修饰反应不仅广泛存在天然产物合成的过程，而且在天然先导化合物改性方面也有着重要应用。亲水性的糖类结合到糖苷配基上可以提高与作用位点结合的特异性来改变母药物的药理活性。改善化合物的水溶性，稳定性、分泌性、减小糖苷配基毒副作用和调节血浆半衰期。在对甘草次酸的糖基化研究中，现有的方法是先对甘草次酸和糖基先进行基团保护修饰，再通过有机合成方法合成含有糖配基的甘草次酸糖基衍生物。在此过程中，反应步骤繁琐，反应条件苛刻，耗费时间长且降低产率，反应时常需要大量用有毒有害溶剂，造成环境污染。酶法合成甘草次酸糖基衍生物能有效避免传统有机合成方法的缺点，酶催化效率高，反应步骤少提高产率，且环境友好，在温和反应条件下，直接将糖基供体中的糖基转移连接到甘草次酸分子上，容易分离甘草次酸糖基化产物。

发明内容：

本发明的目的是提供一种催化甘草次酸进行糖基转移反应的糖基转移酶Unigene14953的基因。

本发明的第二个目的是提供一种催化甘草次酸进行糖基转移反应的糖基转移酶Unigene14953的基因编码的蛋白质。

本发明的第三个目的是提供一种催化甘草次酸进行糖基转移反应的糖基转移酶Unigene20323的基因。

本发明的第四个目的是提供一种催化甘草次酸进行糖基转移反应的糖基转移酶Unigene20323的基因编码的蛋白质。

本发明的第五个目的是提供一种合成3-O-葡萄糖基甘草次酸的方法，通过异源表达制备得到的糖基转移酶Unigene14953，和/或Unigene20323，和/或UGT73C11，和/或UGT73C5，和/或UGT73C6来催化合成3-O-葡萄糖基甘草次酸，开辟了一条以尿苷二磷酸葡萄糖为糖基供体合成3-O-葡萄糖基甘草次酸，为甘草次酸的修饰和3-O-葡萄糖基甘草次酸的合成提供途径和方法。

本发明的技术方案如下：

一种催化甘草次酸进行糖基转移反应的糖基转移酶Unigene14953的基因，它是序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。

一种催化甘草次酸进行糖基转移反应的糖基转移酶Unigene14953的基因编码的蛋白质，它是序列表中SEQ ID No.2所述的氨基酸序列。

一种催化甘草次酸进行糖基转移反应的糖基转移酶Unigene20323的基因，它是序列表中SEQ ID No.3所述的核苷酸序列。

一种催化甘草次酸进行糖基转移反应的糖基转移酶Unigene20323的基因编码的蛋白质，它是序列表中SEQ ID No.4所述的氨基酸序列。

一种合成3-O-葡萄糖基甘草次酸的方法，包括以下步骤：

1、构建糖基转移酶基因工程菌生产糖基转移酶Unigene14953，或Unigene20323，或UGT73C11，或UGT73C5，或UGT73C6；

2、以获得的糖基转移酶Unigene14953，或Unigene20323，或UGT73C11，或UGT73C5，或UGT73C6粗酶液或浓缩酶液为催化剂，以甘草次酸和尿苷二磷酸葡萄糖为底物合成3-O-葡萄糖基甘草次酸。

在实际实施过程中，上述1步骤包含如下具体工艺：A构建生产糖基转移酶Unigene14953，或Unigene20323，或UGT73C11，或UGT73C5，或UGT73C6的基因工程菌；B基因工程菌生产糖基转移酶Unigene14953，或Unigene20323，或UGT73C11，或UGT73C5，或UGT73C6。

所述A构建生产糖基转移酶基因工程菌,可采用任何现有已知的表达载体和其相应表达宿主菌，按照常规的转化步骤或商品宿主菌的使用说明进行操作，构建含有所述的糖基转移酶体基因工程菌。本发明的一些实施例优选采用大肠杆菌作为表达宿主。包括以下步骤：

(1)通过化学合成或从植物cDNA中克隆得到糖基转移酶基因Unigene14953、Unigene20323、UGT73C11、UGT73C5和UGT73C6；该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10；

(2)将(1)克隆得到的糖基转移酶基因分别大肠杆菌表达质粒pET28a相连接，获得重组质粒。

(3)用(2)重组质粒pET28a转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞。

(5)筛选得到大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-UGT73C11、E.coli BL21(DE3)/pET28a-UGT73C5、E.coli BL21(DE3)/pET28a-UGT73C6、E.coli BL21(DE3)/pET28a-Unigene14953和E.coli BL21(DE3)/pET28a-Unigene20323。

所述B发酵基因工程菌生产糖基转移酶Unigene14953、Unigene20323、UGT73C11、UGT73C5和UGT73C6，包括以下步骤：将大肠杆菌基因工程菌进行发酵，发酵结束后，将诱导的大肠杆菌基因工程菌破碎收集上清液，即为含有糖基转移酶的粗酶液。

在实际实施过程中，上述2步骤包含如下具体工艺：在反应容器中分别添加甘草次酸和尿苷二磷酸葡萄糖，加入发酵所得含有糖基转移酶的粗酶液进行反应。

所述反应在pH5.0～11.0、25～55℃下反应2h。

所述反应产物通过HPLC检测。

采用本发明具有催化效率高，反应条件温和，高效，绿色安全等优点。

附图说明:

图1本发明实施例4中糖基转移酶催化产生3-O-葡萄糖基甘草次酸高效液相色谱图

图2本发明实施例4中产物3-O-葡萄糖基甘草次酸分子式。

图3本发明实施例6中糖基转移酶催化产生3-O-葡萄糖基甘草次酸质谱图

图4本发明实施例6中甘草次酸与糖基转移酶催化产生3-O-葡萄糖基甘草次酸红外波谱图

图5本发明实施例7中糖基转移酶在pH5.0-11.0的相对活性。

图6本发明实施例8中糖基转移酶在25-55℃的相对活性。

具体实施方式：

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实验例1：合成3-O-葡萄糖基甘草次酸糖基转移酶基因的获得

A:糖基转移酶Unigene14953和Unigene20323基因的获得

根据甘草转录组数据库筛选，得到糖基转移酶基因Unigene14953和Unigene20323，设计引物：

53-F：5’>ATGGACGTTG CTGAAGAACA GCC<3’(如SEQ ID No.11所示)；

53-R：5’>TTAGTTAAGC TGCTTAGAGT CTCTC<3’(如SEQ ID No.12所示)；

23-F：5’>ATGGTTTTCCAAGCAAACCAACC<3’(如SEQ ID No.13所示)；

23-R：5’>AGTTTCAACT TTACTACTTG ATTGT<3’(如SEQ ID No.14所示)；

以乌拉尔甘草cDNA为模版，使用ExTaq酶进行PCR扩增，分别得到1434bp片段的Unigene14953基因和1470bp片段的Unigene20323基因，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示，克隆至pMD19-T载体，测序确定糖基转移酶基因Unigene14953和Unigene20323完整序列。SEQ ID No.1所示片段表达的氨基酸序列用SEQ ID No.2所示，SEQ ID No3所示片段表达的氨基酸序列用SEQ ID No.4所示。

