ES2264121T3

ES2264121T3 - Sondas de acido nucleico para chlamydia pneumoniae.

Info

Publication number: ES2264121T3
Application number: ES93306551T
Authority: ES
Inventors: Philip Hammond; Anthony Endozo
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1992-08-26
Filing date: 1993-08-19
Publication date: 2006-12-16
Anticipated expiration: 2013-08-19
Also published as: US5374718A; DE69334050T2; ATE334224T1; DE69334050D1; EP0587331B1; AU687752B2; CA2148468C; AU5002993A; CA2148468A1; EP0587331A1; WO1994004549A1; US5683870A; DK0587331T3

Abstract

SE DESCRIBEN UNAS SONDAS DE ENSAYO ESPECIFICAS PARA CHLAMIDIA PNEUMONIAE Y NO OTRAS ESPECIES DE CHLAMYDIA

Description

Sondas de ácido nucleico para Chlamydia pneumoniae.

Campo de la invención

Las invenciones descritas y reivindicadas en la presente memoria se refieren al diseño y construcción de sondas de ácido nucleico para la Chlamydia pneumoniae, que son capaces de detectar el organismo en muestras de ensayo de, por ejemplo, esputos, orina, sangre y secciones de tejido, comida, suelo y agua.

Antecedentes de la invención

Dos cadenas sencillas de ácido desoxirribonucleico ("ADN") o de ácido ribonucleico ("ARN"), formadas a partir de nucleótidos (que incluyen las bases adenina (A), citosina (C), timidina (T), guanina (G), uracilo (U) o inopina (I)), se pueden asociar ("hibridar") para formar una estructura de cadena doble en la que las dos cadenas se mantienen juntas mediante enlaces de hidrógeno entre pares de bases complementarias. De forma general, A forma un enlace de hidrógeno con T o con U, mientras que G forma un enlace de hidrógeno con C. Por tanto, en cualquier punto a lo largo de la cadena, se pueden encontrar los clásicos pares base AT ó AU, TA ó UA, GC ó CG. También se pueden encontrar AG, GU y otros pares base "descolocados" o desigualados.

Cuando una primera cadena sencilla de ácido nucleico contiene suficientes bases complementarias contiguas a una segunda, y ambas cadenas se ponen en contacto en las condiciones que favorecen su hibridación, se obtiene como resultado un ácido nucleico de doble cadena. En las condiciones adecuadas, se pueden formar híbridos ADN/ADN, ARN/ADN o ARN/ARN.

Normalmente, una sonda es una secuencia de ácido nucleico de cadena sencilla que es complementaria en un determinado grado a una secuencia de ácido nucleico que se pretende detectar ("secuencia objetivo"). Puede ser marcada con un resto detectable tal como un resto de radioisótopo, de antígeno o quimioluminiscente. Kohne, Patente de EE.UU. Nº 4.851.330, y Hogan y col., Solicitud de Patente EPO Nº PCT/US87/03009, titulada "Nucleic Acid Probes for Detection and/or Quantitation of Non-Viral Organisms", proporcionan una descripción de los antecedentes del uso de la hibridación de ácido nucleico como procedimiento para la detección de secuencias de ácido nucleico concretas.

Hogan y col., ver referencia anterior, también describen métodos para determinar la presencia de organismos que contienen ARN en una muestra que podría contener dichos organismos. Estos métodos requieren sondas suficientemente complementarias para hibridarse con el ARN ribosomal (rARN) de uno o más organismos no víricos o grupos de organismos no víricos. A continuación la mezcla es incubada en condiciones de hibridación especificadas, y se determina la hibridación de la sonda y cualquier muestra de ensayo de rARN.

Hogan y col. también describen sondas que detectan únicamente subsecuencias de subunidad de rARN específicamente dirigidas de organismos o de grupos de organismos concretos en una muestra, incluso en presencia de muchos organismos no relacionados, o en presencia de los vecinos filogenéticos más próximos conocidos. Ejemplos específicos de sondas de ensayo de hibridación son los proporcionados para: Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium microti, el género Mycobacterium, Mycoplasma pneumoniae, el género Legionella, Chlamydia trachomatis, el género Campylobacter, Enterococcus, el género Pseudomonas grupo I, Enterobacter cloacae, Proteus mirabilis, el género Salmonella, Escherichia coli, bacterias, hongos, y Neisseria gonorrhoeae. Dichas secuencias sonda no reaccionan con ácidos nucleicos de los grupos enumerados, o con cualquier especie bacteriana o agente infeccioso, en las apropiadas condiciones severas de hibridación.

Resumen de la invención

Esta invención describe y reivindica nuevas sondas para la detección de Chlamydia pneumoniae. Estas sondas son capaces de distinguir entre Chlamydia pneumoniae y sus vecinos filogenéticos más próximos conocidos. Estas sondas detectan rARN único y las secuencias génicas que codifican rARN, y pueden usarse en un ensayo para la detección y/o la cuantificación de Chlamydia pneumoniae.

La Chlamydia pneumoniae ha sido identificada como una causa de las infecciones de tracto respiratorio tanto superior como inferior. Se ha demostrado que produce neumonía en neonatos y niños, así como en adultos. También puede causar bronquitis, faringitis y sinusitis, y puede ser una causa de infección de seno crónica en niños. La enfermedad tiene un inicio gradual y a menudo implica dolor de garganta, tos y ronquera. Estos síntomas son similares a los de la neumonía atípica, y por tanto el diagnóstico clínico es difícil.

La C. pneumoniae es un organismo intracelular obligatorio. Se han observado dos tipos de inclusiones intracelulares. Un cuerpo elemental que normalmente tiene forma de pera, pero que puede ser pleomórfico, y un cuerpo reticulado. En los cuerpos elementales hay presentes antígenos específicos y específicos de género. El diagnóstico de C. pneumoniae en laboratorio es difícil. Una identificación definitiva requiere el crecimiento en células HELA 299 o en yolk sac y a menudo se necesitan múltiples etapas. Entonces se usa un anticuerpo monoclonal específico de especie marcada con fluoresceína para someter a tinción a los cuerpos de inclusión. El diagnóstico mediante técnicas serológicas normalmente requiere dos especímenes de suero, uno de los cuales es tomado de semanas a meses después del espécimen inicial. Se necesitan dos especímenes debido al gran número de personas (40-50%) que presenta anticuerpos contra C. pneumoniae. La confirmación de una infección existente requiere la demostración de un aumento en el título de IgC.

