ES2314755T3 - Deteccion y tipificacion de cepas bacterianas de lactobacillus. - Google Patents

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Abstract

Molécula de ácido nucleico aislado seleccionada de entre el grupo constituido por: a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido de SEC. ID nº 1, o su complemento; b) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que presenta por lo menos 75% de identidad de la secuencia con la secuencia de nucleótido de la SEC. ID nº 1, o su complemento; y, c) una molécula de ácido nucleico que comprende 1-140 repeticiones de por lo menos una de las secuencias de nucleótido expuestas en SEC. ID nº 2, SEC. ID nº 3, SEC. ID nº 4, SEC. ID nº 5, SEC. ID nº 6, SEC. ID nº 7, SEC. ID nº 37, SEC. ID nº 38, SEC. ID nº 39, SEC. ID nº 40, SEC. ID nº 41, SEC. ID nº 42, SEC. ID nº 43, SEC. ID nº 44, SEC. ID nº 45, SEC. ID nº 46, SEC. ID nº 47, SEC. ID nº 48.

Description

Detección y tipificación de cepas bacterianas de Lactobacillus.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos para la detección y la tipificación de cepas de Lactobacillus.
Antecedentes de la invención
La diferenciación rápida y precisa de las cepas bacterianas resulta importante cuando se realizan diagnósticos médicos, en los estudios epidemiológicos y para el estudio de la diversidad evolucionaría entre las bacterias. Existen varios procedimientos para la tipificación o detección de las cepas bacterianas, que incluyen RFLP, hibridación y secuenciación. Se han observado los polimorfismos de ADN microsatélite informativos en diferentes cepas de Helicobacter pylori (Marshall et al., (1996) J. Appl. Bacteriol. 81: 509-517). De forma similar, los elementos repetitivos del ADN de Mycobacterium tuberculosis se han utilizado para el seguimiento eficiente de cepas (van soolingen et al. (1993) J. Clin, Microbiol. 31:1987-1995). Además, la variación de las secuencias cortas de repetición (SSR) se ha utilizado para diferenciar cepas de Haemophilus inlfuenzae aisladas de pacientes diferentes (van Belkum et al., (1997) Infect. Immun. 65: 5017-5027). Sin embargo, los procedimientos actuales disponibles para diferenciar eficazmente las cepas bacterianas, como las cepas de Lactobacillus acidoplilus, se fundamentan ya sea en la secuenciación del gen 16SrRNA, que sólo es preciso a nivel de especies, o bien en procedimientos de Electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE).
Las CRISPR (repeticiones polidrómicas cortas interespaciadas regularmente agrupadas: también denominada locus SPIDR (repeticiones directas con espaciadores intercalados), VNTR (número variable de repeticiones tándem), SRVR (repeticiones variables regularmente cortas) y SRSR (repeticiones cortas espaciadas regularmente)), descrito por Jansen et al. (2002) OMICS J. Integr. Biol. 6:23-33, constituyen una familia nueva de secuencias repetidas que están presentes en Bacterias y Archae pero no en Eucariotas. Los locus de repetición consisten generalmente en unas uniones de nucleótidos reforzadas con una longitud de 25 a 37 pares de bases alternadas con espaciadores de ADN no repetitivos de aproximadamente la misma longitud. Cabe indicar el sitio CRIPSR se ha identificado en más de 40 microorganismos (Cansen et al (2002) OMICS J. Integr. Biol. 6:23-33) pero en las bacterias del ácido láctico, sólo se ha descrito en las especies Streptococcus. A pesar de su descubrimiento hace 15 años en E. coli (Ishino et al., (1987) J. Bacteriol. 169:5429-5433), todavía no se ha descubierto la función fisiológica. Las secuencias de nucelótidos de las repeticiones generalmente están altamente conservadas dentro de las especies, pero muestran una similitud muy baja entre las especies. También se ha demostrado que la variabilidad entre los sitios CRISPR no se debe principalmente a los cambios en una única base de nucleótidos, sino más bien de delecciones/inserciones de una repetición completa y de las regiones espaciadoras. Dichas propiedades han llevado al uso del sitio CRISPR como una herramienta de tipificación de las cepas en Mycobacterium (Groenen et al. (1993) Mol. Microbiol. 10:1057-1065).
Como procedimientos para diferenciar las bacterias Lactobacillus, específicamente L. acidophilus o bien no son muy exacto a nivel de la cepa o bien son costosos técnicamente, resulta deseable el desarrollo de unos procedimientos nuevos para la diferenciación de las cepas de Lactobacillus.
Breve sumario de la invención
Se proporcionan las composiciones y los procedimientos para la detección y tipificación de las bacterias, particularmente una cepa de la bacteria Lactobacillus, por ejemplo la cepa Lactobacillus acidophilus. Se presentan las composiciones que incluyen las moléculas de ácidos nucleicos aislados a partir de Lactobacillus acidophilus que comprende una región de ADN, preferentemente situada entre los genes de la ADN polimerasa I (polA) y una ligasa fosforibosilamina-glicina putativa (purD), que consiste en una o más copias de una secuencia repetitiva de ADN de aproximadamente 20-40 pares de bases, tal que aproximadamente 25-35 pares de bases o aproximadamente 27-30 pares de bases, intercaladas con secuencias espaciadoras no repetitivas de aproximadamente la misma longitud. En una forma de realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de 29 pares de bases que está presente 32 veces, y está separada por el mismo número de secuencias espaciadores de 32 pares de bases.
Se muestran composiciones que también incluyen unas moléculas de ácidos nucleicos aislados de Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei y Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus que comprende unas secuencias repetitivas identificadas originalmente en la una región CRISPR. En una forma de realización, la molécula de ácido nucleico aislado comprende una secuencia de 28 pares de bases de L. brevis. En otra forma de realización, la molécula de ácido nucleico aislado comprende una secuencia de 28 pares de bases de L. casei. En otra forma de realización, la molécula de ácido nucleico aislado comprende una secuencia de 28 pares de bases de L. delbrueckii ssp bulgaricus.
La presente invención proporciona además para las moléculas de ácidos nucleicos que comprenden 1-140 repeticiones de la secuencia nucleotídica de la invención. En algunas formas de realización, las moléculas de ácidos nucleicos aisladas comprenden más de 5 repeticiones, más de 10 repeticiones, menos de 50 repeticiones, o menos de 35 repeticiones de la secuencia de nucleótidos de la invención. Las composiciones comprenden también los cebadores para la PCR para la amplificación de esta región en las especies de Lactobacillus, que incluye L. acidophilus, L. brevis, L.caset y L. delbrueckii. Las secuencias de nucleótidos que son complementarias a la secuencia nucleotídica de la invención, o que hibridan con una secuencia de la invención, se describe aquí también. Asimismo se incluyen unos procedimientos y kits para detectar la presencia de una secuencia de ácido nucleico de la invención en una muestra, y los procedimientos y kits para la tipificación de cepas de Lactobacillus, particularmente las cepas de L. acidophilus, L. brevis, L.caset y L. delbrueckii.
Se describen en la presente memoria como referencia las moléculas de ácidos nucleicos variantes suficientemente idénticas a las secuencias de nucleótidos y los fragmentos y los fragmentos suficientemente idénticos a las secuencias de secuencias de nucleótidos. También se describen en la siguiente memoria las moléculas de ácidos nucleicos aislados que comprenden uno o más secuencias de nucleótidos que se encuentran en las SEC. ID nº: 2-50.
Particularmente, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada de entre el grupo constituido por:
a)
molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido de SEC. ID nº 1, o su complemento;
b)
una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que presenta por lo menos 75% de identidad de la secuencia con la secuencia del nucleótido de la SEC. ID nº 1, o su complemento;
c)
una molécula de ácido nucleico que comprende de 1-140 repeticiones de por lo menos una de las secuencias de nucleótidos expuestas en SEC. ID nº 2, SEC. ID nº 3, SEC. ID nº 4, SEC. ID nº 5, SEC. ID nº 6, SEC. ID nº 7, SEC. ID nº 37, SEC. ID nº 38, SEC. ID nº 39, SEC. ID nº 40, SEC. ID nº 41, SEC. ID nº 42, SEC. ID nº 43, SEC. ID nº 44, SEC. ID nº 45, SEC. ID nº 46, SEC. ID nº 47, SEC. ID nº 48.
Se proporcionan los procedimientos de tipificación para la bacteria Lactobacillus que presenta una región CRISPR. Los procedimientos comprenden la obtención de una muestra de la bacteria, la amplificación de una región de ADN que comprende la región CRISPR o su fragmento en la muestra para crear una ADN amplificado; la adición al ADN amplificado de por lo menos una enzima de restricción con el ADN amplificado durante un periodo de tiempo suficiente para formar los fragmentos de restricción; la determinación del número de fragmentos de restricción y sus tamaños; y la tipificación de la bacteria sobre la base del número y el tamaño de los fragmentos de restricción.
También se proporciona un procedimiento para la tipificación de una cepa bacteriana de Lactobacillus. El procedimiento comprende la obtención de una muestra, la amplificación de una región de ADN que comprende por lo menos una de las secuencias de nucleótido descritas anteriormente en las SEC. ID nº: 1-7 y 37-48, o sus variantes, en la muestra para crear una ADN amplificado; y la tipificación de la bacteria basada en el ADN amplificado. Los procedimientos pueden comprender además añadir al ADN amplificado por lo menos un enzima de restricción que reconoce uno o más sitios en el ADN amplificado, incubar el enzima de restricción con el ADN amplificado durante un periodo de tiempo suficiente para formar los fragmentos de restricción, determinar el número de los fragmentos de restricción y su tamaño, y tipificar la cepa bacteriana sobre la base del número y del tamaño de los fragmentos de restricción. Alternativamente, los procedimientos pueden comprender la secuenciación del ADN amplificado para obtener unos resultados de la secuenciación y la tipificación de la cepa bacteriana basada en los resultados de la secuenciación. En una forma de realización, el Lactobacillus es L. acidophilus.