B:糖基转移酶UGT73C11基因的获得

根据糖基转移酶UGT73C11基因(Genbank注册序列号为AFN26664.1)序列，通过密码子优化，化学合成后优化后的糖基转移酶UGT73C11基因片段，如SEQ ID No.8所示。SEQID No.8所示片段表达的氨基酸序列用SEQ ID No.5所示。

C:糖基转移酶UGT73C5和UGT73C6基因的获得

根据糖基转移酶UGT73C5基因(GenBank注册序列号为NP_181218.1)序列和糖基转移酶UGT73C6基因(GenBank注册序列号为OAP07438.1)序列，设计引物：

C5-F：5’>ATGGTTTCCGAAACAACCAAATCTTCTCCA<3’(如SEQ ID No.15所示)；

C5-R：5’>TCAATTATTG GGTTCTGCCA GTTCCATT<3’(如SEQ ID No.16所示)；

C6-F：5’>ATGGCTTTCGAAAAAAACAACGAACCTTTT<3’(如SEQ ID No.17所示)；

C6-R：5’>TCAATTATTGGACTGTGCTAGTTGCATTAT<3’(如SEQ ID No.18所示)；

以拟南芥cDNA为模版，使用ExTaq酶进行PCR扩增，分别得到1488bp片段的UGT73C5基因和1488bp片段的UGT73C6基因，以SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示，克隆至pMD19-T载体，测序确定糖基转移酶基因UGT73C5和UGT73C6完整序列。SEQ ID No.9所示片段表达的氨基酸序列用SEQ ID No.6所示，SEQ ID No10所示片段表达的氨基酸序列用SEQ ID No.7所示。

实施例2：构建含有糖基转移酶的大肠杆菌工程菌

构建含有糖基转移酶UGT73C11基因的大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-UGT73C11，化学合成糖基转移酶UGT73C11基因片段(SEQ ID No.8所示)为模板，设计上下游引物并加入酶切位点EcoRⅠ、SalⅠ和保护碱基：

E-C11-F：5’>CCGGAATTCATGGTTTCTGAAATCACCCACAAAT<3’(如SEQ ID No.19所示)；带有EcoRⅠ的酶切位点。

E-C11-R：5’>ACGCGTCGACGTTGTTAGACTGAGCCAGCTGCATGAT<3’(如SEQ ID No.20所示)；带有SalⅠ的酶切位点。

PCR反应体系为：模板1μL,上下游引物各2μL，Primer star mix(宝生物公司)25μL，用双蒸水不足50μL。PCR反应条件：预变性98℃1min，变性98℃10s、退火58℃5s、延伸72℃1min30s，循环30次，72℃10min，4℃保存。

将克隆得到的UGT73C11基因进行胶回收。回收后的UGT73C11基因和原核表达载体pET28a。分别用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切，酶切体系：EcoRⅠ2μL和SalⅠ2μL，10xdigest buffer 5μL，DNA片段30μL，用双蒸水补足50μL的酶切体系,酶切条件为37℃、2h。酶切后回收酶切产物。

将酶切回收后的UGT73C11片段和载体pET28a用T₄ DNA连接酶进行连接，连接体系UGT73C11 7μL，载体pET28a 1μL，10xligase buffer 1μL，T4 DNA ligase 1μL。反应条件为16℃过夜连接。将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有100mg/L卡那霉素的固体LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，20g/L琼脂糖)平板上，37℃培养。

采用菌落PCR和测序方法鉴定转化子。菌落PCR体系：模板LB平板单菌落，UGT73C11上下游引物各1μL，2xrTaq mix(宝生物公司)10μL，用双蒸水补足20μL.PCR条件：预变性94℃5min，变性94℃30s、退火58℃30s、延伸72℃1min30s，循环30次，72℃10min，4℃保存。经菌落PCR验证含有目标条带的转化子送DNA测序，确定大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-UGT73C11构建成功。

用同样的方法分别构建含有糖基转移酶基因Unigene14953、Unigene20323、UGT73C5和UGT73C6的大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Unigene14953、E.coliBL21(DE3)/pET28a-Unigene20323、E.coli BL21(DE3)/pET28a-UGT73C5和E.coli BL21(DE3)/pET28a-UGT73C6。

所用引物为：

E-C5-F：5’>CGCGGATCCATGGTTTCCGAAACAACCAAATCTTCTCCA<3’(如SEQ ID No.21所示)；带有BamHⅠ的酶切位点。

E-C5-R：上游引物:：5’>CGCGGATCCATTATTG GGTTCTGCCA GTTCCATT<3’(如SEQ IDNo.22所示)；带有BamHⅠ的酶切位点。

E-C6-F：5’>CGCGGATCCATGGCTTTCGAAAAAAACAACGAACCTTTT<3’(如SEQ ID No.23所示)；带有BamHⅠ的酶切位点。

E-C6-R：5’>ACGCGTCGACATTATTGGACTGTGCTAGTTGCATTAT<3’(如SEQ ID No.24所示)；带有SalⅠ的酶切位点。

E-53-F：5’>CGCGGATCCATGGACGTTGCTGAAGAACA GCC<3’(如SEQ ID No.25所示)；带有BamHⅠ的酶切位点。

E-53-R：5’>ACGCGTCGACGTTAAGCTGCTTAGAGT CTCTC<3’(如SEQ ID No.26所示)；带有SalⅠ的酶切位点。

E-23-F：5’>CGCGGATCCATGGTTTTCCAAGCAAACCAACC<3’(如SEQ ID No.27所示)；带有BamHⅠ的酶切位点。

E-23-R：5’>ACGCGTCGACAGTTTCAACTTTACTACTTGATTGT<3’(如SEQ ID No.28所示)；带有SalⅠ的酶切位点。

实施例3：大肠杆菌基因工程菌的发酵

(1)挑取鉴定正确的大肠杆菌工程菌接种于含有100mg/L卡那霉素的LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L)中过夜培养，培养条件37℃，170rpm。

