CN110055232A

CN110055232A - 二个甘草蔗糖合酶及其在合成甘草次酸糖基化衍生物中的应用

Info

Publication number: CN110055232A
Application number: CN201910022893.2A
Authority: CN
Inventors: 冯旭东; 张良; 李春; 刘潇斐; 郭芳
Original assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Current assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Priority date: 2019-01-10
Filing date: 2019-01-10
Publication date: 2019-07-26
Anticipated expiration: 2039-01-10
Also published as: CN110055232B

Abstract

本发明涉及二个甘草蔗糖合酶及其在合成甘草次酸糖基化衍生物中的应用。本发明通过对乌拉尔甘草基因组数据库的系统分析，从乌拉尔甘草细胞中克隆得到二种来源于新型甘草蔗糖合酶基因GuSuS1和GuSuS2及其编码的蛋白，在大肠杆菌细胞中成功异源表达，并验证其催化功，同时偶联蔗糖合酶GuSuS1和糖基转移酶UGT73C11构建UDP循环再生系统，该系统可催化甘草次酸合成3‑O‑单葡萄糖基甘草次酸、30‑O‑单葡萄糖基甘草次酸、3‑O‑单葡萄糖基‑30‑O‑单葡萄糖基甘草次酸三种甘草次酸糖基化衍生物。本发明填补了甘草蔗糖合酶研究方面的空白，为后续甘草细胞蔗糖及核苷糖代谢相关研究提供了一定的参考和依据，同时提供的UDP循环再生体系也大大简便了甘草次酸糖基化修饰过程。

Description

二个甘草蔗糖合酶及其在合成甘草次酸糖基化衍生物中的应用

技术领域：

本发明涉及二种来源于甘草的蔗糖合酶及编码基因，同时涉及一种由甘草来源的蔗糖合酶与欧洲山芥来源的UDP-糖基转移酶参与的酶法合成多种甘草次酸糖苷衍生物的方法，属于生物工程与技术领域。

背景技术：

蔗糖合酶(Sucrose Synthase)一种广泛存在于植物及一些原核生物细胞中的糖基转移酶，直接参与蔗糖的合成与水解过程，因此是植物光合作用及蔗糖代谢途径中的关键酶之一，对于植物的生长代谢过程十分重要。蔗糖是植物体内光合作用的主要产物，是植物生长发育所必需。它不仅是作物产量、纤维品质以及果实食用品质等的重要影响因素，也作为一种信号分子调控植物的生长发育过程。蔗糖合酶可以双向催化反应分别实现蔗糖的合成与水解，其中合成蔗糖时需要活化的核苷糖作为糖基供体，催化果糖生成蔗糖。另外水解蔗糖时，以核苷为糖基受体，生成核苷糖和果糖参与机体其他反应过程，因此，蔗糖合酶又在细胞内核苷糖的合成代谢过程中处于核心地位，其重要性不言而喻。

甘草(Glycyrrhiza uralensis)属于豆科多年生草本植物，是一种被广泛应用的传统中草药，被称为“国老”，其药用部位为根及根茎部，其气微，味甜，具有清热解毒、保肝护肝等功效，同时因其独特的甜味，又被应用于食品饮料等领域。

目前，大多数蔗糖合酶都是来源自植物，近些年，一些来自原核的蓝细菌的蔗糖合酶陆续被报道，丰富了人们对蔗糖合酶的认知，但是，甘草来源的蔗糖合酶目前尚未见报道，其细胞内的蔗糖与核苷糖代谢过程也不清晰。

甘草次酸是一种来源于甘草的五环三萜化合物，因其具有抗肿瘤、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎以及可作为靶向药物载体等多种药理活性和功能而受到广泛关注，但是其水溶性差、生物利用度低以及临床上长期服用会引起多种毒副作用等缺陷限制了甘草次酸的进一步应用。为此，以甘草次酸为前体开发低毒性、高药效的新型甘草次酸衍生物类药物的策略受到广泛关注，其中糖基化修饰作为一种天然产物改性的重要途径有着很多重要的应用，因此对甘草次酸进行糖基化修饰成为了研究热点。

鉴于化学法实现甘草次酸糖基化修饰存在复杂的基团保护/脱保护过程、反应条件苛刻、工艺复杂和产率低等问题，酶法因其定向性好，条件温和以及环境友好等优点而备受瞩目。目前已经有利用糖基转移酶体外催化实现了3-O-单葡萄糖基甘草次酸的生物合成的报道，但是糖基转移酶依赖于昂贵的UDP-葡萄糖作为糖基供体，糖基转移酶利用UDP-葡萄糖的效率偏低，需要过量添加UDP-葡萄糖，而且糖基化产物较为单一，这些因素限制了糖基转移酶的进一步应用。

目前通过蔗糖合酶偶联糖基转移酶构建UDP循环再生体系可以实现UDP-葡萄糖的持续供应，大大释放了糖基转移酶的催化潜力，并且使用廉价易获得的蔗糖作为初始糖基供体驱动整个反应进行，这让生物酶法高效制备天然化合物糖苷衍生物被应用于工业化大规模生产又近了一步，类似的研究工作已逐渐引起越来越多的关注，但是目前被应用的蔗糖合酶种类较少，而作为甘草次酸主要来源的植物甘草细胞来源的蔗糖合酶尚未见报道，利用UDP循环再生体系合成甘草次酸糖苷衍生物的研究亦无人提及。因此，挖掘发现甘草蔗糖合酶将会有助于解析甘草细胞中以蔗糖为中心的相关代谢途径，对甘草育种等研究具有一定的参考作用，同时应用蔗糖合酶偶联糖基转移酶的体系催化甘草次酸生成甘草次酸糖基化衍生物将实现 UDP的循环再生，大大提高反应效率，并且使用蔗糖作为初始糖基供体，也将降低成本。

发明内容：

本发明的目的是挖掘并解析乌拉尔甘草来源的蔗糖合酶，提供二种乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)来源的蔗糖合酶GuSuS1和GuSuS2的基因及其编码的蛋白质，同时提供一种偶联蔗糖合酶和糖基转移酶的UDP循环再生体系用以合成多种甘草次酸糖基化衍生物。

第一方面，本发明提供一种乌拉尔甘草来源的蔗糖合酶GuSuS1，它的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所述；一种乌拉尔甘草来源的蔗糖合酶GuSuS2，它的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所述；一种编码乌拉尔甘草来源的蔗糖合酶GuSuS1基因，它是序列表中SEQ ID No.3所述的核苷酸序列；一种编码乌拉尔甘草来源的蔗糖合酶GuSuS2基因，它是序列表中SEQ ID No.4所述的核苷酸序列。