El ADN amplificado se puede obtener proporcionando un primer cebador que se une a la secuencia repetitiva en la región CRISPR, que proporciona un segundo cebador que se une al ADN flanqueante (es decir, anterior o posterior) la región CRISPR, que utiliza los cebadores en una reacción de PRC para crear el ADN amplificado, la separación del ADN amplificado en un gel para producir un patrón de banda diferente que muestra el número y los tamaños del ADN amplificado, y la tipificación de la cepa bacteriana basada en el patrón de banda. El número y los tamaños de las bandas son característicos de la cepa. El ADN amplificado se puede obtener alternativamente proporcionando un primer cebador que se une a la región anterior al ADN de la región CRISPR, y un segundo cebador que se une a la región posterior al ADN de la región CRISPR, que utiliza los cebadores en una reacción de PCR para crear el ADN amplificado, la separación del ADN amplificado en un gel para producir una banda que muestra el tamaño del ADN amplificado, y la tipificación de la cepa bacteriana basada en el tamaño de la banda. El tamaño del ADN amplificado es característico de la cepa.
Se proporcionan los procedimientos para la detección de la presencia de las especies de Lactobacillus en una muestra. Los procedimientos comprenden la obtención de una muestra, la amplificación de una región de ADN que comprende por lo menos una de las secuencias de nucleótidos descritas anteriormente en las SEC. ID nº: 1-7 y 37-48, o sus variantes, en la muestra para crear una ADN amplificado; y la detección del ADN amplificado. Los procedimientos pueden comprender además la adición al ADN amplificado de por lo menos un enzima de restricción que reconoce uno o más sitios en el ADN amplificado, la incubación del enzima de restricción con el ADN amplificado durante un periodo de tiempo suficiente para formar los fragmentos de restricción, la determinación del número de fragmentos de restricción y su tamaño y la detección de la presencia de unas especies de Lactobacillus basada en el número o el tamaño de los fragmentos de restricción. Alternativamente, los procedimientos pueden comprender además la secuenciación del ADN amplificado para obtener unos resultados de la secuenciación y la detección de la presencia de unas especies de Lactobacillus basada en los resultados de la secuenciación.
Los procedimientos de la presente invención resultan útiles para la detección y la tipificación de las cepas de Lactobacillus como las cepas L. acidophilus, L. brevis, L. casei y L. delbrueckii, en productos alimenticios y suplementos, que incluyen alimentos para animales y los suplementos para la alimentación animal, en unas muestras in vivo/in vitro y para el estudio de la diversidad natural de las especies de unas muestras medioambientales. Los procedimientos resultan útiles para el desarrollo del producto y la identificación de unas cepas bacterianas nuevas, particularmente cepas de Lactobacillus.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 representa una región intergénica en Lactobacillus acidophilus que presenta unas características de un locus CRISPR.
La Figura 2 representa las secuencias de nucleótidos de las regiones repetidas en la región intergénica (SEC. ID nº: 1). Las repeticiones de 29-bp están marcadas (SEC. ID nº: 2-7). Una secuencia invertida imperfecta está indicada mediante un subrayado en la última repetición. Las regiones espaciadoras (SEC. ID nº: 8-35) y la región flanqueante (SEC. ID nº: 36) no están marcadas. Las dos secuencias se repiten en una región espaciadora; una se repite dos veces (enmarcada y en negrita) (SEC. ID nº: 15) y una se repite tres veces (mayúsculas y negrita) (SEC. ID nº: 13).
La Figura 3 consiste en unas fotografías de varios experimentos en geles de electroforesis de agarosa. La Figura 3A muestra unos productos de PCR y las Figuras 3B, C y D muestran los resultados de los fragmentos de restricción. A. Carril M marcador de peso molecular de 1Kb; Carril 1 - NCFM®; Carril 2 - Cepa C; Carril 3 - Cepa D; Carril 4 - ATCC 4356; Carril 5 - Cepa B; carril 6 - Cepa E. B. Carril M marcador de peso molecular de 50 bp; Carril 1 - NCFM®3; Carril 2 - Cepa C; Carril 3 - Cepa D; Carril 4 - ATCC 4356; Carril 5 - ATCC 4357; carril 6 - Cepa B. C. Carril M marcador de peso molecular de 50 bp; Carril 1 - NCFM®; Carril 2 - Cepa C; Carril 3 - Cepa D; Carril 4 - ATCC 4356; Carril 5 - ATCC 4357; carril 6 - Cepa B. D. Carril M marcador de peso molecular de 50 pb; Carril 1 - NCFM®; Carril 2 - Cepa C; Carril 3 - Cepa D; Carril 4 - ATCC 4356; Carril 5 - ATCC 4357; carril 6 - Cepa B.
La Figura 4 es una fotografía de los productos de PCR de las cepas siguientes: Carril 1 - L. acidophilus NCFM®; Carril 2 - L. acidophilus Lac-1; Carril 3 - L. acidophilus Lac-2; Carril 4 - L. acidophilus Lac-3; Carril 5 - L. acidophilus ATCC 4355; Carril 6 - L. acidophilus ATCC 4356; Carril 7 - L. acidophilus ATCC 4357; Carril 8 - L. acidophilus ATCC 4796; Carril 9 - L. helveticus ATCC 521; Carril 10 - L. acidophilus ATCC 832; Carril 11 - L. acidophilus ATCC 9224; Carril 12 - L. acidophilus ATCC 11975; Carril 13 - L. acidophilus ATCC 314; Carril 14 - L. gasseri ATCC 43121; Carril 15 - L. acidophilus Lac-4; Carril 16 - L. acidophilus Lac-5; Carril 17 - L. amylovorus ATCC 33198; Carril 18 - L. gallinarum ATCC 33199; Carril 19 - L. gasseri ATCC 33323; Carril 20 - L. johnosonii ATCC 33200; Carril 21 - L. crispatus Lcr-1; Carril 22 - L. helveticus Lhe-1; Carril 23 - control (sin ADN).
La Figura 5 es una fotografía de unas bandas que resultan de la amplificación por PCR seguida de una digestión de restricción de las cepas siguientes: Carril 1 - L. acidophilus NCFM®; Carril 2 - L. acidophilus Lac-1; Carril 3 - L. acidophilus Lac-2; Carril 4 - L. acidophilus Lac-3; Carril 5 - L. acidophilus ATCC 4355; Carril 6 - L. acidophilus ATCC 4356; Carril 7 - L. acidophilus ATCC 4357; Carril 8 - L. acidophilus ATCC 4796; Carril 9 - L. acidophilus ATCC 832; Carril 10 - L. acidophilus ATCC 9224; Carril 11 - L. acidophilus ATCC 11975; Carril 12 - L. acidophilus ATCC 314; Carril 13 - L. acidophilus Lac-4; Carril 14 - L. acidophilus Lac-5.
La Figura 6 es una imagen que muestra la electroforesis en gel de campo pulsado de L. acidophilus NCFM® (Carril 1); L. acidophilus Lac-1 (Carril 2); L. acidophilus Lac-3 (Carril 3); y L. acidophilus ATCC 4356 (Carril 4).
La Figura 7 muestra una secuencia de repetición de L. acidophilus (Lac) (SEC. ID nº 37); L. brevis (Lbr) (SEC. ID nº 38); L. Casei (Lca) (SEC. ID nº 45); y L. delbrueckii ssp. Bulgaricus (Lde) (SEC. ID nº 46). Los nucleótidos variantes y sus posiciones se muestran debajo de la secuencia principal.
Descripción detalla de la invención
La presente invención se refiere a los procedimientos para la detección y/o tipificación de las cepas de Lactobacillus, que incluye Lactobacillus acidophilus, L. brevis, L. casei y L. delbrueckii. Dichos procedimientos se pueden utilizar en los diagnósticos médicos y de seguridad alimenticia o en investigación. Por "tipificación" o "diferenciación" se hace referencia a la identificación de la cepa de una bacteria, que incluye identificar que es diferente de otras cepas basado en su secuencia de nucleótidos (es decir, mediante el análisis del patrón de banda que resulta de la digestión con enzimas de restricción). Por "detección" se hace referencia a la comprobación de la presencia o ausencia de unas especies de bacteria en una muestra. Las composiciones de la invención incluyen unas moléculas de ácidos nucleicos aislados de L. acidophilus, L. brevis, L. casei y L. delbrueckii que son parte del sitio CRISPR. Por "región CRISPR" o "sitio CRISPR" se hace referencia a una porción repetitiva de una secuencia de nucleótidos, en la que las repeticiones son de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 pares de bases en longitud, y se alternan por unos espaciadores de ADN no repetidos de aproximadamente igual tamaño. Los acrónimos CRISPR, SPIDR, VNTR y SRVR se han utilizado para describir una secuencia de nucleótidos que presenta unas repeticiones interespaciadas.
Adicionalmente, la presente invención proporciona unos procedimientos y unos kits para la tipificación bacteriana que se puede utilizar para determinar similitudes y/o diferencias entre las cepas bacterianas, particularmente las cepas Lactobacillus, que incluye L. acidophilus, L. brevis, L. casei y L. delbrueckii y procedimientos y kits para la detección de la presencia o ausencia de las especies de Lactobacillus en una muestra. Más particularmente, los procedimientos implican un procedimiento rápido, semiautomático para la detección y/p tipificación de las cepas de organismos eucariotas, como L. acidophilus, en la que la secuencia de ADN CRISPR se amplifica y se utiliza para diferenciar entre las cepas de Lactobacillus, o para la detección de unas especies de Lactobacillus.
