CN113693963B - 一种黑素抑制剂、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黑素抑制剂、制备方法及其应用，涉及美白领域。发明针对酪氨酸酶，设计了一个直接抑制酪氨酸酶活性的第一多肽，进而干扰(抑制)黑素的生产过程，减轻肤色，起到美白的效果。发明人还针对α‑MSH‑MC1R信号通路设置了第二多肽，第二多肽可以对α‑MSH‑MC1R信号通路进行抑制，可以直接抑制α‑MSH与MC1R的结合，从而降低TYR的生成。从而抑制黑素的生成，减轻肤色，起到美白的效果。上述黑素抑制剂可以用于制备美白医药产品或美白化妆品，发明人研究表明，黑素抑制剂没有不良反应，且美白效果明显。

Description

一种黑素抑制剂、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及美白领域，具体而言，涉及一种黑素抑制剂、制备方法及其应用。

背景技术

在亚洲文化中，浅肤色一直与年轻和美丽联系在一起。在亚洲国家，特别是中国、印度和日本市场的推动下，对皮肤美白剂的投资每年都在增加。而肤色受到许多内在因素的影响，包括皮肤类型和遗传背景，以及外在因素，包括阳光照射和环境污染的程度。肤色由黑素小体的数量及其在皮肤中的分散程度决定。在生理条件下，色素沉着可以保护皮肤免受有害的紫外线伤害。然而，黑色素的过度生成会导致广泛的美学问题，包括黄褐斑、麻黄色素沉着和炎症后色素沉着。传统的药物，包括皮质类固醇、对苯二酚和氨基氯化汞，通过抑制黑素细胞成熟或干扰黑素生成过程来减轻肤色。然而，上述大多数药物与不良反应密切相关，包括刺痛感、接触性皮炎、刺激性、高毒性和敏感性。因此，化妆品公司和研究机构最近的研究一直集中在开发新型增白剂，选择性抑制酪氨酸酶的活性，以减少色素沉着，同时避免对正常健康黑素细胞的细胞毒性。因此，天然皮肤美白化合物目前在化妆品和医疗行业引起了极大的关注。

黑色素主要由位于皮肤最外层表皮的黑素细胞产生；也正是这一层决定了人类的肤色。黑色素主要在黑素小体中合成，黑素小体在黑素细胞中起着特殊的细胞器的作用。黑素生成是一个复杂的过程，涉及到黑素体内的一系列酶和化学反应，从而产生两种类型的黑色素：真黑素和黑色素。真黑素是一种不溶性聚合物，颜色为深棕色-黑色，而褐黑素是一种可溶性聚合物，颜色为浅红色-黄色，也含有硫。真黑素和黑色素都是由半胱氨酸或谷胱甘肽结合形成的。

目前研究表明，参与黑素生成调节的三个核心信号通路是：1)黑素皮质素1受体(MC1R)信号；2)Wnt/β-连环蛋白信号通路；以及3)酪氨酸激酶受体KIT/干细胞因子(SCF)途径。在黑素生成过程中，L-酪氨酸羟基化生成L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)是整个过程的限速步骤，由酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)催化。抑制TYR活性可减少黑色素生成。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黑素抑制剂、制备方法及其应用以解决上述技术问题。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种黑素抑制剂，其包括如下至少一种的多肽：

具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第一多肽和如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第二多肽。

现有研究表明：α-MSH是一种前体多肽，来源于阿片皮质素原，可通过旁分泌作用调节色素沉着，而黑素皮质素1受体(MC1R)是G蛋白偶联受体家族的成员。α-MSH与MC1R结合导致腺苷酸环化酶激活，增加细胞内cAMP水平，随后上调TYR、酪氨酸酶相关蛋白-1(TRP-1)和酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2)的表达。α-MSH-MC1R信号通路主要通过提高细胞内cAMP水平来诱导黑色素生成，对其的抑制可对黑色素生成产生抑制作用。

发明人提供了一种多肽(第二多肽)可以对α-MSH-MC1R信号通路进行抑制，从而阻断腺苷酸环化酶的激活，使得细胞内的cAMP水平下降，进而下调TYR、酪氨酸酶相关蛋白-1(TRP-1)和酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2)的表达。具体地，第二多肽可以直接抑制α-MSH与MC1R的结合，从而降低TYR的生成。从而抑制黑素的生成，减轻肤色，起到美白的效果。

