CA2569552A1 - Methode de detection du staphylocoque dore resistant a la methicilline (sarm) - Google Patents
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Description
MÉTHODE DE DÉTECTION DU STAPHYLOCOQUE DORÉ
RÉSISTANT A LA MÉTHICILLINE (SARM) DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne une méthode de détection d'une bactérie résistante à
un antibiotique. De préférence, la méthode cherche à détecter le Staphylocoque doré, résistant à la méthicilline.
DESCRIPTION DE L'ART ANTÉRIEUR
Depuis l'apparition de la première souche de Staphylocoque doré résistante à
la méthicilline (SARM) en milieux hospitalier en 1961, on observe une augmentation accrue des cas d'infections dû à ce micro-organisme autant en milieux hospitalier que dans la communauté en général. La méthode standard de culture sur milieu sélectif MSA4 nécessite entre 24 et 72 heures et ne permet pas un diagnostic rapide et efficace.
Il est connu par une personne versée dans l'art que la résistance du Staphylocoque doré à la méthicilline est signalée par la présence d'une séquence d'ADN
spécifique, le transposon mccA, à un endroit spécifique du gène orfX de cette bactérie. Le transposon mccA est effectivement une cassette d'ADN qui s'insère de façon préférentielle dans le gène orfX à un endroit spécifique. II est connu qu'il existe cinq (5) variantes du transposon mccA. Toutefois, il faut savoir que quelque soit la variante du transposon mccA se retrouvant dans le génome du Staphylocoque doré, l'endroit où le transposon mccA, ou une variante de cette dernière, s'insère dans le gène orfX demeurera le même.
De plus, la technique d'amplification en chaîne par la polymérase (PCR) développée
RÉSISTANT A LA MÉTHICILLINE (SARM) DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne une méthode de détection d'une bactérie résistante à
un antibiotique. De préférence, la méthode cherche à détecter le Staphylocoque doré, résistant à la méthicilline.
DESCRIPTION DE L'ART ANTÉRIEUR
Depuis l'apparition de la première souche de Staphylocoque doré résistante à
la méthicilline (SARM) en milieux hospitalier en 1961, on observe une augmentation accrue des cas d'infections dû à ce micro-organisme autant en milieux hospitalier que dans la communauté en général. La méthode standard de culture sur milieu sélectif MSA4 nécessite entre 24 et 72 heures et ne permet pas un diagnostic rapide et efficace.
Il est connu par une personne versée dans l'art que la résistance du Staphylocoque doré à la méthicilline est signalée par la présence d'une séquence d'ADN
spécifique, le transposon mccA, à un endroit spécifique du gène orfX de cette bactérie. Le transposon mccA est effectivement une cassette d'ADN qui s'insère de façon préférentielle dans le gène orfX à un endroit spécifique. II est connu qu'il existe cinq (5) variantes du transposon mccA. Toutefois, il faut savoir que quelque soit la variante du transposon mccA se retrouvant dans le génome du Staphylocoque doré, l'endroit où le transposon mccA, ou une variante de cette dernière, s'insère dans le gène orfX demeurera le même.
De plus, la technique d'amplification en chaîne par la polymérase (PCR) développée
2 récemment a permis de réduire le temps à quelques heures mais les coûts reliés à
cette nouvelle technologie sont encore dispendieux.
Il existe donc un besoin pour de nouveaux tests ou méthodes pour le dépistage de bactéries résistantes aux antibiotiques telle que le SARM.
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 est un histogramme obtenu à partir des valeurs de fluorescence médiane 1 o des résultats rapportés à l'Exemple 1.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
De façon générale, l'invention concerne une méthode de détection d'une bactérie résistante à un antibiotique comme par exemple, le Staphylocoque doré
résistant à la méthicilline, la présente méthode comprenant les étapes suivantes:
- Amplification par réaction en chaîne par polymérase (PCR) d'au moins une région d'ADN du Staphylocoque doré pour obtenir un produit PCR, la région ciblée signalant la résistance du Staphylocoque doré à la méthicilline;
- Hybridation du produit PCR à des sondes couplées à des microsphères;
- Détection de la présence ou l'absence d'un complexe comprenant le produit PCR avec les sondes couplées à des microsphères;
et dans laquelle la détection de la présence d'un complexe produit PCR/sonde est indicatif que ladite bactérie est résistante à ladite méthicilline.
De préférence, deux régions d'ADN d'une bactérie sont ciblées. Une première région génique est caractéristique de la bactérie elle-même, la bactérie étant le Staphylocoque doré. Une deuxième région génique est associée à la résistance à
un antibiotique, ledit antibiotique étant la méthicilline.
cette nouvelle technologie sont encore dispendieux.
Il existe donc un besoin pour de nouveaux tests ou méthodes pour le dépistage de bactéries résistantes aux antibiotiques telle que le SARM.
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 est un histogramme obtenu à partir des valeurs de fluorescence médiane 1 o des résultats rapportés à l'Exemple 1.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
De façon générale, l'invention concerne une méthode de détection d'une bactérie résistante à un antibiotique comme par exemple, le Staphylocoque doré
résistant à la méthicilline, la présente méthode comprenant les étapes suivantes:
- Amplification par réaction en chaîne par polymérase (PCR) d'au moins une région d'ADN du Staphylocoque doré pour obtenir un produit PCR, la région ciblée signalant la résistance du Staphylocoque doré à la méthicilline;
- Hybridation du produit PCR à des sondes couplées à des microsphères;
- Détection de la présence ou l'absence d'un complexe comprenant le produit PCR avec les sondes couplées à des microsphères;
et dans laquelle la détection de la présence d'un complexe produit PCR/sonde est indicatif que ladite bactérie est résistante à ladite méthicilline.
De préférence, deux régions d'ADN d'une bactérie sont ciblées. Une première région génique est caractéristique de la bactérie elle-même, la bactérie étant le Staphylocoque doré. Une deuxième région génique est associée à la résistance à
un antibiotique, ledit antibiotique étant la méthicilline.
3 Ainsi, de préférence, la première région génique ciblée est une partie du gène orfX.
La deuxième région génique ciblée est une séquence d'ADN correspondant à une partie de la séquence d'un transposon appelé mccA.
Il vaut bien également noter que l'invention décrit également une méthode peu coûteuse, exportable, modulable et applicable au dépistage de bactéries résistantes à un antibiotique et plus particulièrement au SARM.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
Les coûts des tests de dépistage étant très élevés, un moyen de mettre au point un test peu coûteux à partir des outils présentement disponibles dans le domaine des nanotechnologies est visé, surtout dans le cadre d'une augmentation accrue des cas d'infections dues à certains micro-organismes autant en milieux hospitalier que dans la communauté en général. La présente invention permettra donc de diminuer les coûts des analyses et minimisera les délais pour l'obtention des résultats.