Las moléculas de ácidos nucleicos aislados de la presente invención se seleccionan de entre el grupo constituido por:
a)
una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido de SEC. ID nº: 1 o su complemento;
b)
una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que presenta por lo menos el 75% de identidad de la secuencia con la secuencia de nucleótido de la SEC. ID nº: 1 o su complemento; y
c)
una molécula de ácido nucleico que comprende 1-140 repeticiones de por lo menos una de las secuencias de nucleótido descritas en las SEC. ID nº 2, SEC. ID nº 3, SEC. ID nº 4, SEC. ID nº 5, SEC. ID nº 6, SEC. ID nº 7, SEC. ID nº 37, SEC. ID nº 38, SEC. ID nº 39, SEC. ID nº 40, SEC. ID nº 41, SEC. ID nº 42, SEC. ID nº 43, SEC. ID nº 44, SEC. ID nº 45, SEC. ID nº 46, SEC. ID nº 47, SEC. ID nº 48.
Las composiciones de ácidos nucleicos comprendidas en la presente invención se aíslan o se purifican sustancialmente. Por "aislado" o "sustancialmente purificado" se hace referencia a que las moléculas de ácidos nucleicos o los fragmentos activos biológicamente o variantes, están sustancialmente o esencialmente libres de componentes que normalmente se encuentran en asociación con el ácido nucleico en su estado natural. Dichos componentes incluyen otro material celular, medio de cultivo de la producción de recombinante y varias sustancias químicas que se utilizan en la síntesis química de ácidos nucleicos. Preferentemente, un ácido nucleico "aislado" de la presente invención está libre de secuencias de ácidos nucleicos que flanquean el ácido nucleico de interés en el ADN genómico del organismo del que se deriva el ácido nucleico (como las secuencias codificantes presentes en los extremos 5' ó 3'). Sin embargo, la molécula puede incluir además bases o grupos que no afectan negativamente las características básicas de la composición. Por ejemplo, en varias formas de realización, el ácido nucleico aislado contiene menos de 5 kb, 4 kb, 3kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ó 0,1 kb de la secuencia de ácido nucleico que normalmente se asocia con el ADN genómico en las células de las que deriva.
Las composiciones y los procedimientos de la presente invención se puede utilizar para detectar las especies de Lactobacillus, que incluyen L. acidophilus, L. brevis, L. casei y L. delbrueckii o para tipificar las especies bacterianas que incluyen cepas de L. acidophilus muy estrechamente relacionadas, tanto en el laboratorio como en los productos comerciales. Esto resulta útil para el desarrollo del producto, así como para la investigación sobre la diversidad y evolución de las especies bacterianas, y en la identificación de cepas bacterianas nuevas, que incluye unas cepas nuevas de Lactobacillus.
Detección y diferenciación de las cepas bacterianas
Los sitios CRISPR son una clase diferente de repeticiones de secuencias cortas intercaladas que se reconocieron primero en E. coli (Ishino et al., (1987) J. Bacteriol. 169: 5429-5433; Nakata et al., (1989) J. Bacteriol. 169: 3553-3556). Se han identificado las SSRs intercaladas similares en Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena y Mycobacterium tuberculosis (Groenen et al., (1993) Mol. Microbiol. 10: 1057-1065; Hoe et al., (1999) Emerg. Infect. Dis. 5: 254-263; Masepohl et al., (1996) Biochim. Biophys. Acta 1307: 26-30; Mojica et al., (1995) Mol. Microbiol. 17: 85-93). Los sitios CRISPR son diferentes de los otros SSR por la estructura de las repeticiones, que se han denominado repeticiones espaciadas cortas regulares (SRSRs) (Janssen et al., (2002) OMICS J. Integ. Biol. 6: 23-33; Mojica et al. (2000) Mol. Microbiol. 36: 244-246). Las repeticiones son elementos cortos que se presentan como aglomeraciones, que siempre están separadas regularmente por unas secuencias únicas que intervienen con una longitud constante (Mojica et al. (2000) Mol. Microbiol. 36: 244-246). A pesar de que las secuencias de repeticiones están altamente conservadas entre las cepas, el número de repeticiones interespaciadas y las secuencias de las regiones espaciadoras difieren de una cepa a otra (van Embden et al., (2000) J. Bacteriol. 182:2393- 2401). Los procedimientos para la identificación de las regiones CRISPS son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, las referencias anteriores, así como los procedimientos utilizados en el Ejemplo 1). Los procedimientos de la presente invención se ejemplifican en la memoria presente mediante unos experimentos que implican L. acidophilus; sin embargo, un experto en la materia puede reconocer que los procedimientos se pueden utilizar para la detección y/o la identificación de cepas de una bacteria que presente una región CRISPR.
El número de nucleótidos en una repetición generalmente es desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 40 pares de bases, pero puede ser desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 39 pares de bases, desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 37 pares de bases, desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 35 pares de bases, desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 33 pares de bases, desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 30 pares de bases, desde aproximadamente 21 hasta aproximadamente 40 pares de bases, desde aproximadamente 21 hasta aproximadamente 39 pares de bases, desde aproximadamente 21 hasta aproximadamente 37 pares de bases, desde aproximadamente 23 hasta aproximadamente 40 pares de bases, desde aproximadamente 23 hasta aproximadamente 39 pares de bases, desde aproximadamente 23 hasta aproximadamente 37 pares de bases, desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 40 pares de bases, desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 39 pares de bases, desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 37 pares de bases o desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 35 pares de bases o desde aproximadamente 28 ó 29 pares de bases. El número de repeticiones puede variar desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 140, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100, desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 100, desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 100, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100, desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 100, desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 100, desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 100, desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 100, desde aproximadamente 35 hasta aproximadamente 100, desde aproximadamente 40 hasta aproximadamente 100, desde aproximadamente 45 hasta aproximadamente 100, desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 100, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 135, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 130, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 125, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 120, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 115, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 110, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 105, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 95, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 90, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 80, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 70, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 60, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 140, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 130, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 120, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 110, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 95, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 90, desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 80, desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 70, desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 60, desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 50, desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 40 ó aproximadamente 32.
Las secuencias de nucleótidos que se describen en la memoria presente se puede utilizar para detectar las especies de Lactobacillus, y/o para diferenciar las cepas bacterianas, que incluye la diferenciación de L. acidophilus NCFM® de otras cepas de L. acidophilus. La detección y/o la diferenciación se basa en la identificación de unas regiones nuevas de CRISPR en L. acidophilus NCFM®, L. brevis, L. casei y L. delbrueckii subespecies bulgaricus. Las regiones CRISPR son específicas de las cepas. La presente invención es aplicable al ensayo de medicamentos, el ensayo de alimentos, el ensayo agrícola y el ensayo medioambiental.
Se dan a conocer unos ensayos diagnósticos para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en una muestra. Dichos procedimientos comprenden la obtención de una muestra, la amplificación de una región del ADN que comprende por lo menos una de las SEC. ID nº: 1-7 y 37-48, para crear un ADN amplificado y la detección de un ADN amplificado. La detección del ADN amplificado es específica para unas especies de Lactobacillus. Las cepas diferentes de unas especies de Lactobacillus, como unas especies L. acidophilus, pueden tener unos tamaños diferentes del ADN amplificado. Por consiguiente, este procedimiento se puede utilizar también como una herramienta para la diferenciación de cepas. El procedimiento puede además comprender la secuenciación del ADN amplificado y la detección de unas especies de Lactobacillus, como L. acidophilus, L. brevis, L. casei ó L. delbrueckii basada en los resultados de la secuenciación. Alternativamente, el procedimiento puede comprender además la adición al ADN amplificado de por lo menos un enzima de restricción que reconoce uno o más sitios en el ADN amplificado, la incubación del enzima de restricción con el ADN amplificado durante un periodo de tiempo suficiente para formar los fragmentos de restricción, la determinación del número y el tamaño de los fragmentos de restricción y la detección de la presencia de unas especies de Lactobacillus, como L. acidophilus, L. brevis, L. casei ó L. delbrueckii basada en el número y el tamaño de los fragmentos de restricción.
Se proporcionan unos procedimientos para la tipificación de Lactobacillus. Estos procedimientos comprenden la obtención de una muestra, la amplificación de una región de ADN que comprende por lo menos una de las secuencias de nucleótidos descritas anteriormente en las SEC. ID nº: 1-7 y 37-48, o sus variantes, en la muestra para crear una ADN amplificado; y la detección del ADN amplificado. Esta tipificación se puede llevar a cabo por la adición al ADN amplificado de por lo menos un enzima de restricción que reconoce uno o más sitios en el ADN amplificado, la incubación del enzima de restricción con el ADN amplificado durante un periodo de tiempo suficiente para formar los fragmentos de restricción, la determinación del número de los fragmentos de restricción y su tamaño, y la tipificación de la cepa bacteriana basado en el número y el tamaño de los fragmentos de restricción. La tipificación se puede llevar a cabo también mediante la secuenciación del ADN amplificado, y la tipificación de la cepa bacteriana basada en los resultados de secuenciación. En una forma de realización, la región de ADN que se va a amplificar comprende la SEC. ID nº: 1. En otra forma de realización, la región de ADN comprende una secuencia de nucleótidos que presenta por lo menos un 75% de identidad de la secuencia con por lo menos una de las SEC. ID nº: 1-7 y 37-48.
El ADN amplificado se puede obtener proporcionando un primer cebador que se une a una región de ADN que flanquea la región CRISPR, dicha región anterior ADN a la región CRISPR, y un segundo cebador que se une a una región de ADN que flanquea la región CRISPR, dicho región posterior al ADN de la región CRISPR, que utiliza los cebadores en una reacción de PCR para crear el ADN amplificado, la separación del ADN amplificado en un gel para producir una banda que muestra el tamaño del ADN CRISPR amplificado, y la tipificación de la cepa bacteriana basada en el tamaño de la banda. El tamaño del ADN amplificado es característico de la cepa de Lactobacillus. En una forma de realización, el primer cebador se une a la región anterior al ADN de la región CRISPR, dicha región como la descrita en la SEC. ID nº: 49, el segundo cebador se une a la región posterior del ADN de la región CRISPR, dicha región como la descrita en la SEC. ID nº: 50.