(2)取过夜培养的菌液3ml接种于300ml含有100mg/L卡那霉素的LB液体培养基中培养3-5h至OD600＝0.6，培养条件37℃，170rpm。

(3)加入诱导剂IPTG，使其终浓度为0.5mM/L,继续培养，培养条件变为16℃，170rpm，8-10h。

(4)将获得的发酵液室温，8000g离心10min后，收集菌体。

(5)25ml的50mM的pH7.0的PBS缓冲液重悬菌体，低温高压破碎机用裂解菌体。

(6)将裂解的菌体在4℃，12000g离心10min，弃沉淀，收集上清，获得含有糖基转移酶的混合液。

实施例4：糖基转移酶催化合成3-O-葡萄糖基甘草次酸

将大肠杆菌工程菌获得的含有糖基转移酶Unigene14953、Unigene20323、UGT73C11、UGT73C5和UGT73C6粗酶液中分别加入0.1μM甘草次酸，0.1μM尿苷二磷酸葡萄糖进行反应，反应条件37℃，2h。

HPLC检测3-O-葡萄糖基甘草次酸产物。取反应物100μL加入900μL的甲醇12000rpm离心10min,取上清液适度稀释后用0.22μm超滤膜过滤，并进行HPLC分析。色谱条件如下：岛津HPLC色谱仪，岛津自动进样器，液相色谱柱为反向C18硅胶柱(4.6mm×250mm)，LC-10A紫外检测器，检测波长为254nm；流动相为冰醋酸水溶液和甲醇双相(V/V＝16:84)等梯度洗脱，流速1(mL min^-1)；柱温40℃。经过糖基转移酶UGT73C11、UGT73C5、UGT73C6、Unigene14953和Unigene20323催化后均能检测如图1所示色谱图，其中箭头所指峰为3-O-葡萄糖基甘草次酸分子式见图2。结果说明糖基转移酶UGT73C11、UGT73C5、UGT73C6、Unigene14953和Unigene20323催化合成3-O-葡萄糖基甘草次酸。

实施例5:3-O-葡萄糖基甘草次酸的分离纯化

1.将糖基转移酶催化反应混合液15000rpm离心10min，分离上清和沉淀，将沉淀用甲醇重悬涡旋振荡5min。

2.将1得到的混合液15000rpm离心10min，分离收集上清。

3.将2得到的上清旋转蒸发浓缩。

4.将3得到的浓缩液用半制备液相分离纯化产物。条件如下：

流动相A为甲醇，流动相B为0.6％冰醋酸水溶液，梯度洗脱。流动相A80％，流动相B20％，流速5mL/min。柱子，岛津C18反向色谱柱，10×25cm，60min。

5.将纯化出的产物，通过旋转蒸发仪和真空冷冻干燥仪进行浓缩干燥，得到白色粉末。

实施例6：3-O-葡萄糖基甘草次酸的鉴定

1.取1mg实施例5中纯化产物产物溶于200μL甲醇进行质谱分析。图3为3-O-葡萄糖基甘草次酸产物的质谱图。结果表明产物的分子量为632，说明产物为甘草次酸连接了一个葡萄糖分子。

2.取1mg实施例5中纯化产物和1mg底物甘草次酸分别与200mg纯KBr研细均匀，置于模具中，用(5-10)x10⁷Pa压力在油压机上压成透明薄片，进行红外光谱检测。图4为反应产物与甘草次酸的红外分析图。由图可知产物与甘草次酸的红外光谱相比，羧基(-COOH)还存在纯化的产物中，特征峰在2800-3100cm^-1之间。说明糖基没有连接到甘草次酸C30位的羧基上。但在1050-1150cm^-1有明显的新峰出现，应该是因为葡萄糖基连接到甘草次酸后，由葡糖糖上的羟基引起的。综上所述，甘草次酸的糖基化产物应该是3-O-葡萄糖基甘草次酸。

3.取5mg纯化产物与5mg甘草次酸，用氘代甲醇溶解，进行1H谱分析。表1为纯化产物与甘草次酸的H谱数据。H谱数据表明葡萄糖分子连接到甘草次酸分子上，并且葡萄糖分子与甘草次酸是通过β糖苷键的方式连接。

表1：甘草次酸和单葡萄糖甘草次酸1H NMR数据

实施例7：酶催化反应的最适pH

将适度稀释糖基转移酶UGT73C11、UGT73C5、UGT73C6、Unigene14953和Unigene20323的粗酶液置于不同pH缓冲液中：磷酸钾缓冲液，50mM、pH5.0-7.0；Tris-HCl缓冲液，50mM、pH8.0-8.9；NaHCO3-NaOH缓冲液，50mmM、pH10.0-11.0。各取100μL不同pH的粗酶液，加入0.1μM甘草次酸和0.1μM尿苷二磷酸葡萄糖，37℃，反应2h后进行酶活测定，研究糖基转移酶的最适pH。由图5可知，重组酶在pH为5.0-11.0之间均能合成3-O-葡萄糖基甘草次酸，且糖基转移酶UGT73C11和Unigene14953最适pH为7.0，糖基转移酶UGT73C5、UGT73C6、Unigene20323最适pH为8.0。

实施例8：酶催化反应最适温度

将适度稀释糖基转移酶UGT73C11、UGT73C5、UGT73C6、Unigene14953和Unigene20323的粗酶液置于pH7.0缓冲液中，每个反应体系取100μL粗酶液，加入0.1μM甘草次酸和0.1μM尿苷二磷酸葡萄糖。分别置于25℃、30℃、35℃、40℃45℃、50℃和55℃等温度下，反应2h后进行酶活测定，研究重组酶的最适温度。由图6可知，重组酶在25-55℃之间均能合成3-O-葡萄糖基甘草次酸，且糖基转移酶UGT73C11、UGT73C5、UGT73C6和Unigene14953最适温度为40℃，糖基转移酶Unigene20323最适温度为45℃。

实施例9：糖基转移酶关键催化氨基酸位点突变验证

通过与已解析晶体结构的糖基转移酶的氨基酸序列对比发现，糖基转移酶UGT73C11的关键催化位点可能为24位的组氨酸和129位的天冬氨酸。通过PCR的方法，以pET28a-UGT73C11重组质粒为模板，将糖基转移酶UGT73C11的24位组氨酸和129位天冬氨酸分别突变为丙氨酸。所用引物为：

11-24F:5’>GCTCAGGGTGCTATGATCCCGATGGTTGACATCGCTCGT<3’如SEQ ID No.29所示。

11-24R:5’>CGGGATCATAGCACCCTGAGCCATGAACGGGAACAGAAC<3’如SEQ ID No.30所示。

11-129F:5’>ATCATCTCTGCTTTCTGCCTGCCGTACACCTCTAAAATC<3’如SEQ ID No.31所示。

11-129R:5’>CAGGCAGAAAGCAGAGATGATGCAAGACGGCTGCGGAGA<3’如SEQ ID No.32所示。

PCR反应体系为：模板1μL,上下游引物各2μL，Fastpfu(全式金生物公司)1μL，buffer 10μL用双蒸水不足50μL。PCR反应条件：预变性95℃3min，变性95℃25s、退火58℃25s、延伸72℃3min30s，循环30次，72℃10min，4℃保存。