La présente invention concerne une méthode de détection d'une bactérie résistante à
un antibiotique, ladite bactérie étant de préférence le Staphylocoque doré
résistant à
la méthicilline, et la méthode comprenant les étapes suivantes:
- Amplification par réaction en chaîne par polymérase (PCR) d'au moins une région d'ADN du Staphylocoque doré pour obtenir un produit PCR, la région ciblée signalant la résistance du Staphylocoque doré à la méthicilline;
- Hybridation du produit PCR à des sondes couplées à des microsphères;
- Détection de la présence ou l'absence d'un complexe comprenant le produit PCR avec les sondes couplées à des microsphères;
et dans laquelle la détection de la présence d'un complexe produit PCR/sonde
La deuxième région génique ciblée est une séquence d'ADN correspondant à une partie de la séquence d'un transposon appelé mccA.
Il vaut bien également noter que l'invention décrit également une méthode peu coûteuse, exportable, modulable et applicable au dépistage de bactéries résistantes à un antibiotique et plus particulièrement au SARM.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
Les coûts des tests de dépistage étant très élevés, un moyen de mettre au point un test peu coûteux à partir des outils présentement disponibles dans le domaine des nanotechnologies est visé, surtout dans le cadre d'une augmentation accrue des cas d'infections dues à certains micro-organismes autant en milieux hospitalier que dans la communauté en général. La présente invention permettra donc de diminuer les coûts des analyses et minimisera les délais pour l'obtention des résultats.
La présente invention concerne une méthode de détection d'une bactérie résistante à
un antibiotique, ladite bactérie étant de préférence le Staphylocoque doré
résistant à
la méthicilline, et la méthode comprenant les étapes suivantes:
- Amplification par réaction en chaîne par polymérase (PCR) d'au moins une région d'ADN du Staphylocoque doré pour obtenir un produit PCR, la région ciblée signalant la résistance du Staphylocoque doré à la méthicilline;
- Hybridation du produit PCR à des sondes couplées à des microsphères;
- Détection de la présence ou l'absence d'un complexe comprenant le produit PCR avec les sondes couplées à des microsphères;
et dans laquelle la détection de la présence d'un complexe produit PCR/sonde
4 est indicatif que ladite bactérie est résistante à ladite méthicilline.
L'invention vise donc à pouvoir détecter la présence d'au moins une région du génome d'une bactérie, le Staphylocoque doré, afin d'identifier si la bactérie est résistante à un antibiotique, cet antibiotique étant la méthicilline.
Une personne versée dans l'art comprendra également qu'un antibiotique est toute substance chimique produite par des micro-organismes ayant le pouvoir d'inhiber et même de détruire les bactéries et autres micro-organismes en solution diluée.
Il aussi lo connu par une personne versée dans l'art qu'un antibiotique peut être obtenu en laboratoire par synthèse ou semi-synthèse. D'une part, un antibiotique synthétique est obtenu soit à partir de dérivés artificiels, soit en recréant des substances primitivement extraites de micro-organismes. D'autre part, un antibiotique semi-synthétique est obtenu en modifiant en laboratoire une substance produite par un micro-organisme. Il est aussi connu par une personne de l'art que l'étendue de l'activité antibactérienne d'un antibiotique définit son spectre. Ainsi, plus un antibiotique détruit de types de bactéries différentes, plus son spectre est large.
Toutefois, pour les fins de la présente invention, l'antibiotique qui sera considéré est la méthicilline.
Il est entendu que les échantillons à partir desquels l'étape d'amplification du génome de la bactérie visée est effectuée sont obtenus à partir d'un échantillon d'ADN, prélevé de préférence à partir des canaux nasaux d'un sujet étudié. Ce spécimen est préférentiellement traité afin d'isoler l'ADN génomique et de préférence purifié par lyse cellulaire à l'aide d'une solution de lyse à base de détergents anioniques. Une personne versée dans l'art connaîtra d'autres méthodes d'isolement et de purification d'ADN et ces dernières peuvent bien sûr s'appliquer.
Selon un mode préféré de l'invention, l'étape d'amplification d'au moins une région d'ADN du Staphylocoque doré se fait par PCR à l'aide d'amorces spécifiques à
ce génome (voir Table 2). Les régions géniques bactériennes ciblées pour l'amplification par PCR se retrouvent de préférence sur deux régions d'ADN, tels sur une première et une deuxième région géniques. La première région génique ciblée pour la
L'invention vise donc à pouvoir détecter la présence d'au moins une région du génome d'une bactérie, le Staphylocoque doré, afin d'identifier si la bactérie est résistante à un antibiotique, cet antibiotique étant la méthicilline.
Une personne versée dans l'art comprendra également qu'un antibiotique est toute substance chimique produite par des micro-organismes ayant le pouvoir d'inhiber et même de détruire les bactéries et autres micro-organismes en solution diluée.
Il aussi lo connu par une personne versée dans l'art qu'un antibiotique peut être obtenu en laboratoire par synthèse ou semi-synthèse. D'une part, un antibiotique synthétique est obtenu soit à partir de dérivés artificiels, soit en recréant des substances primitivement extraites de micro-organismes. D'autre part, un antibiotique semi-synthétique est obtenu en modifiant en laboratoire une substance produite par un micro-organisme. Il est aussi connu par une personne de l'art que l'étendue de l'activité antibactérienne d'un antibiotique définit son spectre. Ainsi, plus un antibiotique détruit de types de bactéries différentes, plus son spectre est large.
Toutefois, pour les fins de la présente invention, l'antibiotique qui sera considéré est la méthicilline.
Il est entendu que les échantillons à partir desquels l'étape d'amplification du génome de la bactérie visée est effectuée sont obtenus à partir d'un échantillon d'ADN, prélevé de préférence à partir des canaux nasaux d'un sujet étudié. Ce spécimen est préférentiellement traité afin d'isoler l'ADN génomique et de préférence purifié par lyse cellulaire à l'aide d'une solution de lyse à base de détergents anioniques. Une personne versée dans l'art connaîtra d'autres méthodes d'isolement et de purification d'ADN et ces dernières peuvent bien sûr s'appliquer.
Selon un mode préféré de l'invention, l'étape d'amplification d'au moins une région d'ADN du Staphylocoque doré se fait par PCR à l'aide d'amorces spécifiques à
ce génome (voir Table 2). Les régions géniques bactériennes ciblées pour l'amplification par PCR se retrouvent de préférence sur deux régions d'ADN, tels sur une première et une deuxième région géniques. La première région génique ciblée pour la
5 détection du SARM est celle qui est caractéristique du Staphylocoque doré et correspond à une partie de la séquence d'ADN du gène orfX. La deuxième région génique ciblée pour la détection du SARM est celle qui signalera la résistance du Staphylocoque doré à un antibiotique, cet antibiotique étant la méthicilline.