此外，发明人还提供了一种可以直接作用于TYR的多肽(即第一多肽)，该第一多肽可以直接结合TYR，直接抑制TYR酶的活性。进而干扰(抑制)黑素的生产过程，减轻肤色，起到美白的效果。

在一种实施方式中，可以将第一多肽和第二多肽组合使用，从而达到稳定的增白效果。发明人发现将二者组合使用，可以协同增效的效果，可以更加明显的降低黑色素的生成，提升美白效果。

第一多肽为环状多肽，其一级结构如下：

Cys-Asn-Gly-Ile-Asn-Tyr-Arg-Trp-Cys(CNGINYRWC，SEQ ID NO.1)，上述第一多肽中的第1位的半胱氨酸与第9位的半胱氨酸以二硫键连接以使第一多肽为环状。分子量为1126.2Da，等电点是8.06。环状多肽比直连多肽具有更好的稳定性，且具有分散性好、生产成本低等特点。发明人发现第一多肽具有较强的抑制TYR活性的功能。

第二多肽为线状多肽，其一级结构如下：Cys-Tyr-Tyr-Lys-Tyr-Phe-Arg-Tyr-Ile(CY_dYK_dYFRYI，SEQ ID NO.2)，其中第2位和第5位的酪氨酸和赖氨酸均为D-性氨基酸，其余为L-型氨基酸。分子量为1770.2Da，等电点是5.95。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述第二多肽中的第2位的酪氨酸和第5位的赖氨酸分别为D-酪氨酸和D-赖氨酸。

本发明还提供了一种黑素抑制剂在制备美白产品中的应用。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述黑素抑制剂用于抑制酪氨酸酶的活性，和/或用于抑制α-MSH-MC1R信号通路。

抑制α-MSH-MC1R信号通路是指：抑制α-MSH与其受体MC1R的结合。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述美白产品为美白医药产品或化妆品。

化妆品为洗面乳、浴液、化妆水、卸妆液、精华液、乳液、蜜类、奶类、护发乳、精华乳、润面霜、粉底霜、精华霜、妆前霜、美白斑贴或油状化妆品；

优选地，油状化妆品为卸妆油、润肤油、润发油或精华油。在其他实施方式中，如下定义的化妆品均在本发明的保护范围内。

化妆品是指以涂抹、喷洒或者其他类似方法，散布于人体表面的任何部位，如皮肤、毛发、指趾甲、唇齿等，以达到清洁、保养、美容、修饰和改变外观，或者修正人体气味，保持良好状态为目的的化学工业品或精细化工产品。

美白医药产品包括不限于：祛斑药物和防光剂(内用或外用防光剂)。本发明提供的黑素抑制剂也可以与多种药物组合使用，例如与外用遮光剂、维A酸类、外用抗氧化剂、ω-3脂肪酸等组合使用也在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种多肽组合物，其包括黑素抑制剂、化妆品辅料和其他化妆品原料。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述化妆品辅料选自如下至少一种的辅料：

保湿剂、乳化剂、矿物油、植物油、增稠剂、pH调节剂、香精和防腐剂。

优选地，保湿剂选自如下至少一种的物质：甘油、多元醇、透明质酸钠、神经酰胺、海藻糖、聚山梨醇酯-30、氨基酸保湿剂。

乳化剂选自羊毛脂；在其他实施方式中，上述乳化剂可以选自聚甘油-10硬脂酸酯、辛基聚甲基硅氧烷、聚二甲基硅氧烷、聚甲基硅倍半氧烷、巴巴苏籽油、植物甾醇油酸酯等。

增稠剂选自如下至少一种的物质：卡波姆，羟乙基纤维素和黄原胶；在其他实施方式中，增稠剂也可选自丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物。

pH调节剂选自如下至少一种的物质：柠檬酸、柠檬酸盐、乳酸、乳酸盐、三乙醇胺和精氨酸；

防腐剂选自如下至少一种的物质：1,2-己二醇、对羟基苯乙酮和乙基己基甘油。

在本发明应用较佳的实施方式中，其他化妆品原料选自如下至少一种的物质：天然角鲨烷、鲸蜡醇、熊果苷、曲酸及其衍生物、甘草黄酮、多肽物质、植物提取物、细胞因子、α-红没药醇、氮酮、高岭土、聚乙烯醇、汉生胶、TiO₂和维生素。