El uso de un ensayo directo de sonda de ADN de esta invención para el rARN de C. pneumoniae permite la identificación conclusiva de la presencia del organismo en una muestra clínica en 2 horas desde la toma de la muestra.

Por tanto, en un primer aspecto, la invención presenta sondas de ensayo de hibridación capaces de distinguir la Chlamydia pneumoniae de otras especies de Chlamydia.

La sonda es complementaria a rARN o a rADN, por ejemplo, a una región variable de rARN.

La presente invención proporciona una sonda de ensayo de hibridación de ácido nucleico de hasta 100 bases de longitud, y que contiene una región de al menos 10 bases contiguas que es perfectamente complementaria a una región de al menos 10 bases del rARN de la Chlamydia pneumoniae, o del ADN que codifica, correspondiente a las bases 1711-1733 del rARN de Escherichia coli 23S, o del ADN que codifica, en la que dicha sonda se hibrida con dicha región de bases de rARN de Chlamydia pneumoniae, o del ADN que codifica, en condiciones severas de hibridación, y en la que dicha sonda no se hibrida con ácido nucleico de Chlamydia psittaci o de Chlamydia trachomatis bajo dichas condiciones.

La presente invención también proporciona una sonda de ensayo de hibridación de hasta 100 bases de longitud y que contiene una región de al menos 10 bases contiguas que es perfectamente complementaria a una región de al menos 10 bases contiguas del rARN de Chlamydia pneumoniae, o al ADN codificador correspondiente a las bases 175-188, 224-247 ó 623-647 de rARN de Escherichia coli 16S, o al ADN codificador, en la que dicha sonda se hibrida a dicha región de bases del rARN de Chlamydia pneumoniae, o al ADN codificador, en condiciones severas de hibridación, y en la que dicha sonda no se hibrida con ácido nucleico de Chlamydia psittaci o de Chlamydia trachomatis en dichas condiciones.

La presente invención proporciona además una sonda de ensayo de hibridación de ácido nucleico de hasta 100 bases de longitud de SEQ ID NO: 11 o su secuencia perfectamente complementaria, en la que dicha sonda se hibrida con rARN de Chlamydia pneumoniae 16S, o con el ADN codificador, en condiciones severas de hibridación, y en la que dicha sonda no se hibrida con ácido nucleico de Chlamydia psittaci o de Chlamydia trachomatis en dichas condiciones.

Preferiblemente el oligonucleótido comprende, consta esencialmente de, o consta de al menos una porción de al menos 10 bases contiguas de la secuencia:

(SEQ ID NO: 2) GCCTAATTACACTACATTCGG ó

(SEQ ID NO: 4) CTGATATCGCATAAACTCTTCCTC ó

(SEQ ID NO: 7) GATAGTTTTAAATGCTGACTTGGGG ó

(SEQ ID NO: 11) GCGGAAAGCTGTATTTCTACAG ó

(SEQ ID NO: 14) CGCTGGGTAATCACCTTAAG ó sus oligonucleótidos complementarios u homólogos (por ejemplo, el ARN codificado), con o sin una sonda colaboradora, como se describe más adelante.

Por "consta esencialmente de" se pretende indicar que la sonda se proporciona en forma de un ácido nucleico purificado que se hibrida en condiciones severas de hibridación con el organismo deseado y no con otros organismos relacionados. Dicha sonda puede estar unida a otros ácidos nucleicos que no afectan a dicha hibridación. Normalmente, se prefiere que la sonda sea de entre 15 y 100 bases de tamaño (más preferiblemente entre 20 y 50). Sin embargo, puede proporcionarse en un vector.

En aspectos relacionados, la invención presenta un polímero de nucleótido capaz de hibridarse con los anteriores oligonucleótidos, un híbrido de ácido nucleico formado con los anteriores oligonucleótidos (útil para permitir la detección de la presencia de una secuencia de oligonucleótidos específica), y una secuencia de ácido nucleico sustancialmente complementaria.

Las sondas de esta invención ofrecen un método rápido, no subjetivo, para la identificación y cuantificación de una colonia bacteriana o de una muestra de tejido biológicamente relevante en busca de la presencia de secuencias de rARN específicas únicas para todas las cepas de Chlamydia pneumoniae.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción de las realizaciones preferidas, y a partir de las reivindicaciones.

Descripción de las realizaciones preferidas Sondas

Hemos descubierto sondas de ADN que son complementarias a una secuencia de rARN concreta obtenida a partir de Chlamydia pneumoniae. Además, hemos usado con éxito dichas sondas en un ensayo específico para la detección de Chlamydia pneumoniae, que distingue la C. pneumoniae de sus vecinos filogenéticos o taxonómicos supuestamente más íntimamente relacionados.

Con la excepción de los virus, todos los organismos procariontes contienen genes de rARN que codifican rARN 5S, rARN 16S y una molécula de rARN más grande conocida como rARN 23S. Usando métodos conocidos por los especialistas en la técnica, se identificaron regiones variables de secuencias de rARN procedentes de rARN 16S de Chlamydia pneumoniae tal como se indica más adelante. Se pueden identificar otras secuencias usando técnicas equivalentes. Estos métodos incluyen el secuenciamiento parcial o completo del rARN de Chlamydia pneumoniae y sus vecinos filogenéticos íntimamente relacionados, la alineación de las secuencias para revelar áreas de máxima homología, y el examen del alineamiento en busca de regiones con variación de secuencia. Por tanto, los ejemplos proporcionados más adelante no limitan esta invención.

Con respecto al secuenciamiento, se hibridaron prímeros de oligonucleótidos complementarios de aproximadamente 10-100 bases de longitud con regiones conservadas de rARN purificado que son específicas de las subunidades 5S, 16S o 23S, y fueron extendidos con la enzima transcriptasa inversa. Se usó degradación química o reacciones de secuenciamiento terminadas en didesoxinucleótidos para determinar la secuencia de nucleótidos del producto extendido. Lane y col., 82 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 6955, 1985. En un método menos preferido, las secuencias de ARN ribosomal genómico también pueden determinarse mediante un procedimiento estándar.