将PCR产物取8μL加入Dpn Ⅰ 1μL和酶切buffer 1μL进行酶切2小时后，回收酶切产物，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。涂布于含有100mg/L卡那霉素的固体LB培养基。筛选突变成功的阳性克隆进行诱导表达方法和酶活检测。结果表明将糖基转移酶UGT73C11的24位组氨酸和129位的天冬氨酸任何一个位点突变后，均丧失催化甘草次酸产生3-O-葡萄糖基甘草次酸的功能。由此可知糖基转移酶UGT73C11的24位组氨酸和129位天冬氨酸为关键催化氨基酸位点，对糖基转移酶UGT73C11催化生产3-O-葡萄糖基甘草次酸十分重要。

同样方法可测得糖基转移酶UGT73C5、UGT73C6、Unigene14953和Unigene20323的关键催化氨基酸位点为：

糖基转移酶UGT73C5的第23位的组氨酸(H)第128位的天冬氨酸(D)；

糖基转移酶UGT73C6的第24位的组氨酸(H)第129位的天冬氨酸(D)；

糖基转移酶Unigene14953的第21位的组氨酸(H)第116位的天冬氨酸(D)；

糖基转移酶Unigene20323的第20位的组氨酸(H)第125位的天冬氨酸(D)。

所用突变引物为：

5-23F:5’>GCTCAAGGCGCTATGATTCCCATGGTTGATATTG<3’如SEQ ID No.33所示。

5-23R:5’>GGGAATCATAGCGCCTTGAGCCATGAAAGGGAAGAGAAC<3’如SEQ ID No.34所示。

5-128F:5’>CTAATTTCTGCTTTTTTGTTTGCCTTATACAAGC<3’如SEQ ID No.35所示。

5-128R:5’>CAAACAAAAAGCGAAATTAGACAGCTTGGTCG<3’如SEQ ID No.36所示。

6-24F:5’>GCTCAAGGCGCTATGATTCCCATGGTTGATATTGC<3’如SEQ ID No.37所示。

6-24R:5’>GGGAATCATAGCGCCTTGAG CCATGAAAGG GAAGAG<3’如SEQ ID No.38所示。

6-129F:5’>CTAATCTCTGCTATGTGTTTGTCGTATACAAGC<3’如SEQ ID No.39所示。

6-129R:5’>CAAACACATAGCAGAGATTA GACAGCTTGG TCGCGG<3’如SEQ ID No.40所示。

53-21F:5’>TAGCAGCTGGTGCGATGATCCCTCTATGCGAC<3’如SEQ ID No.41所示。

53-21R:5’>ACCAGCTGCTAAGTATGGAATGAAG<3’如SEQ ID No.42所示。

53-116F:5’>GACTGCATCGTCGCCGCGTTCCTATTCCCC<3’如SEQ ID No.43所示。

53-116R:5’>GGCGACGATGCAGTCTGGTGGGTCC<3’如SEQ ID No.44所示。

23-20F:5’>ATGGCTCAAGGAGCCATCATCCCCATG<3’如SEQ ID No.45所示。

23-20R:5’>TCCTTGAGCCATTAGTGGAAACAAG<3’如SEQ ID No.46所示。

23-125F:5’>TGCATAATCTCTGCCTTTTGCATTCCT<3’如SEQ ID No.47所示。

23-125R:5’>AGAGATTATGCAACTTGGTTTTGG<3’如SEQ ID No.48所示。

序列表

<110> 北京理工大学

<120> 一种酶法合成3-O-葡萄糖基甘草次酸的方法

<130> 1

<150> 2017106542619

<151> 2017-08-03

<160> 48

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1434

<212> DNA

<213> 甘草(Glycyrrhiza uralensis)

<400> 1

atggacgttg ctgaagaaca gccactcaaa atttacttca ttccatactt agcagctggt 60

cacatgatcc ctctatgcga catagccaca ctcttcgcct cacgtggcca ccacgtgacc 120

atcatcacca ctccctccaa cgcccaaacc ctccgcgaat cccaccactt ccgcgtccaa 180

accatccaat tcccctccca agaagtgggc ctccccgccg gcgtccaaaa cctcaccgcc 240

gtcacgaacc tcgacgactc ctataagatc taccacgcca ccatgcttct ccgcaaacac 300

atcgaggact tcgtggagcg ggacccacca gactgcatcg tcgccgactt cctattcccc 360

tgggtggatg acgtggcaac caagcttcac atcccaagac tcgtcttcaa cggcttcacc 420

ttatttacca tctgtgccat ggaatcccac aaggcacacc ctctcccagt tgatgccgcc 480

tcgggttctt ttgtgattcc cgatttccct caccatgtca ctatcaattc aacaccccca 540

aagcgcacca aggaattcgt agaccctctg ctcacggaag cgttcaagag ccacggcttc 600

ctcatcaaca gcttcgtgga gctcgacgga gaagagtgcg tcgagcacta cgagagaatc 660

accggtggtc acaaggcttg gcatcttggc cctgcctttc tcgttcacag gaccgctcaa 720

gataggggag agaagagcgt ggtgagcgcg caggagtgcc tgagttggct cgactcgaag 780

cgagacaact cagtgctcta catatgcttt ggaaccattt gctatttccc agacaagcag 840

ctttacgaga tcgcaagcgc gattgaagcg tcgggtcacg aattcatatg ggttgttccc 900

gagaagagag ggaatgatga tgagagcgag gaggagaaag aaaagtggct gccaaaggga 960

tttgaagaga ggaataatgg aaagaagggg atgattataa gggggtgggc cccgcaggtg 1020

gcgatcctgg gccaccctgc tgtgggcggg tttctaacgc attgcgggtg gaactccacc 1080

gtggaggccg ttagcgcggg ggttccgatg ataacgtggc cggtacatag cgatcaatac 1140

ttcaacgaga agctgataac tcaggtgagg gggattgggg tggaggtggg tgcggaggag 1200

tggatcgtca ctgcatttcg ggagacggag aagctggtgg gaagggatcg catagagagg 1260

gctgtaagga gggtgatgga cggtggtgat gaggcggtac agatcagacg gcgcgctcga 1320

gagcttgggg aaatggctag acaagctgtt caggaagggg gctcgtctca cagtaatttg 1380

acggccttga ttaatgatct taagcgatgg agagactcta agcagcttaa ctaa 1434

<210> 2

<211> 477

<212> PRT

<213> 甘草(Glycyrrhiza uralensis)