上述曲酸衍生物选自曲酸双棕榈酯；在其他实施方式中，上述曲酸衍生物也可以是2,4,6-三羟基苯甲酸-透明质酸曲酸酯-酯，或者是对曲酸进行改性以提升其抗菌或抗氧化性的衍生物。

上述多肽物质选自如下至少一种的物质：肌肽、促皮肤修复肽、角蛋白酶、五肽-3、谷胱甘肽、鹅肌肽和蛇肉肽。

植物提取物选自如下至少一种的物质：燕麦仁提取液、铁皮石斛提取物、芦荟粉、薄荷醇。

细胞因子选自如下至少一种的物质：表皮生长因子和神经生长因子；在其他实施方式中，细胞因子还可以选择其他的具有明确功能和结构的蛋白或多肽。

维生素选自如下至少一种的物质：维生素B3、维生素C和维生素E。

本发明还提供了一种黑素抑制剂的制备方法，其包括如下步骤：采用固相合成的方法或重组表达的方法合成第一多肽和/或第二多肽；

优选地，当采用固相合成的方法时，先合成第一多肽或第二多肽的粗多肽，然后将粗多肽进行高级结构的复性折叠；

优选地，复性折叠是采用谷胱甘肽氧化还原法复性；

优选地，制备方法还包括将复性折叠的多肽进行纯化；

优选地，纯化是通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。

上述重组表达可以是用细菌或者真核细胞表达，并纯化。

本发明具有以下有益效果：

本发明针对酪氨酸酶，设计了一个直接抑制酪氨酸酶活性的第一多肽，进而干扰(抑制)黑素的生产过程，减轻肤色，起到美白的效果。发明人还针对α-MSH-MC1R信号通路设置了第二多肽，第二多条可以对α-MSH-MC1R信号通路进行抑制，从而阻断腺苷酸环化酶的激活，使得细胞内的cAMP水平下降，进而下调TYR、酪氨酸酶相关蛋白-1(TRP-1)和酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2)的表达。具体地，第二多肽可以直接抑制α-MSH与MC1R的结合，从而降低TYR的生成。从而抑制黑素的生成，减轻肤色，起到美白的效果。

上述黑素抑制剂可以用于制备美白医药产品或美白化妆品，发明人研究表明，黑素抑制剂没有不良反应，且美白效果明显。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为多肽TYRR9与酪氨酸酶催化中心的互作模式图；

图2为TYRR9在酸、碱环境中的稳定性结果图；

图3为多肽MSHR9抑制α-MSH与MC1R的结合的实验结果图；

图4为多肽MSHR9对黑色素细胞MITF和TYR表达量的影响统计图；

图5为多肽TYRR9和多肽MSHR9对B16细胞黑色素生成的影响统计图；

图6为不同浓度的短肽对酪氨酸酶的抑制率统计结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了第一多肽(环状多肽，如下命名为TYRR9)的制备方法，并对其理化性质进行检测。设计的TYRR9直接抑制TYR活性的模式图参照图1所示。

1.根据设计的氨基酸序列：

Cys-Asn-Gly-Ile-Asn-Tyr-Arg-Trp-Cys，用固相合成法合成得到粗多肽；

2.将粗多肽通过HPLC反相柱层析脱盐纯化，鉴定其纯度，直到多肽的纯度不低于95％；

HPLC纯化及鉴定方法：将0.1mg待测样品溶于1mL含有0.1％三氟醋酸的超纯水中，若有不溶解的杂质，用0.45μm滤膜过滤，流动相A为0.1％三氟醋酸-水，流动相B为0.1％三氟醋酸-乙腈，待基线平稳后开始上样，上样量为50μL；色谱柱为硅胶烷基键合相C18柱(4.6mm×300mm，胶粒大小5μm，孔径大小为100A)，采用二元流动相梯度洗脱系统，进行梯度洗脱，即在30min内，流动相B在洗脱剂中的含量从0％-80％按线性关系增长，流速1mL/min，检测波长为215nm，并在25℃下测定。

3.通过等电聚焦电泳测定纯化后的多肽的等电点为8.06，并采用自动氨基酸测序仪测定纯化后多肽的氨基酸序列结构，确定为Cys-Asn-Gly-Ile-Asn-Tyr-Arg-Trp-Cys。