Or, la deuxième région génique ciblée correspond à une partie de la séquence d'ADN du lo transposon mccA.
Il est connu par une personne versée dans l'art que les transposons sont des séquences d'ADN qui peuvent se déplacer à différentes positions dans le génome d'une seule cellule à travers le mécanisme de la transposition. Pour les fins de la présente invention, il faut savoir que le transposon mccA peut avoir au moins cinq (5) variantes (qui seront appelées "MAl", "MA2", "MA3., "MA4. et "MA5" dans la description de la présente invention). Ainsi, quelque soit la variante du transposon mccA se retrouvant dans le génome du Staphylocoque doré, l'endroit où le transposon mccA, ou une variante de cette dernière, s'insère dans le gène orfX
2 o demeurera le même et cette caractéristique permettra ainsi de détecter la présence de la résistance du Staphylocoque doré à la méthicilline Ainsi, selon un mode préféré de l'invention, le transposon mccA peut se déplacer d'un Staphylocoque doré à un autre et lorsque le transposon mccA est à un endroit ou à
une position qui chevauche le gène orfX, la résistance du Staphylocoque doré à
la méthicilline est signalée.
Ainsi, selon un mode préféré de l'invention, l'étape d'amplification d'au moins une région du génome du Staphylocoque doré se fait par PCR à l'aide d'amorces
Or, la deuxième région génique ciblée correspond à une partie de la séquence d'ADN du lo transposon mccA.
Il est connu par une personne versée dans l'art que les transposons sont des séquences d'ADN qui peuvent se déplacer à différentes positions dans le génome d'une seule cellule à travers le mécanisme de la transposition. Pour les fins de la présente invention, il faut savoir que le transposon mccA peut avoir au moins cinq (5) variantes (qui seront appelées "MAl", "MA2", "MA3., "MA4. et "MA5" dans la description de la présente invention). Ainsi, quelque soit la variante du transposon mccA se retrouvant dans le génome du Staphylocoque doré, l'endroit où le transposon mccA, ou une variante de cette dernière, s'insère dans le gène orfX
2 o demeurera le même et cette caractéristique permettra ainsi de détecter la présence de la résistance du Staphylocoque doré à la méthicilline Ainsi, selon un mode préféré de l'invention, le transposon mccA peut se déplacer d'un Staphylocoque doré à un autre et lorsque le transposon mccA est à un endroit ou à
une position qui chevauche le gène orfX, la résistance du Staphylocoque doré à
la méthicilline est signalée.
Ainsi, selon un mode préféré de l'invention, l'étape d'amplification d'au moins une région du génome du Staphylocoque doré se fait par PCR à l'aide d'amorces
6 spécifiques aux régions ciblées du génome (voir Table 2), et de préférence, aux première et deuxième régions géniques soit celles correspondant respectivement aux parties des gènes orfX et mccA. Ainsi, lors de la réaction PCR, les amorces spécifiques aux régions déterminées contribuent à l'amplification d'au moins une région du génome du Staphylocoque doré, et ce, dans des conditions d'amplification favorisant la production de grandes quantités de fragments d'ADN, soient les produits du PCR. Chaque produit du PCR peut être d'une longueur d'environ 200 nucléotides.
De préférence, les amorces utilisées pour la réaction PCR peuvent servir à
amplifier 1o plus une séquence d'ADN correspondant à plus d'une variante du transposon mccA.
Par conséquent, les amorces créées pour amplifier des séquences correspondant à
une partie de chacune des séquences des variantes MAl, MA2, MA3, MA4 et MA5 peuvent participer ensemble à la réaction PCR afin de détecter la présence du SARM.
Aussi, selon un mode préféré de l'invention, au moins une des amorces utilisées a également été modifiée afin de comprendre une modification terminale à
l'extrémité
5'. Selon un mode préféré de l'invention, l'extrémité 5' de l'amorce est liée à une molécule terminale, comme par exemple la biotine. La molécule terminale est choisie parmi des molécules qui ont une affinité particulière et connue à une autre protéine. Il est connu par une personne versée dans l'art que la vitamine biotine a une très forte affinité pour une protéine bactérienne, la streptavidine. La combinaison streptavidine-biotine peut être utilisée pour lier deux molécules, telles que des ligands à
des récepteurs, par exemple. Une personne versée dans l'art comprendra que d'autres modifications terminales peuvent être apportés aux amorces afin de leur accorder, à
leur terminaison 5', un élément d'une telle combinaison. Aussi selon un mode préféré
de l'invention, la modification terminale à l'extrémité 5' sera effectuée sur l'amorce ciblant la première région génomique ainsi que sur l'amorce spécifique à la deuxième région génomique.
De préférence, les amorces utilisées pour la réaction PCR peuvent servir à
amplifier 1o plus une séquence d'ADN correspondant à plus d'une variante du transposon mccA.
Par conséquent, les amorces créées pour amplifier des séquences correspondant à
une partie de chacune des séquences des variantes MAl, MA2, MA3, MA4 et MA5 peuvent participer ensemble à la réaction PCR afin de détecter la présence du SARM.
Aussi, selon un mode préféré de l'invention, au moins une des amorces utilisées a également été modifiée afin de comprendre une modification terminale à
l'extrémité
5'. Selon un mode préféré de l'invention, l'extrémité 5' de l'amorce est liée à une molécule terminale, comme par exemple la biotine. La molécule terminale est choisie parmi des molécules qui ont une affinité particulière et connue à une autre protéine. Il est connu par une personne versée dans l'art que la vitamine biotine a une très forte affinité pour une protéine bactérienne, la streptavidine. La combinaison streptavidine-biotine peut être utilisée pour lier deux molécules, telles que des ligands à
des récepteurs, par exemple. Une personne versée dans l'art comprendra que d'autres modifications terminales peuvent être apportés aux amorces afin de leur accorder, à
leur terminaison 5', un élément d'une telle combinaison. Aussi selon un mode préféré
de l'invention, la modification terminale à l'extrémité 5' sera effectuée sur l'amorce ciblant la première région génomique ainsi que sur l'amorce spécifique à la deuxième région génomique.