<400> 2

Met Asp Val Ala Glu Glu Gln Pro Leu Lys Ile Tyr Phe Ile Pro Tyr

1 5 10 15

Leu Ala Ala Gly His Met Ile Pro Leu Cys Asp Ile Ala Thr Leu Phe

20 25 30

Ala Ser Arg Gly His His Val Thr Ile Ile Thr Thr Pro Ser Asn Ala

35 40 45

Gln Thr Leu Arg Glu Ser His His Phe Arg Val Gln Thr Ile Gln Phe

50 55 60

Pro Ser Gln Glu Val Gly Leu Pro Ala Gly Val Gln Asn Leu Thr Ala

65 70 75 80

Val Thr Asn Leu Asp Asp Ser Tyr Lys Ile Tyr His Ala Thr Met Leu

85 90 95

Leu Arg Lys His Ile Glu Asp Phe Val Glu Arg Asp Pro Pro Asp Cys

100 105 110

Ile Val Ala Asp Phe Leu Phe Pro Trp Val Asp Asp Val Ala Thr Lys

115 120 125

Leu His Ile Pro Arg Leu Val Phe Asn Gly Phe Thr Leu Phe Thr Ile

130 135 140

Cys Ala Met Glu Ser His Lys Ala His Pro Leu Pro Val Asp Ala Ala

145 150 155 160

Ser Gly Ser Phe Val Ile Pro Asp Phe Pro His His Val Thr Ile Asn

165 170 175

Ser Thr Pro Pro Lys Arg Thr Lys Glu Phe Val Asp Pro Leu Leu Thr

180 185 190

Glu Ala Phe Lys Ser His Gly Phe Leu Ile Asn Ser Phe Val Glu Leu

195 200 205

Asp Gly Glu Glu Cys Val Glu His Tyr Glu Arg Ile Thr Gly Gly His

210 215 220

Lys Ala Trp His Leu Gly Pro Ala Phe Leu Val His Arg Thr Ala Gln

225 230 235 240

Asp Arg Gly Glu Lys Ser Val Val Ser Ala Gln Glu Cys Leu Ser Trp

245 250 255

Leu Asp Ser Lys Arg Asp Asn Ser Val Leu Tyr Ile Cys Phe Gly Thr

260 265 270

Ile Cys Tyr Phe Pro Asp Lys Gln Leu Tyr Glu Ile Ala Ser Ala Ile

275 280 285

Glu Ala Ser Gly His Glu Phe Ile Trp Val Val Pro Glu Lys Arg Gly

290 295 300

Asn Asp Asp Glu Ser Glu Glu Glu Lys Glu Lys Trp Leu Pro Lys Gly

305 310 315 320

Phe Glu Glu Arg Asn Asn Gly Lys Lys Gly Met Ile Ile Arg Gly Trp

325 330 335

Ala Pro Gln Val Ala Ile Leu Gly His Pro Ala Val Gly Gly Phe Leu

340 345 350

Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Val Glu Ala Val Ser Ala Gly Val

355 360 365

Pro Met Ile Thr Trp Pro Val His Ser Asp Gln Tyr Phe Asn Glu Lys

370 375 380

Leu Ile Thr Gln Val Arg Gly Ile Gly Val Glu Val Gly Ala Glu Glu

385 390 395 400

Trp Ile Val Thr Ala Phe Arg Glu Thr Glu Lys Leu Val Gly Arg Asp

405 410 415

Arg Ile Glu Arg Ala Val Arg Arg Val Met Asp Gly Gly Asp Glu Ala

420 425 430

Val Gln Ile Arg Arg Arg Ala Arg Glu Leu Gly Glu Met Ala Arg Gln

435 440 445

Ala Val Gln Glu Gly Gly Ser Ser His Ser Asn Leu Thr Ala Leu Ile

450 455 460

Asn Asp Leu Lys Arg Trp Arg Asp Ser Lys Gln Leu Asn

465 470 475

<210> 3

<211> 1470

<212> DNA

<213> 甘草(Glycyrrhiza uralensis)

<400> 3

atggttttcc aagcaaacca acctcacttc gtcttgtttc cactaatggc tcaaggacac 60

atcatcccca tgatagacat tgcaaggctc ttagcacagc gtggtgctat tgttaccata 120

ttcactaccc caaaaaatgc atctcgtttc acctcagttc tttctcgtgc tgtttcctct 180

ggcctccaaa tccgactagt acatctccat ttcccatcaa aagaagcagg actacctgaa 240

gggtgtgaaa atcttgacat ggtagcatca catgacatga tatgcaatat cttccaagca 300

attaggatgc tccaaaagca agcagaagaa ttgtttgaga cactcacacc aaaaccaagt 360

tgcataatct ctgacttttg cattccttgg actattcaag tagctgaaaa gcaccacatt 420

ccaaggattt ctttccatgg attctcttgc ttctgcctcc actgcatgct caagatacac 480

acttcaaagg ttcttgaagg catcacttca gaatcagagt acttcactgt tcctggcata 540

cctgaccaaa ttcaggttac caaacagcag gtacctggac caatgataga tgaaatgaag 600

gaatttgggg agcagatgcg tgatgctgag ataaggtcat atggtgtaat tatcaacact 660

tttgaagagt tggagaaagc atatgttaat gattacaaga aggaaagaaa tggcaaggtt 720

tggtgcattg gccctgtttc actctgtaac aaagatgggt tggataaggc tcaaagaggc 780

aacaaggcct caattagtga acaccattgc ttggagtggc tggatttgca gcagcccaat 840

tctgtgatct atgtttgtct tggaagcttg tgcaatttaa ctcctccaca acttatggag 900

ttggctttgg gcttggaagc cacaaaaagg ccattcattt gggttattag ggaaggaaat 960

aagtttgagg agttggaaaa gtggattagt gaagaagggt ttgaggaaag gatcaagggg 1020

agaggcctta taattagggg ttgggctcca caggtgttaa tattatcaca cccttccatt 1080

gggggattct taacacattg tggttggaac tcaacacttg aaggggtaac cgctggggtc 1140

ccaatggtta cttggccact atttgctgat cagtttttga atgagaagct tgttactcaa 1200

gtgttgagga ttggagtgag ccttggggta gacgttccat tgaagtgggg agaagaagag 1260

aaggttggtg ttcaggtgaa gaaggaaggt attgagaagg caatatgcat ggtgatggat 1320

gagggagagg aaagtaaaga gagaagagaa agggccaagg aactcagtga gatggcaaag 1380

agagcagttg aaaaagatgg atcttctcat cttaatatga caatgcttat ccaagacatt 1440

atgcaacaat caagtagtaa agttgaaact 1470

<210> 4

<211> 490

<212> PRT

<213> 甘草(Glycyrrhiza uralensis)