第二方面，本发明提供一种偶联蔗糖合酶和糖基转移酶的体外酶催化体系，用以合成3-O- 单葡萄糖基甘草次酸(结构如式一所示)、30-O-单葡萄糖基甘草次酸(结构如式二所示)、3-O- 单葡萄糖基-30-O-单葡萄糖基甘草次酸(结构如式三所示)三种甘草次酸糖基化衍生物。

附图说明:

图1为本发明实施例1中蔗糖合酶GuSuS1、GuSuS2基因和UGT73C11基因的DNA琼脂糖凝胶电泳图。图A中M：DNA分子量标准(DNA Marker)；图B中M：DNA分子量标准(DNAMarker)，1：GuSuS1；2：GuSuS2。

图2为本发明实施例3中蔗糖合酶GuSuS1、GuSuS2蛋白和UGT73C11的蛋白表达纯化的SDS-PAGE图。图A从左往右8条泳道分别为1：GuSuS1细胞破碎后上清；2：GuSuS1 细胞破碎后沉淀；3：75mM咪唑洗脱结果；4：175mM咪唑洗脱结果；M：蛋白分子量标准；5：GuSuS2细胞破碎后上清；6：GuSuS2细胞破碎后沉淀；7：75mM咪唑洗脱结果；8： 175mM咪唑洗脱结果。图B为UGT73C11的蛋白表达纯化结果。

图3为本发明实施例4中蔗糖合酶GuSuS1与GuSuS2催化蔗糖和UDP生成UDP-葡萄糖的高效液相色谱图。图中A:UDP标准品；B:UDP-葡萄糖标准品；C:GuSuS1催化蔗糖水解反应产物；D:GuSuS2催化蔗糖水解反应产物

图4为本发明实施例5中偶联蔗糖合酶和糖基转移酶的体外酶催化体系用以合成甘草次酸糖基化衍生物的过程原理示意图。

图5为本发明实施例5中偶联蔗糖合酶和糖基转移酶的体外酶催化体系的高效液相色谱图。其中1为3-O-单葡萄糖基-30-O-单葡萄糖基甘草次酸，2为30-O-单葡萄糖基甘草次酸， 3为3-O-单葡萄糖基甘草次酸，4为甘草次酸。

图6为本发明实施例6中合成的30-O-单葡萄糖基甘草次酸的高效液相色谱-质谱联用仪鉴定结果。

图7为本发明实施例6中合成的3-O-单葡萄糖基甘草次酸的高效液相色谱-质谱联用仪鉴定结果。

图8为本发明实施例6中合成的3-O-单葡萄糖基-30-O-单葡萄糖基甘草次酸的高效液相色谱-质谱联用仪鉴定结果。

图9为本发明实施例6中合成的3-O-单葡萄糖基甘草次酸的¹³C谱图。

图10为本发明实施例6中合成的3-O-单葡萄糖基甘草次酸的¹H谱图。

图11为本发明实施例6中合成的30-O-单葡萄糖基甘草次酸的¹³C谱图。

图12为本发明实施例6中合成的30-O-单葡萄糖基甘草次酸的¹H谱图。

图13为本发明实施例6中合成的3-O-单葡萄糖基-30-O-单葡萄糖基甘草次酸的¹³C谱图。

图14为本发明实施例6中合成的3-O-单葡萄糖基-30-O-单葡萄糖基甘草次酸的¹H谱图。

具体实施方式：

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：蔗糖合酶GuSuS1与GuSuS2基因与糖基转移酶UGT73C11基因的获得

A.蔗糖合酶GuSuS1与GuSuS2基因的获得

根据甘草基因组数据库筛选，分析得到蔗糖合酶基因GuSuS1与GuSuS2序列，设计引物：

GuSuS1-F：5’>TGGGTCGCGGATCCGAATTCATGGCTACCGATCGTTTGA<3’

GuSuS1-R：5’>GGTGCTCGAGTGCGGCCGCACTCCTCAACAGCTAGGGGCA<3’

GuSuS2-F：5’>TGGGTCGCGGATCCGAATTCATGGCTAATGATCATCTRA<3’

GuSuS2-R：5’>GGTGCTCGAGTGCGGCCGCACTCTTCAATAGCAAGGGGCA<3’

以乌拉尔甘草cDNA为模版，使用ExTaq酶进行PCR扩增，分别得到2418bp片段的GuSuS1基因和2418bp片段的GuSuS2基因，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，克隆至pMD19-T载体，测序确定蔗糖合酶GuSuS1和蔗糖合酶GuSuS2基因完整序列。SEQ ID No.3 所示片段表达的氨基酸序列用SEQ ID No.1所示，SEQ ID No.4所示片段表达的氨基酸序列用SEQ ID No.2所示。

B.糖基转移酶UGT73C11基因的获得

根据糖基转移酶UGT73C11基因(Genbank注册序列号为AFN26664.1)序列，通过密码子优化，化学合成优化后的糖基转移酶UGT73C11基因片段，如SEQ ID No.5所示。SEQ IDNo.5所示片段表达的氨基酸序列用SEQ ID No.6所示。

实施例2：构建表达蔗糖合酶和糖基转移酶的大肠杆菌工程菌

A.构建表达蔗糖合酶GuSuS1与GuSuS2的大肠杆菌工程菌

为分别构建表达蔗糖合酶GuSuS1与GuSuS2的大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-GuSuS1和E.coli BL21(DE3)/pET28a-GuSuS2，以克隆所得蔗糖合酶GuSuS1与GuSuS2基因片段(SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示)为模板，设计上下游引物并加入酶切位点BamHⅠ、XhoⅠ和保护碱基：

BamHI-GuSuS1-F：5’>AGCAAATGGGTCGCGGATCCATGGCTACCGATCGTTTGAC<3’

XhoI-GuSuS1-R：5’>GGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCTCCTCAACAGCTAGGGGCA<3’

BamHI-GuSuS2-F：5’>AGCAAATGGGTCGCGGATCCATGGCTAATGATCATCTAAC<3’

XhoI-GuSuS2-R：5’>GGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCTCTTCAATAGCAAGGGGCA<3’