Alternativamente, el ADN amplificado se puede obtener proporcionando un primer cebador que se une a la secuencia repetitiva en la región CRISPR, que proporciona un segundo cebador que se une al ADN flanqueante (es decir, anterior o posterior) la región CRISPR, que utiliza los cebadores en una reacción de PRC para crear el ADN amplificado, la separación del ADN amplificado en un gel para producir un patrón de banda diferente que muestra el número y los tamaños del ADN amplificado, y la tipificación de la cepa bacteriana basada en el patrón de banda. El número y los tamaños de las bandas son para diagnosticar la cepa de Lactobacillus. En una forma de realización, el primer cebador se une a una de las SEC. ID nº: 2-7 y 37-48, y el segundo cebador se une al ADN flanqueante de una de las SEC. ID nº: 2-7 y 37-48.
El procedimiento en el que un cebador se une a una de las SEC. ID nº: 2-7 y 37-48 produce varias bandas de tamaños variados, en función del número y el espaciado de las repeticiones en relación con el cebador anclado. Por ejemplo, si la región repetida está presente cinco veces, el cebador complementario con la región repetida se unirá en cinco lugares para generar cinco bandas que se pueden visualizar como una huella en un gel de agarosa o de poliacrilamida. Los productos de PCR se pueden amplificar a diferentes longitudes y algunas de las bandas resultantes no se pueden por consiguiente visualizar tan fácilmente como otras, si es que se visualizan. El patrón de banda diferente muestra el número y el tamaño del ADN amplificado, y se puede utilizar para caracterizar las cepas de Lactobacillus que incluyen las cepas de L. acidophilus, L. brevis, L. casei y L. delbrueckii.
El término "muestra" hace referencia a tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como células de los cultivos de partida (madre, semilla, total/conjunto, concentrado, seco, liofilizado, congelado) o productos alimenticios/lácteos/de alimentación que presentan dichos cultivos, o derivados del uso de dichos cultivos. La muestra puede ser un suplemento alimentario, un fermento bioprocesado, o un sujeto que ha ingerido una sustancia que comprende la secuencia de nucleótidos. Es decir, el procedimiento de detección de la invención se puede utilizar para detectar el ADN genómico que comprende una secuencia de nucleótidos descritos en una muestra tanto in vitro como in vivo. Las técnicas in vitro para la detección de ADN genómico que comprende las secuencias de nucleótidos descritos incluye, pero no se limita, a las hibridaciones Southern. Los resultados obtenidos en una muestra a partir de alimentos, suplementos, cultivo, producto o un sujeto se pueden comparar a partir de una muestra a partir de un cultivo control producto o sujeto. En una forma de realización, la muestra contiene ADN genómico a partir de un cultivo de partida.
La amplificación de la región de ADN deseada se puede conseguir utilizando un procedimiento conocido en la técnica, que incluye una reacción en cadena de polimerasa (PCR). Por "amplificación" se hace referencia la producción de copias adicionales de la secuencia de ácido nucleico. Esto se lleva a cabo generalmente utilizando unas técnicas de PCR bien conocidas en la técnica (Dieffenbach y Dveksler (1995) PCR Primer, a Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Plainview, New york). Por "reacción en cadena de polimerasa" o "PCR" se hace referencia a un procedimiento como el que se da a conocer en las patentes US nº 4.683.195 y nº 4.683.202 que describe el procedimiento para aumentar la concentración de un segmento de una secuencia diana en una mezcla de ADN genómico sin clonación ni purificación. La longitud del segmento amplificado de la secuencia diana deseada se determina mediante las posiciones relativas de dos cebadores oligonucleótidos con respecto a cada uno, y por consiguiente, dicha longitud es un parámetro controlable. En virtud del aspecto repetido del procedimiento, el procedimiento se define como "PCR". Debido a que los segmentos amplificables deseados de la secuencia diana se ha convertido en unas secuencias predominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se denomina "PCR amplificada".
En un abordaje de PCR, los cebadores de oligonucleótidos se pueden diseñar para la utilización en unas reacciones de PCR para amplificar toda o parte de los sitios CRISPR. Por "cebador" se hace referencia a un oligonucleótido, ya sea cuando se da naturalmente en una digestión por restricción purificada o producido sintéticamente, que puede actuar como un punto de partida de la síntesis cuando se sitúa en unas condiciones en los que la síntesis de un producto de extensión del cebador que resulta complementaria a la hebra de ácido nucleico (es decir, la presencia de nucleótidos y el agente de inducción como ADN polimerasa y a una temperatura y pH adecuados). El cebador presenta preferentemente de una sola hebra para la eficiencia máxima de la amplificación, pero alternativamente puede presentar doble hebra. Si es de doble hebra, el cebador se trata primero para separar sus hebras antes de ser utilizado para preparar los productos de extensión. Preferentemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe ser lo suficientemente largo para cebar la síntesis de los productos de extensión en presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de varios factores, que incluye la temperatura, la fuente del cebador, y la utilización del procedimiento. Los cebadores de PCR son preferentemente de por lo menos 10 nucleótidos de longitud, y más preferentemente de por lo menos 20 nucleótidos de longitud.
Las composiciones de la invención incluyen unos cebadores de oligonucleótidos que se pueden utilizar para amplificar dichas regiones repetitivas. Los ejemplos de cebadores de PCR que se pueden utilizar en los procedimientos de la invención incluyen unos cebadores que se unen a una región de ADN genómico que flanquea la región CRISPR, como los que se encuentran en las SEC. ID nº: 49 y 50, o unos cebadores que se une a la SEC. ID nº: 36, o unos cebadores que se unen dentro de la región CRISPR o su combinación. El cebador que va hacia delante y el inverso se diseñan para amplificar toda o parte de la región CRISPR. Por "flanqueante" se hace referencia a una región 5' (anterior) o 3' (posterior) de la secuencia. En algunas formas de realización, por lo menos un cebador se une a la primera secuencia de repetición (por ejemplo, SEC. ID nº: 2) y un cebador se une a la secuencia de que flanquea la secuencia de ADN (por ejemplo, SEC. ID nº: 36), por lo tanto amplifica toda la región CRISPR. En algunas formas de realización, ambos cebadores se unen al ADN que flanquea la región CRISPR. Los cebadores que se diseñan para unirse al ADN que flanquea una región CRISPR deben ser específicos de las especies, por ello este ADN que flanquea no se espera que comparta bastante identidad de secuencia entre todas las especies de Lactobacillus.
Las secuencias repetitivas en estas regiones CRISPR muestran una homología de nucleótidos unas con otras (ver Figura 7). Las secuencias repetitivas de L. acidophilus son por lo menos el 86% idénticas las unas con las otras. Las secuencias repetitivas de L. brevis son por lo menos el 82% idénticas las unas con las otras. Las secuencias repetitivas de L. delbrueckii ssp. Bulgaricus son por lo menos el 89% idénticas las unas con las otras. Las secuencias repetitivas de L. acidophilus son por lo menos el 57% idénticas con las secuencias repetitivas de L. brevis. Las secuencias repetitivas de L. acidophilus son por lo menos el 71% idénticas con las secuencias repetitivas de L. casei. Las secuencias repetitivas de L. acidophilus son por lo menos el 75% idénticas con las secuencias repetitivas de L. delbrueckii. Las secuencias repetitivas de L. brevis son por lo menos el 64% idénticas con las secuencias repetitivas de L. casei. Las secuencias repetitivas de L. brevis son por lo menos el 64% idénticas con las secuencias repetitivas de L. delbrueckii. Las secuencias repetitivas de L. casei son por lo menos el 71% idénticas con las secuencias repetitivas de L. delbrueckii.
Cuando la secuencia de ADN que flanquea la región CRISPR es conocida, un experto en la materia puede diseñar unos cebadores para amplificar la región CRISPR basado en esta secuencia flanqueante conocida. Cuando la secuencia de ADN que flanquea la región CRISPR todavía no es conocida, un experto en la materia puede determinar esta secuencia flanqueante utilizando los procedimientos conocidos en la técnica. El genoma completo de L. acidophilus NCFM se proporciona en la solicitud provisional U.S Nº 60/622.712 y Eltermann et al, (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102:3906-3912. El genoma completo de L. plantarum se proporciona en Kleerebezen et al, (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:1190-1995. El genoma completo de L. johnsonii se proporciona en Pridmore et al, (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:2515-2517.
Los procedimientos para el diseño de los cebadores de PCR y para la clonación por PCR son conocidos generalmente en la técnica y se dan a conocer en Sambrook et al. (1989) Molecular cloning, a Laboratory Manual (2º Ed. Cold Spring Harbor Press, Plainview, Nueva York). Ver también Innis et al., eds (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York), Innis y Gelfand, eds (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York), Innis y Gelfand, eds (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Los procedimientos conocidos de PCR incluyen, pero no se limitan a, los procedimientos que utilizan cebadores emparejados, cebadores anidados, cebadores solos específicos, cebadores degenerados, cebadores específicos de genes, cebadores específicos de vector, parcialmente desparejados, y similares.
Con la PCR es posible amplificar una sola copia de una secuencia diana específica a un nivel detectable por varias metodologías diferentes (por ejemplo, hibridación con una sonda marcada; incorporación de unos cebadores biotinilados seguidos de la detección del conjugado avidita-enzima; incorporación de desonucleótidos trifosfato marcados con ^{32}P, como dCTP o dATP, en el segmento amplificado). Además del ADN genómico, se puede amplificar cualquier secuencia de oligonucleótidos con el conjunto adecuado de moléculas cebadoras. En particular, los segmentos amplificados creados por el procedimiento de PCR sí mismo son, ellas mismas, unos moldes eficaces para las posteriores amplificaciones de PCR.
La amplificación en PCR requiere unos "reactivos de PCR" o unos "materiales de PCR", que en la presente memoria se definen como todos los reactivos necesarios para llevar a cabo la amplificación excepto la polimerasa, el cebador, y el molde. Los reactivos de PCR normalmente incluyen unos precursores de ácido nucleico (dCTP, dTTP, etc.) y un tampón.
