JP5806841B2 - 細菌株の検出および型決定 - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、細菌株（特に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株）を検出および型決定するための方法に関する。

（発明の背景）
医学的診断を行うとき、疫学的研究において、そして細菌間の進化学的多様性を研究するために、細菌株の迅速かつ正確な鑑別が重要である。種々の方法が、細菌株を型決定または検出するために存在し、それらとしては、ＲＦＬＰ、ハイブリダイゼーションおよび配列決定が挙げられる。疫学的に情報価値のあるマイクロサテライトＤＮＡの多型性は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉの異なる株において観察されてきた（非特許文献１）。同様に、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの反復ＤＮＡエレメントが、株の有効な追跡のために使用されてきた（非特許文献２）。加えて、短い配列反復（ＳＳＲ）のバリエーションは、異なる患者から単離されたＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株を鑑別するために使用されてきた（非特許文献３）。しかしながら、細菌株（例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株）を詳細に鑑別するために利用可能な現行の方法は、その種レベルに限り正確な１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列決定、または長くかつ困難なパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）手順のいずれかに基づく。
非特許文献４に記載されるＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ；ＳＰＩＤＲ（Ｓｐａｃｅｒｓ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｐｅａｔｓ）、ＶＮＴＲ（Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ Ｔａｎｄｅｍ Ｒｅｐｅａｔｓ）、ＳＲＶＲ（Ｓｈｏｒｔ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）およびＳＲＳＲ（Ｓｈｏｒｔ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｓｐａｃｅｄ Ｒｅｐｅａｔｓ））とも呼ばれる）遺伝子座は、細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）および古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）には存在するが、真核生物（Ｅｕｋａｒｙａ）には存在しない反復配列の新規ファミリーを構成する。この反復遺伝子座は、代表的に、長さ２５〜３７塩基対のヌクレオチドの反復性ストレッチから構成され、この反復は、ほぼ同じ長さの非反復性のＤＮＡスペーサーと交互にされる。現在までに、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、４０種を超える微生物において同定されている（非特許文献４）。しかし乳酸菌では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種由来しか記述されていない。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の発見（非特許文献５）から１５年以上経っているにもかかわらず、未だにこの生理的な機能は発見されていない。この反復のヌクレオチド配列は、一般的に種内において保存されているが、種間においては低い類似性を示す。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の間の変動性は、主として単一のヌクレオチド塩基の変更のためではなく、むしろ反復領域全体およびスペーサー領域全体の欠失／挿入のためであることもまた示されている。これらの特性は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにおいて、株を型決定する手段としてのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の使用を導いた（非特許文献６）。

Ｍａｒｓｈａｌｌら Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９６）８１：５０９〜５１７ Ｖａｎ Ｓｏｏｌｉｎｇｅｎら Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９３）３１：１９８７〜１９９５ ｖａｎ Ｂｅｌｋｕｍら Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９７）６５：５０１７〜５０２７ Ｊａｎｓｅｎら ＯＭＩＣＳ Ｊ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｂｉｏｌ．（２００２）６：２３〜３３ Ｉｓｈｉｎｏら Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９：５４２９〜５４３３ Ｇｒｏｅｎｅｎら Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９３）１０：１０５７〜１０６５

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細菌（特に、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）を鑑別する方法は、その種レベルに対して正確でもなく、また技術的に厳密でもないので、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株を鑑別するための新規の方法の開発が望まれる。

（発明の要旨）
細菌（特に、細菌のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株（例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株））を検出および型決定するための組成物および方法が提供される。本発明の組成物としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓから単離された核酸分子が挙げられる。この核酸分子は、好ましくはＤＮＡポリメラーゼＩの遺伝子（ｐｏｌＡ）と推定上のホスホリボシルアミン−グリシンリガーゼの遺伝子（ｐｕｒＤ）との間に位置し、約２０〜４０塩基対（例えば、約２５〜３５塩基対または約２７〜３０塩基対）の反復ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーから構成される、ＤＮＡ領域を含む。この反復ＤＮＡ配列は、ほぼ同じ長さの非反復性のスペーサーで分散される。一実施形態において、単離された核酸分子は、３２回存在する２９塩基対の配列を含み、そして同じ数の３２塩基対のスペーサーによって区分される。

本発明の組成物としてはまた、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓから単離された核酸分子も挙げられ、この核酸分子は、本来ＣＲＩＳＰＲ領域において同定される反復配列を含む。一実施形態において、この単離された核酸分子は、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ由来の２８塩基対の配列を含む。別の実施形態において、この単離された核酸分子は、Ｌ．ｃａｓｅｉ由来の２８塩基対の配列を含む。さらに別の実施形態において、この単離された核酸分子は、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ由来の２８塩基対の配列を含む。

このヌクレオチド配列に十分に同一な改変核酸分子もまた、本発明により包含される。加えて、このヌクレオチド配列のフラグメントおよび十分に同一なフラグメントが、包含される。特に、本発明は、配列番号１〜５０に見られるヌクレオチド配列の１つ以上を含む、単離された核酸分子を提供する。さらに、本発明は、本発明のヌクレオチド配列の１〜１４０回の反復を含む単離された核酸分子、またはその改変体を提供する。いくつかの実施形態において、この単離された核酸分子は、本発明のヌクレオチド配列の５回より多い反復、１０回より多い反復、５０回より少ない反復もしくは３５回より少ない反復、またはその改変体を含む。組成物はまた、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉおよびＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉが挙げられる）におけるこの領域を増幅するためのＰＣＲプライマーも含む。本発明のヌクレオチド配列に相補的であるかまたは、本発明の配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列もまた、包含される。さらに、サンプル内の本発明の核酸配列の存在を検出するための方法およびキットが包含され、そしてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株（特に、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ株、Ｌ．ｃａｓｅｉ株およびＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ株）を含む細菌を型決定するための方法およびキットが包含される。

ＣＲＩＳＰＲ領域を有する細菌を型決定するための方法が提供される。これらの方法は、以下の工程を包含する：細菌を含むサンプルを得る工程；このサンプル内のＣＲＩＳＰＲ領域またはそのフラグメントを含むＤＮＡ領域を増幅して、増幅されたＤＮＡを作製する工程；この増幅されたＤＮＡ内の１箇所以上の部位を認識する少なくとも１種の制限酵素を、この増幅されたＤＮＡに添加する工程；この制限酵素とこの増幅されたＤＮＡとを、制限フラグメントを形成するのに十分な時間でインキュベートする工程；これらの制限フラグメントの数とそれらの大きさとを決定する工程；そして、これらの制限フラグメントの数と大きさとに基づいて、この細菌を型決定する工程。

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細菌株を型決定するための方法もまた提供される。この方法は、以下の工程を包含する：サンプルを得る工程；配列番号１〜７および配列番号３７〜４８に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つ、またはその改変体を含む、このサンプル内のＤＮＡ領域を増幅して、増幅されたＤＮＡを作製する工程；そして、この増幅されたＤＮＡに基づいて、細菌株を型決定する工程。これらの方法は、さらに以下の工程を含み得る：この増幅されたＤＮＡ内の１箇所以上の部位を認識する少なくとも１種の制限酵素を、この増幅されたＤＮＡに添加する工程；この制限酵素とこの増幅されたＤＮＡとを、制限フラグメントを形成するのに十分な時間でインキュベートする工程；これらの制限フラグメントの数とそれらの大きさとを決定する工程；そして、これらの制限フラグメントの数と大きさとに基づいて、この細菌株を型決定する工程。代替的に、これらの方法はさらに、この増幅されたＤＮＡを配列決定して、配列決定の結果を得る工程、そしてこの配列決定の結果に基づいて、この細菌株を型決定する工程を含み得る。一実施形態において、このＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓである。