4.通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定其分子量为1128.2Da；

分子量的测定方法如下：将纯化后的多肽溶于去离子水中，配置成1μmol/mL的溶液，取10μL与等体积的饱和基质溶液(将α-氰基-4-羟基肉桂酸溶于含0.1％三氟醋酸的50％乙腈溶液中，制成饱和溶液，离心，取上清液)混合后测定。

5.进行多肽的复性；

将步骤2纯化获得的多肽溶解于复性缓冲液中(5mmol/L GSH和0.5mmol/L GSSG的0.1mol/L Tris-HCl，0.1mol/L NaCl)，浓度小于1％。使用pH 7.4，温度28℃。复性时间为24h。复性多肽使用C18 RP-HPLC分离纯化。C18柱(X BridgeTM BEH300 prep 10×250mm)，有机溶剂为乙腈(TEDIA)、TFA为挥发剂。溶剂A：0.1％TFA的超纯水溶液，溶剂B：0.1％TFA的乙腈溶液。

洗脱使用如下的线性浓度梯度：0-3min，B：5％；3-4min，B：5-20％；4-24min，B：20-40％；24-25min，B：40-100％。流速为1.5m L/min，上样量为0.5mg的合成多肽。

6.通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定复性后的分子量为1126.2Da；

方法：将纯化后的多肽溶于去离子水中，配置成1μmol/mL的溶液，取10μL与等体积的饱和基质溶液(将α-氰基-4-羟基肉桂酸溶于含0.1％三氟醋酸的50％乙腈溶液中，制成饱和溶液，离心，取上清液)混合后测定。

7.进行多肽的稳定性测试；

在强度较大酸碱水解情况下考察TYRR9的稳定性。酸降解条件：1M HCl在室温下处理多肽30min；碱降解条件1M NaOH在室温下处理多肽30min。处理TYRR9的浓度为1mg/mL。用前述HPLC鉴定方法鉴定TYRR9在强酸、强碱溶液中的稳定性。

对照组为：未与HCl孵育的多肽TYRR9。将多肽TYRR9溶于水中，常温放置30分钟。

实验结果参照图2所示。室温下，1mg/mL TYRR9在1M的HCl中孵育30分钟，样品稀释10倍测定色谱行为：与对照相(图2A)相比，实验组的色谱行为没有改变，未出现新杂质峰(图2B)。

室温下，TYRR9在1M的NaOH中孵育30分钟，测定色谱行为，样品稀释10倍测定色谱行为。对照组为：未与NaOH孵育的多肽TYRR9。将多肽TYRR9溶于水中，常温放置30分钟。与对照组相比色谱行为没有改变，未出现新杂质峰(图2C)。说明设计合成的具有TYR抑制功能的多肽TYRR9在强酸、强碱环境中都具有很好的稳定性。

8.测试多肽在脂性物质中的分散性

以多肽在TYRR9在羊毛脂中均一性和分散性测定为例。分别取1000g羊毛脂、1000mg上述纯化制备的TYRR9多肽，室温下在SHW/R型移动式高剪切乳化机中混合均匀，搅拌速度120转/min，搅拌30分钟。混匀后，分装成5mL每管。这种条件下TYRR9的理论含量为1mg/g。取分装20管，精密称取适量1g混合物(约相当TYRR9 0.1mg 10mL)量瓶中，加20％乙醇溶液，使溶解(必要时超声使溶解)并稀释至刻度，精密量取2mL用Folin酚法进行蛋白定量。

实验表明20份样品中TYRR9的平均含量为0.92±0.24mg/g，且每份样品含量范围均在理论含量的90％以内。说明设计的具有TYR抑制功能的多肽TYRR9在脂性环境中具有很好的分散性。

实施例2

本实施例提供了第二多肽(线状多肽，如下命名为MSHR9)的制备方法，并对其理化性质进行检测。

1.根据设计的氨基酸序列：

Cys-Tyr-Asp-Tyr-Lys-Asp-Tyr-Phe-Arg-Tyr-Ile，其中第2位和第4位的酪氨酸和赖氨酸为D-性氨基酸，其余为L-型氨基酸。用固相合成法合成得到粗多肽；