Una vez el ADN que comprende el sitio CRISPR o su porción se ha amplificado, después se debe digerir (cortar) con un enzima de restricción. Tal como s utiliza en la presente memoria, los términos "endonucleasas de restricción" y "enzimas de restricción" se refiere a los enzimas bacterianos, cada uno de los cuales rompe el ADN de doble hebra en una secuencia nucleotídica específica o cerca de la misma. Los enzimas de restricción son bien conocidos en la técnica y se pueden obtener fácilmente, por ejemplo, a partir de una variedad de fuentes comerciales (por ejemplo, New England Biolabs, Inc., Beverly, Massachussets). Similarmente, los procedimientos para la utilización de los enzimas de restricción también son conocidos y de rutina en la técnica. Los enzimas de restricción preferidos con aquellos que producen entre 10 y 24 fragmentos de ADN cuando se corta el sitio CRISPR (por ejemplo, SEC. ID nº: 1). Los ejemplos de dichos enzimas incluyen, pero no se limitan a, AluI, MseI y Tsp5091. Los fragmentos de ADN obtenidos que utilizan los enzimas de restricción se pueden detectar, por ejemplo, como bandas por electroforesis en gel. Los enzimas de restricción se puede utilizar para crear polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP). Los RFLP son, en esencia, unos huellas de memoria únicas de una pieza de ADN, ya sea del cromosoma total (genoma) o una parte del
mismo, como la región del genoma que comprende el sitio CRISPR L. acidophilus descrita en la presente invención.
Los RFLP se generan cortando ("restringiendo") una molécula de ADN con una endonucleasa de restricción. Varios centenares de dichos enzimas se han aislado, como se hace naturalmente por la bacteria. En esencia, la bacteria utiliza dichos enzimas como un sistema de defensa, para reconocer y después cortar (restringir) cualquier molécula de ADN extraña que puede entrar en la célula bacteriana (por ejemplo, una infección vírica). Se ha encontrado que cada uno de estos varios centenares de diferentes enzimas de restricción corta (es decir, "rompe" o "restringe") el ADN en una secuencia diferente de los 4 nucleótidos básicos (A, T, G, C) que forman todas las moléculas de ADN, por ejemplo, un enzima puede reconocer solo y específicamente la secuencia A-A-T-G-A-C, mientras que otro enzima puede reconocer solo y específicamente la secuencia G-T-A-C-T-A, etc. Dependiendo del enzima único implicado, dichas secuencias de reconocimiento puede variar en longitud, desde tan solo 4 nucleótidos hasta 21 nucleótidos. Cuanto más larga es la secuencia de reconocimiento, dará como resultado unos fragmentos de restricción más cortos, y cuando más grande es el sitio de reconocimiento, más baja será la probabilidad que se encuentre repetidamente a lo largo del ADN.
Después de la digestión, los fragmentos individuales resultantes se separan desde uno a otro basado en su tamaño. Cualquier procedimiento para la separación de ADN comprende los procedimientos de la invención, que incluye, pero no se limita a, electroforesis en gel, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), espectroscopia de masas, y la utilización de dispositivo microfluido. En una forma de realización, los fragmentos de ADN se separan por electroforesis en gel de agarosa. La electroforesis en gel separa las moléculas cargadas de tamaños diferentes por su velocidad de desplazamiento a través de un gel estacionario bajo la influencia de una corriente eléctrica. Dichos fragmentos de ADN separados se pueden visualizar fácilmente, por ejemplo, por tinción con bromuro de etidio y visionando el gel bajo una fuente de luz ultravioleta. El patrón de las bandas refleja los tamaños del ADN digerido por restricción.
Alternativamente a la realización de RFLP en el sitio CRISPR amplificado, la secuencia del ADN amplificado se puede obtener mediante cualquier procedimientos conocido en la técnica, que incluye los procedimientos de secuenciación automática y manual. Ver, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular cloning, a Laboratory Manual (2º Ed. Cold Spring Harbor Press, Plainview, Nueva York; Roe et al., (1996) DNA Isolation and Sequencing (Essential Techniques, John wiley & Sons).
También se describen en la presente memoria, otros procedimientos que utilizan las regiones repetitivas de CRISPR nuevas de la invención para detectar y/o tipificar las cepas de Lactobacillus. Dichos procedimientos incluyen los procedimientos de hibridación, ya sea que utiliza una molécula de ácido nucleico de la invención como sonda, o una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar con una secuencia de nucleótidos descrita de la presente invención. Ver, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular cloning, a Laboratory Manual (2º Ed. Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York).
En la técnicas de hibridación, las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, productos amplificados por PCR, o sus oligonucleótidos y puede comprender toda la secuencia de nucleótidos conocida o parte de la misma descrita en la presente memoria. Además, se puede marcar con un grupo detectable como P^{32}, o cualquier otro mercador detectable, como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, o una co-factor del enzima. El térmico "marcado", en relación con la sonda, se prevé comprender el marcado directo de la sonda por acoplamiento (por ejemplo unión física) de una sustancia detectable a la sonda, así como el marcado indirecto de la sonda por reactividad con otro reactivo que se marca directamente. Los ejemplos de marcado indirecto incluyen el marcado final de la sonda de ADN con biotina tal como se puede detectar con estreptavidina marcada fluorescentemente.
Las sondas de hibridación se pueden preparar por marcado de oligonucleótidos sintéticos basado en las secuencias de nucleótidos de la región CRISPR conocidas descritas en la presente memoria. En una forma de realización, la secuencia de nucleótidos de la región CRISPR de L. acidophilus (SEC. ID nº: 1) se utiliza como sonda para detectar y/o diferenciar una cepa de L. acidophilus. En otra forma de realización, la sonda es un fragmento de una secuencia de nucleótidos descrita en la presente memoria, como una sonda constituida por una secuencia repetitiva única, como se ha descubierto en una de las SEC. ID nº: 2-7 y 37-48. En otra forma de realización, la sonda es una secuencia que se encuentra en una región espaciadora, por ejemplo en una de las SEC. ID nº: 8-35. En otra forma de realización, la sonda es una región flanqueante, como SEC. ID nº:36. La sonda de hibridación generalmente comprende una región de la secuencia de nucleótidos que hibrida bajo unas condiciones estrictas con por lo menos aproximadamente 10, preferentemente aproximadamente 20, más preferentemente aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 ó 400 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos de una región CRISPR de la invención o un fragmento o su variante. La preparación de sondas para la hibridación generalmente es conocida en la técnica y se da a conocer en Sambrook et al. (1989) Molecular cloning, a Laboratory Manual (2º Ed. Cold Spring Harbor Press, Plainview, Nueva York), incorporado en la presente memoria como referencia.
Sustancialmente unas secuencias idénticas hibridarán con cada una bajo unas condiciones estrictas. Por "condiciones estrictas" se hace referencia a unas condiciones bajo las cuales una sonda hibridará con su secuencia diana a un grado detectablemente mayor que con otras secuencias (por ejemplo, por lo menos el doble del valor de base).Las condiciones estrictas son conocidas en la técnica y se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York (1989)), 6.3.1-6.3.6.
Cuando se utilizan unas sondas, las condiciones astringentes serán aquellas en las que la concentración de sal es inferior a aproximadamente ión Na 1,5M, generalmente aproximadamente una concentración ión Na (u otras sales) de 0,01M a 1,0 M a un pH de 7,0 hasta 8,3 y la temperatura es por lo menos 30ºC para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60ºC para las sondas largas (por ejemplo, superior a 50 nucleótidos).
Los lavados pos-hibridación son instrumentales en especificidad controladoras. Los dos factores críticos son una densidad iónica y la temperatura de la solución del lavado final. Para al detección de las secuencias que hibridan con toda la longitud o aproximadamente toda la longitud de la secuencia diana, la temperatura bajo estas condiciones estrictas se selecciona para situarse a una temperatura aproximadamente 5ºC por debajo del punto de fusión térmica T_{m} para la secuencia específica a una densidad iónica y un pH definidos. Sin embargo, las condiciones astringentes comprenderán las temperaturas en el intervalo de 1ºC a 20ºC por debajo de la T_{m} dependiendo del grado de astringencia deseado como se ha calificado de otro modo en la presente memoria. Para los híbridos ADN-ADN, la T_{m} se puede determinar utilizando la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284: T_{m} = 81,5ºC + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC)-0,61 (%forma)- 500/L; en el que M es la molaridad de los cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos guanosina y citosina en el ADN, % de forma es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en los pares de bases. La T_{m} es la temperatura (bajo una densidad iónica y pH definidos) a la cual el 50% de la secuencia diana complementaria hibrida con una sonda aparejada
perfectamente.
La capacidad para detectar las secuencias con unos grados de homología variables se puede obtener mediante la variación de las condiciones de hibridación y/o lavado. Para las secuencias que son 100% idénticas (sondeo homólogo), las condiciones de astringencia se deben obtener para no permitir un mal apareamiento. Al permitir que se produzca un mal apareamiento de los residuos de nucléotidos, se pueden detectar las secuencias con un grado de similitud más bajo (sondeo heterólogo). Para cada 1% de mal apareamiento, la Tm se reduce en aproximadamente 1ºC; por consiguiente, las condiciones de hibridación y/o lavado se pueden manipular para permitir la hibridación de las secuencias con un porcentaje de identidad diana. Por ejemplo, si se prefieren las secuencias con una identidad de secuencia \geq al 90%, al T_{m} se puede disminuir en 10ºC.
