JPWO2006118079A1

JPWO2006118079A1 - 皮膚の老化防止剤

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Publication number: JPWO2006118079A1
Application number: JP2007514715A
Authority: JP
Inventors: 新山崎; 三之助浅賀; 駒井　功一郎; 功一郎駒井
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-04-28
Filing date: 2006-04-24
Publication date: 2008-12-18
Also published as: WO2006118079A1

Abstract

本発明により、クルクメノン、4S−ジヒドロクルクメノン、および／またはクルカラブラノール有効成分とする皮膚外用剤が提供される。これらは、ヒアルロン酸の断片化を抑制し、さらに線維芽細胞賦活作用を有するので、該皮膚外用剤は老化防止剤として有用である。

Description

近年、社会の高齢化に伴って老化に対する関心が非常に高くなっている。なかでも皮膚はいわゆる老化の徴候が顕著に表れる部分であるため、特に女性においてはシワ、たるみ等を防止してその美観を維持しようとする要求が極めて高い。本発明は、皮膚の張りを維持するために重要な成分であるヒアルロン酸の断片化を防ぐ一方、皮膚の細胞を賦活してその代謝を促進させ、シワやたるみを防止し若しくは改善するために使用される老化防止剤に関する。

ヒアルロン酸に代表されるムコ多糖類は皮膚の張りを維持するための重要な成分とされ、その断片化および／または低分子化により本来の機能が損なわれると考えられている。従って、ヒアルロン酸の断片化の防止は皮膚のシワの予防および皮膚の老化防止に有効とされ、特許文献１にはリュウタン、キキョウ、その他の植物抽出物がヒアルロン酸断片化抑制剤として化粧料に利用できることが開示されている。

一方、皮膚は常に紫外線や温度・湿度の変化によるストレスを受けており、その結果生じた肌荒れや、乾燥、炎症、小じわ等の表皮傷害は、加齢に伴う細胞機能の低下によって修復が極めて困難となる。そこで、細胞を賦活してその代謝を亢進させこのような傷害から回復または改善する細胞賦活剤が提案され、例えば特許文献２には、特定の植物、生薬および／または菌類の抽出物よりなる表皮細胞賦活剤が記載されている。また、特許文献３にはウコン属植物の抽出物よりなる真皮線維芽細胞賦活剤が開示されている。

これらのヒアルロン酸断片化抑制剤または細胞賦活剤はいずれも、植物抽出物の段階に止まり、作用の有効成分を特定するには至っていないが、特許文献４にはウコン葉エキスよりなる皮膚外用剤が開示され、クルジオンおよびクルクモールがその美白作用に重要な役割を果たしていることが記載されている。しかしながら、当該皮膚外用剤は老化に伴うシミ、ソバカスの低減、退色、消去により皮膚本来の色、艶をよみがえらせて美白、美肌を達成させることを目的とし、本発明のヒアルロン酸断片化阻害剤および／または細胞賦活剤としての老化防止剤とは異なる。
特開２００１−１２２７６５号公報特開２００３−２９２４３２号公報特開２００４−７５６３２号公報特開２００４−１３１４９８号公報

上記のとおり、植物抽出物よりなるヒアルロン酸断片化抑制剤および細胞賦活剤が知られているがその作用は十分でなく、本発明は、更に新しいヒアルロン酸断片化抑制剤および／または細胞賦活剤を提供することを目的とする。

生薬でウコンと称される材料には、春ウコン（Curcuma aromatica）と秋ウコン（C. longa）、紫ウコン・白ウコン（C. zedoria）がありその根茎の切断面の色調差異により区別されている。これらウコンの根茎部はガンや生活習慣病予防効能を持つことから機能性食品として古くから利用されているが、地上部分は殆どの場合廃棄処分されているのが現状である。