この増幅されたＤＮＡは、以下の工程により取得され得る：ＣＲＩＳＰＲ領域内の反復配列に結合する第一のプライマーを提供する工程、このＣＲＩＳＰＲ領域に隣接する（すなわち、このＣＲＩＳＰＲ領域の上流または下流の）ＤＮＡに結合する第二のプライマーを提供する工程、ＰＣＲ反応において、これらのプライマーを使用して、増幅されたＤＮＡを作製する工程、この増幅されたＤＮＡをゲル上で分離して、この増幅されたＤＮＡの数と大きさとを示す識別可能なバンドパターンを生成する工程、そしてこのバンドパターンに基づいて、この細菌株を型決定する工程。これらのバンドの数および大きさは、この株の特徴である。代替的に、この増幅されたＤＮＡは、以下の工程により取得され得る：ＣＲＩＳＰＲ領域の上流のＤＮＡ領域に結合する第一のプライマーと、ＣＲＩＳＰＲ領域の下流のＤＮＡ領域に結合する第二のプライマーとを提供する工程、ＰＣＲ反応において、これらのプライマーを使用して、増幅されたＤＮＡを作製する工程、この増幅されたＤＮＡをゲル上で分離して、増幅されたＣＲＩＳＰＲ ＤＮＡの大きさを示すバンドを生成する工程、そしてこのバンドの大きさに基づいて、この細菌株を型決定する工程。この増幅されたＤＮＡの大きさは、この株の特徴である。

サンプル内のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の存在を検出するための方法が提供される。これらの方法は、以下の工程を包含する：サンプルを得る工程；配列番号１〜７および配列番号３７〜４８に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つ、またはその改変体を含むＤＮＡ領域を増幅して、増幅されたＤＮＡを作製する工程；そして、この増幅されたＤＮＡを検出する工程。これらの方法は、さらに以下の工程を含み得る：この増幅されたＤＮＡ内の１箇所以上の部位を認識する少なくとも１種の制限酵素を、この増幅されたＤＮＡに添加する工程；この制限酵素とこの増幅されたＤＮＡとを、制限フラグメントを形成するのに十分な時間でインキュベートする工程；これらの制限フラグメントの数とそれらの大きさとを決定する工程；そして、これらの制限フラグメントの数と大きさとに基づいて、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の存在を検出する工程。代替的に、これらの方法はさらに、この増幅されたＤＮＡを配列決定して、配列決定の結果を得る工程、そしてこの配列決定の結果に基づいて、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の存在を検出する工程を含み得る。
本発明の方法は、食品内、および栄養補助食品内（動物飼料内、および動物飼料栄養補助食品内を含む）、インビボサンプル内／インビトロサンプル内の細菌株（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ株、Ｌ．ｃａｓｅｉ株およびＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ株のようなＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株が挙げられる）の検出および型決定することのために、そして環境サンプル由来のこれらの種の天然の多様性を研究するために有用である。これらの方法はまた、新規細菌株（特に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株）の製品開発および同定のために有用である。
本発明は例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子、または該核酸分子の相補体；
ｂ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子、または該核酸分子の相補体；
ｃ）配列番号２〜５０のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子、または該核酸分子の相補体；
ｄ）配列番号２〜５０のいずれかに記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子、または該核酸分子の相補体；
ｅ）配列番号１〜５０のいずれかのフラグメントを含む核酸分子；および
ｆ）配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９に記載の少なくとも１つのヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列の改変体の１〜１４０回の反復を含む核酸分子、
からなる群から選択される、単離された核酸分子。
（項目２）
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細菌株を型決定するための方法であって、該方法は、
ａ）サンプルを得る工程；
ｂ）配列番号１〜７および配列番号３７〜４８に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ領域を該サンプル内で増幅し、そして増幅されたＤＮＡを作製する工程；および
ｃ）該増幅されたＤＮＡに基づいて、該細菌株を型決定する工程、
を包含する、方法。
（項目３）
前記増幅されるべきＤＮＡ領域が配列番号１に記載の配列を含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記増幅されるべきＤＮＡ領域が、配列番号１〜７および配列番号３７〜４８に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つを含む、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記サンプルは、食品、栄養補助食品、動物飼料および動物飼料栄養補助食品からなる群から選択される、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓである、項目２に記載の方法。
（項目７）
前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓである、項目２に記載の方法。
（項目８）
前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、Ｌ．ｃａｓｅｉである、項目２に記載の方法。
（項目９）
前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉである、項目２に記載の方法。
（項目１０）
前記増幅されたＤＮＡ領域は、ＰＣＲにより得られ、該ＰＣＲは、配列番号４９または配列番号５０に記載の配列を含む少なくとも１つのプライマーを使用して実行される、項目２に記載の方法。
（項目１１）
項目２に記載の方法であって、該方法はさらに、
ａ）前記増幅されたＤＮＡ内の１箇所以上の部位を認識する少なくとも１種の制限酵素を、該増幅されたＤＮＡに添加する工程；
ｂ）該制限酵素と該増幅されたＤＮＡとを、制限フラグメントを形成するのに十分な時間でインキュベートする工程；
ｃ）該制限フラグメントの数と大きさとを決定する工程；そして
ｄ）該制限フラグメントの数と大きさとに基づいて、前記細菌株を型決定する工程、
を包含する、方法。
（項目１２）
前記制限酵素は、ＡｌｕＩ、ＭｓｅＩおよびＴｓｐ５０９１からなる群から選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
項目２に記載の方法であって、該方法はさらに、
ａ）前記増幅されたＤＮＡを配列決定して、配列決定の結果を得る工程；そして
ｂ）該配列決定の結果に基づいて、前記細菌株を型決定する工程、
を包含する、方法。
（項目１４）
項目２に記載の方法であって、前記増幅されたＤＮＡは、
ａ）配列番号２〜７および配列番号３７〜４８のいずれかに記載の配列に結合する第一のプライマーを提供する工程；
ｂ）配列番号２〜７および配列番号３７〜４８のいずれかに記載の配列の上流のＤＮＡまたは下流のＤＮＡに結合する第二のプライマーを提供する工程；そして
ｃ）ＰＣＲ反応において、該第一のプライマーと該第二のプライマーとを使用して、該増幅されたＤＮＡを作製する工程、
により得られる、方法。
（項目１５）
項目２に記載の方法であって、前記増幅されたＤＮＡは、
ａ）配列番号２〜７および配列番号３７〜４８のいずれかに記載の配列の上流の領域に結合する第一のプライマーを提供する工程；
ｂ）配列番号２〜７および配列番号３７〜４８のいずれかに記載の配列の下流の領域に結合する第二のプライマーを提供する工程；そして
ｃ）ＰＣＲ反応において、該第一のプライマーと該第二のプライマーとを使用して、該増幅されたＤＮＡを作製する工程、
により得られる、方法。
（項目１６）
ポリメラーゼ連鎖反応のプライマーであって、該プライマーのヌクレオチド配列は、配列番号４９に記載の配列または該配列の改変体を含む、プライマー。
（項目１７）
ポリメラーゼ連鎖反応のプライマーであって、該プライマーのヌクレオチド配列は、配列番号５０に記載の配列または該配列の改変体を含む、プライマー。
（項目１８）
サンプル内のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の存在を検出するためのキットであって、該キットは、項目１６および１７に記載のポリメラーゼ連鎖反応のプライマーと使用説明書とを備える、キット。
（項目１９）
サンプル内のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株を型決定するためのキットであって、該キットは、増幅されたＤＮＡを作製する工程での使用のための項目１６および１７に記載のポリメラーゼ連鎖反応のプライマーと、該増幅されたＤＮＡ内の１箇所以上の部位を認識する少なくとも１つの制限酵素と、使用説明書とを備える、キット。
（項目２０）
サンプル内のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の存在を検出するための方法であって、該方法は、
ａ）サンプルを得る工程；
ｂ）配列番号１〜４８に記載の配列の少なくとも１つまたは該配列の改変体を含むＤＮＡ領域を増幅して、増幅されたＤＮＡを作製する工程；そして
ｃ）該増幅されたＤＮＡを検出する工程、
を包含する、方法。
（項目２１）
前記増幅する工程は、配列番号４９もしくは配列番号５０に記載の配列または該配列の改変体を含む、少なくとも１つのプライマーを使用して実行される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
ＣＲＩＳＰＲ領域を有する細菌を型決定するための方法であって、該方法は、
ａ）該細菌を含むサンプルを得る工程；
ｂ）該サンプル内のＣＲＩＳＰＲ領域または該領域のフラグメントを含むＤＮＡ領域を増幅して、増幅されたＤＮＡを作製する工程；
ｃ）該増幅されたＤＮＡ内の１箇所以上の部位を認識する少なくとも１種の制限酵素を、該増幅されたＤＮＡに添加する工程；
ｄ）該制限酵素と該増幅されたＤＮＡとを、制限フラグメントを形成するのに十分な時間でインキュベートする工程；
ｅ）該制限フラグメントの数と大きさとを決定する工程；そして
ｆ）該制限フラグメントの数と大きさとに基づいて、該細菌を型決定する工程、
を包含する、方法。