No siempre es necesario determinar la secuencia completa de aminoácidos con el fin de obtener la secuencia sonda. La extensión a partir de cualquier prímero de oligonucleótido sencillo puede dar lugar a hasta 300-400 bases de secuencia. Cuando se usa un prímero sencillo para secuenciar parcialmente el rARN del organismo objetivo o de organismos estrechamente relacionados con el objetivo, se puede realizar un alineamiento como el descrito más adelante. Si se descubre una secuencia de sonda útil, no es necesario continuar con el secuenciamiento del rARN usando otros prímeros. Por otro lado, si no se obtiene ninguna secuencia sonda útil a partir del secuenciamiento con el primer prímero, o si se desea una mayor sensibilidad, se pueden emplear otros prímeros para obtener más secuencias. En los casos en los que no se comprenden bien los modelos de variación correspondientes a una molécula, pueden requerirse más datos de secuenciamiento antes de diseñar la sonda.

Después del secuenciamiento, las secuencias son alineadas para maximizar la homología. La molécula de rARN presenta una estrecha relación de estructura secundaria para funcionar. Esto impone restricciones en los cambios evolutivos de la secuencia primaria, de tal modo que se mantenga la estructura secundaria. Por ejemplo, si se cambia una base en un lado de la hélice, se realiza un cambio compensatorio en el otro lado para preservar la complementariedad (esto se denomina co-varianza). Esto permite que dos secuencias diferentes sean alineadas en base a la secuencia primaria conservada, y también en base a los elementos de estructura secundaria conservados. Una vez que las secuencias están alineadas, es posible encontrar las regiones en las que la secuencia primaria es variable.

Hemos identificado regiones variables mediante análisis comparativo de secuencias de rARN, tanto publicadas en la bibliografía como determinadas por nosotros. Los ordenadores y los programas de ordenador que pueden ser usados o adaptados para los propósitos descritos en la presente memoria se encuentran disponibles comercialmente. Puesto que la evolución de la secuencia en cada una de las regiones variables (por ejemplo, de un mínimo de 10 oligonucleótidos) es, en su mayor parte, divergente, no convergente, con seguridad podemos diseñar sondas basadas en unas pocas secuencias de rARN que difieren entre el organismo objetivo y sus parientes filogenéticamente más próximos. Hemos observado una variación entre el organismo objetivo y el pariente filogenético más próximo en la misma muestra suficiente para diseñar la sonda de interés.

Hemos identificado las siguientes líneas generales útiles para el diseño de sondas con las características deseadas. Debido a que la extensión y la especificidad de reacciones de hibridación como las descritas en el presente documento se ven afectadas por una serie de factores, la manipulación de uno o más de esos factores determinará la sensibilidad exacta y la especificidad exacta de una sonda concreta, si es perfectamente complementaria a su objetivo o no. La importancia y el efecto de diversas condiciones de ensayo, explicadas con mayor profundidad en la presente memoria, son conocidas por los especialistas de la técnica.

En primer lugar, la estabilidad del híbrido sonda:ácido nucleico objetivo debería ser elegida para que fuera compatible con las condiciones de ensayo. Esto se puede lograr evitando secuencias largas ricas en A y en T, terminando los híbridos con pares base G:C, y diseñando la sonda con una Tm apropiada. Los puntos de comienzo y de fin de la sonda deberían ser elegidos de tal modo que la longitud y los % de G y de C dieran como resultado una Tm de unos 2-10ºC más que la temperatura a la que se realizará el ensayo final. La composición base de la sonda es significativa debido a que los pares base G-C presentan un mayor estabilidad térmica que los pares base A-T por la formación de enlaces de hidrógeno adicionales. Por tanto, la hibridación que implica ácidos nucleicos complementarios con un mayor contenido en G-C será estable a mayores temperaturas.

A la hora de diseñar una sonda también deben tenerse en cuenta condiciones tales como la fuerza iónica y la temperatura de incubación a la que se usará la sonda. Se sabe que la hibridación aumenta con la fuerza iónica de la mezcla de reacción, y que la estabilidad térmica de los híbridos aumenta con la fuerza iónica. Por otro lado, reactivos químicos tales como la formamida, la urea, el dimetilsulfóxido y los alcoholes, que interrumpen enlaces de hidrógeno, aumentan la severidad de la hibridación. La desestabilización de los enlaces de hidrógeno por medio de dichos reactivos puede reducir enormemente la Tm. En general, la hibridación óptima para las sondas de oligonucleótidos sintéticas de aproximadamente 10-50 bases de longitud se encuentra unos 5ºC por debajo de la temperatura de fusión de un dúplex dado. La incubación a temperaturas por debajo del óptimo puede permitir que secuencias no equiparadas se hibriden y, por tanto, puede dar lugar a una especificidad reducida.

Es deseable tener sondas que se hibriden únicamente en condiciones de alta severidad. En condiciones de alta severidad sólo se formarán híbridos de ácidos nucleicos altamente complementarios (es decir, aquellos que presentan al menos unas 14 bases de 17 que son complementarias en una serie contigua); no se formarán híbridos sin un grado suficiente de complementariedad. Del mismo modo, la severidad de las condiciones de ensayo determina la cantidad de complementariedad necesaria entre dos cadenas de ácido nucleico que forman un híbrido. Se elige la severidad para maximizar la diferencia de estabilidad entre el híbrido formado con el objetivo y el ácido nucleico no objetivo.

En segundo lugar, las sondas deberían posicionarse de tal modo que se minimice la estabilidad del híbrido sonda:ácido nucleico no objetivo. Esto se puede lograr minimizando la longitud de complementariedad perfecta con organismos no objetivo, evitando regiones ricas en G y C de homología con las secuencias no objetivo, y posicionando la sonda para que abarque tantos puntos no complementariedad desestabilizantes como sea posible. El hecho de que una secuencia sonda sea útil para detectar únicamente un tipo específico de organismo depende enormemente de la diferencia en la estabilidad térmica entre los híbridos sonda:objetivo y los híbridos sonda:no objetivo. Al diseñar sondas, las diferencias en los valores de Tm deberían ser tan grandes como fuera posible (por ejemplo, de al menos 2ºC y preferiblemente de 5ºC).