<400> 4

Met Val Phe Gln Ala Asn Gln Pro His Phe Val Leu Phe Pro Leu Met

1 5 10 15

Ala Gln Gly His Ile Ile Pro Met Ile Asp Ile Ala Arg Leu Leu Ala

20 25 30

Gln Arg Gly Ala Ile Val Thr Ile Phe Thr Thr Pro Lys Asn Ala Ser

35 40 45

Arg Phe Thr Ser Val Leu Ser Arg Ala Val Ser Ser Gly Leu Gln Ile

50 55 60

Arg Leu Val His Leu His Phe Pro Ser Lys Glu Ala Gly Leu Pro Glu

65 70 75 80

Gly Cys Glu Asn Leu Asp Met Val Ala Ser His Asp Met Ile Cys Asn

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Glu Thr Leu Thr Pro Lys Pro Ser Cys Ile Ile Ser Asp Phe Cys Ile

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Pro Trp Thr Ile Gln Val Ala Glu Lys His His Ile Pro Arg Ile Ser

130 135 140

Phe His Gly Phe Ser Cys Phe Cys Leu His Cys Met Leu Lys Ile His

145 150 155 160

Thr Ser Lys Val Leu Glu Gly Ile Thr Ser Glu Ser Glu Tyr Phe Thr

165 170 175

Val Pro Gly Ile Pro Asp Gln Ile Gln Val Thr Lys Gln Gln Val Pro

180 185 190

Gly Pro Met Ile Asp Glu Met Lys Glu Phe Gly Glu Gln Met Arg Asp

195 200 205

Ala Glu Ile Arg Ser Tyr Gly Val Ile Ile Asn Thr Phe Glu Glu Leu

210 215 220

Glu Lys Ala Tyr Val Asn Asp Tyr Lys Lys Glu Arg Asn Gly Lys Val

225 230 235 240

Trp Cys Ile Gly Pro Val Ser Leu Cys Asn Lys Asp Gly Leu Asp Lys

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Lys Phe Glu Glu Leu Glu Lys Trp Ile Ser Glu Glu Gly Phe Glu Glu

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Arg Ile Lys Gly Arg Gly Leu Ile Ile Arg Gly Trp Ala Pro Gln Val

340 345 350

Leu Ile Leu Ser His Pro Ser Ile Gly Gly Phe Leu Thr His Cys Gly

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Trp Pro Leu Phe Ala Asp Gln Phe Leu Asn Glu Lys Leu Val Thr Gln

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Gly Glu Glu Glu Lys Val Gly Val Gln Val Lys Lys Glu Gly Ile Glu

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Lys Ala Ile Cys Met Val Met Asp Glu Gly Glu Glu Ser Lys Glu Arg

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<210> 5

<211> 495

<212> PRT

<213> 欧洲山芥(Barbarea vulgaris)

<400> 5

Met Val Ser Glu Ile Thr His Lys Ser Tyr Pro Leu His Phe Val Leu

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<211> 495

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

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Met Val Ser Glu Thr Thr Lys Ser Ser Pro Leu His Phe Val Leu Phe

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<211> 495

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 7

Met Ala Phe Glu Lys Asn Asn Glu Pro Phe Pro Leu His Phe Val Leu

1 5 10 15

Phe Pro Phe Met Ala Gln Gly His Met Ile Pro Met Val Asp Ile Ala

20 25 30

Arg Leu Leu Ala Gln Arg Gly Val Leu Ile Thr Ile Val Thr Thr Pro

35 40 45

His Asn Ala Ala Arg Phe Lys Asn Val Leu Asn Arg Ala Ile Glu Ser

50 55 60

Gly Leu Pro Ile Asn Leu Val Gln Val Lys Phe Pro Tyr Gln Glu Ala

65 70 75 80

Gly Leu Gln Glu Gly Gln Glu Asn Met Asp Leu Leu Thr Thr Met Glu

85 90 95

Gln Ile Thr Ser Phe Phe Lys Ala Val Asn Leu Leu Lys Glu Pro Val

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Gln Asn Leu Ile Glu Glu Met Ser Pro Arg Pro Ser Cys Leu Ile Ser

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Asp Met Cys Leu Ser Tyr Thr Ser Glu Ile Ala Lys Lys Phe Lys Ile

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Pro Lys Ile Leu Phe His Gly Met Gly Cys Phe Cys Leu Leu Cys Val

145 150 155 160

Asn Val Leu Arg Lys Asn Arg Glu Ile Leu Asp Asn Leu Lys Ser Asp

165 170 175

Lys Glu Tyr Phe Ile Val Pro Tyr Phe Pro Asp Arg Val Glu Phe Thr

180 185 190

Arg Pro Gln Val Pro Val Glu Thr Tyr Val Pro Ala Gly Trp Lys Glu

195 200 205

Ile Leu Glu Asp Met Val Glu Ala Asp Lys Thr Ser Tyr Gly Val Ile

210 215 220

Val Asn Ser Phe Gln Glu Leu Glu Pro Ala Tyr Ala Lys Asp Phe Lys

225 230 235 240

Glu Ala Arg Ser Gly Lys Ala Trp Thr Ile Gly Pro Val Ser Leu Cys

245 250 255

Asn Lys Val Gly Val Asp Lys Ala Glu Arg Gly Asn Lys Ser Asp Ile

260 265 270

Asp Gln Asp Glu Cys Leu Glu Trp Leu Asp Ser Lys Glu Pro Gly Ser

275 280 285

Val Leu Tyr Val Cys Leu Gly Ser Ile Cys Asn Leu Pro Leu Ser Gln

290 295 300

Leu Leu Glu Leu Gly Leu Gly Leu Glu Glu Ser Gln Arg Pro Phe Ile

305 310 315 320

Trp Val Ile Arg Gly Trp Glu Lys Tyr Lys Glu Leu Val Glu Trp Phe

325 330 335

Ser Glu Ser Gly Phe Glu Asp Arg Ile Gln Asp Arg Gly Leu Leu Ile

340 345 350

Lys Gly Trp Ser Pro Gln Met Leu Ile Leu Ser His Pro Ser Val Gly

355 360 365

Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Gly Ile Thr

370 375 380

Ala Gly Leu Pro Met Leu Thr Trp Pro Leu Phe Ala Asp Gln Phe Cys

385 390 395 400

Asn Glu Lys Leu Val Val Gln Ile Leu Lys Val Gly Val Ser Ala Glu

405 410 415

Val Lys Glu Val Met Lys Trp Gly Glu Glu Glu Lys Ile Gly Val Leu

420 425 430

Val Asp Lys Glu Gly Val Lys Lys Ala Val Glu Glu Leu Met Gly Glu

435 440 445

Ser Asp Asp Ala Lys Glu Arg Arg Arg Arg Ala Lys Glu Leu Gly Glu

450 455 460

Ser Ala His Lys Ala Val Glu Glu Gly Gly Ser Ser His Ser Asn Ile

465 470 475 480

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<210> 8

<211> 1488

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

atggtttctg aaatcaccca caaatcttac ccgctgcact tcgttctgtt cccgttcatg 60

gctcagggtc acatgatccc gatggttgac atcgctcgtc tgctggctca gcgtggtgtt 120

aaaatcacca tcgttaccac cccgcacaac gctgctcgtt tcgaaaacgt tctgtctcgt 180

gctatcgaat ctggtctgcc gatctctatc gttcaggtta aactgccgtc tcaggaagct 240

ggtctgccgg aaggtaacga aaccttcgac tctctggttt ctatggaact gctggttccg 300

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ccgcagccgt cttgcatcat ctctgacttc tgcctgccgt acacctctaa aatcgctaaa 420