PCR反应体系为：模板1μL,上下游引物各2μL，Primer star mix(宝生物公司)25μL，用双蒸水不足50μL。PCR反应条件：预变性98℃1min，变性98℃10s、退火58℃5s、延伸72℃2min 30s，循环30次，72℃10min，4℃保存。

将克隆得到的蔗糖合酶GuSuS1与GuSuS2基因分别使用Thermo琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收进行纯化回收。对原核表达载体pET28a用限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ进行双酶切，酶切体系：BamHⅠ2μL和XhoⅠ2μL，10×digest buffer 5μL，DNA片段30μL，用双蒸水补足50μL的酶切体系,酶切条件为37℃、2h。酶切后使用Thermo琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收酶切产物。

使用Gibson Assembly法(采用NEB官方网站https://international.neb.com/推荐的方法) 对插入片段蔗糖合酶基因与线性化的载体pET28a进行无缝连接。将连接产物转化大肠杆菌 BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有100mg/L卡那霉素的固体LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，20g/L琼脂糖)平板上，37℃过夜培养。

采用菌落PCR和测序方法鉴定转化子。菌落PCR体系：模板LB平板单菌落，UGT73C11上下游引物各1μL，2×Taq mix(北京聚合美生物科技有限公司)10μL，用双蒸水补足20μL.PCR条件：预变性94℃5min，变性94℃30s、退火58℃30s、延伸72℃2min 30s，循环30次，72℃10min，4℃保存。经菌落PCR验证含有正确目标条带的转化子送DNA测序 (金唯智生物科技有限公司)，确定大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-GuSuS1和 E.coli BL21(DE3)/pET28a-GuSuS2构建成功。

B.构建表达糖基转移酶UGT73C11基因的大肠杆菌工程菌

为构建表达来源于欧洲山芥(Barbarea vulgaris)的糖基转移酶UGT73C11基因的大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-UGT73C11，化学合成糖基转移酶UGT73C11基因片段 (SEQ ID No.5所示)为模板，设计上下游引物并加入酶切位点EcoRⅠ、SalⅠ和保护碱基：

引物E-C11-F：5’>CCGGAATTCATGGTTTCTGAAATCACCCACAAAT<3’，带有EcoRⅠ 的酶切位点。

引物E-C11-R：5’>ACGCGTCGACGTTGTTAGACTGAGCCAGCTGCATGAT<3’，带有 SalⅠ的酶切位点。

采用本实施例中构建蔗糖合酶的大肠杆菌工程菌相同的方法构建含有糖基转移酶 UGT73C11基因的大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-UGT73C11。

实施例3：大肠杆菌基因工程菌的发酵及蔗糖合酶、糖基转移酶的纯化

A.大肠杆菌基因工程菌的发酵

(1)挑取鉴定正确的大肠杆菌工程菌接种于50mL含有100mg/L卡那霉素的LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L)中37℃，170rpm过夜培养。

(2)取过夜培养的菌液4mL接种于400mL含有100mg/L卡那霉素的LB液体培养基中培养2-3h至OD600＝0.6，培养条件37℃，170rpm。

(3)加入诱导剂IPTG，使其终浓度为0.1mM/L,继续培养，培养条件变为16℃，170rpm 过夜培养。

(4)将获得的发酵液室温，9000rpm离心3min后，收集菌体。

(5)15ml的50mM的pH7.0的PBS缓冲液重悬菌体，用低温高压细胞破碎机裂解菌体。

(6)将裂解的菌体在4℃，12000g离心10min，弃沉淀，收集上清，获得含有蔗糖合酶的粗酶液。

B.蔗糖合酶、糖基转移酶的纯化

用蛋白纯化系统AKTA purifier进行蛋白纯化。

(1)样品前处理：将上步得到的粗酶液，经0.45μm孔径过滤器过滤后4℃保存留用。

(2)Ni柱前处理：上样前，使用不少于10倍柱体积的Binding Buffer(25mM咪唑、50mM PBS，pH7.0)以1mL/min的流速冲洗平衡Ni柱。

(3)上样：经过上样前处理的样品以0.5mL/min的流速通过衡流泵抽送进入Ni柱中，收集穿透液，可反复上样以提高样品的挂柱效率。平衡上样后Ni柱：用大于10倍柱体积的 Binding Buffer以1mL/min的流速再次平衡镍柱以除去未结合在柱上的蛋白。

(4)梯度洗脱：按照Elution Buffer(1M咪唑)与Binding Buffer不同梯度的比例洗脱 Ni柱，流速为1mL/min，并观察监测OD280值，收集蛋白吸收峰对应的洗脱液并将通过SDS-PAGE检测后确定目的蛋白所在。

(5)用超滤管浓缩蛋白和更换缓冲液，使用Nanodrop 2000c检测蛋白浓度，4℃存放备用。

实施例4：蔗糖合酶催化蔗糖水解反应

由于蔗糖水解生成的UDP-葡萄糖在在紫外有吸收，故考虑使用HPLC检测UDP-葡萄糖的生成。取10μL纯化后的GuSuS1或GuSuS2、蔗糖(终浓度20mM)、UDP(终浓度2mM)、 PBS(50mM，pH7.0)配制成200μL体系后40℃反应20min，沸水浴10min以终止反应。反应产物经岛津LC-10型HPLC系统检测，HPLC条件如下：

流动相：A为8mM四丁基硫酸氢铵、17mM磷酸二氢钾，调pH至6.5；B为流动相A与甲醇按7:3的比例配制，调pH至6.5，流动相溶液需经过0.22μm孔径滤膜过滤并超声波震荡脱气，现配现用。等度洗脱：流动相A：流动相B＝23：77，流速为1mL/min，检测波长为 260nm。液相色谱柱为InertSustain反向C18硅胶柱，5μm，4.6x250mm。待测样品12000rpm 离心5min去除沉淀，将上清用0.22μm孔径滤膜过滤上清到液相小瓶中制成样品。

实施例5：偶联蔗糖合酶和糖基转移酶的UDP循环再生体系

以甘草次酸为底物，同时加入蔗糖合酶GuSuS1和糖基转移酶UGT73C11，添加尿苷二磷酸，蔗糖，40℃水浴反应2h，可实现甘草次酸的糖基化修饰，合成3-O-单葡萄糖基甘草次酸、 30-O-单葡萄糖基甘草次酸、3-O-单葡萄糖基-30-O-单葡萄糖基甘草次酸。