La longitud de la secuencia de ácido nucleico objetivo y, por consiguiente, la longitud de la secuencia sonda también pueden ser importantes. En algunos casos, pueden existir varias secuencias de una región concreta, que varíen en la posición y en la longitud, que darán lugar a sondas con las características de hibridación deseadas. En otros casos, una secuencia puede ser significativamente mejor que otra que difiera apenas en una única base. Mientras sea posible para ácidos nucleicos que no son perfectamente complementarios para hibridarse, normalmente la extensión más larga de secuencia de base perfectamente homóloga determinará principalmente la estabilidad del híbrido. Aunque se pueden usar sondas de oligonucleótidos de diferente longitud y composición de bases, las sondas de oligonucleótidos preferidas en esta invención se encuentran entre aproximadamente 10 y 50 bases de longitud y son suficientemente homólogas con el ácido nucleico objetivo.

En tercer lugar, son menos preferidas las regiones de rARN conocidas por formar estructuras internas fuertes inhibidores de la hibridación. Del mismo modo, las sondas con una extensa auto-complementariedad deberían ser evitadas.

Como se ha explicado anteriormente, la hibridación es la asociación de dos cadenas sencillas de ácido nucleico complementario para formar una doble cadena unida por enlaces de hidrógeno. Implícitamente, si una de las dos cadenas se encuentra implicada total o parcialmente en un híbrido, tendrá menos capacidad para participar en la formación de un nuevo híbrido. En el caso del rARN, se sabe que la molécula forma híbridos intramoleculares muy estables. Diseñando una sonda de tal modo que una porción sustancial de la secuencia de interés sea de cadena sencilla, la velocidad y la extensión de la hibridación puede incrementarse enormemente. Si el objetivo es la secuencia genómica correspondiente al rARN, entonces se originará de forma natural en una forma de cadena doble, este también es el caso que se da con el producto de la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Estos objetivos de doble cadena son inhibidores naturales de la hibridación con una sonda. Finalmente, puede haber híbridos intramoleculares e intermoleculares formados dentro de una sonda si existe una auto-complementariedad suficiente. Dichas estructuras se pueden evitar a través de un diseño de sonda cuidadoso. Existen programas de ordenador que detectan este tipo de interacción.

Una vez que se ha identificado una supuesta secuencia única, se produce un oligonucleótido de ADN complementario. Este oligonucleótido de cadena sencilla servirá como sonda en la hibridación de reacción. Se pueden producir oligonucleótidos definidos mediante cualquiera de los diversos métodos conocidos, que incluyen la síntesis química en fase sólida automatizada usando precursores de cianoetilfosforamidita. Barone y col., 12 Nucleic Acids Research 4051, 1984. Por supuesto, se pueden emplear otros métodos bien conocidos para la construcción de oligonucleótidos. 2 J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis, Molecular Cloning 11 (2ª ed. 1989).

Una vez sintetizadas, las sondas de oligonucleótidos seleccionadas también pueden ser marcadas mediante cualquier método conocido. 2 J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis, Molecular Cloning 11 (2ª ed. 1989). Las marcas útiles incluyen radioisótopos y grupos de marca no radiactivos. Las marcas isotópicas incluyen ^{3}H, ^{35}S, ^{32}P, ^{125}I, ^{97}Co y ^{14}C. La mayoría de los métodos de marcado isotópico incluyen el uso de enzimas, e incluyen los métodos conocidos de traducción de apodos, marcado en los extremos, síntesis de segunda cadena, y transcripción inversa. Cuando se emplean sondas radio-marcadas, la hibridación se puede detectar mediante autorradiografía, recuento de radiación o recuento gamma. El método de detección seleccionado dependerá de las condiciones de hibridación y del radioisótopo concreto usado para el marcado.

También se pueden usar materiales no isotópicos para el marcado, y se pueden introducir internamente en la secuencia o en el extremo de la secuencia. Se pueden incorporar nucleótidos modificados enzimática o químicamente, y las modificaciones químicas de la sonda se pueden realizar durante o después de la síntesis de la sonda, por ejemplo, mediante el uso de grupos de unión que no son nucleótidos. Las marcas no isotópicas incluyen moléculas fluorescentes, moléculas quimioluminiscentes, enzimas, cofactores, sustratos de enzimas, haptenos y otros ligandos. Actualmente preferimos usar ésteres de acridinio.

Después de la síntesis y la purificación de una secuencia de oligonucleótido concreto, se pueden utilizar varios procedimientos para determinar la aceptabilidad del producto final. El primero es la electroforesis de gel de poliacrilamida, que se usa para determinar el tamaño. 2 J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis, Molecular Cloning, 11.51 (2ª ed. 1989). Dichos procedimientos se conocen en la técnica. Además de la electroforesis de gel de poliacrilamida, también se pueden usar procedimientos de Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) para determinar el tamaño y la pureza del producto de oligonucleótido. Estos procedimientos también son conocidos por los especialistas de la técnica.

Los especialistas en la técnica apreciarán que los factores que afectan a la estabilidad térmica pueden afectar a la especificidad de la sonda y, por tanto, deben controlarse. Por tanto, debería determinarse el perfil de fusión, que incluye la temperatura de fusión™ de los híbridos oligonucleótido/objetivo. El método preferido se describe en Arnold y col., Patente de EE.UU. Nº 5.283.174.

Para la medida de Tm usando un Ensayo de Protección de Hibridación (HPA, del inglés "Hybridization Protection Assay"), se usa la siguiente técnica. Se forma un híbrido sonda:objetivo en exceso de objetivo en una disolución tamponada de succinato de litio que contiene laurilsulfato de litio. Se diluyen alícuotas de este híbrido en el tampón de hibridación y se incuban durante cinco minutos a diversas temperaturas, comenzando por debajo de la Tm estimada (normalmente 55ºC) y subiendo en incrementos de 2-5 grados. A continuación, esta disolución es diluida con un tampón de borato ligeramente alcalino y es incubada a una temperatura menor (por ejemplo a 50ºC) durante diez minutos. En estas condiciones el éster de acridinio unido a una sonda de cadena sencilla se hidroliza, mientras que el unido a una sonda hibridada se mantiene relativamente protegido de la hidrólisis. La cantidad de quimioluminiscencia que permanece es proporcional a la cantidad de híbrido, y se mide en un luminómetro mediante la adición de peróxido de hidrógeno seguido de una base. Los datos se representan como porcentaje de la señal máxima frente a la temperatura (normalmente desde la temperatura más baja). La Tm se define como la temperatura a la cual se mantiene el 50% de la señal máxima.