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cacgttctgc gtaaaaaccg tgaaatcctg gaaaacctga aatctgacaa agaacacttc 540

gttgttccgt acttcccgga ccgtgttgaa tttacccgtc cgcaggttcc gatggctacc 600

tacgttccgg gtgaatggca cgaaatcaaa gaagacatcg ttgaagctga caaaacctct 660

tacggtgtta tcgttaacac ctaccaggaa ctggaaccgg cttacgctaa cgactacaaa 720

gaagctcgtt ctggtaaagc ttggactatc ggcccggtaa gcctgtgcaa caaagttggt 780

gctgacaaag ctgaacgtgg taacaaagct gacatcgacc aggacgaatg cctgaaatgg 840

ctggactcta aagaagaagg ttctgttctg tacgtttgcc tgggttctat ctgctctctg 900

ccgctgtctc agctgaaaga actgggtctg ggtctggaag aatctcagcg tccgttcatc 960

tgggttgttc gtggttggga aaaaaacaaa gaactgctgg aatggttctc tgagtctggt 1020

ttcgaagaac gtgttaaaga ccgtggtctg ctgatcaaag gttggtctcc gcagatgctg 1080

atcctggctc atcactctgt tggtggcttc ctgacccact gcggttggaa ctctaccctg 1140

gaaggtatca cctctggtat cccgctgctg acctggccgc tgttcggtga ccagttctgc 1200

aaccagaaac tggttgttca ggttctgaaa gttggtgttt ctgctggtgt tgaagaagtt 1260

accaactggg gtgaagaaga aaaaatcggt gttctggttg acaaagaagg tgttaaaaaa 1320

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gaactgggtc agctggctca gaaagctgtt gaagaaggtg gttcttctca ctctaacatc 1440