具体地，配制200μL反应体系：GuSuS1纯酶液(终浓度25μg/mL)、BvEc纯酶液(终浓度20μg/mL)、蔗糖(200mM)、UDP(1mM)、甘草次酸(50μM)以及PBS缓冲液(50 mM，pH7.0)。置于40℃水浴反应4h，加入800μL甲醇混匀，12000rpm离心10min去除沉淀，HPLC检测样品。

实施例6：三种甘草次酸糖基化衍生物的制备及结构表征

(1)按实施例3的操作流程获得蔗糖合酶GuSuS1和糖基转移酶UGT73C11的粗酶液，向混合粗酶液中加入1mL、0.1M的乙醇溶甘草次酸(分多次加入，反应后每隔2h取样HPLC 检测，观察甘草次酸转化率，若即将被转化完全可补加甘草次酸)，200μL、0.1M UDP以及终浓度1M的蔗糖进行反应，40℃水浴摇床170rpm，反应10h。

(2)将反应产物15000rpm离心10min，用20mL甲醇将沉淀涡旋振荡充分重悬，并使用0.22μm孔径有机滤膜过滤制成样品。

(3)用半制备液相分离纯化产物，方法如下：

流动相配比，A：甲醇；B：0.6％冰醋酸水溶液，A:B＝80:20；流动相溶液均需经过0.22μm 孔径滤膜过滤并超声波震荡脱气。流速为5mL/min，检测波长为254nm。液相色谱柱为岛津 C18硅胶柱，20x250mm。取待测步骤1所得样品2mL，使用注射进样的方式上样分离，对 UV线中每个峰进行液体的收集，并用分析型高效液相色谱仪进行检测以判断不同甘草次酸糖基化衍生物对应的保留时间并判断纯度。收集完所有GAMG样品后，使用真空浓缩仪进行浓缩干燥成粉末，放于4℃保存留用。

(4)三种甘草次酸糖基化衍生物粉末溶于氘代甲醇中，使用Bruker Ascend 700M核磁共振波谱仪进行¹H谱和¹³C谱分析，并分析确定结构信息。

序列表

<110> 北京理工大学

<120> 二个甘草蔗糖合酶及其在合成甘草次酸糖基化衍生物中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 806

<212> PRT

<213> 乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)

<400> 1

Met Ala Thr Asp Arg Leu Thr Arg Val His Ser Leu Arg Glu Arg Leu

1 5 10 15

Asp Glu Thr Leu Thr Ala Asn Arg Asn Glu Ile Leu Ala Leu Leu Ser

20 25 30

Arg Ile Glu Ala Lys Gly Lys Gly Ile Leu Gln His His Gln Val Ile

35 40 45

Ala Glu Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Asn Arg His Lys Leu Met Asp

50 55 60

Gly Ala Phe Gly Glu Val Leu Arg Ser Thr Gln Glu Ala Ile Val Leu

65 70 75 80

Pro Pro Trp Val Ala Leu Ala Val Arg Pro Arg Pro Gly Val Trp Glu

85 90 95

Tyr Leu Arg Val Asn Val His Ala Leu Val Val Glu Glu Leu Gln Pro

100 105 110

Ala Glu Phe Leu Arg Phe Lys Glu Glu Leu Val Asp Gly Ser Ser Asn

115 120 125

Gly Asn Phe Val Leu Glu Leu Asp Phe Glu Pro Phe Thr Ala Ser Phe

130 135 140

Pro Arg Pro Thr Leu Asn Lys Ser Ile Gly Asn Gly Val Gln Phe Leu

145 150 155 160

Asn Arg His Leu Ser Ala Lys Leu Phe His Asp Lys Glu Ser Leu His

165 170 175

Pro Leu Leu Glu Phe Leu Arg Leu His Ser Tyr Lys Gly Lys Thr Leu

180 185 190

Met Leu Asn Asp Arg Ile Gln Thr Pro Asp Ser Leu Gln His Val Leu

195 200 205

Arg Lys Ala Glu Glu Tyr Leu Gly Thr Leu Ser Pro Glu Thr Pro Tyr

210 215 220

Ser Val Phe Glu His Lys Phe Gln Glu Ile Gly Leu Glu Arg Gly Trp

225 230 235 240

Gly Asp Thr Ala Glu Arg Val Leu Glu Ser Ile Gln Leu Leu Leu Asp

245 250 255

Leu Leu Glu Ala Pro Asp Pro Cys Thr Leu Glu Thr Phe Leu Gly Arg

260 265 270

Ile Pro Met Val Phe Asn Val Val Ile Leu Ser Pro His Gly Tyr Phe

275 280 285

Ala Gln Asp Asn Val Leu Gly Tyr Pro Asp Thr Gly Gly Gln Val Val

290 295 300

Tyr Ile Leu Asp Gln Val Arg Ala Leu Glu Asn Glu Met Leu His Arg

305 310 315 320

Ile Lys Gln Gln Gly Leu Asp Ile Val Pro Arg Ile Leu Ile Ile Thr

325 330 335

Arg Leu Leu Pro Asp Ala Val Gly Thr Thr Cys Gly Gln Arg Leu Glu

340 345 350

Lys Val Phe Gly Thr Glu His Cys His Ile Leu Arg Val Pro Phe Arg

355 360 365

Asn Glu Lys Gly Met Val Arg Lys Trp Ile Ser Arg Phe Glu Val Trp

370 375 380

Pro Tyr Leu Glu Thr Tyr Thr Glu Asp Val Ala His Glu Leu Ala Lys

385 390 395 400

Glu Leu Gln Gly Lys Pro Asp Leu Ile Val Gly Asn Tyr Ser Asp Gly

405 410 415

Asn Ile Val Ala Ser Leu Leu Ala His Lys Leu Gly Val Thr Gln Cys

420 425 430

Thr Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Thr Lys Tyr Pro Glu Ser Asp Ile