図１は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の特徴を有する、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ内の遺伝子間領域を示す。 図２は、遺伝子間領域（配列番号１）における反復領域のヌクレオチド配列を示す。２９ｂｐの反復が強調される（配列番号２〜７）。最後の反復において、１つの不完全な逆方向反復が下線により示される。スペーサー領域（配列番号８〜３５）および隣接領域（配列番号３６）は、強調されない。２つの配列が、このスペーサー領域で反復される；１つ（配列番号１５）は２回反復され（縁どりかつ太活字）、そして１つ（配列番号１３）は３回反復される（大文字かつ太活字）。 図３は、種々のアガロースゲル電気泳動実験の顕微鏡写真から構成される。図３Ａは、ＰＣＲ産物を示し、そして図３Ｂ、図３Ｃおよび図３Ｄは、制限フラグメントの結果を示す。Ａ．レーンＭ−１Ｋｂ ＤＮＡラダー；レーン１−ＮＣＦＭ（登録商標）；レーン２−株Ｃ；レーン３−株Ｄ；レーン４−ＡＴＣＣ ４３５６；レーン５−株Ｂ；レーン６−株Ｅ。Ｂ．レーンＭ−５０ｂｐ ＤＮＡラダー；レーン１−ＮＣＦＭ（登録商標）；レーン２−株Ｃ；レーン３−株Ｄ；レーン４−ＡＴＣＣ ４３５６；レーン５−ＡＴＣＣ ４３５７；レーン６−株Ｂ。Ｃ．レーンＭ−５０ｂｐ ＤＮＡラダー；レーン１−ＮＣＦＭ（登録商標）；レーン２−株Ｃ；レーン３−株Ｄ；レーン４−ＡＴＣＣ ４３５６；レーン５−ＡＴＣＣ ４３５７；レーン６−株Ｂ。Ｄ．レーンＭ−５０ｂｐ ＤＮＡラダー；レーン１−ＮＣＦＭ（登録商標）；レーン２−株Ｃ；レーン３−株Ｄ；レーン４−ＡＴＣＣ ４３５６；レーン５−ＡＴＣＣ ４３５７；レーン６−株Ｂ。 図４は、以下の株のＰＣＲ産物の顕微鏡写真である：レーン１−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭ（登録商標）；レーン２−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｌａｃ−１；レーン３−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｌａｃ−２；レーン４−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｌａｃ−３；レーン５−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ４３５５；レーン６−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ４３５６；レーン７−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ４３５７；レーン８−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ４７９６；レーン９−Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ ５２１；レーン１０−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ８３２；レーン１１−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ９２２４；レーン１２−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ １１９７５；レーン１３−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ３１４；レーン１４−Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＡＴＣＣ ４３１２１；レーン１５−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｌａｃ−４；レーン１６−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｌａｃ−５；レーン１７−Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ ＡＴＣＣ ３３１９８；レーン１８−Ｌ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ ＡＴＣＣ ３３１９９；レーン１９−Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＡＴＣＣ ３３３２３；レーン２０−Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＡＴＣＣ ３３２００；レーン２１−Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ Ｌｃｒ−１；レーン２２−Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ Ｌｈｅ−１；レーン２３−コントロール（ＤＮＡなし）。 図５は、以下の株のＰＣＲ増幅とそれに続く制限消化から生じたバンドの顕微鏡写真である：レーン１−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭ（登録商標）；レーン２−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｌａｃ−１；レーン３−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｌａｃ−２；レーン４−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｌａｃ−３；レーン５−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ４３５５；レーン６−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ４３５６；レーン７−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ４３５７；レーン８−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ４７９６；レーン９−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ８３２；レーン１０−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ９２２４；レーン１１−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ １１９７５；レーン１２−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ３１４；レーン１３−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｌａｃ−４；レーン１４−Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｌａｃ−５。 図６は、以下の株のパルスフィールドゲル電気泳動を示す顕微鏡写真である：Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭ（登録商標）（レーン１）；Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｌａｃ−１（レーン２）；Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｌａｃ−３（レーン３）；およびＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ４３５６（レーン４）。 図７は、以下の株由来の反復配列を示す：Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌａｃ）（配列番号３７）；Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ（Ｌｂｒ）（配列番号３８）；Ｌ．ｃａｓｅｉ（Ｌｃａ）（配列番号４５）；およびＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ．Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（Ｌｄｅ）（配列番号４６）。改変ヌクレオチドおよびそれらの位置が、主配列の下に示される。

（発明の詳細な説明）
本発明は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉおよびＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉが挙げられる）のような細菌株を検出および／または型決定するための方法および組成物に関する。これらの方法は、医療の安全性診断もしくは食品の安全性診断、または研究において使用され得る。「型決定」または「鑑別」により、細菌株の同定（ヌクレオチド配列に基づいて（すなわち、制限酵素消化によりもたらされるバンドパターンを分析することにより）、細菌株が他の株と異なることを同定することを含む）が意図される。「検出」により、サンプル内の細菌種の存在または不在の確認が意図される。本発明の組成物としては、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一部であり、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉおよびＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉから単離された、核酸分子が挙げられる。「ＣＲＩＳＰＲ領域」または「ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座」により、ヌクレオチド配列の反復性ストレッチが意図され、この反復は、長さ約２０〜約４０塩基対であり、ほぼ同じ長さの非反復性のＤＮＡスペーサーと交互にされる。頭字語ＣＲＩＳＰＲ、ＳＰＩＤＲ、ＶＮＴＲおよびＳＲＶＲは、間隙を有する反復を持つヌクレオチド配列を説明するために各々使用されている。