2.将粗多肽通过HPLC反相柱层析脱盐纯化，鉴定其纯度，直到多肽的纯度不低于95％；

HPLC纯化及鉴定方法：将0.1mg待测样品溶于1mL含有0.1％三氟醋酸的超纯水中，若有不溶解的杂质，用0.45μm滤膜过滤，流动相A为0.1％三氟醋酸-水，流动相B为0.1％三氟醋酸-乙腈，待基线平稳后开始上样，上样量为50μL；色谱柱为硅胶烷基键合相C18柱(4.6mm×300mm，胶粒大小5μm，孔径大小为100A)，采用二元流动相梯度洗脱系统，进行梯度洗脱，即在30min内，流动相B在洗脱剂中的含量从0％-80％按线性关系增长，流速1mL/min，检测波长215nmol/L，25℃下测定。

3.通过等电聚焦电泳测定纯化后的多肽的等电点为5.95。并采用自动氨基酸测序仪测定纯化后多肽的氨基酸序列结构，确定为Cys-Tyr-Asp-Tyr-Lys-Asp-Tyr-Ph-eArg-Tyr-Ile。

4.通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定其分子量为1770.2Da；

方法：将纯化后的多肽溶于去离子水中，配置成1μmol/mL的溶液，取10μL与等体积的饱和基质溶液(将α-氰基-4-羟基肉桂酸溶于含0.1％三氟醋酸的50％乙腈溶液中，制成饱和溶液，离心，取上清液)混合后测定。

5.测试多肽在脂性物质中的分散性；

以多肽在MSHR9在羊毛脂中均一性和分散性测定为例。分别取羊毛脂1000g、1000mg纯化的MSHR9多肽，室温条件下在SHW/R型移动式高剪切乳化机中混合均匀，搅拌速度120转/min，搅拌30分钟。混匀后，分装成每管5mL。这种条件下MSHR9的理论含量为1mg/g。取分装20管，精密称取适量1g混合物(约相当MSHR90.1mg 10mL)量瓶中，加20％乙醇溶液，使溶解(必要时超声使溶解)并稀释至刻度，精密量取2mL用Folin酚发进行蛋白定量。

实验表明20份样品中MSHR9的平均含量为0.92±0.37mg/g，且每份样品含量范围均在理论含量的90％以内。说明设计的具有α-MSH-MC1R结合抑制功能的多肽MSHR9在脂性环境中具有很好的分散性。

实施例3

本实施例提供了一种美白日霜。

其配方由如下质量百分比的组分组成：

水相：1,3-丁二醇6％，芦荟粉0.2％，熊果苷1.5％，TYRR9 0.1％，MSHR9 0.05％，卡波树脂0.2％，甘草酸二钾0.5％，水相乳化剂1％，防腐剂0.1。

油相：角鲨烷8％，鲸蜡醇7％；二苯酮—32％，油相乳化剂0.8％，防腐剂0.1％，VE1.2％，BHT 0.05％，香精0.1％。去离子水加至100％。

实施例4

本实施例提供了一种美白晚霜。

其配方由如下质量百分比的组分组成：

水相：1,3-丁二醇5％，芦荟粉0.2％，卡波树脂0.2％，水相乳化剂1％，角蛋白酶0.7％，促皮肤修复肽0.2％，TYRR9 0.1％，MSHR90.05％，防腐剂0.1％。

油相：液体石蜡3％，天然角鲨烷5％，鲸蜡醇6％，α-红没药醇0.5％，氮酮0.5％，油相乳化剂0.8％，防腐剂0.1％、BTH 0.05％，香精0.2％。去离子水加至100％。

实施例5

本实施例提供了一种美白面膜。

其配方由如下质量百分比的组分组成：

天然中草药萃取物3％，TYRR9 0.15％，MSHR9 0.1％，汉生胶0.3％，TiO₂ 3％，薄荷醇0.2％，丙三醇4％，高岭土7％，聚乙烯醇5％，防腐剂0.1％，香精0.1％，去离子水加至100％。