7 Selon un mode préféré de l'invention, l'étape de l'hybridation des produits PCR est précédée par la liaison des sondes spécifiques à des microsphères. Les sondes sont spécifiques en ce qu'elles correspondent à des sous-régions déterminées à
partir de la première et de la deuxième région géniques du Staphylocoque doré. La première et la deuxième sous-région génique sont comprises de préférence dans la séquence du gène orfX. Ainsi, préférentiellement, une première sonde comprend une séquence pour identifier la première sous-région génique. Cette première sonde est listée à la Table 3 comme étant OXSAS-1. Une deuxième sonde comprend une séquence pour lo identifier la deuxième sous-région génique correspondant à une partie du produit PCR dérivé de la séquence du transposon mccA et à une partie du gène orfX. De préférence, cette deuxième sonde est listée à la Table 3 comme étant MASS-2.
Les sondes comportent également, de préférence, une modification à l'extrémité
5'.
Cette modification est préférablement de type "5'Uni-link amino" afin de permettre à
la sonde de se lier aux groupements hydroxyles à la surface des microsphères, mais une personne versée dans l'art comprendra que d'autres types de modifications peuvent réaliser le même objectif. Ainsi, une fois qu'elles seront liées aux microsphères, les sondes spécifiques auront pour tâche d'identifier les produits du PCR obtenus lors de l'étape de l'amplification et de s'y lier par hybridation.
Selon un autre mode préféré de l'invention, chacune des microsphères peut se définir généralement comme étant un excipient sous forme de petite sphère dont le diamètre est compris entre quelques microns et un millimètre, solide et pleine, ayant à
sa surface une substance adhésive, de préférence le polystyrène, et dans laquelle des principes actifs, de préférence au nombre de deux, sont dissous ou dispersés.
Les principes actifs sont généralement ajoutés selon une quantité prédéfinie, selon la technique de marquage de la microsphère qui s'ensuivra. Les microsphères sont disponibles chez de nombreux fournisseurs et sont choisies parmi 100 microsphères
partir de la première et de la deuxième région géniques du Staphylocoque doré. La première et la deuxième sous-région génique sont comprises de préférence dans la séquence du gène orfX. Ainsi, préférentiellement, une première sonde comprend une séquence pour identifier la première sous-région génique. Cette première sonde est listée à la Table 3 comme étant OXSAS-1. Une deuxième sonde comprend une séquence pour lo identifier la deuxième sous-région génique correspondant à une partie du produit PCR dérivé de la séquence du transposon mccA et à une partie du gène orfX. De préférence, cette deuxième sonde est listée à la Table 3 comme étant MASS-2.
Les sondes comportent également, de préférence, une modification à l'extrémité
5'.
Cette modification est préférablement de type "5'Uni-link amino" afin de permettre à
la sonde de se lier aux groupements hydroxyles à la surface des microsphères, mais une personne versée dans l'art comprendra que d'autres types de modifications peuvent réaliser le même objectif. Ainsi, une fois qu'elles seront liées aux microsphères, les sondes spécifiques auront pour tâche d'identifier les produits du PCR obtenus lors de l'étape de l'amplification et de s'y lier par hybridation.
Selon un autre mode préféré de l'invention, chacune des microsphères peut se définir généralement comme étant un excipient sous forme de petite sphère dont le diamètre est compris entre quelques microns et un millimètre, solide et pleine, ayant à
sa surface une substance adhésive, de préférence le polystyrène, et dans laquelle des principes actifs, de préférence au nombre de deux, sont dissous ou dispersés.
Les principes actifs sont généralement ajoutés selon une quantité prédéfinie, selon la technique de marquage de la microsphère qui s'ensuivra. Les microsphères sont disponibles chez de nombreux fournisseurs et sont choisies parmi 100 microsphères
8 disponibles. Le choix des microsphères est déterminé de façon aléatoire car elles sont pratiquement toutes identiques ou similaires. De plus, il est à noter qu'une personne versée dans l'art saura que la substance adhésive à la surface de la microsphère peut être d'un autre type de molécule, comme par exemple un ligand, un anticorps ou une protéine.
Selon un mode préféré de l'invention, les principes actifs qui sont dissous ou dispersés dans chacune des microsphères sont des chromophores. Les chromophores sont généralement des molécules colorées, pouvant faire partie de la lo famille des nitrés, des monoazoiques, des diazoiques, des triphenylméthanes, des quinoneimines, des xanthènes et des anthraquinones. La liste de ces familles de chromophores n'est pas exhaustive. Les principes actifs, de préférence des chromophores rouge et orange sont mélangés dans la microsphère et excités à
l'aide d'un laser diode à 635 nM-10mW lors de l'étape de la détection par l'appareil cytofluorométrique. La couleur qui sera observée lors de l'étape de la détection et de la quantification des microsphères est due à un phénomène de résonance entre une double liaison chimique et la lumière d'excitation du chromophore choisi.
L'utilisation d'un chromophore pour la détection d'une microsphère n'est pas l'unique moyen de marquer ces microsphères. Effectivement, si un appareil de détection le permet, un autre type de principe actif pourra être utilisé. Par exemple, une personne versée dans l'art reconnaîtra qu'un principe actif de nature radioactive, magnétique, thermique ou autre, par exemple, peut être utilisé afin de détecter un produit PCR/sonde.
Ainsi, encore selon un mode préféré de l'invention, les sondes sont couplées aux microsphères choisies. L'étape de l'hybridation des produits du PCR aux sondes couplées à des microsphères peut ensuite être complétée afin de produire des complexes comprenant les produits du PCR liées aux sondes couplées à des microsphères. Après l'hybridation, ces complexes sont récupérés par centrifugation et
Selon un mode préféré de l'invention, les principes actifs qui sont dissous ou dispersés dans chacune des microsphères sont des chromophores. Les chromophores sont généralement des molécules colorées, pouvant faire partie de la lo famille des nitrés, des monoazoiques, des diazoiques, des triphenylméthanes, des quinoneimines, des xanthènes et des anthraquinones. La liste de ces familles de chromophores n'est pas exhaustive. Les principes actifs, de préférence des chromophores rouge et orange sont mélangés dans la microsphère et excités à
l'aide d'un laser diode à 635 nM-10mW lors de l'étape de la détection par l'appareil cytofluorométrique. La couleur qui sera observée lors de l'étape de la détection et de la quantification des microsphères est due à un phénomène de résonance entre une double liaison chimique et la lumière d'excitation du chromophore choisi.
L'utilisation d'un chromophore pour la détection d'une microsphère n'est pas l'unique moyen de marquer ces microsphères. Effectivement, si un appareil de détection le permet, un autre type de principe actif pourra être utilisé. Par exemple, une personne versée dans l'art reconnaîtra qu'un principe actif de nature radioactive, magnétique, thermique ou autre, par exemple, peut être utilisé afin de détecter un produit PCR/sonde.