加えて、本発明は、細菌株（特に、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉおよびＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを含むＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株）の間の類似性および／または相違を決定するために使用され得る、細菌の型決定のための方法およびキット、ならびに、サンプル内のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の存在または不在を検出するための方法およびキットを提供する。より詳細には、この方法は、原核生物の株（例えば、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）の検出および／または型決定のための迅速かつ半自動化的な方法に関する。この方法において、ＣＲＩＳＰＲのＤＮＡ配列は、増幅され、そして、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株間を鑑別するため、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の検出のために使用される。

本発明の単離された核酸分子は、配列番号１〜５０に記載のヌクレオチド配列ならびにその改変体およびフラグメントを含む。本発明はまた、これらの核酸配列に相補的な分子またはこれらの配列にハイブリダイズする分子も包含する。

本発明により包含される核酸分子組成物は、単離されるか、または実質的に精製される。「単離される」または「実質的に精製される」により、核酸分子または生物学的に活性なフラグメントもしくは改変体が、実質的にかまたは本質的に、この核酸の天然の状態においてこの核酸とともに通常見出される構成要素を、含まないことが意図される。このような構成要素としては、他の細胞物質、組換え生産由来の培地およびこの核酸を化学合成することにおいて使用される種々の化学物質が挙げられる。好ましくは、本発明の「単離された」核酸は、この核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて、目的の核酸に隣接する核酸配列（例えば、その５’末端または３’末端に存在するコード配列）を含まない。しかしながら、この分子は、この組成物の基本的な特徴に悪影響を与えない、数個のさらなる塩基または部分を含み得る。例えば、種々の実施形態において、単離された核酸は、この核酸が由来する細胞において、通常ゲノムＤＮＡと関係する核酸配列の５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満の配列を含む。

本発明の組成物および方法は、研究室または商品の両方において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉおよびＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉが挙げられる）を検出するか、または細菌株（ごく近縁のＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株が挙げられる）を型決定するために使用され得る。このことは、製品開発ならびに細菌種の多様性および進化の研究のために有用であり、そして新規細菌株（新規Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株が挙げられる）の同定において有用である。

（細菌株の検出および鑑別）
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、最初にＥ．ｃｏｌｉにおいて認識された、分散型の短い配列の反復（ＳＳＲ）の明確なクラスである（Ｉｓｈｉｎｏら（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５４２９〜５４３３；Ｎａｋａｔａら（１９８９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３５５３〜３５５６）。同様の分散型ＳＳＲが、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、ＡｎａｂａｅｎａおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓで同定されている（Ｇｒｏｅｎｅｎら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：１０５７〜１０６５；Ｈｏｅら（１９９９）Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５：２５４〜２６３；Ｍａｓｅｐｏｈｌら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３０７：２６〜３０；Ｍｏｊｉｃａら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７：８５〜９３）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、反復の構造により他のＳＳＲと異なり、短く規則的に間隔の空いた反復（ＳＲＳＲ）と称されている（Ｊａｎｓｅｎら（２００２）ＯＭＩＣＳ Ｊ．Ｉｎｔｅｇ．Ｂｉｏｌ．６：２３〜３３；Ｍｏｊｉｃａら（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：２４４〜２４６）。これらの反復は、一定の長さを有する特有の介在配列により、常に規則的に間隔を空けられる、クラスター内に生じる短いエレメントである（Ｍｏｊｉｃａら（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：２４４〜２４６）。これらの反復配列は株間において高く保存されるが、分散型の反復の数およびスペーサー領域の配列は、株間で異なる（ｖａｎ Ｅｍｂｄｅｎら（２０００）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：２３９３〜２４０１）。ＣＲＩＳＰＲ領域を同定するための方法は、当該分野において周知である（例えば、上記引用文献（これらの全体が、本明細書において参考として援用される）ならびに実施例１において使用される方法を参照のこと）。本発明の方法は、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓに関する実験により、本明細書において例示されるが、当業者は、これらの方法が、ＣＲＩＳＰＲ領域を有するあらゆる細菌の検出および／または株の同定のために使用され得ることを認識する。

１つの反復内のヌクレオチドの個数は、一般的に約２０〜約４０塩基対であるが、約２０〜約３９塩基対、約２０〜約３７塩基対、約２０〜約３５塩基対、約２０〜約３３塩基対、約２０〜約３０塩基対、約２１〜約４０塩基対、約２１〜約３９塩基対、約２１〜約３７塩基対、約２３〜約４０塩基対、約２３〜約３９塩基対、約２３〜約３７塩基対、約２５〜約４０塩基対、約２５〜約３９塩基対、約２５〜約３７塩基対、約２５〜約３５塩基対、または約２８もしくは２９塩基対であり得る。反復の数は、以下の範囲であり得る：約１回〜約１４０回、約１回〜約１００回、約２回〜約１００回、約５回〜約１００回、約１０回〜約１００回、約１５回〜約１００回、約２０回〜約１００回、約２５回〜約１００回、約３０回〜約１００回、約３５回〜約１００回、約４０回〜約１００回、約４５回〜約１００回、約５０回〜約１００回、約１回〜約１３５回、約１回〜約１３０回、約１回〜約１２５回、約１回〜約１２０回、約１回〜約１１５回、約１回〜約１１０回、約１回〜約１０５回、約１回〜約１００回、約１回〜約９５回、約１回〜約９０回、約１回〜約８０回、約１回〜約７０回、約１回〜約６０回、約１回〜約５０回、約１０回〜約１４０回、約１０回〜約１３０回、約１０回〜約１２０回、約１０回〜約１１０回、約１０回〜約９５回、約１０回〜約９０回、約２０回〜約８０回、約３０回〜約７０回、約３０回〜約６０回、約３０回〜約５０回、約３０回〜約４０回、または約３２回。

本明細書で開示されるヌクレオチド配列は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種を検出するため、および／または細菌株を鑑別する（他のＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株からＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭ（登録商標）株を鑑別することが挙げられる）ために使用され得る。検出および／または鑑別は、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭ（登録商標）、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉおよびＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ亜種ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓにおける新規ＣＲＩＳＰＲ領域の同定に基づく。これらのＣＲＩＳＰＲ領域は株特異的であるので、これらの特異的な配列の存在についてアッセイする任意の方法が、本発明により包含される。本発明は、医療試験、食品試験、農業試験および環境試験に適用可能である。

サンプル内の核酸分子の存在を検出する診断アッセイが開示される。これらの方法は、以下の工程を包含する：サンプルを得る工程；配列番号１〜７および配列番号３７〜４８に記載の配列の少なくとも１つまたはその改変体を含む、ＤＮＡ領域を増幅して、増幅されたＤＮＡを作製する工程；そして増幅されたＤＮＡを検出する工程。増幅されたＤＮＡの検出は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種に対して特異的である。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の異なる株（例えば、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種）は、異なる大きさの増幅されたＤＮＡを有し得る。それゆえ、この方法はまた、株の鑑別のための手段としても使用され得る。さらに、この方法は、この増幅されたＤＮＡを配列決定する工程、そして配列決定の結果に基づいて、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えば、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉまたはＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）の存在を検出する工程を含み得る。代替的に、この方法は、さらに以下の工程を包含し得る：増幅されたＤＮＡ内の１箇所以上の部位を認識する少なくとも１種の制限酵素を、増幅されたＤＮＡに添加する工程；制限酵素と増幅されたＤＮＡとを、制限フラグメントを形成するのに十分な時間でインキュベートする工程；制限フラグメントの数と大きさとを決定する工程；そして、これらの制限フラグメントの数と大きさとに基づいて、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えば、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉまたはＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）の存在を検出する工程。