实验例1

本实验例测试多肽TYRR9的酪氨酸酶抑制活性。

将1mL 0μM，5μM,10μM,50μM,100μM,200uM浓度的TYRR9溶液分别加入到1mL酪氨酸酶(100IU)溶液中，37℃孵育10min，加入1mL 1.5mg/mL L-多巴溶液，混合均匀后，立即测定溶液在475nmol/L处的吸收值，每隔30s读数，持续10min。通过对测定数据进行拟合，计算斜率A1。采用同样方法计算当PBS(1/15mM，pH 6.8)缓冲液加入到该体系中后所测得的475nmol/L处吸收值数据拟合后的斜率A0，短肽对酪氨酸酶抑制率即为：TYRR9对酪氨酸酶抑制率(％)＝(A0-A1)/A0×100％拟合数据，得到TYRR9对酪氨酸酶活性的半数抑制浓度IC₅₀值。测定曲线参照图6所示。

结果表明，TYRR9具有较好的抑制酪氨酸酶活性的能力，其对酪氨酸酶活性的半数抑制浓度IC₅₀值为45.24μmol/L。

实验例2

本实验例测试多肽MSHR9抑制α-MSH-MC1R的结合作用。

1.采用表面等离子共振法检测多肽MSHR9抑制α-MSH-MC1R的结合的相互作用：

具体步骤如下所示：

a.CM5芯片活化：CM5芯片(GE Healthcare)装载到BIAcore3000(GE)表面等离子共振仪上后0.1M EDC和0.1M NHS的1:1的混合液以5μL/min的流速流经CM5芯片表面20min以活化芯片上偶联的羧基基团。

b.固定相蛋白偶联：用200μL偶联溶液醋酸钠(10mM，pH 5)稀释MC1R胞外区为20μg/mL的蛋白浓度；后以5μL/min的流速流经CM5芯片表面以偶联MC1R到芯片表面并使偶联的响应值达到2000RU。

c.封闭：固定相蛋白偶联后，75μL封闭液乙醇胺(1M，pH 8.5)流经芯片表面15min以封闭多余的活性位点。

d.结合抑制实验：芯片首先用HEPS-EP缓冲液(GE)以10μL/min的流速平衡20min；检测不同浓度的MSHR9(100，200，400nmol/L)对α-MSH(100nmol/L)与MC1R的结合的影响，以10μL/min的流速流经芯片表面以检测结合。

结合抑制实验结果如图3所示，MSHR9可抑制α-MSH与MC1R的结合，且呈剂量依赖关系。

2.测试不同浓度的α-MSH对B16黑素细胞MITF、TYR蛋白表达量的影响。

配制含浓度为10nmol/Lα-MSH的培养基，取对数生长期细胞，调节B16黑色素细胞密度为1×10⁵个/mL接种于3个6孔细胞培养板中，传代时添加含α-MSH的培养基，每组3个重复。设置添加不同MSHR9浓度(0、100、200nmol/L)试验组。37℃，5％CO₂培养箱培养，72h收集处理后的B16黑色素细胞，用PBS冲洗3次，每孔加入含有浓度为100μg/mL PMSF的裂解液提取细胞总蛋白质。测定总蛋白浓度，计算每个样品蛋白上样量。每孔上样量200μg将变性后的总蛋白质样品进行SDS-PAGE，浓缩胶电泳条件为恒压80V，当条带至分离胶时，将电压调至120V。电泳结束后，将蛋白条带转移至PVDF膜上。转膜结束后，将PVFD膜用5％封闭蛋白干粉TBST稀释的封闭液室温摇床上封闭1h。根据抗体说明书稀释一抗，将NC印迹膜放入孵育盒中，孵育一抗，4℃摇床过夜孵育。一抗孵育完成后，室温复温30min。然后TBST洗膜10min×3次，加入二抗，37℃摇床孵育1h。二抗孵育结束后，再次用TBST洗膜5min×6次，将PVDF膜印迹膜置于保鲜膜上，滤纸吸取多余的TBST溶液，滴加适量的配置好的ECL发光液，盖上保鲜膜，置X线暗盒中在暗室中曝光，获取图像。

用Image J软件对其进行半定量分析:测定印迹条带面积和灰度值，蛋白质总量＝条带面积×灰度值。

Western印迹结果显示(参照图4所示)，MSHR9浓度在100nmol/L和200nmol/L时，MITF蛋白表达量分别是对照组的0.80倍和0.61倍，且差异显著(P<0.05)。TYR蛋白表达量分别是对照组的0.85倍和0.52倍，且差异显著(P<0.05)。表明MSHR9可以显著抑制B16黑素细胞MITF、TYR蛋白表达。