Ainsi, encore selon un mode préféré de l'invention, les sondes sont couplées aux microsphères choisies. L'étape de l'hybridation des produits du PCR aux sondes couplées à des microsphères peut ensuite être complétée afin de produire des complexes comprenant les produits du PCR liées aux sondes couplées à des microsphères. Après l'hybridation, ces complexes sont récupérés par centrifugation et
9 re-suspendues dans une solution contenant un agent combiné.
De préférence, cet agent combiné comprend deux éléments, un premier et un deuxième élément. Le premier élément est généralement une protéine, ayant une forte affinité complémentaire à la molécule terminale se retrouvant sur les produits du PCR, et est de préférence la streptavidine. Le deuxième élément est lié au premier élément. Le deuxième élément est un autre chromophore de longueur d'onde distincte des chromophores utilisés comme agents actifs dans la microsphère.
De préférence, le deuxième élément est la R-phycoérythine (aussi connu sous le nom lo d"'Alexa 532" ou "Cy3") qui est excité à une longueur d'onde de 532 nm-13 mW par un laser yttrium aluminium garnet ("YAG"). Ainsi, lorsque l'agent combiné se lie au complexe produit PCR/sonde par le lien d'affinité très puissant entre la première partie de l'agent combiné et la modification terminale 5' du produit PCR, il est possible d'effectuer la détection et la quantification des complexes afin de déterminer la présence ou l'absence d'un produit du PCR, ce qui permet de déterminer la présence ou l'absence du SARM.
Selon un mode préféré de l'invention, la détection des complexes produit PCR/sonde s'effectue dans un appareil permettant la détection simultanée par laser d'un complexe lié à un agent combiné. Cet appareil est de préférence un cytofluoromètre.
Ainsi, l'étape de la détection permet d'identifier, de préférence par mesure de la fluorescence des chromophores, la présence des microsphères et la présence ou l'absence du deuxième élément de l'agent combiné. Plus précisément, la fluorescence des chromophores, ces derniers comprenant, de préférence, les principes actifs dissous dans la microsphère d'une part et le chromophore constituant le deuxième élément de l'agent combiné d'autre part, signalera la présence des régions d'ADN ciblées La présence de la première région génique et de la deuxième région génique seront ainsi identifiées et la présence du SARM pourra être déterminée.
Une personne dans le domaine comprendra que l'étape de détection de la présente méthode implique une étape de quantification des complexes, laquelle peut être calculée, par exemple, par une valeur médiane de la fluorescence des 5 chromophores. Dans le cas où l'invention est réalisée à l'aide d'un cytofluoromètre de marque LUMINEXO, la réalisation simultanée, dans une seule réaction, de 100 tests sur 96 échantillons différents, sera permise, ce qui en fait un calibre idéal pour les besoins de dépistage d'un nombre restreint de gènes ou régions géniques. Une personne versée dans l'art comprendra qu'un autre type d'appareil peut réaliser le
De préférence, cet agent combiné comprend deux éléments, un premier et un deuxième élément. Le premier élément est généralement une protéine, ayant une forte affinité complémentaire à la molécule terminale se retrouvant sur les produits du PCR, et est de préférence la streptavidine. Le deuxième élément est lié au premier élément. Le deuxième élément est un autre chromophore de longueur d'onde distincte des chromophores utilisés comme agents actifs dans la microsphère.
De préférence, le deuxième élément est la R-phycoérythine (aussi connu sous le nom lo d"'Alexa 532" ou "Cy3") qui est excité à une longueur d'onde de 532 nm-13 mW par un laser yttrium aluminium garnet ("YAG"). Ainsi, lorsque l'agent combiné se lie au complexe produit PCR/sonde par le lien d'affinité très puissant entre la première partie de l'agent combiné et la modification terminale 5' du produit PCR, il est possible d'effectuer la détection et la quantification des complexes afin de déterminer la présence ou l'absence d'un produit du PCR, ce qui permet de déterminer la présence ou l'absence du SARM.
Selon un mode préféré de l'invention, la détection des complexes produit PCR/sonde s'effectue dans un appareil permettant la détection simultanée par laser d'un complexe lié à un agent combiné. Cet appareil est de préférence un cytofluoromètre.
Ainsi, l'étape de la détection permet d'identifier, de préférence par mesure de la fluorescence des chromophores, la présence des microsphères et la présence ou l'absence du deuxième élément de l'agent combiné. Plus précisément, la fluorescence des chromophores, ces derniers comprenant, de préférence, les principes actifs dissous dans la microsphère d'une part et le chromophore constituant le deuxième élément de l'agent combiné d'autre part, signalera la présence des régions d'ADN ciblées La présence de la première région génique et de la deuxième région génique seront ainsi identifiées et la présence du SARM pourra être déterminée.
Une personne dans le domaine comprendra que l'étape de détection de la présente méthode implique une étape de quantification des complexes, laquelle peut être calculée, par exemple, par une valeur médiane de la fluorescence des 5 chromophores. Dans le cas où l'invention est réalisée à l'aide d'un cytofluoromètre de marque LUMINEXO, la réalisation simultanée, dans une seule réaction, de 100 tests sur 96 échantillons différents, sera permise, ce qui en fait un calibre idéal pour les besoins de dépistage d'un nombre restreint de gènes ou régions géniques. Une personne versée dans l'art comprendra qu'un autre type d'appareil peut réaliser le
10 même objectif et que le type d'appareil utilisé dépendra de la nature de la modification terminale à l'extrémité 5' effectuée sur les amorces et sur le premier élément de l'agent combiné.
Selon un mode préféré de l'invention, la quantification des complexes produit PCR/sonde permet d'établir rapport de la fluorescence entre les complexes qui ont comme produit du PCR le produit de l'amplification de la première région génique et de la deuxième région génique et ainsi d'identifier a présence du SARM.
L'invention s'étend à la méthode exécutée dans des plaques de différentes grandeurs et ne se limite pas à son exécution sur une plaque de 96 puits.
De préférence, ce ratio permet, à son tour, d'établir un rapport qui traduira la présence ou l'absence du SARM.
EXEMPLE 1: MÉTHODE DE DÉPISTAGE DU SARM A L'AIDE DE SONDES
COUPLÉES A DES MICROSPHERES
MATÉRIELS ET MÉTHODES:
1. Extraction de l'ADN bactérien à partir de spécimens nasaux a. Transférer les écouvillons dans 1.0 mL d'une solution saline stérile
Selon un mode préféré de l'invention, la quantification des complexes produit PCR/sonde permet d'établir rapport de la fluorescence entre les complexes qui ont comme produit du PCR le produit de l'amplification de la première région génique et de la deuxième région génique et ainsi d'identifier a présence du SARM.