435 440 445

Tyr Trp Lys Lys Phe Glu Glu Lys Tyr His Phe Ser Cys Gln Phe Thr

450 455 460

Ala Asp Leu Phe Ala Met Asn His Thr Asp Phe Ile Ile Thr Ser Thr

465 470 475 480

Phe Gln Glu Ile Ala Gly Ser Lys Asp Thr Val Gly Gln Tyr Glu Ser

485 490 495

His Thr Ala Phe Thr Leu Pro Gly Leu Tyr Arg Val Val His Gly Ile

500 505 510

Asp Val Phe Asp Pro Lys Phe Asn Ile Val Ser Pro Gly Ala Asp Gln

515 520 525

Thr Ile Tyr Phe Pro Tyr Thr Asp Thr Ser Arg Arg Leu Thr Ser Phe

530 535 540

His Pro Glu Ile Glu Glu Leu Leu Tyr Ser Ser Val Glu Asn Glu Glu

545 550 555 560

His Ile Cys Val Leu Lys Asp Arg Asn Lys Pro Ile Ile Phe Thr Met

565 570 575

Ala Arg Leu Asp Arg Val Lys Asn Ile Thr Gly Leu Val Glu Trp Tyr

580 585 590

Gly Lys Asn Ala Lys Leu Arg Glu Leu Val Asn Leu Val Val Val Ala

595 600 605

Gly Asp Arg Arg Lys Glu Ser Lys Asp Leu Glu Glu Lys Ala Glu Met

610 615 620

Lys Lys Met Tyr Gly Leu Ile Glu Thr Tyr Lys Leu Asn Gly Gln Phe

625 630 635 640

Arg Trp Ile Ser Ser Gln Met Asn Arg Val Arg Asn Gly Glu Leu Tyr

645 650 655

Arg Val Ile Cys Asp Thr Lys Gly Ala Phe Val Gln Pro Ala Val Tyr

660 665 670

Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Val Glu Ala Met Thr Cys Gly Leu Pro

675 680 685

Thr Phe Ala Thr Cys Asn Gly Gly Pro Ala Glu Ile Ile Val His Gly

690 695 700

Lys Ser Gly Phe His Ile Asp Pro Tyr His Gly Ala Ala Ala Ala Asp

705 710 715 720

Leu Leu Val Glu Phe Phe Glu Lys Cys Lys Ala Asp Pro Ser His Trp

725 730 735

Asp Asn Ile Ser His Gly Gly Leu Gln Arg Ile Glu Glu Lys Tyr Thr

740 745 750

Trp Gln Ile Tyr Ser Glu Arg Leu Leu Thr Leu Thr Gly Val Tyr Gly

755 760 765

Phe Trp Lys His Val Ser Asn Leu Asp Arg Arg Glu Ser Arg Arg Tyr

770 775 780

Leu Glu Met Phe Tyr Ala Leu Lys Tyr Arg Lys Leu Ala Glu Ser Val

785 790 795 800

Pro Leu Ala Val Glu Glu

805

<210> 2

<211> 806

<212> PRT

<213> 乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)

<400> 2

Met Ala Asn Asp His Leu Thr His Ser His Ser Phe Arg Glu Arg Leu

1 5 10 15

Asp Glu Thr Leu Thr Gly His Arg Asn Glu Ile Leu Ala Leu Leu Ser

20 25 30

Arg Ile Glu Ala Lys Gly Lys Gly Ile Leu Gln His His Gln Val Ile

35 40 45

Ala Glu Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Asn Arg Gln Lys Leu Leu Asn

50 55 60

Gly Ala Phe Gly Glu Val Leu Arg Ser Thr Gln Glu Ala Ile Val Leu

65 70 75 80

Pro Ser Phe Val Ala Leu Ala Val Arg Pro Arg Pro Gly Val Trp Glu

85 90 95

Tyr Leu Arg Ile Asn Val His Gly Leu Val Val Asp Glu Leu Arg Ala

100 105 110

Ala Glu Tyr Leu Lys Phe Lys Glu Glu Leu Val Glu Gly Ser Ser Asn

115 120 125

Gly Asn Phe Val Leu Glu Leu Asp Phe Glu Pro Phe Asn Ala Ser Phe

130 135 140

Pro Arg Pro Thr Leu Asn Lys Ser Ile Gly Asn Gly Val Glu Phe Leu

145 150 155 160

Asn Arg His Leu Ser Ala Lys Leu Phe His Gly Lys Glu Ser Met Lys

165 170 175

Pro Leu Leu Glu Phe Leu Arg Leu His Ser Tyr Asn Gly Lys Thr Met

180 185 190

Met Leu Asn Asp Arg Ile Gln Asn Leu Asn Ser Leu Gln His Val Leu

195 200 205

Arg Lys Ala Glu Glu Tyr Leu Ser Thr Ile Ala Pro Gln Thr Pro Tyr

210 215 220

Ser Glu Phe Glu His Glu Phe Gln Glu Ile Gly Leu Glu Arg Gly Trp

225 230 235 240

Gly Asp Thr Ala Glu Arg Val Leu Glu Met Ile Gln Leu Leu Leu Asp

245 250 255

Leu Leu Glu Ala Pro Asp Pro Cys Thr Leu Glu Thr Phe Leu Gly Arg

260 265 270

Ile Pro Met Val Phe Asn Val Val Ile Leu Ser Pro His Gly Tyr Phe

275 280 285

Ala Gln Asp Asn Val Leu Gly Tyr Pro Asp Thr Gly Gly Gln Val Val

290 295 300

Tyr Ile Leu Asp Gln Val Arg Ala Leu Glu Asn Glu Met Leu Asn Arg

305 310 315 320

Ile Lys Lys Gln Gly Leu Asp Ile Thr Pro Arg Ile Leu Ile Ile Thr

325 330 335

Arg Leu Leu Pro Asp Ala Val Gly Thr Thr Cys Gly Gln Arg Leu Glu

340 345 350

Lys Val Tyr Asn Thr Glu His Cys His Ile Leu Arg Val Pro Phe Arg

355 360 365

Thr Glu Lys Gly Ile Val Arg Lys Trp Ile Ser Arg Phe Glu Val Trp

370 375 380

Pro Tyr Leu Glu Thr Tyr Thr Glu Asp Val Ala Asn Glu Leu Ala Lys

385 390 395 400

Glu Leu Gln Gly Lys Pro Asp Leu Ile Val Gly Asn Tyr Ser Asp Gly

405 410 415

Asn Ile Val Ala Ser Leu Leu Ala His Lys Leu Gly Val Thr Gln Cys

420 425 430

Thr Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Thr Lys Tyr Pro Glu Ser Asp Ile