Las condiciones de astringencia bajas incluyen la hibridación con una solución tampón de 30-35% de formamida, NaCl 1M, SDS 1% (dodecilsulfato sódico) a una temperatura de 37ºC, y un lavado en SSC de 1X a 2X (20X SSC = NaCl 3,0 M/citrato trisódico 0,3 M) a una temperatura de 50 a 55ºC. Las condiciones ejemplares de astringencia moderada incluyen la hibridación en 40 al 45% de formamida, NaCl 1.0 M, SDS 1% a una temperatura de 37ºC, y un lavado en SSC de 0,5X a 1X a una temperatura de 55 a 60ºC. Las condiciones ejemplares de astringencia elevada incluyen la hibridación en el 50% de formamida, NaCl 1M, SDS 1% a una temperatura de 37ºC, y un lavado en SSC a 1X a una temperatura de 60 a 65ºC. Opcionalmente, los tampones de lavado pueden comprender desde aproximadamente 0,1% al aproximadamente el 1% de SDS. LA duración de la hibridación generalmente es de menos de 24 horas, frecuentemente aproximadamente 4 hasta aproximadamente 12 horas. Una guía extensa para la hibridación de los ácidos nucleicos se encuentra en Tijseen (1993) Nucleic Acid Probes, Parte 1, capítulo 2 (Elsevier, New York); y Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 2 (Greene Publishing y Wiley-Interscience, New York). Ver Sambrook et al. (1989) Molecular cloning, a Laboratory Manual (2º Ed. Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York).
Los procedimientos que comprenden las técnicas de hibridación para detectar o diferenciar las cepas bacterianas también están contemplados. Estos incluyen, pero no se limitan a, transferencia de Southern (ver, por ejemplo, Van Embden et al., (1993) J. Clin Microbiol, 31: 406-409), ensayos de cambio de movilidad (ver, por ejemplo, Solicitud publicada nº 20030219778), ensayos de secuenciación que utilizan matrices de oligonucleótidos (ver, por ejemplo, Pease et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5022-5026), spoligotyping (ver, por ejemplo, Kamerbeek et al., (1997) J. Clin Microbiol, 35: 907-914), hibridación fluorescente in situ (FISH) (ver, por ejemplo, Amann et al., (1990) J. Bacteriol, 172: 762-770) y los ensayos de seguimiento heterodúplex o análisis de movilidad heterodúplex (ver, por ejemplo, White et al., (2000) J. Clin. Micro.38: 477-482).
La presente invención comprende asimismo unos kits para la tipificación o detección de las cepas de Lactobacillus presentes en, por ejemplo, un producto alimenticio o un cultivo de partida, o en un sujeto que ha consumido un material prebiótico. Por ejemplo, el kit comprende unos cebadores de PCR para la amplificación de un sitio CRISPR, así como una polimerasa y otros materiales de PCR para la utilización en la amplificación de ADN. El kit puede contener también uno o más enzimas de restricción para la utilización en el análisis por RFLP. El kit puede contener un compuesto marcado o un agente que puede detectar una secuencia de ácido nucleico descrita en una muestra y los medios para la determinación de la cantidad de una secuencia de ácido nucleico descrita en la muestra (por ejemplo, una sonda de oligonucleótido que se une a una secuencia de ácido nucleico de la invención, por ejemplo una de las SEC. ID nº 1-50).
Para los kits a base de oligonucleótidos, el kit puede comprender, por ejemplo (1) un oligonucleótido, por ejemplo, un oligonucleótido marcado detectable, que hibrida con una secuencia de ácido nucleico descrita, o (2) un par de cebadores útiles para la amplificación de una molécula de ácido nucleico descrita.
El kit puede comprender también, por ejemplo, un agente tampón, un conservante, o un agente estabilizador de proteína. El kit comprende también los componentes necesarios para la detección del agente detectable (por ejemplo, un enzima o un sustrato). El kit puede contener también una muestra control o unas series de muestras control (tanto positivo como negativo) que se pueden analizar y comparar con las muestras de ensayo consideradas. Frecuentemente cada componente del kit está cerrado dentro de un contenedor individual, y todos los contenedores diferentes se encuentran dentro de un embalaje único junto con las instrucciones de uso.
En una forma de realización, el kit comprende varias sondas en un formato de matriz, como las descritas, por ejemplo en las patentes US nº 5.412.087 y 5.545.531 y la publicación internacional Nº WO 95/00530. Las sondas para la utilización en la matriz se pueden sintetizar ya sea directamente en la superficie de la matriz, como se da a conocer en la publicación internacional Nº WO 95/00530 o bien antes de la inmovilización en la superficie de la matriz (Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis a Practical Approach (IRL Press, Oxford, Inglaterra). Las sondas se pueden inmovilizar en la superficie utilizando unas técnicas bien conocidas por un experto en la materia, como las que se describen en la patente U.S. nº 5.412.087. Las sondas pueden ser un ácido nucleico o una secuencia de péptido, preferentemente purificada.
Las matrices se pueden utilizar para cribar unos organismos, muestras, productos para diferenciar entre las cepas de Lactobacillus o para comprobar la presencia de unas especies de Lactobacillus, como L. acidophilus NCFM®. Se detecta la unión a una sonda de captura, por ejemplo, mediante una señal generada a partir de un marcador unido a la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico descrita. El procedimiento puede incluir el contacto de la molécula que comprende el ácido nucleico descrito en una primera matriz que presenta varias sondas de captura y una segunda sonda que presenta varias sondas de captura. Los resultados de cada hibridación se pueden comparar para analizar las diferencias de contenido entre la primera y la segunda muestra. La primera multitud de sondas de captura puede derivar de una muestra control, por ejemplo, una muestra que se sabe que contiene L. acidophilus NCFM®, o un sujeto control, por ejemplo, alimento, que incluye alimentos para animales o suplementos para alimentos animales, un suplemento dietético, una muestra de cultivo de partida, o un fluido biológico. La segunda variedad de sondas de captura puede derivar de una muestra experimental, por ejemplo, un sujeto que haya consumido un material prebiótico, o una muestra de cultivo de partida, un alimento o un fluido biológico.
Dichos ensayos puede resultar especialmente útiles en la selección microbiana y los procedimientos de control de calidad en los que la detección de materiales no deseados es esencial. La detección de secuencias de nucleótidos particulares también puede resultar útil en la determinación de la composición genética de alimentos, productos de fermentación, o microbios industriales o microbios presentes en el sistema digestivo de animales o humanos que haya consumido prebióticos.
Fragmentos y variantes
Las moléculas de ácidos nucleicos aislados que comprende la secuencia de nucleótidos de un sitio CRISPR de L. acidophilus, L. brevis, L. casei y L. delbrueckii o sus variantes o fragmentos se presentan en la presente memoria. Por "fragmento" de una molécula de ácido nucleico se hace referencia a una porción de la secuencia de nucleótidos. Los fragmentos de las moléculas de ácidos nucleicos se pueden utilizar como sondas de hibridación para detectar y/o diferenciar las regiones CRISPR de varias bacterias, que incluyen las especies de Lactobacillus, o se pueden utilizar como sondas en la amplificación de PCR de las regiones CRISPR. Los fragmentos de ácidos nucleicos también se pueden unir a los sustratos físicos para comprender lo que se puede considerar como una macro- o micromatriz (por ejemplo, la patente US nº 5.837.832 y 5.861.242). Dichas matrices de ácidos nucleicos se pueden utilizar para identificar las moléculas de ácidos nucleicos con la identidad suficiente para las secuencias diana. Por "molécula de ácido nucleico" se hace referencia a las moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generado utilizando unos análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser de una sola hebra o de doble hebra, pero preferentemente es ADN de doble hebra. Un fragmento de nucleótido se puede utilizar como una sonda de hibridación o cebador de PCR como se ha descrito anteriormente. Los fragmentos de las moléculas de ácido nucleico de la región CRISPR comprenden por lo menos aproximadamente 15, 20, 50, 75, 100, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 nucleótidos o hasta el número total de nucleótidos presente en una secuencia de nucleótidos de longitud total de la región CRISPR como se da a conocer en la presente memoria (por ejemplo, 1953 en SEC. ID nº: 1).
Por "variante" se hace referencia a una secuencia suficientemente idéntica. Consecuentemente, se describen en la presente memoria las moléculas de ácidos nucleicos aisladas que son suficientemente idénticas a una de las secuencias de nucleótidos de la SEC. ID nº 1-50, o las moléculas de ácidos nucleicos que hibridan con una de las secuencias de nucleótidos de SEC. ID nº 1-50, o su complemento, bajo unas condiciones astringentes.
En general, los secuencias de nucleótidos que presentan por lo menos una identidad del 45%, 55% o 65%, preferentemente por lo menos 70% o 75% de identidad, más preferentemente por lo menos aproximadamente 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% o 90%, más preferentemente por lo menos aproximadamente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una de las secuencias de nucleótidos de SEC. ID nº 1-50, se describe en la presente memoria como suficientemente idénticas.
Las variantes que se producen naturalmente pueden existir en una población (por ejemplo, en una población de Lactobacillus). Dichas variantes se pueden identificar utilizando unas técnicas de biología molecular bien conocidas, como PCR, e hibridación como se ha descrito anteriormente. Las secuencias de nucleótidos obtenidas sintéticamente, por ejemplo, las secuencias generadas por mutagénesis dirigida o mutagénesis mediada por PCR, que todavía permiten la diferenciación o la detección de cepas, también están incluidas como variantes. Se pueden introducir una o más sustituciones de nucleótidos, adiciones, delecciones en una secuencia de nucleótido descrita en la presente memoria, tal que estas sustituciones, adiciones o delecciones no afectan la capacidad para diferenciar las cepas basada en uno de los procedimientos descritos en la presente memoria o conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a RFLP, secuenciación e hibridación. Los ejemplos de variantes de una región CRISPR repetida se pueden encontrar en la SEC. ID nº: 2-7 y 37-48.