Además del método anterior, también se puede determinar la temperatura de fusión del híbrido oligonucleótido/objetivo mediante métodos isotópicos bien conocidos por los especialistas de la técnica. Cabe destacar que la Tm correspondiente a un híbrido dado variará dependiendo de la disolución de la hibridación que se use, debido a que la estabilidad térmica depende de la concentración de las diferentes sales, detergentes, y otros solutos que efectúan una estabilidad de híbrido relativa durante la desnaturalización térmica. 2 J. Sambrook, E.F. Fritach y T. Maniatis, Molecular Cloning, 9.51 (2ª ed. 1989).

Se puede medir la velocidad de hibridación determinando C_{o}t_{1/2}. La velocidad con la que la sonda se hibrida con su objetivo es una medida de la estabilidad térmica de la estructura secundaria del objetivo en la región de la sonda. La medida estándar de la velocidad de hibridación es C_{o}t_{1/2}, que se mide como moles de nucleótido por litro y por segundo. Por tanto, es la concentración de sonda por el tiempo en el cual se produce el 50% de la hibridación máxima a dicha concentración. Este valor se determina hibridando cantidades variables de sonda con una cantidad constante de objetivo durante un tiempo fijo. Por ejemplo, se incuban 0,05 pmol de objetivo con 0,012, 0,025, 0,05, 0,1 y 0,2 pmol de sonda durante 30 minutos. Se mide la cantidad de híbrido después de 30 minutos mediante HPA, tal como se ha descrito anteriormente. A continuación se representa la señal como el logaritmo del porcentaje de Unidades de Luz Relativas (RLU) máximas (a partir de la máxima concentración de sonda) frente a la concentración de sonda (moles de nucleótido por litro). La RLU es una medida de la cantidad de fotones emitidos por la sonda marcada detectados por el luminómetro. El C_{o}t_{1/2} se obtiene gráficamente a partir de la concentración correspondiente al 50% del máximo de hibridación multiplicado por el tiempo de hibridación en segundos. Estos valores oscilan entre 9,0 x 10^{-6} y 9 x 10^{-5}, siendo los valores preferidos los inferiores a 3,5 x 10^{-5}.

Tal como describen Kohne y Kacian (Patente de EE.UU. Nº 5.132.207), se pueden usar otros métodos de reasociación de ácidos nucleicos.

El siguiente ejemplo presenta sondas sintéticas complementarias a una secuencia de rARN única, o al correspondiente gen, de un organismo objetivo, la Chlamydia pneumoniae, y su uso en un ensayo de hibridación.

Ejemplo

Se identificaron sondas específicas de C. pneumoniae mediante el secuenciamiento con prímeros complementarios al rARN 16S y 23S. Las secuencias enumeradas anteriormente fueron caracterizadas y no mostraron especificidad por la Chlamydia pneumoniae. Los vecinos filogenéticamente próximos, C. trachomatis y C. psittaci, fueron empleados como comparación con la secuencia de C. pneumoniae.

Para demostrar la reactividad y la especificidad de las sondas hacia la C. pneumoniae, fueron usadas en un ensayo de hibridación. Primero las sondas fueron sintetizadas con un ligando no nucleótidos, a continuación fueron marcadas con un éster de acridinio quimioluminiscente tal como se describe en la Solicitud de Patente EPO Nº PCT/US88/03361, titulada "Acridinium Ester Labeling and Purification of Nucleotide Probes", presentada el 5 de Octubre de 1988. El éster de acridinio unido a la sonda sin hibridar permanece no luminiscente en condiciones ligeramente alcalinas, mientras que el éster de acridinio unido a la sonda hibridada es relativamente resistente. Por tanto, es posible evaluar la hibridación de la sonda marcada con éster de acridinio mediante incubación en un tampón alcalino, seguido de la detección de la quimioluminiscencia en un luminómetro. Los resultados se presentan en RLU, la cantidad de fotones emitidos mediante la sonda marcada se miden con el luminómetro.

Se potenció la hibridación de ácido nucleico mediante el uso de "Sondas Colaboradoras" usando técnicas descritas en Hogan y col., US-A-5030557. Esta publicación describe un proceso para potenciar la unión entre una sonda de nucleótido y una secuencia de nucleótido complementaria de un ácido nucleico objetivo de cadena sencilla, que comprende la adición al ácido nucleico objetivo de un oligonucleótido colaborador que se hibrida con el ácido nucleico objetivo en una región diferente a la de la sonda, añadiéndose el oligonucleótido colaborador en una cantidad eficaz para potenciar la unión de la sonda con el ácido nucleico objetivo. De acuerdo con la presente invención, se hibridó ARN con las sondas marcadas con éster de acridinio en presencia de una o más Sondas Colaboradoras que presentaban las siguientes secuencias de oligonucleótidos (escritas de 5' a 3'):

(SEQ ID NO: 1) TATTAGCGATCGTTTCCAACCGTTATCCCCAAGT,

(SEQ ID NO: 3) AACCGAAAGGTCCGAAGATCCCCTTCTTTAATATATATTAGAT,

(SEQ ID NO: 5) GGGCTTTTACCCCACCAACAAG,

(SEQ ID NO: 6) TTGAGCCCCAAAATTTAACATCTAACTTTCCTTTCCGCC,

(SEQ ID NO: 8) CCCTTTTCCCCATCTATCCTCTAGAAA,

(SEQ ID NO: 9) CCACATGCTCCACTGCTTGTGCGGGCCCCCGTC,

(SEQ ID NO: 10) TTGTCAAATACATGTCAAGTCCAGGTAAGGTCCTTCGCG,

(SEQ ID NO:12) GCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTATCTGTCCTT,

(SEQ ID NO: 13) AGGCTCCCCTTATTCCGAAGTTACG, y

(SEQ ID NO: 15) CTCTGCGGCCCCCCAAGGCTCATAC.