435 440 445

Tyr Trp Lys Lys Phe Glu Asp Lys Tyr His Phe Ser Cys Gln Phe Thr

450 455 460

Ala Asp Leu Phe Ala Met Asn His Thr Asp Phe Ile Ile Thr Ser Thr

465 470 475 480

Phe Gln Glu Ile Ala Gly Ser Lys Asp Thr Val Gly Gln Tyr Glu Ser

485 490 495

His Thr Ala Phe Thr Leu Pro Gly Leu Tyr Arg Val Val His Gly Ile

500 505 510

Asp Val Phe Asp Pro Lys Phe Asn Ile Val Ser Pro Gly Ala Asp Met

515 520 525

Ser Ile Tyr Phe Pro Tyr Thr Glu Thr Lys Arg Arg Leu Thr Ser Phe

530 535 540

His Pro Glu Ile Glu Glu Leu Leu Tyr Ser Ser Val Glu Asn Glu Glu

545 550 555 560

His Ile Cys Val Leu Lys Asp Arg Asn Lys Pro Ile Ile Phe Thr Met

565 570 575

Ala Arg Leu Asp Arg Val Lys Asn Ile Thr Gly Leu Val Glu Trp Tyr

580 585 590

Gly Lys Asn Ala Lys Leu Arg Glu Leu Val Asn Leu Val Val Val Ala

595 600 605

Gly Asp Arg Arg Lys Val Ser Lys Asp Leu Glu Glu Lys Ala Glu Met

610 615 620

Lys Lys Met Tyr Gly Leu Ile Glu Thr Tyr Lys Met Asn Gly Gln Phe

625 630 635 640

Arg Trp Ile Ser Ser Gln Met Asn Arg Val Arg Asn Gly Glu Leu Tyr

645 650 655

Arg Val Ile Cys Asp Thr Lys Gly Ala Phe Val Gln Pro Ala Val Tyr

660 665 670

Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Val Glu Ala Met Thr Cys Gly Leu Pro

675 680 685

Thr Phe Ala Thr Cys Asn Gly Gly Pro Ala Glu Ile Ile Val His Gly

690 695 700

Lys Ser Gly Tyr His Ile Asp Pro Tyr His Gly Asp Arg Ala Ala Glu

705 710 715 720

Leu Leu Val Glu Phe Phe Glu Lys Ser Lys Ala Asp Pro Ser His Trp

725 730 735

Asp Lys Ile Ser His Gly Gly Leu Lys Arg Ile His Glu Lys Tyr Thr

740 745 750

Trp Gln Ile Tyr Ser Glu Arg Leu Leu Thr Leu Thr Gly Val Tyr Gly

755 760 765

Phe Trp Lys His Val Ser Asn Leu Asp Arg Arg Glu Ser Lys Arg Tyr

770 775 780

Leu Glu Met Phe Tyr Ala Leu Lys Tyr Arg Lys Leu Ala Glu Ser Val

785 790 795 800

Pro Leu Ala Ile Glu Glu

805

<210> 3

<211> 2418

<212> DNA

<213> 乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)

<400> 3

atggctaccg atcgtttgac ccgtgttcac agtctccgtg agaggctcga tgaaaccttg 60

actgctaata gaaatgaaat tttggccctt ctctcaagga tcgaagccaa gggcaagggg 120

atcctgcaac accaccaggt cattgctgag tttgaggaaa ttcctgagga gaatagacat 180

aagctgatgg atggggcatt tggagaagtc ttgagatcca cacaggaagc catagtttta 240

ccaccatggg ttgctctggc tgttcgtcca aggcctggtg tttgggagta cctgagagtg 300

aatgtgcacg ctcttgttgt cgaagagttg caacctgctg agtttctccg cttcaaggag 360

gaacttgttg atggaagttc taatggcaac tttgtgcttg agttggactt tgaaccattt 420

actgcatcct tcccccgccc aactctcaac aagtcaattg gaaatggtgt gcaattcctc 480

aaccgtcacc tttctgcaaa actcttccat gacaaggaga gcttgcatcc acttctggaa 540

ttcctcagac ttcacagcta caagggaaag acattgatgt tgaatgacag aattcaaacc 600

ccggattctc ttcaacatgt tctgaggaaa gctgaagagt atcttggaac actttctcct 660

gagacaccct actcagtatt tgagcacaag ttccaggaga tcggtttgga gagagggtgg 720

ggtgacaccg cggagcgtgt cctcgagtcc atccaactcc tcttggatct tcttgaggct 780

cctgaccctt gcacccttga gactttcctt ggaaggatcc ccatggtctt taatgttgtg 840

atcctttcgc cccacggtta ctttgcccaa gataatgtct tgggataccc tgataccggt 900

ggccaggttg tttacatctt ggatcaagtt cgcgccttgg agaatgagat gctccatcgc 960

attaagcaac aaggcttgga tatcgtccct cgcattctca ttatcacccg tcttctcccc 1020

gatgcagtag gaactacctg tggccaacga ctcgagaagg tctttggaac cgagcattgc 1080

cacattcttc gagttccctt cagaaacgag aagggaatgg ttcgcaagtg gatctcaaga 1140

ttcgaagtct ggccatacct agaaacttac actgaggatg ttgcccatga acttgccaaa 1200

gagttgcaag gcaagccaga tctgattgtt ggaaactaca gtgatggaaa cattgttgcc 1260

tctttgttgg cacataaatt aggtgtcact cagtgtacca ttgctcatgc acttgagaag 1320

accaagtacc ctgaatctga catttactgg aaaaaattcg aagagaaata tcacttctct 1380

tgccaattca cagctgatct ctttgctatg aaccacacag acttcatcat caccagtacc 1440

ttccaagaga ttgctggaag caaggacact gttggacagt atgagagtca cactgccttc 1500

acccttcctg gactctaccg tgtcgtgcac ggtattgatg tctttgatcc aaaattcaac 1560

attgtatctc ccggagctga tcagaccatc tacttcccct acaccgacac cagccgcagg 1620

ctgacatcct tccaccccga aatcgaagag cttctttaca gctcagtgga gaatgaagag 1680

cacatatgtg tattgaagga ccgcaacaag ccaattatct tcaccatggc gaggttggac 1740

cgtgtgaaga acatcactgg acttgtcgag tggtacggca agaacgccaa gctccgtgag 1800

ctggtgaacc ttgtggttgt tgccggagac aggaggaagg agtccaagga cttggaagag 1860

aaggccgaga tgaagaagat gtacggcctg attgagacct acaagctgaa tggccaattc 1920

aggtggatct cctctcagat gaaccgggtg aggaacgggg agctgtaccg tgtcatctgc 1980

gacacaaagg gagctttcgt gcagcctgct gtctatgagg cctttggatt gacagttgtt 2040

gaggccatga cttgtgggtt gccaacattt gcaacatgca atggtggccc tgctgagatc 2100

attgttcatg gcaagtctgg tttccacatt gacccttacc acggcgcggc cgccgccgat 2160

ctccttgttg aattctttga gaagtgcaag gctgacccat ctcactggga caacatctcc 2220

catggtggtc tccaacgtat tgaagagaag tatacatggc aaatttactc tgagaggctt 2280

ctcactctca ctggtgtcta tggcttctgg aagcatgtgt ctaaccttga ccgccgcgag 2340

agccgccgtt atcttgagat gttctatgct ctcaagtacc gcaaattggc tgagtctgtg 2400

cccctagctg ttgaggag 2418

<210> 4

<211> 2418

<212> DNA

<213> 乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)