Identidad de secuencia
Las secuencias de nucleótidos presentadas en la presente invención presentan determinada identidad de secuencia. Por "identidad de secuencia" se hace referencia a los residuos de nucleótidos que son los mismos cuando se alinean dos secuencias para la correspondencia máxima en una ventana de comparación específica. Por "ventana de comparación" se hace referencia a una segmento contiguo de unas secuencias de dos nucleótidos para la alineación óptima, en el que la segunda secuencia puede contener adiciones o delecciones (es decir, huecos) cuando se compara con la primera secuencia. Generalmente, para las alineaciones de ácidos nucleicos, la ventana de comparación es por lo menos de 20 nucleótidos contiguos en longitud, y opcionalmente puede ser de 30, 40, 50, 100 o superior. Los expertos de la materia apreciarán que para evitar una elevada similitud debido a la inclusión de huecos, normalmente se introduce una penalización por hueco y se resta del número de coincidencias.
Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de nucleótidos, se lleva a cabo una alineación. El porcentaje de identidad de las dos secuencias está en función del número de residuos idénticos compartidos en la ventana de comparación (es decir, porcentaje de identidad = número de residuos idénticos/número total de residuos x 100). En otra forma de realización, las secuencias presentan la misma longitud. Los procedimientos similares a los mencionados a continuación se pueden utilizar para determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias. Los procedimientos se pueden utilizar también con o sin posibilidad de existencia de huecos.
Los algoritmos matemáticos se pueden utilizar para determinar el porcentaje de identidad de las dos secuencias. Los ejemplos no limitantes de los algoritmos matemáticos son los algoritmos de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado en Carril y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877; el algoritmo de Myers y Millar (1998) CABIOS 4:11-17; el algoritmo de homología local de Smith et al., (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; y el procedimiento de búsqueda para la alineación local de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448.
Se han diseñado varias aplicaciones informáticas basadas en estos algoritmos matemáticos para permitir la determinación de la identidad de la secuencia. Los programas BLAST de Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403 se basan en los algoritmos de Karin y Altschul (1990) supra. Las búsquedas para obtener secuencias de nucleótidos que son homólogas a las secuencias de nucleótidos de la presente invención se pueden llevar a cabo con el programa BLSTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12. Las alineaciones espaciadas se pueden obtener utilizando BLAST espaciado (en BLAST 2.0) como se ha descrito en Altschul et al., (1997) Nucleic Acid Res. 25:3389. Para detectar las relaciones distantes entre moléculas, se puede utilizar PSI-BLAST. Ver, Altschul et al. (1997) supra. En todos los programas BLAST, se pueden utilizar los parámetros predeterminados de los programas respectivos. Ver, www.ncbi.nlm.nih.gov. La alineación se puede llevar a cabo manualmente mediante inspección.
Otro programa que se puede utilizar para determinar el porcentaje de identidad de la secuencia es el programa ALIGN (versión 2.0), que utiliza los algoritmos matemáticos de Myers y Miller (1988) supra. Además de los programas ALIGN y BLAST, los programas de BESTFIT, GAP, FASTA y TFASTA son parte del paquete de Software de Wisconsin Genetics, versión 10 (disponible en Accelrys Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, USA), y se puede utilizar para la realización de alineaciones de secuencia. El programa preferido es GAP versión 10, que utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) supra. A menos que se indique lo contrario los valores de identidad de la secuencia proporcionados en la presente memoria se refieren a los valores obtenidos utilizando GAP versión 10 con los parámetros siguientes: % de identidad utilizando peso GAP de 50 y peso de longitud de 3 y la matriz de recuento nwsgapdna.cmp. Se pueden utilizar otros programas equivalentes. Por "programa equivalente" se hace referencia a un programa de comparación de una secuencia que, para una de las dos secuencias estudiadas, genera una alineación que presenta apareamientos de residuos de nucleótidos idénticos y un porcentaje de identidad de secuencia idéntico si se compara con la misma alineación generada por GAP versión 10.
Los ejemplos siguientes se proporcionan a título ilustrativo no limitativo.
Experimental Ejemplo 1 Análisis del ADN
La secuencia de ADN genómico de Lactobacillus acidophilus NCFM® se analizó para estudiar el ADN repetitivo mediante "análisis de repetición y apareamiento" utilizando el paquete de Software Applied Maths' Kodon. Se identificó una región intergénica entre la ADN polimerasa I (polA) (ORF 1550) y una ligasa fosforibosilamina-glicina putativa (purD) (ORF 1551) se identificaron por tener unos rasgos característicos de un sitio CRISPR. Esta región presenta aproximadamente 2,4 kb de longitud y contiene 32 repeticiones casi perfectas de 29 pares de bases separadas por 32 espaciadores de pares de bases (ver Figuras 1 y 2).
Varios de los rasgos de la región CRISPR se pueden apreciar en la Figura 2. Las repeticiones de 29 pares de bases están destacadas. El primer nucleótido de la repetición es o bien una A o una G. El último nucleótido de la repetición cambia de T a C en un número de repetición 21. Una repetición inversa imperfecta está indicada con un subrayado en la última repetición. La primera repetición contiene dos sustituciones de pares de bases A-T. La repetición 26ª contiene una sustitución de pares de bases C-T. Las dos secuencias se repiten en la región espaciadora; una se repite dos veces (en negrita y rodeadas) y una se repite tres veces (en negrita y mayúsculas). La 16ª región espaciadora es una base más larga que las otras.
Ejemplo 2 PCR de una región intergénica
Los cebadores se diseñaron para amplificar toda la región intergénica entre polA y purD (tamaño de producto esperado = 2582 pares de bases). Los cebadores son los siguientes:
1550_F- 5' GCA TTA GTG TGC AAC CCA TCT GG 3 (SEC. ID nº 49)
1551_R- 5' GAT CTG CTG GAT TGC TTC TAC CG 3' (SEC. ID nº 50)
Se preparó una mezcla de la reacción de PCR para cada reacción (25,0 \mul de AccuPrime SuperMix II (conc. 2X.); 1,0 \mul de cada cebador (20 \muM); 1 \mul de molde (300 ng/\mul): H2O a 50,0 \mul). Las condiciones de la reacción fueron las siguientes: 1 ciclo a una temperatura de 95ºC durante 5 minutos; 40 ciclos con una primera etapa a una temperatura de 95ºC durante 30 segundos, una segunda etapa a una temperatura de 54ºC durante 30 segundos, y una tercera etapa a una temperatura de 68ºC durante 3 minutos; 1 ciclo a una temperatura de 68ºC durante 7 minutos.
Esta PCR se realizó en dieciséis cepas de L. acidophilus. Todas la cepas de L. acidophilus que se habían identificado previamente como idénticas a L. acidophilus NCFM® por otros medios (es decir, PFGE, Microarrays, secuenciación 16S, etc) generaron un amplicon PCR del mismo tamaño. Tres cepas que previamente se habían mostrado diferentes de NCFM® (ATCC 4356, ATCC 4357 y cepa B) presentaron unos amplicones de diferente tamaño. Las cepas de Lactobacillus helveticus, Lactobacillus gasseri, y Lactobacillus plantarum que se analizaron no generaron ningún producto de PCR.
Se descubrieron cuatro cepas que no generaron producto de PCR: L. acidophilus ATCC 521, L. acidophilus cepa F, L. acidophilus cepa G y L. acidophilus cepa H.
Estas cepas se enviaron a los laboratorios MIDI para su identificación y se identificaron como se expone a continuación:
L. acidophilus ATCC 521
L. helveticus
L. acidophilus cepa F
Pediococcus parvulus
L. acidophilus cepa G
L. gasseri
L. acidophilus cepa H
L. plantarum
Los resultados de PCR para las 6 cepas se representan en la Figura 3A. Las bandas de diferentes tamaños indican que existen diferencias significativas en la región CRISPR de algunas cepas.
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Ejemplo 3 Procedimiento de amplificación por PCR es específico para la detección de Lactobacillus acidophilus
La PCR se realizó en 23 muestras bacterianas como se describe en el Ejemplo 2. La amplificación por PCR de todas las cepas de L. acidophilus ensayadas dio como resultado un amplicón de PCR, mientras que todas las otras especies ensayadas no (ver Figura 4). Las especies de todas las cepas ensayadas se confirmaron utilizando la secuenciación 16S. Por consiguiente, este procedimiento es específico para L. acidophilus. 
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Ejemplo 4 Digestión por restricción de la región intergénica
Con el fin de generar unos patrones más discriminatorios para cada cepa, los productos de PCR CRISPR se sometieron a una digestión por restricción con tres enzimas que generaron entre 10 y 24 bandas: AluI - 10 bandas; MseI - 19 bandas; Tsp5091 - 24 bandas.
AluI: Seis productos de PCR CRISPR se digirieron con AluI y se separaron en un gel de agarosa al 2% (Figura 3B), Dichas cepas mostraron una diferencia en el patrón de bandas, ATCC 4356, ATCC 4357 y cepa B. Estos resultados concuerdan con los resultados de otros ensayos (Microarray, PCR-transposas, PFGE) lo que indica que estas tres cepas son únicas (datos no representados).
MseI: Seis productos de PCR CRISPR se digirieron con MseI y se separaron en un gel de agarosa al 3% (Figura 3C).
Tsp5091: Seis productos de PCR CRISPR se digirieron con Tsp5091 y se separaron en un gel de agarosa al 3% (Figura 3D).
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Ejemplo 5 Amplificación por PCR seguida de una digestión enzimática puede diferenciar las cepas de L. acidophilus
Catorce cepas de L. acidophilus se sometieron tanto a la amplificación como la digestión por enzima de restricción del sitio CRISPR como se describe en los ejemplos 2 y 4.
Se generaron siete patrones de bandas diferentes que indican que dicho procedimiento puede diferenciar las cepas (ver Figura 5).
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Ejemplo 6 Productos de PCR/digestión coinciden con los resultados de PFGE
Se realizó PFGE en las catorce cepas de L. acidophilus mencionadas en el Ejemplo 5. Los resultados de PFGE confirmaron los obtenidos utilizando el procedimiento de PCR/digestión como se ha descrito en los ejemplos 2-5 (ver Figura 6). Las cepas NCFM® y Lac-1 mostraron unos resultados de PFGE y PCR/digestión idénticos, pero eran diferentes de Lac-3 y ATCC4356.