本発明者らは、通常廃棄処分されているウコン葉の有効利用を探る研究の一環として、福岡県山門郡山川町で生産されている白ウコン葉部に含まれる有用成分を探索した結果、単離された特定のセスキテルペン類がヒアルロン酸断片化阻害作用および細胞賦活作用を有することを見出し、本発明を完成させた。

本発明の有効成分であるセスキテルペン類はヒアルロン酸の断片化を抑制し、更には細胞の賦活作用を併せ持つので、皮膚の張りを維持する一方、皮膚の細胞の代謝を促進させ、シワやたるみを防止し若しくは改善するために使用される老化防止剤として有用である。

更に、これらセスキテルペン類はチロシナーゼ阻害活性を示すのみならず、実際にメラニンの合成を抑制することが今回確認された。このことは、本発明の老化防止剤が美白効果も有することを示している。

ウコン葉抽出液のガスクロマトグラフィーの結果を示す。

クルクメノンは、ウコン（Curcuma aromatica）より、好ましくはその葉の部分から、ヘキサン、ジエチルエーテル等の有機溶媒を用いて抽出し単離することができる（特開平１−２３３２１７）。また、後記実施例の記載に基づいて、白ウコン乾燥葉より単離することもできる。さらに、使用目的に応じて、ウコン抽出物を適宜精製しクルクメノンとして用いることもできる。4S−ジヒドロクルクメノンおよび／またはクルカラブラノールも同様である。

本発明の老化防止剤は皮膚外用剤として提供される。この場合、クルクメノン、4S−ジヒドロクルクメノンおよび／またはクルカラブラノールの配合量は皮膚外用剤に対して好ましくは０．０００１％〜５重量％、より好ましくは０．００１％〜１重量％の範囲である。また、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常化粧品や医薬品の外用剤に用いられる成分、例えば、保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、乳化剤、アルコール成分、色剤、着香剤、水性成分、皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。

この皮膚外用剤は、クリーム剤、液剤、ローション剤、乳剤、ゲル剤、軟膏剤等、種々の剤形で提供され、特に限定はされない。また、その使用形態も任意であって、例えば、化粧水、乳液、クリーム、パック等のフェーシャル化粧料やファンデーションの他、メーキャップ化粧料、毛髪用化粧料、芳香化粧料、浴用剤、石けん等で使用することができるが、限定はされない。
本発明に係るセスキテルペン類はメラニンの合成を抑制する作用をも有するので、美白効果とあわせて、シワやたるみを防止し若しくは改善するための皮膚外用剤として特に好適に用いられる。
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。

セスキテルペン類の単離と同定
白ウコンの乾燥葉の水−エタノール系溶剤で得た抽出物３０ｇを用いて活性成分の単離を実施した。該ウコン抽出物を蒸留水１Ｌに溶解後、ヘキサン１Ｌで２回分液し、ヘキサン可溶画分と水可溶画分とに分画した。それぞれの画分を減圧濃縮し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。その結果、ヘキサン画分０．５１ｇ、水画分２．９２ｇを得た。両成分についてチロシナーゼ阻害試験（例えば、特開平２００４−１３１４９８号参照）およびヒアルロン酸断片化抑制試験（下記参照）にて活性を評価したところ、ヘキサン画分に高い活性が認められたのでこの画分に注目して成分の単離を実施した。

ヘキサン画分０．２ｇをシリカゲル（富士シリシア化学、BW-127ZH）を充填したカラムクロマトグラフィー（展開剤：ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）に供し、単離を行った。その結果、フラクション１から５の画分を得た。各フラクションを濃縮したところ、フラクション１からクルクメノン（白色結晶、０．０２５ｇ、収率０．１２５％）、フラクション３から4S-ジヒドロクルクメノン（油状、０．０１３ｇ、収率０．０６５％）、フラクション４からクルカラブラノール（油状、０．００８ｇ、収率０．０４％）をそれぞれ得た。各成分はマススペクトル（GC-MS）、赤外吸収スペクトル（IR）および核磁気共鳴スペクトル（NMR）によった。