L'invention s'étend à la méthode exécutée dans des plaques de différentes grandeurs et ne se limite pas à son exécution sur une plaque de 96 puits.
De préférence, ce ratio permet, à son tour, d'établir un rapport qui traduira la présence ou l'absence du SARM.
EXEMPLE 1: MÉTHODE DE DÉPISTAGE DU SARM A L'AIDE DE SONDES
COUPLÉES A DES MICROSPHERES
MATÉRIELS ET MÉTHODES:
1. Extraction de l'ADN bactérien à partir de spécimens nasaux a. Transférer les écouvillons dans 1.0 mL d'une solution saline stérile
11 Pour un contrôle optionnel, inoculer une gélose MSA4.
b. Transférer la solution saline dans un tube de 1.5 mL
c. Centrifuger à 13000 x g pendant 5 minutes d. Resuspendre les culots dans 100 uL de tampon de lyse Triton X-100 1.0%
Tween 20 0.5%
Tris-HCI pH8.0 10 mM
EDTA pH8.0 1 mM
e. Transférer la solution dans un tube de 0.2 mL
f. Incuber à 95 C pendant 10 min g. Centrifuger à 5800 X g pendant 5 min h. Garder 80 uL de surnageant 2. Préparation du mastermix pour la réaction d'amplification dans le thermocycleur:
a. Dégeler les réactifs (tampon, dNTPs, amorces) et conserver à 4 C.
b. Diluer et combiner les amorces (voir Table 2) c. Calculer le volume requis selon le nombre de réaction à effectuer en utilisant une valeur de 20 uL (ou de 25uL) par réaction de PCR.
Réactifs volume concentration finale acceptable Tampon 10X 2.0 uL lx mM dNTP's 0.2 uL 200 à 250 uM
25 mM MgC12 2.0 uL 2.5 mM
25 20 uM amorces bio 0.8 uL 0.3 à 0.5 uM
10 uM amorces std 0.8 uL 0.1 à 0.3 uM
H20 12.0 uL
Taq polymérase 0.2 uL 0,5-1,0 unité
Total 18.0 uL
b. Transférer la solution saline dans un tube de 1.5 mL
c. Centrifuger à 13000 x g pendant 5 minutes d. Resuspendre les culots dans 100 uL de tampon de lyse Triton X-100 1.0%
Tween 20 0.5%
Tris-HCI pH8.0 10 mM
EDTA pH8.0 1 mM
e. Transférer la solution dans un tube de 0.2 mL
f. Incuber à 95 C pendant 10 min g. Centrifuger à 5800 X g pendant 5 min h. Garder 80 uL de surnageant 2. Préparation du mastermix pour la réaction d'amplification dans le thermocycleur:
a. Dégeler les réactifs (tampon, dNTPs, amorces) et conserver à 4 C.
b. Diluer et combiner les amorces (voir Table 2) c. Calculer le volume requis selon le nombre de réaction à effectuer en utilisant une valeur de 20 uL (ou de 25uL) par réaction de PCR.
Réactifs volume concentration finale acceptable Tampon 10X 2.0 uL lx mM dNTP's 0.2 uL 200 à 250 uM
25 mM MgC12 2.0 uL 2.5 mM
25 20 uM amorces bio 0.8 uL 0.3 à 0.5 uM
10 uM amorces std 0.8 uL 0.1 à 0.3 uM
H20 12.0 uL
Taq polymérase 0.2 uL 0,5-1,0 unité
Total 18.0 uL
12 d. Déposer 18 uL de mastermix par puit e. Ajouter 2 uL d'ADN purifié, mélanger et sceller la plaque f. Déposer les réactions dans un thermocycleur.
3. Programmation du thermocycleur Étape T temps standard temps rapide 1. 94 C 10 à 15 min 10 min 2. 94 C 30 sec 10 sec 3. 60 C 40 sec 15 sec 4. 72 C 60 sec 10 sec 5. Répéter 44 fois les étapes 2 à 4 6. 72 C 5 min 5 min 7. 4 C conserver conserver 4. Hybridation Selon un mode préféré de l'invention, l'hybridation des fragments amplifiés aux sondes qui ont été préalablement couplées à une microsphère spécifique sélectionnée parmi 100 microsphères différentes est effectué. Ces sondes correspondent aux séquences listées à la Table 3. L'appareil Luminex possède un laser qui a pour fonction de détecter les chromophores et donc d'identifier avec précision une des 100 sphères disponibles.
a. Choisir les microsphères couplées aux sondes appropriées, et plus précisément les sondes qui correspondent à une première sous-région génique et à une deuxième sous-région génique, soient les sondes OXSAS-1 et MASS-2 respectivement (voir Table 3).
b. Resuspendre les microsphères par vortex pendant 20 secondes et par sonication pendant 20 secondes
3. Programmation du thermocycleur Étape T temps standard temps rapide 1. 94 C 10 à 15 min 10 min 2. 94 C 30 sec 10 sec 3. 60 C 40 sec 15 sec 4. 72 C 60 sec 10 sec 5. Répéter 44 fois les étapes 2 à 4 6. 72 C 5 min 5 min 7. 4 C conserver conserver 4. Hybridation Selon un mode préféré de l'invention, l'hybridation des fragments amplifiés aux sondes qui ont été préalablement couplées à une microsphère spécifique sélectionnée parmi 100 microsphères différentes est effectué. Ces sondes correspondent aux séquences listées à la Table 3. L'appareil Luminex possède un laser qui a pour fonction de détecter les chromophores et donc d'identifier avec précision une des 100 sphères disponibles.
a. Choisir les microsphères couplées aux sondes appropriées, et plus précisément les sondes qui correspondent à une première sous-région génique et à une deuxième sous-région génique, soient les sondes OXSAS-1 et MASS-2 respectivement (voir Table 3).
b. Resuspendre les microsphères par vortex pendant 20 secondes et par sonication pendant 20 secondes
13 c. Diluer les microsphères à une concentration de 50 microsphères par uL
de solution TMAC à 1.5X (3M TMAC, 50 mM Tris-HCI, pH8.0, 4 mM
EDTA, pH8.0, 0.1% sarkosyl).
d. Mettre 13 uL de tampon TE par puit.
e. Ajouter 30 uL de la solution diluée de microsphères.
f. Ajouter 2 uL de la réaction de PCR et mélanger à l'aide d'une pipette multipuits.
g. Sceller la plaque à l'aide d'une scelleuse.
h. Incuber à 95 C pendant 5 min et à 54 C pendant 15 min.
i. Centrifuger la plaque à 3000 x g pendant 5 min à la température ambiante.
j. Enlever le surnageant par inversion en fouettant à trois reprises.