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Ejemplo 7 Identificación de las regiones CRISPR en otras especies de Lactobacillus
Se analizaron otras especies de Lactobacillus para las secuencias CRISPR como se ha descrito en el Ejemplo 1. Las secuencias CRISPR se encontraron en L. brevis, L. casei y L. delbrueckii spp bulgaricus. Las secuencias repetitivas se muestran en la Figura 7, con unas variantes de nucleótidos que se muestran por debajo de las secuencias principales. Dentro de las regiones analizadas, se encontraron 32 repeticiones en L. acidophilus, 12 repeticiones en L. brevis, 21 repeticiones en L. casei, y 17 repeticiones en L. delbrueckii spp bulgaricus. 
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Ejemplo 8 Tipificación de cepas de las especies de Lactobacillus
Los cebadores se diseñaron para amplificar toda la región CRISPR de y L. delbrueckii spp bulgaricus. Se preparó una mezcla de reacción de PCR y se llevó a cabo la PCR en diez cepas de y L. delbrueckii spp bulgaricus, como se describe en el Ejemplo 2. Los productos de PCR se sometieron a digestión de restricción con AluI; MseI y Tsp5091 como se ha descrito ene el Ejemplo 4. El ADN se separa por electroforesis en gel y se analizan los patrones de las bandas. Las detección de patrones de bandas diferentes indica la presencia de diferentes cepas de L. delbrueckii spp bulgaricus.
Conclusiones: La identificación de una región CRISPR única en NCFM® es un descubrimiento prometedor para el desarrollo de los procedimientos de detección y diferenciación. De las 20 cepas denominadas como L. acidophilus ensayadas, 16 generaron un fragmento de CRISPR-PCR. Los laboratorios MIDI confirmaron que las cuatro cepas para las que no se amplificó ningún fragmento fueron confirmadas no estaban identificadas correctamente reforzando la posición dicho sitio CRISPR como un sitio L. acidophilus específico. Las 16 cepas restantes se sometieron a los análisis de restricción del fragmento CRISPR-PCR que reveló que las 12 cepas presentaban unos patrones de restricción idénticos y que 3 cepas presentaban unos patrones únicos. Dichos resultados están respaldados por los resultados que se han generado independientemente por análisis comparativo de microarray, PCR-transposas y PFGE.
En resumen, un análisis de restricción PCR-CRISPR relativamente rápido y fácil generó unos patrones de fragmentación únicos a partir de las cepas verdaderamente diferentes de L. acidophilus ensayadas. El procedimiento se aplica también a otras especies de Lactobacillus que incluyen L. brevis, L. casei y L. delbrueckii.
<110> Russell, W. Michael
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Barrangou, Rodolphe 
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<120> DETECCIÓN Y TIPIFICACIÓN DE CEPAS BACTERIANAS
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<130> 43556/290117
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<150> 11/_,_
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<151> 005-04-27
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<150> 60/566,007
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<151> 2004-04-28
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<160> 50
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<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
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<210> 1
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<211> 1953
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<212> ADN
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<213> Lactobacillus acidophilus 
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<400> 1
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1 
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<210> 2
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Lactobacillus acidophilus 
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<400> 2
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2 
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<210> 3
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Lactobacillus acidophilus 
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<400> 3
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3 
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<210> 4
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Lactobacillus acidophilus 
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<400> 4
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<212> ADN
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<213> Lactobacillus acidophilus 
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<210> 6
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Lactobacillus acidophilus 
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<400> 6
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6 
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<210> 7
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Lactobacillus acidophilus 
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<400> 7
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7 
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<212> ADN
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
90 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
11 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<312> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus brevis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus brevis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus brevis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus brevis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus brevis 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus brevis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus brevis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
43 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus casei 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus delbrueckii 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus delbrueckii 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
46 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus delbrueckii 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
47 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
48 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus acidophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
49 
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (24)

1. Molécula de ácido nucleico aislado seleccionada de entre el grupo constituido por:
a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido de SEC. ID nº 1, o su complemento;
b) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que presenta por lo menos 75% de identidad de la secuencia con la secuencia de nucleótido de la SEC. ID nº 1, o su complemento; y,
c) una molécula de ácido nucleico que comprende 1-140 repeticiones de por lo menos una de las secuencias de nucleótido expuestas en SEC. ID nº 2, SEC. ID nº 3, SEC. ID nº 4, SEC. ID nº 5, SEC. ID nº 6, SEC. ID nº 7, SEC. ID nº 37, SEC. ID nº 38, SEC. ID nº 39, SEC. ID nº 40, SEC. ID nº 41, SEC. ID nº 42, SEC. ID nº 43, SEC. ID nº 44, SEC. ID nº 45, SEC. ID nº 46, SEC. ID nº 47, SEC. ID nº 48.
2. Procedimiento para la tipificación de la cepa bacteriana de Lactobacillus en una muestra, que comprende:
a) amplificar una región de ADN que comprende una secuencia de nucleótido que presenta por lo menos 75% de identidad de secuencia con por lo menos una de las secuencias de nucleótido expuestas en las SEC. ID nº: 1-7 y 37-48 en dicha muestra para crear ADN amplificado; y,
b) tipificar la cepa bacteriana sobre la base de dicho ADN amplificado.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicha región de ADN que se va a amplificar comprende la SEC. ID nº 1.
4. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicha región de ADN que se va a amplificar comprende por lo menos una de las secuencias de nucleótidos expuestas en las SEC. ID nº 1-7 y 37-48.
5. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicha muestra se selecciona de entre el grupo constituido por un producto alimenticio, un suplemento dietético, un alimento para animales y un suplemento alimenticio para animales.
6. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho Lactobacillus es un L. acidophilus.
7. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho Lactobacillus es un L. brevis.
8. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho Lactobacillus es un L. casei.
9. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho Lactobacillus es un L. delbrueckii.
10. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho ADN amplificado se obtiene por PCR, y en el que dicha PCR se lleva a cabo utilizando por lo menos un cebador que comprende la SEC. ID nº 49 o la SEC. ID nº 50.
11. Procedimiento según la reivindicación 2, que comprende además:
a) añadir a dicho ADN amplificado por lo menos un enzima de restricción que reconoce uno o más sitios en dicho ADN amplificado;
b) incubar dicho enzima de restricción con dicho ADN amplificado durante un periodo de tiempo suficiente para formar los fragmentos de restricción;
c) determinar el número de dichos fragmentos de restricción y su tamaño; y
d) tipificar dicha cepa bacteriana sobre la base de dicho número y tamaño de dichos fragmentos de restricción.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicho enzima de restricción se selecciona de entre el grupo constituido por AluI; MseI, y Tsp5091.
13. Procedimiento según la reivindicación 2, que comprende además:
a) secuenciar dicho ADN amplificado para obtener los resultados de secuenciación y;
b) tipificar dicha cepa bacteriana sobre la base de dichos resultados de secuenciación.
14. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho ADN amplificado se obtiene:
a) proporcionando un primer cebador que se une a cualquiera de las SEC. ID nº: 2-7 y 37-48;
b) proporcionando un segundo cebador que se une al ADN anterior o posterior de cualquiera de las SEC. ID nº: 2-7 y 37-48; y,
c) utilizando dichos primer y segundo cebadores en una reacción de PCR para crear dicho ADN amplificado.
15. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho ADN amplificado se obtiene:
a) proporcionando un primer cebador que se une a una región anterior de cualquiera de las SEC. ID nº: 2-7 y 37-48;
b) proporcionando un segundo cebador que se une a una región posterior de cualquiera de las SEC. ID nº: 2-7 y 37-48; y,
c) utilizando dichos primer y segundo cebadores en una reacción de PCR para crear dicho ADN amplificado.
16. Cebador de la reacción en cadena de la polimerasa, cuya secuencia de nucleótido comprende la SEC. ID nº: 49.
17. Cebador de la reacción en cadena de la polimerasa, cuya secuencia de nucleótido comprende la SEC. ID nº: 50.
18. Kit para la detección de la presencia de una especie de Lactobacillus en una muestra, que comprende los cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa según las reivindicaciones 16 y 17, y las instrucciones para su utilización.
19. Kit para tipificar una cepa de Lactobacillus en una muestra, que comprende los cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa según las reivindicaciones 16 y 17 para la utilización en la creación de ADN amplificado, por lo menos un enzima de restricción que reconoce uno o más sitios en dicho ADN amplificado, y las instrucciones para su utilización.
20. Procedimiento para la detección de la presencia de una especie de Lactobacillus en una muestra que comprende:
a) amplificar una región de ADN que comprende por lo menos una de entre SEC. ID nº: 1-35 y 37-48, para crear un ADN amplificado; y,
b) detectar dicho ADN amplificado.
21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que dicha amplificación se lleva a cabo utilizando por lo menos un cebador que comprende la SEC. ID nº 49 o la SEC. ID nº 50.
22. Procedimiento para la tipificación de la bacteria Lactobacillus que presenta una región CRISPR en una muestra que comprende dicha bacteria, que comprende:
a) amplificar una región de ADN que comprende dicha región CRISPR o un fragmento de la misma en dicha muestra para crear un ADN amplificado.
23. Procedimiento según la reivindicación 22, que comprende las etapas adicionales que consisten en:
b) añadir a dicho ADN amplificado por lo menos un enzima de restricción que reconoce uno o más sitios en dicho ADN amplificado;
c) incubar dicho enzima de restricción con dicho ADN amplificado durante un periodo de tiempo suficiente para formar los fragmentos de restricción;
d) determinar el número de dichos fragmentos de restricción y su tamaño; y
e) tipificar dicha bacteria sobre la base de dicho número y tamaño de dichos fragmentos de restricción.
24. Procedimiento según la reivindicación 22 ó 23, que comprende además la etapa que consiste en secuenciar dicho ADN amplificado.
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