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細菌株を型決定するための方法が提供される。これらの方法は、以下の工程を包含する：サンプルを得る工程；配列番号１〜７および配列番号３７〜４８に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つまたはその改変体を含むＤＮＡ領域を、サンプル内で増幅して、増幅されたＤＮＡを作製する工程；そして増幅されたＤＮＡに基づいて、細菌株を型決定する工程。この型決定は、以下の工程により行われ得る：増幅されたＤＮＡ内の１箇所以上の部位を認識する少なくとも１種の制限酵素を、増幅されたＤＮＡに添加する工程；制限酵素と増幅されたＤＮＡとを、制限フラグメントを形成するのに十分な時間でインキュベートする工程；制限フラグメントの数と大きさとを決定する工程；そして、これらの制限フラグメントの数と大きさとに基づいて、細菌株を型決定する工程。型決定はまた、増幅されたＤＮＡを配列決定する工程、そして配列決定の結果に基づいて細菌株を型決定する工程によっても行われ得る。一実施形態において、増幅されるべきＤＮＡ領域は、配列番号１に記載の配列を含む。別の実施形態において、ＤＮＡ領域は、配列番号１〜７および配列番号３７〜４８に記載の配列の少なくとも１つに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

増幅されたＤＮＡは、以下の工程により取得され得る：ＣＲＩＳＰＲ領域に隣接するＤＮＡ領域（例えば、ＣＲＩＳＰＲ領域の上流のＤＮＡ）に結合する第一のプライマーおよびＣＲＩＳＰＲ領域に隣接するＤＮＡ領域（例えば、ＣＲＩＳＰＲ領域の下流のＤＮＡ）に結合する第二のプライマーを提供する工程；ＰＣＲ反応において、これらのプライマーを使用して、増幅されたＤＮＡを作製する工程；この増幅されたＤＮＡをゲル上で分離して、増幅されたＣＲＩＳＰＲ ＤＮＡの大きさを示すバンドを生成する工程；そしてこのバンドの大きさに基づいて、細菌株を型決定する工程。この増幅されたＤＮＡの大きさは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の特徴である。一実施形態において、第一のプライマーはＣＲＩＳＰＲ領域の上流のＤＮＡ領域（例えば、配列番号４９に記載のＤＮＡ）に結合し、そして第二のプライマーはＣＲＩＳＰＲ領域の下流のＤＮＡ領域（例えば、配列番号５０に記載のＤＮＡ）に結合する。

代替的に、増幅されたＤＮＡは、以下の工程により取得され得る：ＣＲＩＳＰＲ領域内の反復配列に結合する第一のプライマーを提供する工程；このＣＲＩＳＰＲ領域に隣接する（すなわち、このＣＲＩＳＰＲ領域の上流または下流の）ＤＮＡに結合する第二のプライマーを提供する工程；ＰＣＲ反応において、これらのプライマーを使用して、増幅されたＤＮＡを作製する工程；この増幅されたＤＮＡをゲル上で分離して、この増幅されたＤＮＡの数と大きさとを示す識別可能なバンドパターンを生成する工程；そしてこのバンドパターンに基づいて、細菌株を型決定する工程。これらのバンドの数および大きさは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の診断に役立つ。一実施形態において、第一のプライマーは配列番号２〜７および配列番号３７〜４８に記載の配列のいずれかに結合し、そして第二のプライマーは配列番号２〜７および配列番号３７〜４８に記載の配列のいずれかに隣接するＤＮＡに結合する。

１つのプライマーが配列番号２〜７および配列番号３７〜４８に記載の配列のいずれかに結合する、この方法は、固定されたプライマーに対応した反復の数と間隔とに依存して、多くの異なる大きさのバンドを生成する。例えば、反復領域が５回存在する場合、この反復領域に相補的であるプライマーは、５箇所に結合し、そしてアガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル上でフィンガープリント（ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ）として可視化され得る５つのバンドを生成する。ＰＣＲ産物は、異なる程度に増幅され得、これにより生じるバンドのいくつかは、あるとしても他のバンドと同じほど容易に可視化され得ない。識別可能なバンドパターンは、増幅されたＤＮＡの数と大きさとを示し、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ株、Ｌ．ｃａｓｅｉ株およびＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ株が挙げられる）を特徴付けるために使用され得る。

用語「サンプル」は、被験体に存在するか、または被験体から単離される組織、細胞および生物学的流体ならびに出発培養物（母培養物、種培養物、バルク／セットの培養物、濃縮培養物、乾燥培養物、凍結乾燥培養物、凍結培養物）由来の細胞またはこのような培養物を保持するか、もしくはこのような培養物の使用から得られる食品／乳製品／飼料製品を含むことが意図される。サンプルは、栄養補助食品、バイオプロセス発酵物（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｅ）、またはこのヌクレオチド配列を含む物質を摂取した被験体であり得る。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロおよびインビボの両方において、サンプル内の開示されるヌクレオチド配列を含むゲノムＤＮＡを検出するために使用され得る。開示されるヌクレオチド配列を含むゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられるが、これに限定されない。食品、栄養補助食品、培養物、製品または被験体由来のサンプルにより得られる結果は、コントロールの培養物、製品または被験体由来のサンプルにより得られる結果と比較され得る。一実施形態において、サンプルは、出発培養物由来のゲノムＤＮＡを含む。

所望のＤＮＡ領域の増幅は、当該分野において公知の任意の方法により達成され得、それとしては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。「増幅」により、核酸配列のさらなるコピーの生成が意図される。このことは、一般的に、当該分野において周知のＰＣＲ技術を使用して実行され得る（ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５）ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ、ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ））。「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」により、方法（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号（本明細書において参考として援用される）に開示される方法）が意図され、これらの特許は、クローニング化も精製もすることなく、ゲノムＤＮＡの混合物内の標的配列のセグメントの濃度を増大させるための方法を記載する。所望の標的配列の増幅されたセグメントの長さは、相互についての２つのオリゴヌクレオチドプライマーの相対的な位置により決定される。したがって、この長さは、制御可能なパラメーターである。このプロセスの反復する局面の理由で、この方法は「ＰＣＲ」と呼ばれる。標的配列の所望の増幅されたセグメントは、混合物内で、優勢な配列となる（濃度の点から）ので、これらのセグメントは「ＰＣＲ増幅された」と呼ばれる。