<400> 4

atggctaatg atcatctaac ccattctcac tctttccgcg agaggcttga tgaaactctc 60

actggtcaca ggaatgagat tttggccctt ctatcaagga ttgaagccaa gggcaaggga 120

atcctgcaac accaccaggt cattgcagag tttgaagaaa tccctgagga gaataggcaa 180

aaactactta atggggcatt tggagaagtt ttgagatcta cccaggaagc catagtgttg 240

ccatcatttg ttgctttggc tgttcgtcca aggcctggtg tttgggagta tcttcgaatc 300

aatgttcacg ggcttgttgt tgatgagctt cgtgctgctg agtacctgaa gttcaaggag 360

gagcttgttg aaggaagttc taatggcaac tttgtgcttg agttggactt tgaaccattc 420

aatgcttcct tcccccgacc aactctgaac aagtcgatcg gaaatggcgt ggagttcctc 480

aaccgccatc tttctgctaa gctcttccat ggcaaagaga gcatgaagcc actgcttgaa 540

ttcctcaggc ttcacagcta taatggaaag actatgatgt tgaatgacag aattcaaaac 600

ctgaattctc tccaacatgt tttgagaaaa gcagaagagt atctgagcac aattgctccc 660

caaacaccct actcggaatt cgagcacgaa ttccaggaga tcggtttgga gagaggatgg 720

ggtgacaccg cggagcgtgt cctcgagatg atccagcttc tgctggatct tctcgaggca 780

cctgaccctt gcacccttga gacattcctt ggaagaatcc ctatggtctt taatgttgtc 840

atcctttctc cccatggtta ctttgcacaa gataatgtct tgggataccc tgataccggt 900

ggacaggttg tgtacatctt ggatcaagtt cgtgccttgg agaatgagat gctcaatcgt 960

atcaagaaac aaggcttgga tatcacccct cgcattctca ttatcactcg tcttctccct 1020

gatgcagtgg gaactacttg tggccagcgt cttgagaagg tatataacac tgaacattgc 1080

cacattcttc gagttccctt tagaacagag aagggaattg ttcgcaaatg gatctcaaga 1140

tttgaagtct ggccctacct agagacttac actgaggatg ttgccaatga acttgccaaa 1200

gagcttcaag gcaagcctga tctgatagtt ggaaactaca gtgatggaaa cattgttgcc 1260

tctttgttag cacataaatt gggtgtgact cagtgtacca ttgctcatgc acttgagaag 1320

accaagtatc cagagtctga catttactgg aagaaatttg aagacaaata ccacttctca 1380

tgccaattca ctgctgatct ttttgcaatg aaccacacag actttattat caccagcacc 1440

ttccaagaga ttgctggaag caaggatact gttggacagt atgagagtca cactgccttc 1500

acccttccgg gactttaccg cgttgttcac ggcattgatg tattcgatcc gaagttcaac 1560

attgtctctc caggagctga catgagcatt tacttcccat acacagaaac caagcgtagg 1620

ttgacatcat tccaccctga gattgaagaa cttctctaca gctcagtgga gaatgaggag 1680

cacatatgtg tattgaagga ccggaacaag ccaatcatct tcaccatggc aaggttggac 1740

cgtgtgaaga acatcacagg acttgttgag tggtatggca agaatgccaa actgagggag 1800

ttggtgaacc ttgttgttgt tgctggggac aggaggaagg tatcaaagga cttggaagag 1860

aaagctgaga tgaagaaaat gtatggactc attgagacct acaagatgaa tggccaattc 1920

agatggatct cttctcagat gaatcgtgtg aggaatggag agctctaccg tgtcatttgt 1980

gacacaaagg gtgcattcgt tcagcctgct gtatatgaag cctttggttt aactgttgtt 2040

gaggccatga cttgtgggtt gccaacattt gcaacatgta atggtggtcc tgctgagatc 2100

attgtgcatg ggaaatctgg gtaccatatt gacccttacc atggtgatcg tgctgctgag 2160

cttcttgttg agttctttga gaagagcaag gctgatccat ctcattggga caaaatctcc 2220

catggaggtc tcaaacgtat tcatgagaag tacacatggc aaatttactc tgagaggctc 2280

ctgactctca ctggtgtcta tggcttctgg aagcatgtgt caaaccttga tcgccgtgag 2340

agcaaacgct acctcgagat gttctatgcc ctcaagtacc gcaaattggc tgaatctgtg 2400

ccccttgcta ttgaagag 2418

<210> 5

<211> 1485

<212> DNA

<213> 欧洲山芥(Barbarea vulgaris)