5. Marquage d'une molécule, la biotine, à un chromophore, la phycoérythrine.
Une fois l'hybridation complétée, les complexes comprenant les microsphères couplées aux sondes avec les produits PCR, sont récupérés par centrifugation et re-suspendues dans une solution contenant une molécule, de préférence la biotine, liée à un chromophore, de préférence la phycoérythine. Cette étape de l'invention se 2 o détaille comme suit:
a. Ajouter 75 uL d'une solution de TMAC 1X contenant de la streptavidine-phycoérythrine à 4 ug par mL.
b. Resuspendre les culots à l'aide d'une pipette multipuits.
c. Incuber 5 min à la température ambiante dans l'obscurité.
6. Analyse:
a. Préparer le fichier d'exécution de l'appareil LUMINEX en utilisant, par exemple un volume de 50 uL analysé pendant 45 secondes à la température
de solution TMAC à 1.5X (3M TMAC, 50 mM Tris-HCI, pH8.0, 4 mM
EDTA, pH8.0, 0.1% sarkosyl).
d. Mettre 13 uL de tampon TE par puit.
e. Ajouter 30 uL de la solution diluée de microsphères.
f. Ajouter 2 uL de la réaction de PCR et mélanger à l'aide d'une pipette multipuits.
g. Sceller la plaque à l'aide d'une scelleuse.
h. Incuber à 95 C pendant 5 min et à 54 C pendant 15 min.
i. Centrifuger la plaque à 3000 x g pendant 5 min à la température ambiante.
j. Enlever le surnageant par inversion en fouettant à trois reprises.
5. Marquage d'une molécule, la biotine, à un chromophore, la phycoérythrine.
Une fois l'hybridation complétée, les complexes comprenant les microsphères couplées aux sondes avec les produits PCR, sont récupérés par centrifugation et re-suspendues dans une solution contenant une molécule, de préférence la biotine, liée à un chromophore, de préférence la phycoérythine. Cette étape de l'invention se 2 o détaille comme suit:
a. Ajouter 75 uL d'une solution de TMAC 1X contenant de la streptavidine-phycoérythrine à 4 ug par mL.
b. Resuspendre les culots à l'aide d'une pipette multipuits.
c. Incuber 5 min à la température ambiante dans l'obscurité.
6. Analyse:
a. Préparer le fichier d'exécution de l'appareil LUMINEX en utilisant, par exemple un volume de 50 uL analysé pendant 45 secondes à la température
14 ambiante afin de détecter un minimum de 100 microsphères pour chacune des sondes utilisées.
b. Déposer la plaque dans l'appareil.
c. Démarrer l'analyse.
L'appareil cytofluorométrique de marque Luminex possède un laser qui a pour fonction de détecter les chromophores et donc d'identifier avec précision une des 100 microsphères disponibles. Le plateau d'échantillonnage propre à l'appareil LuminexO a été retenu parce qu'il permet simultanément la réalisation dans une seule réaction de 100 tests sur 96 échantillons différents, ce qui en fait un calibre idéal pour les besoins de dépistage. De plus, les coûts d'acquisition de l'appareil et celui des réactions sont inférieurs à ceux déjà utilisés. Les conditions expérimentales sont uniques, rapides et spécifiques à un coût nettement inférieure à ce qui existe présentement. Cet appareil permet donc de mesurer la présence de deux éléments fluorescents simultanément.
Ainsi, la présence des principes actifs dissous dans la microsphère d'une part, et le chromophore constituant le deuxième élément de l'agent combiné d'autre part, signalera la présence des régions d'ADN ciblées, correspondant à la séquence d'ADN d'une partie de la première région génique caractérisant une espèce bactérienne, et à la séquence d'ADN d'une partie de la deuxième région génique, soit une partie de la séquence d'ADN du transposon mccA.
L'appareil de détection produit donc les données brutes qu'il faut ensuite analyser. Le transfert et l'enregistrement des données peuvent se faire dans un fichier de type Excel.
L'interprétation des résultats et leur validation permettront d'établir la présence du SARM.
Ainsi, le ratio de la fluorescence entre les complexes qui ont comme produit du PCR
le produit de l'amplification de la séquence de la première région génique, correspondant à une partie de la séquence d'ADN du gène orfX, et les complexes qui ont comme produit PCR le produit de l'amplification de la séquence d'une partie du transposon mccA, permet d'établir un ratio selon lequel la présence du SARM
peut être déterminée.
5 RÉSULTATS:
Table 1: Résultats des mesures d'intensité de fluorescence médiane de l'Exemple 1 Spécimen Median MFI MFI Diagnostique Sample orfX mccA orfX mccA SARM
1 1 105 64 + - -2 2 117 58 + - -3 3 140 78 + - -Souche contrôle ATCC
43300 4 146 284 + + +
Souche contrôle ATCC
25923 5 139 44 + - -6 6 193 412 + + +
7 7 122 527 + + +
8 8 142 430 + + +
9 9 217 527 + + +
10 10 184 449 + + +
11 11 181 82 + - -12 12 199 499 + + +
13 13 293 480 + + +
14 14 254 461 + + +
b. Déposer la plaque dans l'appareil.
c. Démarrer l'analyse.
L'appareil cytofluorométrique de marque Luminex possède un laser qui a pour fonction de détecter les chromophores et donc d'identifier avec précision une des 100 microsphères disponibles. Le plateau d'échantillonnage propre à l'appareil LuminexO a été retenu parce qu'il permet simultanément la réalisation dans une seule réaction de 100 tests sur 96 échantillons différents, ce qui en fait un calibre idéal pour les besoins de dépistage. De plus, les coûts d'acquisition de l'appareil et celui des réactions sont inférieurs à ceux déjà utilisés. Les conditions expérimentales sont uniques, rapides et spécifiques à un coût nettement inférieure à ce qui existe présentement. Cet appareil permet donc de mesurer la présence de deux éléments fluorescents simultanément.
Ainsi, la présence des principes actifs dissous dans la microsphère d'une part, et le chromophore constituant le deuxième élément de l'agent combiné d'autre part, signalera la présence des régions d'ADN ciblées, correspondant à la séquence d'ADN d'une partie de la première région génique caractérisant une espèce bactérienne, et à la séquence d'ADN d'une partie de la deuxième région génique, soit une partie de la séquence d'ADN du transposon mccA.
L'appareil de détection produit donc les données brutes qu'il faut ensuite analyser. Le transfert et l'enregistrement des données peuvent se faire dans un fichier de type Excel.
L'interprétation des résultats et leur validation permettront d'établir la présence du SARM.