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En el siguiente experimento, se evaluó el ARN liberado por > 10^{7} organismos. Como ejemplo de dicho método se proporciona Murphy y col., Patente de EE.UU. Nº 5.374.522. Después de la hibridación a 60ºC durante una hora en succinato de litio 0,19 M, pH 5, laurilsulfato de litio 0,62 M, ácido etilendiamintetraacético 3 mM, ácido N,N,N',N'-tetraacético bis (beta-amino éter etílico) de etilenglicol 3 mM, se unieron híbridos a partículas magnéticas en una disolución que contiene borato sódico 0,76 M, pH 7,5, y fueron lavados una vez en una disolución que contiene borato sódico 80 mM, pH 10,4. La quimioluminiscencia asociada a las partículas se mide en un luminómetro. Se restó la RLU correspondiente a la reacción de hibridación que contiene 1 ng de ARN no objetivo de los valores mostrados. Un valor neto de RLU superior a +300 RLU se consideró como una reacción positiva; menos de +300 se consideró una reacción negativa.

Los siguientes datos muestran que las cinco sondas descritas anteriormente, y evaluadas como una mezcla, no reaccionaron con organismos de una amplia sección filogenético. Por supuesto, cada sonda puede usarse sola en un ensayo de hibridación.

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Organismo	N^{o} ATCC	RLU neta^{(1)}

Acinetobacter calcoaceticus	33604	-13
Acinetobacter lwoffii	15309	-3
Actinomyces israelí	10049	14
Actinomyces pyogenes	19411	2
Aerococcus viridans	11563	32
Aeromonas hydrophila	7966	1
Alcaligenes denitrificans	27061	19
Alcaligenes faecalis	8750	7

(Continuación)

Organismo	N^{o} ATCC	RLU neta^{(1)}

Bacillus subtilis	651	0
Bacteroides fragilis	23745	-15
Bordetella bronchiseptica	10580	0
Branhamella catarrhalis	25238	-10
Brevibacterium linens	9172	-4
Candida albicans	18804	4
Capnocytophaga ochracea	27872	-115
Chlamydia pneumoniae^{2}	1310	436
Chlamydia psittaci^{2}	VR-656	2
Chlamydia trachomatis^{2}	VR-878	21
Clostridium innocuum	14501	9
Clostridium pasteurianum	6013	-3
Clostridium perfringens	13124	2
Clostridium ramosum	25582	-7
Corynebacterium diphtheriae	11913	-9
Corybacterium haemolyticum	9345	-10
C. pseudodiphtheriticum	10700	1
C. pseudotuberculosis	19410	-5
Corynebacterium xerosis	373	-4
Cryptococcus neoformans	32045	-2
Deinococcus radiodurans	35073	-8
Dermatophilus congolensis	14637	-3
Derxia gummosa	15994	148
Enterococcus faecalis	19433	-12
Erysipelothrix rhusiopathiae	19414	-2
Escherichia coli	10798	-13
Flavobacterium meningosepticum	13253	-22
Gemella haemolysans	10379	-24
Haemophilus influenzae	19418	-2
Klebsiella pneumoniae	23357	-2
Lactobacillus acidophilus	4356	-9
Lactococcus lactis cremoris	19257	-7
Legionella pneumophila	33152	-10
Leuconostoc paramesenteroides	33313	-8
Listeria monocytogenes	35152	-13
Micrococcus kristinae	27570	-3
Micrococcus luteus	4698	-7
Moraxella osloensis	19976	-10
Neisseria lactamica	23970	-1
Neisseria meningitidis	13077	-7
Neisseria mucosa	19696	-20
Neisseria sicca	29193	-8
Nocardia asteroides	19247	-1
Oerskovia turbata	33225	-10
Oerskovia xanthineolytica	27402	-7
Paracoccus denitrificans	17741	-15
Pediococcus acidilactici	33314	-9
Peptostreptococcus magnus	14955	4
Peptostreptococcus anaerobius	27337	120
Propionibacterium acnes	6919	-31
Proteus mirabilis	25933	-3
Pseudomonas aeruginosa	25330	-14

(Continuación)

Organismo	N^{o} ATCC	RLU neta^{(1)}

Rhodococcus bronchialis	25592	-15
Rhodospirillum rubrum	11170	-7
Staphylococcus aureus	25923	-8
Staphylococcus aureus	12598	-15
Staphylococcus aureus	33591	-3
Staphylococcus epidermidis	12228	-11
Streptococcus agalactiae	13813	-14
Streptococcus mitis	9811	-10
Streptococcus pneumoniae	6303	-6
Streptococcus pyogenes	19615	-4
Streptococcus sanguis	10556	-12
Streptomyces griseus	23345	-15
Vibrio parahaemolyticus	17802	-10
Yersinia enterocolitica	9610	-15

1) \; Valor experimental, el valor obtenido con 1 ng del rARN no objetivo.
2) \; Se evaluaron 10 ng de rARN extraído.

Los anteriores datos muestran que las nuevas sondas descritas y reivindicadas en la presente memoria son capaces de distinguir a la Chlamydia pneumoniae de sus vecinos filogenéticos más próximos conocidos.