实验例3

本实验例进行溶血性测定实验。

将采集的健康人血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成10⁷-10⁸细胞/mL的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液分别与溶解于生理盐水的促皮肤修复肽样品混合，37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，上清液于540nmol/L测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用Triton X-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比H％＝(A样品-A阴性对照)/A阳性对照×100％。

表1.多肽TYRR9和多肽MSHR9的溶血活性

HC₁₀和HC₅₀分别是引起人红细胞溶血10％和50％的多肽浓度。Hmax是最高肽浓度(320μg/mL)下溶血的百分比(％)μg/mL)。

表1结果表明：多肽TYRR9和多肽MSHR9在浓度为320μg/mL时的无溶血活性，不会引起人体红细胞破裂溶解而对人体产生伤害，因此，本发明提供的多肽TYRR9和多肽MSHR9具有在美白化妆品添加剂领域进一步的开发应用的前景。

实验例4

本实验例进行细胞毒性测定实验。

用MTT法检测多肽TYRR9和多肽MSHR9对人皮肤成纤维细胞HFF-1毒性。人皮肤成纤维细胞HFF-1购于昆明细胞库。先将成纤维细胞于含有15％胎牛血清以及双抗(青霉素和链霉素各100U/mL)的DMEM中培养，待细胞长满后，用0.25％的胰蛋白酶消化下来，用上述培养基洗两次，重新悬浮细胞，细胞计数后将细胞悬浮液100μL加入到96孔细胞培养板中，使每孔细胞数达到10⁵个。加入样品，对照组加入相同体积的灭菌超纯水，置37℃，5％CO₂培养箱内培养24h。培养结束后，96孔细胞培养板每孔加入20μL5mg/mL MTT溶液(用细胞培养PBS缓冲液配制)，继续培养5h，用注射器吸出孔中液体，每孔加入100μLDMSO，用移液枪吹打几次使紫色结晶完全溶解。酶标仪检测光吸收，测定波长490nmol/L，参考波长630nm。

表2.多肽TYRR9和多肽MSHR9对HFF-1细胞的毒性

结果如表2所示，多肽TYRR9和多肽MSHR9浓度为200μg/mL时的细胞毒性只有1.37％和4.13％(无统计学差异)，说明多肽TYRR9和多肽MSHR9对人皮肤成纤维细胞细胞毒性非常小，对人体正常皮肤细胞不会产生伤害，因此十分利于其进一步的开发应用。

实验例5

本实验例研究多肽TYRR9和多肽MSHR9对黑色素生成的影响。

复苏B16黑色素细胞，CO2培养箱静置培养，待细胞密度达到对数生长期时，以1×10⁵个/mL密度接种于3个6孔板中，24h后换液，37℃，5％CO₂培养箱培养。设置添加不同TYRR9(0、50、100μmol/L)和MSHR9浓度(0、100、200nmol/L)试验组。72h后弃培养基，每孔加入1mL消化液，37℃，5％CO2培养箱中消化3min，终止消化后离心弃上清，加入PBS重悬细胞，再次离心，重复3次，第3次细胞计数板计数，弃去PBS，每管加入0.2M NaOH溶液溶解黑色素细胞，将细胞溶解液移入1.5mL的EP管中，80℃金属浴加热5min。将黑色素细胞样品加入96孔酶标板中，每孔100μl，每个样品重复3次，做空白对照只加0.2M NaOH溶液。使用酶标仪在475nmol/L进行波长数值测量。黑色素含量等结果均“平均值±标准误(Means±SE)”表示。

实验组与对照组相比，TYRR9(50、100μmol/L)和MSHR9(100、200nmol/L)可以抑制黑色素生成(参照图5所示)。且TYRR9(100μmol/L)和MSHR9(200nmol/L)联合使用时，对黑色素的抑制效果更加明显。TYRR9在50μmol/L和100μmol/L时，黑色素表达量分别是对照组的0.72倍和0.55倍，且差异显著(P<0.05)。MSHR9在100nmol/L和200nmol/L时，黑色素表达量分别是对照组的0.82倍和0.68倍，且差异显著(P<0.05)。TYRR9(100μmol/L)和MSHR9(200nmol/L)联合使用时，黑色素表达量分别是对照组的0.46倍，且差异极其显著(P<0.01)。