ＰＣＲアプローチにおいて、オリゴヌクレオチドプライマーは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の全てまたは一部を増幅するＰＣＲ反応における使用のために設計され得る。「プライマー」により、精製された制限消化物内に自然に生じようと合成的に生成されようと、オリゴヌクレオチドが意図される。このオリゴヌクレオチドは、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件（すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼのような誘発剤の存在かつ適切な温度およびｐＨ）に置かれる場合に、合成の開始点として作用し得る。プライマーは、増幅における最大限の効率のために好ましくは一本鎖であるが、代替的に二本鎖でもよい。二本鎖である場合、プライマーは、伸長産物を調製するために使用される前に、その鎖を分離させるように、まず処理される。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘発剤の存在下で伸長産物の合成を開始するために、十分に長くあるべきである。プライマーの正確な長さは、多くの因子（温度、プライマーの供給源およびこの方法の使用）に依存する。ＰＣＲプライマーは、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチドの長さであり、そして最も好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドの長さである。

本発明の組成物は、これらの反復領域を増幅するために使用され得るオリゴヌクレオチドプライマーを含む。本発明の方法において使用され得るＰＣＲプライマーの例としては、ＣＲＩＳＰＲ領域に隣接するゲノムＤＮＡの領域（例えば、配列番号４９または５０に見出される領域）に結合するプライマー、配列番号３６に記載の配列に結合するプライマーまたはＣＲＩＳＰＲ領域内に結合するプライマー、あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。順方向（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマーおよび逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーは、ＣＲＩＳＰＲ領域の全てまたは一部を増幅するために設計される。「隣接する」により、配列の５’（上流）領域または３’（下流）領域が意図される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのプライマーは、ＣＲＩＳＰＲ領域に隣接するＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態において、１つのプライマーは、第一の反復配列（例えば、配列番号２）に結合し、そして１つのプライマーは、隣接するＤＮＡ配列（例えば、配列番号３６）に結合する。それゆえ、全体のＣＲＩＳＰＲ領域が増幅される。いくつかの実施形態において、両方のプライマーは、ＣＲＩＳＰＲ領域に隣接するＤＮＡ領域に結合する。ＣＲＩＳＰＲ領域に隣接するＤＮＡに結合するように設計されるプライマーは種特異的である。それは、この隣接するＤＮＡが、全てのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の間で十分な配列同一性を共有するとは予想されないからである。

これらのＣＲＩＳＰＲ領域内の反復配列は、互いにヌクレオチド相同性を示す（図７を参照のこと）。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの反復配列は、互いに少なくとも８６％一致する。Ｌ．ｂｒｅｖｉｓの反復配列は、互いに少なくとも８２％一致する。Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの反復配列は互いに少なくとも８９％一致する。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの反復配列は、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓの反復配列と少なくとも５７％一致する。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの反復配列は、Ｌ．ｃａｓｅｉの反復配列と少なくとも７１％一致する。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの反復配列は、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの反復配列と少なくとも７５％一致する。Ｌ．ｂｒｅｖｉｓの反復配列は、Ｌ．ｃａｓｅｉの反復配列と少なくとも６４％一致する。Ｌ．ｂｒｅｖｉｓの反復配列は、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの反復配列と少なくとも６４％一致する。Ｌ．ｃａｓｅｉの反復配列は、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの反復配列と少なくとも７１％一致する。

ＣＲＩＳＰＲ領域に隣接するＤＮＡ配列が公知である場合、当業者は、この公知の隣接する配列に基づいてＣＲＩＳＰＲ領域を増幅するためのプライマーを設計し得る。ＣＲＩＳＰＲ領域に隣接するＤＮＡ配列がまだ公知でない場合、当業者は、当該分野において公知の方法を使用してこの隣接する配列を決定し得る。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭの全ゲノムは、米国仮出願第６０／６２２，７１２号およびＡｌｔｅｒｍａｎｎら（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２：３９０６〜３９１２（これらの全体が本明細書において参考として援用される）において提供される。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍのゲノムは、Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００：１９９０〜１９９５において提供される。Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉの全ゲノムは、Ｐｒｉｄｍｏｒｅら（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：２５１２〜２５１７において提供される。

ＰＣＲプライマーを設計するための方法およびＰＣＲクローニングのための方法は、一般的に当該分野において公知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）において開示される。Ｉｎｎｉｓら、編（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；ＩｎｎｉｓおよびＧｅｌｆａｎｄ、編（１９９５）ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；ならびにＩｎｎｉｓおよびＧｅｌｆａｎｄ、編（１９９９）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）もまた参照のこと。ＰＣＲの公知の方法としては、対のプライマー、ネステッドプライマー（ｎｅｓｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）、単一の特異的なプライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマーおよび部分的ミスマッチプライマー（ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）などを使用する方法が挙げられるが、これらに限定されない。

ＰＣＲにより、単一のコピーの特定の標的配列を、いくつかの異なる方法論（例えば、標識プローブを用いるハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマーの取り込みとそれに続くアビジン−酵素結合体の検出；増幅されるセグメントへの^３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＣＴＰまたはｄＡＴＰ）の取り込み）により検出可能なレベルまで増幅することが可能である。ゲノムＤＮＡに加えて、任意のオリゴヌクレオチド配列が、プライマー分子の適切なセットにより増幅され得る。特に、ＰＣＲプロセス自体により作製される増幅されるセグメントは、それら自体が、続くＰＣＲ増幅のための効果的なテンプレートである。

ＰＣＲにおける増幅は、ポリメラーゼ、プライマーおよびテンプレート以外の、増幅を実行するために必要な全ての試薬として本明細書で定義される「ＰＣＲ試薬」または「ＰＣＲの材料」を必要とする。ＰＣＲ試薬は、通常、核酸前駆物質（ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰなど）および緩衝液を含む。

一旦、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座またはその一部を含むＤＮＡが増幅されると、次に、それは、制限酵素により消化（切断）され得る。本明細書で使用される場合、用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は、細菌酵素をいい、制限酵素の各々は、特定のヌクレオチド配列においてか、またはその近くで二本鎖ＤＮＡを切断する。制限酵素は当該分野において周知であり、そして例えば、種々の商業供給源（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から容易に取得され得る。同様に、制限酵素を使用するための方法はまた、当該分野において一般的に周知かつ日常的である。好ましい制限酵素は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座（例えば、配列番号１）を切断する場合に、１０個〜２４個のＤＮＡフラグメントを生成する制限酵素である。このような酵素の例としては、ＡｌｕＩ、ＭｓｅＩおよびＴｓｐ５０９１が挙げられるが、これらに限定されない。制限酵素を使用して得られるＤＮＡフラグメントは、例えば、ゲル電気泳動によるバンドとして検出され得る。制限酵素は、Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ（ＲＦＬＰ）を作製するために使用され得る。ＲＦＬＰは、本質的に、完全な染色体（ゲノム）であろうと、その一部（例えば、本発明において開示される新規Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を含むゲノム領域）であろうと、ＤＮＡ断片の固有のフィンガープリントのスナップショット（ｓｎａｐｓｈｏｔ）である。

ＲＦＬＰは、制限エンドヌクレアーゼによりＤＮＡ分子を切断する（「制限する」）ことによって生成される。天然において、このような酵素が細菌により生成されているので、数百種類のこのような酵素が単離されている。本質的に、細菌は、この細菌細胞に侵入し得る（例えば、ウイルス感染）任意の外来のＤＮＡ分子を認識し、そして切断する（制限する）防御システムとしてこのような酵素を使用する。数百種類の異なる制限酵素の各々は、全てのＤＮＡ分子を構成する４種の塩基ヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）の異なる配列においてＤＮＡを切断する（すなわち、「切断する（ｃｌｅａｖｅ）」または「制限する」）ことが見出されている。例えば、１つの酵素は、特異的に、かつ唯一、配列Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｃを認識し得る一方で、別の酵素は、特異的に、かつ唯一、配列Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ａを認識し得る、などである。関連する固有の酵素に依存して、このような認識配列は、４ヌクレオチド程度の短いものから２１ヌクレオチド程度の長いものまで、その長さにおいて変化し得る。認識部位が長ければ長いほど、ＤＮＡ全体にわたってこの部位が反復して見出される可能性はより低くなるので、認識配列が長ければ長いほど、生じる制限フラグメントは少なくなる。