Otras realizaciones se encuentran en las siguientes reivindicaciones.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Gen-Probe Incorporated

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 9880 Campus Point Drive

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: San Diego

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: California

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 92121

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nucleic Acid Probes To Chlamydia pneumoniae

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FORMATO LEGIBLE EN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: PC Compatible IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.25 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN CORRESPONDIENTE A LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TATTAGCGAT CGTTTCCAAC CGTTATCCCC AAGT

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN CORRESPONDIENTE A LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCTAATTAC ACTACATTCG G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN CORRESPONDIENTE A LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 43

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACCGAAAGG TCCGAAGATC CCCTTCTTTA ATATATATTA GAT

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN CORRESPONDIENTE A LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGATATCGC ATAAACTCTT CCTC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN CORRESPONDIENTE A LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGCTTTTAC CCCACCAACA AG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN CORRESPONDIENTE A LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGAGCCCCA AAATTTAACA TCTAACTTTC CTTTCCGCC

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN CORRESPONDIENTE A LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATAGTTTTA AATGCTGACT TGGGG

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN CORRESPONDIENTE A LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCTTTTCCC CATCTATCCT CTAGAAA

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN CORRESPONDIENTE A LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCACATGCTC CACTGCTTGT GCGGGCCCCC GTC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN CORRESPONDIENTE A LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGTCAAATA CATGTCAAGT CCAGGTAAGG TCCTTCGCG

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN CORRESPONDIENTE A LA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGAAAGCT GTATTTCTAC AG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN CORRESPONDIENTE A LA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTGACGACA GCCATGCAGC ACCTGTGTAT CTGTCCTT

\hfill

38

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN CORRESPONDIENTE A LA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGCTCCCCT TATTCCGAAG TTACG

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN CORRESPONDIENTE A LA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCTGGGTAA TCACCTTAAG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN CORRESPONDIENTE A LA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCTGCGGCC CCCCAAGGCT CATAC

\hfill

25

Claims

1. Una sonda de ensayo de hibridación de ácido nucleico de hasta 100 bases de longitud, y que contiene una región de al menos 10 bases contiguas que es perfectamente complementaria a una región de al menos 10 bases contiguas del rARN de Chlamydia pneumoniae, o del ADN codificador, correspondiente a las bases 1711-1733 del rARN 23S de Escherichia coli o del ADN codificador, en la que dicha sonda se hibrida con dicha región de bases del rARN de Chlamydia pneumoniae, o del ADN codificador, en condiciones severas de hibridación, y en la que dicha sonda no se hibrida con ácidos nucleicos de Chlamydia psittaci o de Chlamydia trachomatis en dichas condiciones.

2. Una sonda de ensayo de hibridación de ácido nucleico de hasta 100 bases de longitud, y que contiene una región de al menos 10 bases contiguas que es perfectamente complementaria a una región de al menos 10 bases contiguas del rARN de Chlamydia pneumoniae, o del ADN codificador, correspondiente a las bases 175-188, 224-247 ó 623-647 del rARN 16S de Escherichia coli o del ADN codificador, en la que dicha sonda se hibrida con dicha región de bases del rARN de Chlamydia pneumoniae, o del ADN codificador, en condiciones severas de hibridación, y en la que dicha sonda no se hibrida con ácidos nucleicos de Chlamydia psittaci o de Chlamydia trachomatis en dichas condiciones.

3. La sonda de ensayo de hibridación de ácido nucleico de la reivindicación 2, en la que dicha sonda comprende una región de al menos 10 bases contiguas que es perfectamente complementaria a una región de al menos 10 bases contiguas del rARN de Chlamydia pneumoniae, o del ADN codificador, correspondiente a las bases 175-188 del rARN 16S de Escherichia coli, o del ADN codificador.

4. La sonda de ensayo de hibridación de ácido nucleico de la reivindicación 2, en la que dicha sonda comprende una región de al menos 10 bases contiguas que es perfectamente complementaria a una región de al menos 10 bases contiguas de rARN de Chlamydia pneumoniae, o del ADN codificador, correspondiente a las bases 224-247 del rARN 16S de Escherichia coli, o del ADN codificador.

5. La sonda de ensayo de hibridación de ácido nucleico de la reivindicación 2, en la que dicha sonda comprende una región de al menos 10 bases contiguas que es perfectamente complementaria a una región de al menos 10 bases contiguas de rARN de Chlamydia pneumoniae, o del ADN codificador, correspondiente a las bases 623-647 del rARN 16S de Escherichia coli, o del ADN codificador.

6. La sonda de ensayo de hibridación de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha sonda tiene al menos 15 bases de longitud.

7. La sonda de ensayo de hibridación de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha sonda tiene de 20 a 50 bases de longitud.

8. La sonda de ensayo de hibridación de ácido nucleico de la reivindicación 2, en la que dicha sonda comprende la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 2 ó su secuencia perfectamente complementaria.

9. La sonda de ensayo de hibridación de ácido nucleico de la reivindicación 8, en la que la secuencia de bases de dicha sonda consiste en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 2 ó en su secuencia perfectamente complementaria.

10. La sonda de ensayo de hibridación de ácido nucleico de la reivindicación 2, en la que dicha sonda comprende la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 4 ó su secuencia perfectamente complementaria.

11. La sonda de ensayo de hibridación de ácido nucleico de la reivindicación 10, en la que la secuencia de bases de dicha sonda consiste en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 4 ó su secuencia perfectamente complementaria.

12. La sonda de ensayo de hibridación de ácido nucleico de la reivindicación 2, en la que dicha sonda comprende la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 7 ó su secuencia perfectamente complementaria.

13. La sonda de ensayo de hibridación de ácido nucleico de la reivindicación 12, en la que la secuencia de bases de dicha sonda consiste en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 7 ó su secuencia perfectamente complementaria.

14. Una sonda de ensayo de hibridación de ácido nucleico de hasta 100 bases de longitud, y que comprende la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 11 o su secuencia perfectamente complementaria, en la que dicha sonda se hibrida con rARN 16S de Chlamydia pneumoniae, o con el ADN codificador, en condiciones severas de hibridación, y en la que dicha sonda no se hibrida con ácido nucleico de Chlamydia psittaci o de Chlamydia trachomatis en dichas condiciones.

15. La sonda de ensayo de hibridación de ácido nucleico de la reivindicación 14, en la que la secuencia de bases de dicha sonda consiste en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 11 ó en su secuencia perfectamente complementaria.

16. La sonda de ensayo de hibridación de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que dicha sonda comprende la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 14 ó su secuencia perfectamente complementaria.

17. La sonda de ensayo de hibridación de ácido nucleico de la reivindicación 16, en la que la secuencia de bases de dicha sonda consiste en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 14 ó en su secuencia perfectamente complementaria.

18. La sonda de ensayo de hibridación de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en la que dicha sonda es marcada con una etiqueta isotópica o no isotópica.

19. La sonda de ensayo de hibridación de ácido nucleico de la reivindicación 18, en la que dicha marca es un éster de acridinio.