实验例6

本实验例分别进行多肽TYRR9和多肽MSHR9美白功效的动物实验评价。

随机选择豚鼠(昆明医科大学实验动物中心)12只，选择棕色皮肤部位涂抹给药。褪掉背部相应区域的毛后，用UVB紫外照射，UVB紫外灯管照射波长为310nmol/L，累计照射总量2000mJ/cm²左右。每天照射1次，持续2周，停止照射后常规喂养1周。将豚鼠背部剃毛成两块2cm×2cm大小的去毛区，一块作为给药区域，每次用移液枪涂抹TYRR9(100μmol/L)(组1)、MSHR9(200nmol/L)(组2)溶液或者TYRR9(100μmol/L)和MSHR9(200nmol/L)(组3)混合溶液50μl，每日2次；另一块作为空白对照区域，每次涂抹PBS缓冲液50μL。每次给药前均用剃须刀剃毛，连续给药30天后，取皮肤组织，10％的中性甲醛溶液固定，常规石蜡切片。组织切片经过多巴染色或氨银染色后，显微照相，并对其进行光密度分析。

由表3和表4可知，在豚鼠皮肤上连续涂抹TYRR9和MSHR9多肽30天后，经过L-多巴染色或氨银染色的皮肤切片中光密度/黑素细胞面积值(表3)和光密度/切片面积值(表4)与对照组相比均有明显下降，统计数据具有显著性差异，这表明多肽TYRR9和MSHR9能够有效地抑制皮肤内黑素的生成，具有较好的美白功效。

表3涂抹多肽TYRR9和MSHR9后光密度/黑素细胞面积变化

注：**表示P<0.01。

表4涂抹多肽TYRR9和MSHR9后光密度/切片面积变化

注：**表示P<0.01。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川丽妍工坊生物科技有限公司

<120> 一种黑素抑制剂、制备方法及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Cys Asn Gly Ile Asn Tyr Arg Trp Cys

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Cys Tyr Tyr Lys Tyr Phe Arg Tyr Ile

1 5

Claims (15)

1.一种黑素抑制剂，其特征在于，其包括如下至少一种的多肽：

第一多肽和第二多肽；所述第一多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的黑素抑制剂，其特征在于，所述第一多肽中的第1位的半胱氨酸与第9位的半胱氨酸以二硫键连接以使所述第一多肽为环状。

3.根据权利要求1或2所述的黑素抑制剂，其特征在于，所述第二多肽中的第2位的酪氨酸和第5位的赖氨酸分别为D-酪氨酸和D-赖氨酸。

4.一种如权利要求1-3任意一项所述的黑素抑制剂在制备美白产品中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，当所述黑素抑制剂含第一多肽而不含第二多肽时，所述黑素抑制剂用于抑制酪氨酸酶的活性；

当所述黑素抑制剂含第二多肽时，所述黑素抑制剂用于抑制α-MSH-MC1R信号通路。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抑制α-MSH-MC1R信号通路是指：抑制α-MSH与其受体MC1R的结合。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述美白产品为美白医药产品或化妆品。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述化妆品为洗面乳、化妆水、精华液或精华霜。

9.一种多肽组合物，其特征在于，其包括权利要求1-3任意一项所述的黑素抑制剂、化妆品辅料和其他化妆品原料。

10.根据权利要求9所述的多肽组合物，其特征在于，所述化妆品辅料选自如下至少一种的辅料：

保湿剂、乳化剂、矿物油、植物油、增稠剂、pH调节剂、香精和防腐剂。

11.一种如权利要求1-3任意一项所述的黑素抑制剂的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：采用固相合成的方法或重组表达的方法合成第一多肽和/或第二多肽。

12.根据权利要求11所述的黑素抑制剂的制备方法，其特征在于，当采用固相合成的方法时，先合成第一多肽或第二多肽的粗多肽，然后将所述粗多肽进行高级结构的复性折叠。

13.根据权利要求12所述的黑素抑制剂的制备方法，其特征在于，所述复性折叠是采用谷胱甘肽氧化还原法复性。

14.根据权利要求12所述的黑素抑制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将所述复性折叠的多肽进行纯化。

15.根据权利要求14所述的黑素抑制剂的制备方法，其特征在于，所述纯化是通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。