<400> 5

atggtttctg aaatcaccca caaatcttac ccgctgcact tcgttctgtt cccgttcatg 60

gctcagggtc acatgatccc gatggttgac atcgctcgtc tgctggctca gcgtggtgtt 120

aaaatcacca tcgttaccac cccgcacaac gctgctcgtt tcgaaaacgt tctgtctcgt 180

gctatcgaat ctggtctgcc gatctctatc gttcaggtta aactgccgtc tcaggaagct 240

ggtctgccgg aaggtaacga aaccttcgac tctctggttt ctatggaact gctggttccg 300

ttcttcaaag ctgttaacat gctggaagaa ccggttcaga aactgttcga agaaatgtct 360

ccgcagccgt cttgcatcat ctctgacttc tgcctgccgt acacctctaa aatcgctaaa 420

aaattcaaca tcccgaaaat cctgttccac ggtatgtgct gcttctgcct gctgtgcatg 480

cacgttctgc gtaaaaaccg tgaaatcctg gaaaacctga aatctgacaa agaacacttc 540

gttgttccgt acttcccgga ccgtgttgaa tttacccgtc cgcaggttcc gatggctacc 600

tacgttccgg gtgaatggca cgaaatcaaa gaagacatcg ttgaagctga caaaacctct 660

tacggtgtta tcgttaacac ctaccaggaa ctggaaccgg cttacgctaa cgactacaaa 720

gaagctcgtt ctggtaaagc ttggactatc ggcccggtaa gcctgtgcaa caaagttggt 780

gctgacaaag ctgaacgtgg taacaaagct gacatcgacc aggacgaatg cctgaaatgg 840

ctggactcta aagaagaagg ttctgttctg tacgtttgcc tgggttctat ctgctctctg 900

ccgctgtctc agctgaaaga actgggtctg ggtctggaag aatctcagcg tccgttcatc 960

tgggttgttc gtggttggga aaaaaacaaa gaactgctgg aatggttctc tgactctggt 1020

ttcgaagaac gtgttaaaga ccgtggtctg ctgatcaaag gttggtctcc gcagatgctg 1080

atcctggctc atcactctgt tggtggcttc ctgacccact gcggttggaa ctctaccctg 1140

gaaggtatca cctctggtat cccgctgctg acctggccgc tgttcggtga ccagttctgc 1200

aaccagaaac tggttgttca ggttctgaaa gttggtgttt ctgctggtgt tgaagaagtt 1260

accaactggg gtgaagaaga aaaaatcggt gttctggttg acaaagaagg tgttaaaaaa 1320

gctgttgaag aactgatggg tgaatctgac gacgctaaag aacgtcgtaa acgtgttaaa 1380

gaactgggtc agctggctca gaaagctgtt gaagaaggtg gttcttctca ctctaacatc 1440

acctctctgc tggaagacat catgcagctg gctcagtcta acaac 1485

<210> 6

<211> 495

<212> PRT

<213> 欧洲山芥(Barbarea vulgaris)

<400> 6

Met Val Ser Glu Ile Thr His Lys Ser Tyr Pro Leu His Phe Val Leu

1 5 10 15

Phe Pro Phe Met Ala Gln Gly His Met Ile Pro Met Val Asp Ile Ala

20 25 30

Arg Leu Leu Ala Gln Arg Gly Val Lys Ile Thr Ile Val Thr Thr Pro

35 40 45

His Asn Ala Ala Arg Phe Glu Asn Val Leu Ser Arg Ala Ile Glu Ser

50 55 60

Gly Leu Pro Ile Ser Ile Val Gln Val Lys Leu Pro Ser Gln Glu Ala

65 70 75 80

Gly Leu Pro Glu Gly Asn Glu Thr Phe Asp Ser Leu Val Ser Met Glu

85 90 95

Leu Leu Val Pro Phe Phe Lys Ala Val Asn Met Leu Glu Glu Pro Val

100 105 110

Gln Lys Leu Phe Glu Glu Met Ser Pro Gln Pro Ser Cys Ile Ile Ser

115 120 125

Asp Phe Cys Leu Pro Tyr Thr Ser Lys Ile Ala Lys Lys Phe Asn Ile

130 135 140

Pro Lys Ile Leu Phe His Gly Met Cys Cys Phe Cys Leu Leu Cys Met

145 150 155 160

His Val Leu Arg Lys Asn Arg Glu Ile Leu Glu Asn Leu Lys Ser Asp

165 170 175

Lys Glu His Phe Val Val Pro Tyr Phe Pro Asp Arg Val Glu Phe Thr

180 185 190

Arg Pro Gln Val Pro Met Ala Thr Tyr Val Pro Gly Glu Trp His Glu

195 200 205

Ile Lys Glu Asp Ile Val Glu Ala Asp Lys Thr Ser Tyr Gly Val Ile

210 215 220

Val Asn Thr Tyr Gln Glu Leu Glu Pro Ala Tyr Ala Asn Asp Tyr Lys

225 230 235 240

Glu Ala Arg Ser Gly Lys Ala Trp Thr Ile Gly Pro Val Ser Leu Cys

245 250 255

Asn Lys Val Gly Ala Asp Lys Ala Glu Arg Gly Asn Lys Ala Asp Ile

260 265 270

Asp Gln Asp Glu Cys Leu Lys Trp Leu Asp Ser Lys Glu Glu Gly Ser

275 280 285

Val Leu Tyr Val Cys Leu Gly Ser Ile Cys Ser Leu Pro Leu Ser Gln

290 295 300

Leu Lys Glu Leu Gly Leu Gly Leu Glu Glu Ser Gln Arg Pro Phe Ile

305 310 315 320

Trp Val Val Arg Gly Trp Glu Lys Asn Lys Glu Leu Leu Glu Trp Phe

325 330 335

Ser Asp Ser Gly Phe Glu Glu Arg Val Lys Asp Arg Gly Leu Leu Ile

340 345 350

Lys Gly Trp Ser Pro Gln Met Leu Ile Leu Ala His His Ser Val Gly

355 360 365

Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Gly Ile Thr

370 375 380

Ser Gly Ile Pro Leu Leu Thr Trp Pro Leu Phe Gly Asp Gln Phe Cys

385 390 395 400

Asn Gln Lys Leu Val Val Gln Val Leu Lys Val Gly Val Ser Ala Gly

405 410 415

Val Glu Glu Val Thr Asn Trp Gly Glu Glu Glu Lys Ile Gly Val Leu

420 425 430

Val Asp Lys Glu Gly Val Lys Lys Ala Val Glu Glu Leu Met Gly Glu

435 440 445

Ser Asp Asp Ala Lys Glu Arg Arg Lys Arg Val Lys Glu Leu Gly Gln

450 455 460

Leu Ala Gln Lys Ala Val Glu Glu Gly Gly Ser Ser His Ser Asn Ile

465 470 475 480

Thr Ser Leu Leu Glu Asp Ile Met Gln Leu Ala Gln Ser Asn Asn

485 490 495

Claims

1.二种蔗糖合酶GuSuS1和GuSuS2，其特征在于，所述蔗糖合酶用于甘草次酸糖基衍生物的合成。

2.如权利要求1所述，GuSuS1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，GuSuS2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求2所述，编码GuSuS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码GuSuS2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.如权利要求1所述，三种甘草次酸糖基化衍生物，特征在于，如式1、式2、式3所示的结构。

5.如权利要求4所述，制备三种甘草次酸糖基衍生物的体系包括蔗糖合酶、糖基转移酶、蔗糖、尿苷二磷酸和甘草次酸。