20. La sonda de ensayo de hibridación de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en la que dichas condiciones severas de hibridación incluyen un tampón a 60ºC que comprende succinato de litio 0,19 M, laurilsulfato de litio 0,62 M, ácido etilendiamintetraacético 3 mM, y ácido N,N,N',N'-tetraacético de bis(beta-amino etil éter) de etilenglicol 3 mM.

21. Un híbrido de ácido nucleico formado entre una sonda de ensayo de hibridación de ácido nucleico como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 y ácido nucleico procedente de Chlamydia pneumoniae.

22. Una mezcla de sondas que comprende una sonda de ensayo de hibridación de ácido nucleico como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 y una sonda colaboradora de ácido nucleico.

23. La mezcla de sondas de la reivindicación 22, en la que dicha sonda comprende una región de al menos 10 bases contiguas que es perfectamente complementaria a una región de al menos 10 bases contiguas del rARN de Chlamydia pneumoniae, o del ADN codificador, correspondientes a las bases 175-188 del rARN 16S de Escherichia coli, o al ADN codificador, y en la que dicha sonda colaboradora presenta una secuencia de bases seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, y sus secuencias perfectamente complementarias.

24. La mezcla de sondas de la reivindicación 22, en la que dicha sonda comprende la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 2 ó su secuencia perfectamente complementaria, y en la que dicha sonda colaboradora presenta una secuencia de bases seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, y sus secuencias perfectamente complementarias.

25. La mezcla de sondas de la reivindicación 22, en la que la secuencia de bases de dicha sonda consiste en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 2 ó su secuencia perfectamente complementaria, y en la que dicha sonda colaboradora presenta una secuencia de bases seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, y sus secuencias perfectamente complementarias.

26. La mezcla de sondas de la reivindicación 22, en la que dicha sonda comprende una región de al menos 10 bases contiguas que es perfectamente complementaria a una región de al menos 10 bases contiguas del rARN de Chlamydia pneumoniae, o del ADN codificador, correspondientes a las bases 224-247 del rARN 16S de Escherichia coli, o del ADN codificador, y en la que dicha sonda colaboradora presenta una secuencia de bases seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, y sus secuencias perfectamente complementarias.

27. La mezcla de sondas de la reivindicación 22, en la que dicha sonda comprende la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 4 ó su secuencia perfectamente complementaria, y en la que dicha sonda colaboradora presenta una secuencia de bases seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, y sus secuencias perfectamente complementarias.

28. La mezcla de sondas de la reivindicación 22, en la que la secuencia de bases de dicha sonda consiste en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 4 ó en su secuencia perfectamente complementaria, y en la que dicha sonda colaboradora presenta una secuencia de bases seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, y sus secuencias perfectamente complementarias.

29. La mezcla de sondas de la reivindicación 22, en la que dicha sonda comprende una región de al menos 10 bases contiguas que es perfectamente complementaria a una región de al menos 10 bases contiguas del rARN de Chlamydia pneumoniae, o del ADN codificador, correspondientes a las bases 623-647 del rARN 16S de Escherichia coli, o del ADN codificador, y en la que dicha sonda colaboradora presenta una secuencia de bases seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, y sus secuencias perfectamente complementarias.

30. La mezcla de sondas de la reivindicación 22, en la que dicha sonda comprende la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 7 ó su secuencia perfectamente complementaria, y en la que dicha sonda colaboradora presenta una secuencia de bases seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, y sus secuencias perfectamente complementarias.

31. La mezcla de sondas de la reivindicación 22, en la que la secuencia de bases de dicha sonda consiste en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 7 ó en su secuencia perfectamente complementaria, y en la que dicha sonda colaboradora presenta una secuencia de bases seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, y sus secuencias perfectamente complementarias.

32. La mezcla de sondas de la reivindicación 22, en la que dicha sonda comprende una región de al menos 10 bases contiguas que es perfectamente complementaria a una región de al menos 10 bases contiguas del rARN de Chlamydia pneumoniae, o del ADN codificador, correspondientes a las bases 1008-1030 del rARN 16S de Escherichia coli, o del ADN codificador, y en la que dicha sonda colaboradora presenta una secuencia de bases seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 12, y sus secuencias perfectamente complementarias.

33. La mezcla de sondas de la reivindicación 22, en la que dicha sonda comprende la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 11 ó su secuencia perfectamente complementaria, y en la que dicha sonda colaboradora presenta una secuencia de bases seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 12, y sus secuencias perfectamente complementarias.

34. La mezcla de sondas de la reivindicación 22, en la que la secuencia de bases de dicha sonda consiste en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 11 ó en su secuencia perfectamente complementaria, y en la que dicha sonda colaboradora presenta una secuencia de bases seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 12, y sus secuencias perfectamente complementarias.

35. La mezcla de sondas de la reivindicación 22, en la que dicha sonda comprende una región de al menos 10 bases contiguas que es perfectamente complementaria a una región de al menos 10 bases contiguas del rARN de Chlamydia pneumoniae, o del ADN codificador, correspondientes a las bases 1711-1733 del rARN 16S de Escherichia coli, o del ADN codificador, y en la que dicha sonda colaboradora presenta una secuencia de bases seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 15, y sus secuencias perfectamente complementarias.

36. La mezcla de sondas de la reivindicación 22, en la que dicha sonda comprende la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 14 ó su secuencia perfectamente complementaria, y en la que dicha sonda colaboradora presenta una secuencia de bases seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 15, y sus secuencias perfectamente complementarias.

37. La mezcla de sondas de la reivindicación 22, en la que la secuencia de bases de dicha sonda consiste en la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 14 ó en su secuencia perfectamente complementaria, y en la que dicha sonda colaboradora presenta una secuencia de bases seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 15, y sus secuencias perfectamente complementarias.

38. Un método para la detección de Chlamydia pneumoniae en una muestra, que comprende las etapas de:

(a): poner en contacto dicha muestra con una sonda de ensayo de hibridación de ácido nucleico como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20; y

(b): detectar la presencia de un híbrido de ácido nucleico que comprende dicha sonda, como indicativo de la presencia de Chlamydia pneumoniae en dicha muestra.