Ainsi, le ratio de la fluorescence entre les complexes qui ont comme produit du PCR
le produit de l'amplification de la séquence de la première région génique, correspondant à une partie de la séquence d'ADN du gène orfX, et les complexes qui ont comme produit PCR le produit de l'amplification de la séquence d'une partie du transposon mccA, permet d'établir un ratio selon lequel la présence du SARM
peut être déterminée.
5 RÉSULTATS:
Table 1: Résultats des mesures d'intensité de fluorescence médiane de l'Exemple 1 Spécimen Median MFI MFI Diagnostique Sample orfX mccA orfX mccA SARM
1 1 105 64 + - -2 2 117 58 + - -3 3 140 78 + - -Souche contrôle ATCC
43300 4 146 284 + + +
Souche contrôle ATCC
25923 5 139 44 + - -6 6 193 412 + + +
7 7 122 527 + + +
8 8 142 430 + + +
9 9 217 527 + + +
10 10 184 449 + + +
11 11 181 82 + - -12 12 199 499 + + +
13 13 293 480 + + +
14 14 254 461 + + +
15 15 254 488 + + +
16 16 24 58 - - -
17 17 17 60 - - -
18 18 30 62 - - -lo La méthode de l'invention permet donc de mettre au point un test de détection du SARM qui est aussi rapide et efficace et ce, à coût nettement inférieur à ce qui existe présentement sur le marché.
Un kit pour permettre le dépistage ou la détection du SARM est aussi envisagé
par l'invention.
Même si un mode de réalisation préférentiel de la présente invention a été
décrit en détail ci-dessus et illustré dans les dessins accompagnant la demande, il doit être compris que l'invention n'est pas limitée à ce mode de réalisation particulier et que plusieurs changements et modifications peuvent y être effectués sans s'éloigner de la portée ou l'esprit de la présente invention.
lo TABLE 2. Liste des amorces utilisées dans l'Exemple 1 pour l'amplification en multiplexe par PCR
Nom des Séquences (5'--> 3') Modification Fragment amorces (pbs) RX5'bio TGGGAATGTCATTTTGCTGA 5' biotine FX3' GCTATCTTCCGAAGGATTG
FMA3'bio AAATGATGCGGGTTGTGTTA 5' biotine Table 3. Liste des sondes couplées aux microsphères Nom Séquence Modification Ensemble de microsphères OXSAS-1 TCGTCATTGGCGGATCAA 5'Uni-link amino 022 MASS-2 CGCATAATCTTAAATGCTCT 5'Uni-link amino 063
Un kit pour permettre le dépistage ou la détection du SARM est aussi envisagé
par l'invention.
Même si un mode de réalisation préférentiel de la présente invention a été
décrit en détail ci-dessus et illustré dans les dessins accompagnant la demande, il doit être compris que l'invention n'est pas limitée à ce mode de réalisation particulier et que plusieurs changements et modifications peuvent y être effectués sans s'éloigner de la portée ou l'esprit de la présente invention.
lo TABLE 2. Liste des amorces utilisées dans l'Exemple 1 pour l'amplification en multiplexe par PCR
Nom des Séquences (5'--> 3') Modification Fragment amorces (pbs) RX5'bio TGGGAATGTCATTTTGCTGA 5' biotine FX3' GCTATCTTCCGAAGGATTG
FMA3'bio AAATGATGCGGGTTGTGTTA 5' biotine Table 3. Liste des sondes couplées aux microsphères Nom Séquence Modification Ensemble de microsphères OXSAS-1 TCGTCATTGGCGGATCAA 5'Uni-link amino 022 MASS-2 CGCATAATCTTAAATGCTCT 5'Uni-link amino 063
Claims (4)
1. Une méthode de détection du Staphylocoque doré résistant à la méthicilline, caractérisée en ce que la méthode comprend les étapes suivantes:
- Amplification par réaction en chaîne par polymérase (PCR) d'au moins une région d'ADN du Staphylocoque doré pour obtenir un produit PCR, la région ciblée signalant la résistance de la bactérie à la méthicilline;
- Hybridation du produit PCR à des sondes couplées à des microsphères;
- Détection de la présence ou l'absence d'un complexe comprenant le produit PCR avec les sondes couplées à des microsphères;
et dans laquelle la détection de la présence d'un complexe produit PCR/sonde est indicatif que ladite bactérie est résistante à ladite méthicilline.
- Amplification par réaction en chaîne par polymérase (PCR) d'au moins une région d'ADN du Staphylocoque doré pour obtenir un produit PCR, la région ciblée signalant la résistance de la bactérie à la méthicilline;
- Hybridation du produit PCR à des sondes couplées à des microsphères;
- Détection de la présence ou l'absence d'un complexe comprenant le produit PCR avec les sondes couplées à des microsphères;
et dans laquelle la détection de la présence d'un complexe produit PCR/sonde est indicatif que ladite bactérie est résistante à ladite méthicilline.
2. Méthode de détection selon la revendication 1, caractérisée en ce que la au moins une région d'ADN du Staphylocoque doré comprend deux régions géniques, soit une première région génique qui sert à identifier la bactérie et une deuxième région génique qui sert à identifier la présence d'une région génique associée à la résistance de la bactérie à la méthicilline.
3. Méthode de détection selon la revendication 2, caractérisée en ce que la première région génique correspond à une partie du gène orfX et la deuxième région génique correspond à une partie de la séquence d'ADN correspondant au transposon mccA.
4. Un kit pour la détection d'au moins une région d'ADN d'une bactérie susceptible d'être résistante à un antibiotique, la région ciblée étant associée à la résistance de la bactérie audit antibiotique, caractérisé en ce qu'il comprend des réactifs nécessaires pour permettre ladite détection.
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| WO (1) | WO2008061376A1 (fr) |
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| US11834720B2 (en) | 2005-10-11 | 2023-12-05 | Geneohm Sciences, Inc. | Sequences for detection and identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) of MREJ types xi to xx |
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|---|---|---|---|---|
| JP3957338B2 (ja) * | 1996-02-23 | 2007-08-15 | 株式会社カイノス | 診断薬 |
| CA2906516C (fr) * | 1999-09-28 | 2017-03-07 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Acides nucleiques et methodes de detection de streptocoque |
| CA2348042A1 (fr) * | 2001-06-04 | 2002-12-04 | Ann Huletsky | Sequences permettant de detecter et d'identifier des staphylococcus aureus resistant a la meticilline |
| EP1529847B1 (fr) * | 2003-11-07 | 2006-04-05 | Federal Rep. of Germany repr. by the Ministry of Health & Soc. Security, the latter repr. by the Pres. of the Robert Koch Ins. | Méthode pour la détection de Staphylococcus aureus résistant aux méthiciline (MRSA) |
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