クルクメノン：

mp.118.5-119.5℃
CI-MS; m/z=235[M+H]^＋
^１H-NMR(CDCl₃)δ(ppm):0.45(1H, dt, J=3.0, 6.0Hz, H-1), 0.67(1H, q, J=4.0Hz, H-5), 1.10(3H, s, H-14), 1.60(2H, m, H-2), 1.80(3H, s, H-12), 2.09(3H, s, H-13), 2.12(3H, s, H-15), 2.48(2H, q, J=7.5Hz, H-9), 2.53(2H, d, J=3.0Hz, H-3), 2.82(2H, br.s, H-6)

4S-ジヒドロクルクメノン

EI-MS; m/z=236(M^＋), 218(M-18), 68(base peak)
IR(cm^-1);3436, 1678, 1053
^１H-NMR δ(ppm):0.45(1H, H-1), 0.65(1H, H-5), 1.12(3H, H-14), 1.18(3H, H-15), 1.80(3H, H-12), 2.10(3H, H-13), 3.78(1H, H-4)

クルカラブラノール

EI-MS; m/z=252(M^＋)
IR(cm^-1);3494, 1752, 1713
^１H-NMR(CDCl₃)δ(ppm):0.44(1H, H-1), 0.58(1H, H-5), 1.62(2N, H-2), 2.16(3H, H-15), 2.52(2H, H-3), 1.08(3H, H-12), 1.20(3H, H-13), 1.13(3H, H-14), 4.22(OH, H-4)

ヒアルロン酸断片化抑制試験
微生物起源のヒアルロン酸ナトリウムを用いて、活性酸素（アスコルビン酸−鉄系）によるヒアルロン酸の断片化に対する抑制作用の測定をした。
0.04%ヒアルロン酸ナトリウムを含む0.3Mリン酸緩衝液（pH5.3、0.45mL）に1%の試料溶液（0.05mL）と1mMアスコルビン酸（0.025mL）ならびに1mM塩化第二鉄水溶液（0.025mL）とを加え、37℃で24時間インキュベートした後、その反応液を取り出し、これに0.1%アルブミンを含む0.04M酢酸ナトリウム／0.08M酢酸緩衝液（pH3.75、2.0mL）を加えてよく撹拌した。５分後、生成したヒアルロン酸とアルブミンとの複合体の濁度（残存ヒアルロン酸量）を600nmにおける吸光度（Esr）として測定した。

尚、本法で用いたヒアルロン酸の測定では、試料とアルブミンとの間でも複合体を形成する可能性があるため、ブランクとしてヒアルロン酸ナトリウムのみを除いた時の濁度（Eb）を測定した。また、試験に供した元のヒアルロン酸量はアスコルビン酸−鉄系におけるヒアルロン酸の断片化操作を除いた場合のアルブミンとの複合体の濁度（Eso）を測定した。

ヒアルロン酸断片化抑制作用率（％）の算出は、前記の方法でヒアルロン酸の断片化を測定した。試験に供した元のヒアルロン酸量（Eso）に対するヒアルロン酸量（残存ヒアルロン酸量：Esr）の割合を下式より算出して求めた。
ヒアルロン酸断片化抑制率（％）＝（Esr−Eb／Eso−Eb）×１００
陽性対照としては没食子酸を用いた。
結果を表１に示した。

化合物（１）：クルクメノン
化合物（２）：4S-ジヒドロクルクメノン
化合物（３）：クルカラブラノール

細胞賦活作用試験
ヒト新生児皮膚線維芽細胞（NB1RGB）を使用して、濃度2.5×10^４セル/mLの細胞液を5%FBS−MEM培地を用いて調製し、９６ウェルプレートに播種した（200μL）。その後、ＣＯ_２インキュベータ（37℃、5%ＣＯ_２）で24時間培養した。
試料を0.5%FBS−MEM培地で溶解し濾過滅菌した。そして９６ウェルプレートの培地を除いて代わりに0.5%FBS−MEM培地を添加した（100μL）。その後先に調製した試料溶液（100μL）を添加した。ここで、ブランクには0.5%FBS−MEM培地を、活性指標には5%FBS−MEM培地を添加した。その後、ＣＯ_２インキュベータで７日間培養した。