acctctctgc tggaagacat catgcagctg gctcagtcta acaactaa 1488

<210> 9

<211> 1488

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 9

atggtttccg aaacaaccaa atcttctcca cttcactttg ttctcttccc tttcatggct 60

caaggccaca tgattcccat ggttgatatt gcaaggctct tggctcagcg tggtgtgatc 120

ataacaattg tcacgacgcc tcacaatgca gcgaggttca agaatgtcct aaaccgtgcc 180

attgagtctg gcttgcccat caacttagtg caagtcaagt ttccatatct agaagctggt 240

ttgcaagaag gacaagagaa tatcgattct cttgacacaa tggagcggat gatacctttc 300

tttaaagcgg ttaactttct cgaagaacca gtccagaagc tcattgaaga gatgaaccct 360

cgaccaagct gtctaatttc tgatttttgt ttgccttata caagcaaaat cgccaagaag 420

ttcaatatcc caaagatcct cttccatggc atgggttgct tttgtcttct gtgtatgcat 480

gttttacgca agaaccgtga gatcttggac aatttaaagt cagataagga gcttttcact 540

gttcctgatt ttcctgatag agttgaattc acaagaacgc aagttccggt agaaacatat 600

gttccagctg gagactggaa agatatcttt gatggtatgg tagaagcgaa tgagacatct 660

tatggtgtga tcgtcaactc atttcaagag ctcgagcctg cttatgccaa agactacaag 720

gaggtaaggt ccggtaaagc atggaccatt ggacccgttt ccttgtgcaa caaggtagga 780

gccgacaaag cagagagggg aaacaaatca gacattgatc aagatgagtg ccttaaatgg 840

ctcgattcta agaaacatgg ctcggtgctt tacgtttgtc ttggaagtat ctgtaatctt 900

cctttgtctc aactcaagga gctgggacta ggcctagagg aatcccaaag acctttcatt 960

tgggtcataa gaggttggga gaagtacaaa gagttagttg agtggttctc ggaaagcggc 1020

tttgaagata gaatccaaga tagaggactt ctcatcaaag gatggtcccc tcaaatgctt 1080

atcctttcac atccatcagt tggagggttc ctaacacact gtggttggaa ctcgactctt 1140

gaggggataa ctgctggtct accgctactt acatggccgc tattcgcaga ccaattctgc 1200

aatgagaaat tggtcgttga ggtactaaaa gccggtgtaa gatccggggt tgaacagcct 1260

atgaaatggg gagaagagga gaaaatagga gtgttggtgg ataaagaagg agtgaagaag 1320

gcagtggaag aattaatggg tgagagtgat gatgcaaaag agagaagaag aagagccaaa 1380

gagcttggag attcagctca caaggctgtg gaagaaggag gctcttctca ttctaacatc 1440

tctttcttgc tacaagacat aatggaactg gcagaaccca ataattga 1488

<210> 10

<211> 1488

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 10

atggctttcg aaaaaaacaa cgaacctttt cctcttcact ttgttctctt ccctttcatg 60

gctcaaggcc acatgattcc catggttgat attgcaaggc tcttggctca gcgaggtgtg 120

cttataacaa ttgtcacgac gcctcacaat gcagcaaggt tcaagaatgt cctaaaccgt 180

gccattgagt ctggtttgcc catcaaccta gtgcaagtca agtttccata tcaagaagct 240

ggtctgcaag aaggacaaga aaatatggat ttgcttacca cgatggagca gataacatct 300

ttctttaaag cggttaactt actcaaagaa ccagtccaga accttattga agagatgagc 360

ccgcgaccaa gctgtctaat ctctgatatg tgtttgtcgt atacaagcga aatcgccaag 420

aagttcaaaa taccaaagat cctcttccat ggcatgggtt gcttttgtct tctgtgtgtt 480

aacgttctgc gcaagaaccg tgagatcttg gacaatttaa agtctgataa ggagtacttc 540

attgttcctt attttcctga tagagttgaa ttcacaagac ctcaagttcc ggtggaaaca 600

tatgttcctg caggctggaa agagatcttg gaggatatgg tagaagcgga taagacatct 660

tatggtgtta tagtcaactc atttcaagag ctcgaacctg cgtatgccaa agacttcaag 720

gaggcaaggt ctggtaaagc atggaccatt ggacctgttt ccttgtgcaa caaggtagga 780

gtagacaaag cagagagggg aaacaaatca gatattgatc aagatgagtg ccttgaatgg 840

ctcgattcta aggaaccggg atctgtgctc tacgtttgcc ttggaagtat ttgtaatctt 900

cctctgtctc agctccttga gctgggacta ggcctagagg aatcccaaag acctttcatc 960

tgggtcataa gaggttggga gaaatacaaa gagttagttg agtggttctc ggaaagcggc 1020

tttgaagata gaatccaaga tagaggactt ctcatcaaag gatggtcccc tcaaatgctt 1080

atcctttcac atccttctgt tggagggttc ttaacgcact gcggatggaa ctcgactctt 1140

gaggggataa ctgctggtct accaatgctt acatggccac tatttgcaga ccaattctgc 1200

aacgagaaac tggtcgtaca aatactaaaa gtcggtgtaa gtgccgaggt taaagaggtc 1260

atgaaatggg gagaagaaga gaagatagga gtgttggtgg ataaagaagg agtgaagaag 1320

gcagtggaag aactaatggg tgagagtgat gatgcaaaag agagaagaag aagagccaaa 1380

gagcttggag aatcagctca caaggctgtg gaagaaggag gctcctctca ttctaatatc 1440

actttcttgc tacaagacat aatgcaacta gcacagtcca ataattga 1488

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

atggacgttg ctgaagaaca gcc 23

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

ttagttaagc tgcttagagt ctctc 25

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

atggttttcc aagcaaacca acc 23

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

agtttcaact ttactacttg attgt 25

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

atggtttccg aaacaaccaa atcttctcca 30

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

tcaattattg ggttctgcca gttccatt 28

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

atggctttcg aaaaaaacaa cgaacctttt 30

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

tcaattattg gactgtgcta gttgcattat 30

<210> 19

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

ccggaattca tggtttctga aatcacccac aaat 34

<210> 20

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

acgcgtcgac gttgttagac tgagccagct gcatgat 37

<210> 21

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

cgcggatcca tggtttccga aacaaccaaa tcttctcca 39

<210> 22

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 22

cgcggatcca ttattgggtt ctgccagttc catt 34

<210> 23

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

cgcggatcca tggctttcga aaaaaacaac gaacctttt 39

<210> 24

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 24

acgcgtcgac attattggac tgtgctagtt gcattat 37

<210> 25

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 25

cgcggatcca tggacgttgc tgaagaacag cc 32

<210> 26

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 26

acgcgtcgac gttaagctgc ttagagtctc tc 32

<210> 27

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 27

cgcggatcca tggttttcca agcaaaccaa cc 32

<210> 28

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 28

acgcgtcgac agtttcaact ttactacttg attgt 35

<210> 29

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 29

gctcagggtg ctatgatccc gatggttgac atcgctcgt 39

<210> 30

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 30

cgggatcata gcaccctgag ccatgaacgg gaacagaac 39

<210> 31

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 31

atcatctctg ctttctgcct gccgtacacc tctaaaatc 39

<210> 32

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 32

caggcagaaa gcagagatga tgcaagacgg ctgcggaga 39

<210> 33

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 33

gctcaaggcg ctatgattcc catggttgat attg 34

<210> 34

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 34

gggaatcata gcgccttgag ccatgaaagg gaagagaac 39

<210> 35

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 35

ctaatttctg cttttttgtt tgccttatac aagc 34

<210> 36

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 36

caaacaaaaa gcgaaattag acagcttggt cg 32

<210> 37

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 37

gctcaaggcg ctatgattcc catggttgat attgc 35

<210> 38

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 38

gggaatcata gcgccttgag ccatgaaagg gaagag 36

<210> 39

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 39

ctaatctctg ctatgtgttt gtcgtataca agc 33

<210> 40

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 40

caaacacata gcagagatta gacagcttgg tcgcgg 36

<210> 41

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 41

tagcagctgg tgcgatgatc cctctatgcg ac 32

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 42

accagctgct aagtatggaa tgaag 25

<210> 43

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 43

gactgcatcg tcgccgcgtt cctattcccc 30

<210> 44

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 44

ggcgacgatg cagtctggtg ggtcc 25

<210> 45

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 45

atggctcaag gagccatcat ccccatg 27

<210> 46

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 46

tccttgagcc attagtggaa acaag 25

<210> 47

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 47

tgcataatct ctgccttttg cattcct 27

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 48

agagattatg caacttggtt ttgg 24

Claims

1.一种糖基转移酶Unigene14953，其特征在于，所述糖基转移酶Unigene14953的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种编码权利要求1所述糖基转移酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种糖基转移酶Unigene20323，其特征在于，所述糖基转移酶Unigene20323的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.一种编码权利要求3所述糖基转移酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.一种合成3-O-葡萄糖基甘草次酸的方法，其特征在于，使用和/或添加糖基转移酶作为催化剂，催化甘草次酸和尿苷二磷酸葡萄糖合成3-O-葡萄糖基甘草次酸。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述糖基转移酶优先选择Unigene14953，和/或Unigene20323，和/或UGT73C11(GenBank注册序列号为AFN26667.1)，和/或UGT73C5(GenBank注册序列号为NP_181218.1)，和/或UGT73C6(GenBank注册序列号为OAP07438.1)。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，优选权利要求6所述糖基转移酶的突变体，其具有糖基转移酶活性，且含有与酶催化功能相关的氨基酸残基：

SEQ ID No.2的第21位的组氨酸(H)第116位的天冬氨酸(D)；

SEQ ID No.4的第20位的组氨酸(H)第125位的天冬氨酸(D)；

SEQ ID No.5的第24位的组氨酸(H)第129位的天冬氨酸(D)；

SEQ ID No.6的第23位的组氨酸(H)第128位的天冬氨酸(D)；

SEQ ID No.7的第24位的组氨酸(H)第129位的天冬氨酸(D)。

其中，所述突变体的氨基酸位置编号基于糖基转移酶Unigene14953、Unigene20323、UGT73C11、UGT73C5和UGT73C6的氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示。

8.根据权利要求5中所述的方法，其特征在于，所述催化反应pH范围为5.0-11.0，所述催化反应温度为25-55℃。

9.权利要求1-7中任一项所述的基因序列或氨基酸序列在合成3-O-葡萄糖基甘草次酸的应用。

10.权利要求1-7中任一项所述的基因序列或氨基酸序列在制备以甘草次酸做为活性成分药物中的应用。