消化に続いて、生じる個々のフラグメントは、それらの大きさに基づいて互いに分離される。ＤＮＡを分離するために適切な任意の方法は、本発明の方法により包含され、それらとしては、ゲル電気泳動、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、質量分析および微量流体（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）デバイスの使用が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、ＤＮＡフラグメントは、アガロースゲル電気泳動により分離される。ゲル電気泳動は、電流の影響下において、異なる大きさの荷電した分子を、静止したゲルを通るそれらの移動速度により分離する。これらの分離されたＤＮＡフラグメントは、例えば、臭化エチジウムにより染色し、そしてゲルをＵＶ照明の下で見ることにより容易に可視化され得る。バンディングのパターンは、制限消化されたＤＮＡの大きさを反映する。

代替的に、増幅されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座においてＲＦＬＰを実行するために、増幅されたＤＮＡの配列が、当該分野において公知の任意の方法により取得され得、この方法としては、自動の配列決定法および手動の配列決定法が挙げられる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｒｏｅら（１９９６）ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）を参照のこと。

本発明の新規ＣＲＩＳＰＲ反復領域を利用して、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株を検出および／または型決定するための他の方法もまた、本発明により包含される。これらの方法としては、本発明の核酸分子をプローブとして使用するか、または本発明において開示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る核酸分子を使用するかのいずれかによる、ハイブリダイゼーション方法が挙げられる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。

ハイブリダイゼーション技術において、ハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡフラグメント、ＰＣＲ増幅された産物または他のオリゴヌクレオチドであり得、そして、本明細書において開示される公知のヌクレオチド配列の全てまたは一部を含み得る。加えて、プローブは、^３２Ｐのような検出可能な基または任意の他の検出可能なマーカー（例えば、他の放射性同位体、蛍光性化合物、酵素または酵素補因子）により標識され得る。用語「標識される」は、プローブに関して、プローブに検出可能な物質を連結する（すなわち、物理的に連結する（ｌｉｎｋｉｎｇ））ことによるプローブの直接標識化、ならびに直接標識される別の試薬との反応性によるプローブの間接標識化を包含することが意図される。間接標識化の例としては、蛍光標識されたストレプトアビジンにより検出され得るような、ビオチンによるＤＮＡプローブの末端標識化が挙げられる。

ハイブリダイゼーションのためのプローブは、本明細書において開示される公知のＣＲＩＳＰＲ領域のヌクレオチド配列に基づく合成オリゴヌクレオチドを標識化することにより作製され得る。一実施形態において、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓのＣＲＩＳＰＲ領域のヌクレオチド配列（配列番号１）全体が、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株を検出および／または鑑別するためのプローブとして使用される。別の実施形態において、プローブは、本明細書で開示されるヌクレオチド配列のフラグメント（例えば、配列番号２〜７および配列番号３７〜４８のいずれかにおいて見られるような、単回の反復配列からなるプローブ）である。さらに別の実施形態において、プローブは、スペーサー領域（例えば、配列番号８〜３５のいずれか）において見出される配列である。別の実施形態において、プローブは、隣接する領域（例えば、配列番号３６の領域）である。ハイブリダイゼーションプローブは、代表的に、ストリンジェントな条件下で、以下にハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む：本発明のＣＲＩＳＰＲ領域のヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは改変体のうちの、少なくとも約１０、好ましくは約２０、より好ましくは約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０または４００の連続するヌクレオチド。ハイブリダイゼーションのためのプローブの調製は、一般的に当該分野において公知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（本明細書において参考として援用される）において開示される。

実質的に同一な配列は、ストリンジェントな条件下で、互いにハイブリダイズする。「ストリンジェントな条件」により、プローブが、他の配列に比べ、検出可能なより大きい程度（例えば、バックグラウンドよりも少なくとも２倍大きく）その標的配列にハイブリダイズする条件が意図される。ストリンジェントな条件は、当該分野において公知であり、そして、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））、６．３．１〜６．３．６において見出され得る。

プローブを使用する場合、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３において約１．５Ｍ未満のＮａイオン濃度、代表的に約０．０１Ｍ〜約１．０ＭのＮａイオン（または他の塩）濃度であり、かつ温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に対して少なくとも約３０℃、そして長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより長い）に対して少なくとも約６０℃である条件である。

ハイブリダイゼーション後の洗浄は、特異性を制御するための手段となる。２つの決定的な要素は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。全長またはほぼ全長の標的配列にハイブリダイズする配列の検出のために、ストリンジェントな条件下の温度は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列についての熱融点（Ｔ_ｍ）よりも約５℃低いように選択される。しかしながら、ストリンジェントな条件は、所望の程度のストリンジェンシーに依存し、それ以外は本明細書中で適切とされる場合、Ｔ_ｍよりも１℃〜２０℃低い範囲の温度を包含する。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて、Ｔ_ｍは、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７〜２８４に記載の以下の式を使用して決定され得る：
Ｔ_ｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ
ここで、
Ｍは、一価の陽イオンのモル濃度であり、
％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチドとシトシンヌクレオチドとのパーセンテージであり、
％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、そして、
Ｌは、塩基対のハイブリッドの長さである。Ｔ_ｍは、相補的な標的配列のうちの５０％が、完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度（規定のイオン強度およびｐＨの下で）である。

異なる程度の相同性を持つ配列を検出する能力は、ハイブリダイゼーション条件および／または洗浄条件のストリンジェンシーを変更することにより取得され得る。１００％一致する配列を標的とする（相同的探索（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｂｉｎｇ））ために、ミスマッチを許容しないストリンジェンシーの条件が得られるはずである。生じるヌクレオチド残基のミスマッチを許容することにより、類似性の程度の低い配列が検出され得る（非相同的探索（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｂｉｎｇ））。ミスマッチの１％毎に対して、Ｔ_ｍは、約１℃低くされ、それゆえハイブリダイゼーションおよび／または洗浄の条件は、標的のパーセンテージ同一性の配列へのハイブリダイゼーションを許容するように操作される。例えば、９０％以上の配列同一性を有する配列が好ましい場合、Ｔ_ｍは、１０℃低くされ得る。

模範的な低ストリンジェンシーの条件としては、以下が挙げられる：３７℃において、３０％〜３５％ ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を用いるハイブリダイゼーション、そして５０℃〜５５℃において、１×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍ クエン酸三ナトリウム）による洗浄。模範的な中程度のストリンジェンシーの条件としては、以下が挙げられる：３７℃において、４０％〜４５％ ホルムアミド、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳによるハイブリダイゼーション、そして５５℃〜６０℃において、０．５×ＳＳＣ〜１×ＳＳＣによる洗浄。模範的な高ストリンジェンシーの条件としては、以下が挙げられる：３７℃において、５０％ ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳによるハイブリダイゼーション、そして６０℃〜６５℃において、０．１×ＳＳＣによる洗浄。必要に応じて、洗浄緩衝液は、約０．１％〜約１％のＳＤＳを含み得る。ハイブリダイゼーション時間は、一般的に約２４時間未満であり、通常約４時間〜１２時間である。核酸のハイブリダイゼーションについての広範な手引が、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、第Ｉ部、第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、編（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２章（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）において見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。