50μg/mLのニュートラルレッド（200μL）を5%FBS−MEM培地に加えた培地（19.8mL）を調製した。９６ウェルプレートの培地を除いて代わりにニュートラルレッド含有培地（200μL）を添加しＣＯ_２インキュベータで２時間培養した。
培地を捨て、1%CaCl_２、1%ホルマリン溶液（100μL）を添加して１分間撹拌した。その後、1%酢酸・50%エタノール溶液（100μL）を添加し15分間撹拌した。その後、マイクロプレートリーダーを用いて570nmの吸光度を測定した。
結果を表２に示した。コントロール（0.5%FBS含有MEM培地を用いて培養を行ったもの）を１００として各検体の細胞増殖率を示している。陽性対照としてはアルブチンを用いた。

メラニン合成抑制試験
ＭＥＭ（SIGMA M4655）500mlにウシ胎児血清（FBS, GIBCO, Lot 3762782S）を最終濃度10%となるように添加し、抗生物質−抗菌剤（GIBCO, BRL 15240-096）を100μL加えた。また添加する供試サンプルによる培地のpH変動を防ぐために1M HEPES（SIGMA）溶液を10mLとなるように添加し、10%FBS-MEM培地を作成した。
この10%FBS-MEM培地を用いて、B16メラノーマ細胞の濃度が5×10^４cell/mLとなるように細胞液を調製し、60mmディッシュに5mLずつ播種した（１サンプルにつき、4-5枚試験を行った）。その後、ＣＯ_２インキュベータ（37℃、5%ＣＯ_２）で２４時間培養した。

サンプルをPBSで希釈し、濾過滅菌した。また、10%FBS-MEM培地100mLあたり4mLのテオフィリン溶液（テオフィリン0.18gを蒸留水で加熱溶解し、完全に溶けたのを確認した後20mLにメスアップして調製した）を添加した培地を調製した。そして、ディッシュの培地を除き、先に調製したテオフィリン入り培地を4.5mL添加した。その後、先に調製したサンプル溶液を500μL添加した。ここでブランクにはPBSを500μL添加した。その後、ＣＯ_２インキュベータで３日間培養した。

次に、合成されたメラニンの抽出を行った。トリプシン5mLで細胞を洗った後、トリプシン1mLを加えて37℃のＣＯ2インキュベータで5分間処理を行った。細胞が完全に剥がれたら培地4mLを添加して15mL遠心管に移した。ディッシュに残った細胞はPBS1mLを加え洗って採取した。その後、250ｇ（1500rpm）で10分間遠心分離し、上清を除去した。その後、エタノール：ジエチルエーテル＝３：１溶液を1mL加えボルテックスミキサーで撹拌して、再度、250ｇ（1500rpm）で10分間遠心分離し、上清を除去した。その後、ジエチルエーテル1mLで洗い、250ｇ（1500rpm）で遠心分離し上清を除去した後、60℃の乾熱滅菌機で1時間乾燥させた。乾燥した沈殿物を10%DMSO、1N NaOH溶液1mLを加え80-90℃の湯につけて溶解した。その後、分光光度計で1N NaOHをブランクとして420nmの吸光度を測定した。

上記の各成分を常法に従って混合し、美容液を得る。

上記の各成分を常法に従って混合し、化粧油を得る。

上記の各成分を常法に従って混合し、石けんを得る。

Claims

クルクメノン、4S−ジヒドロクルクメノンおよび／またはクルカラブラノールを有効成分とする、皮膚の老化防止剤。
ヒアルロン酸の断片化を阻害するために使用される、請求項１の老化防止剤。
皮膚の細胞を賦活するために使用される、請求項１の老化防止剤。