細菌株を検出または鑑別するためのハイブリダイゼーション技術を包含する方法もまた包含される。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：サザンブロット法（例えば、Ｖａｎ Ｅｍｂｄｅｎら（１９９３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１：４０６〜４０９を参照のこと）、シフト移動度アッセイ（ｓｈｉｆｔ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙ）（例えば、米国公開出願第２００３０２１９７７８号を参照のこと）、オリゴヌクレオチドアレイを使用する配列決定アッセイ（例えば、Ｐｅａｓｅら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：５０２２〜５０２６を参照のこと）、スポリゴタイピング（ｓｐｏｌｉｇｏｔｙｐｉｎｇ）（例えば、Ｋａｍｅｒｂｅｅｋら（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：９０７〜９１４を参照のこと）、Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）（例えば、Ａｍａｎｎら（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：７６２〜７７０を参照のこと）およびヘテロ二本鎖追跡アッセイまたはヘテロ二本鎖移動度アッセイ（例えば、Ｗｈｉｔｅら（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．３８：４７７〜４８２を参照のこと）。

本発明はまた、サンプル内の本発明の核酸の存在を検出するためのキットも包含する。このようなキットは、例えば、食品もしくは出発培養物または共生物質を摂取した被験体において、存在するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の型決定または検出のために使用され得る。例えば、キットは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の増幅のためのＰＣＲプライマーならびにＤＮＡ増幅における使用のためのポリメラーゼおよび他のＰＣＲの材料を備え得る。キットはまた、ＲＦＬＰ分析における使用のための１種以上の制限酵素も備え得る。キットはまた、サンプル内の開示される核酸配列を検出し得る標識化合物または標識薬剤、およびサンプル内の開示される核酸配列の量を決定するための手段（例えば、本発明の核酸配列（例えば、配列番号１〜５０に記載の配列のいずれか）に結合するオリゴヌクレオチドプローブ）も含み得る。

オリゴヌクレオチドに基づくキットについて、このキットは、例えば以下を備える：（１）開示される核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（例えば、検出可能な標識オリゴヌクレオチド）、または（２）開示される核酸分子を増幅するために有用なプライマーの組。

キットはまた、例えば、緩衝化剤、保存剤またはタンパク質安定化剤も含み得る。キットはまた、検出可能な因子（例えば、酵素または基質）を検出するために必要な構成要素も含み得る。キットはまた、コントロールサンプルまたは一連のコントロールサンプル（陽性および陰性の両方）も含み得、これらのコントロールサンプルは、アッセイされ得、そして含まれる試験サンプルと比較され得る。キットの各々の構成要素は、通常、個別の容器内に同封される。そして、種々の容器の全ては、使用のための説明書とともに単一の包装内にある。

一実施形態において、キットは、アレイの形式による複数のプローブ（例えば、米国特許第５，４１２，０８７号および同第５，５４５，５３１号ならびに国際公開第ＷＯ９５／００５３０号（これらは参考として援用される）に記載されるプローブ）を含む。アレイにおける使用のためのプローブは、国際公開第ＷＯ９５／００５３０号に開示されるようにアレイの表面上に直接的に合成され得るか、またはアレイ表面上への固定化の前に合成され得るかのいずれかである（Ｇａｉｔ編（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ））。プローブは、当業者に周知の技術（例えば、米国特許第５，４１２，０８７号に記載される技術）を使用して、その表面上に固定化され得る。プローブは、核酸配列またはペプチド配列であり得、好ましくは精製され得る。

アレイは、生物、サンプルまたは製品をスクリーニングし、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株間を鑑別するためか、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えば、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭ（登録商標））の存在を確認するために使用され得る。捕捉プローブへの結合は、例えば、開示される核酸配列を含む核酸分子に付着した標識から生成されるシグナルにより検出される。この方法は、開示される核酸配列を含む分子と、複数の捕捉プローブを有する第一のアレイおよび複数の異なる捕捉プローブを有する第二のアレイとを接触させる工程を包含し得る。各々のハイブリダイゼーションの結果は、第一のサンプルと第二のサンプルとの間の含量における相違を分析するために比較され得る。第一の複数の捕捉プローブは、コントロールサンプル（例えば、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭ（登録商標）を含むことが公知のサンプル）由来であり得るか、またはコントロール被験体（例えば、食品（動物飼料または動物飼料栄養補助食品を含む）、栄養補助食品、出発培養物サンプルまたは生物学的流体）由来であり得る。第二の複数の捕捉プローブは、実験サンプル（例えば、共生物質を摂取した被験体、出発培養物サンプル、食品または生物学的流体）由来であり得る。

これらのアッセイは、微生物の選択、および好ましくない物質の検出が必須である品質管理手順において、特に有用であり得る。特定のヌクレオチド配列の検出はまた、食品、発酵産物もしくは産業用微生物の遺伝的組成、または共生物を摂取した動物もしくはヒトの消化器系内に存在する微生物を決定することにおいて、有用であり得る。

（フラグメントおよび改変体）
本発明は、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ由来のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のヌクレオチド配列またはその改変体およびフラグメントを含む単離された核酸分子を含む。核酸分子の「フラグメント」により、ヌクレオチド配列の一部が意図される。核酸分子のフラグメントは、種々の細菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種が挙げられる）由来のＣＲＩＳＰＲ領域を検出および／または鑑別するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得るか、あるいはＣＲＩＳＰＲ領域のＰＣＲ増幅におけるプライマーとして使用され得る。核酸のフラグメントはまた、マクロアレイまたはマイクロアレイとみなされ得るものを含む物理的な基板に結合され得る（例えば、米国特許第５，８３７，８３２号および同第５，８６１，２４２号）。このような核酸のアレイは、標的配列に対する十分な同一性で核酸分子を同定するために使用され得る。「核酸分子」により、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）ならびに、ヌクレオチド類似体を使用して生成されるＤＮＡ類似体またはＲＮＡ類似体が意図される。核酸分子は、単鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。ヌクレオチドフラグメントは、上記のようなハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとして使用され得る。ＣＲＩＳＰＲ領域の核酸分子のフラグメントは、少なくとも約１５、２０、５０、７５、１００、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００ヌクレオチドまたは本明細書に開示される全長ＣＲＩＳＰＲ領域のヌクレオチド配列に存在する全ヌクレオチドの個数以下（例えば、配列番号１についての１９５３）を含む。

ヌクレオチド配列の改変体が、本発明により包含される。「改変体」により、十分に同一な配列が意図される。したがって、本発明は、以下と十分に一致する単離された核酸分子を包含する：配列番号１〜５０に記載のヌクレオチド配列のいずれか、またはストリンジェントな条件下で、配列番号１〜５０に記載のヌクレオチド配列のいずれかもしくはその相補体にハイブリダイズする核酸分子。

一般的に、配列番号１〜５０に記載のヌクレオチド配列のいずれかに対して、以下の配列同一性を有するヌクレオチド配列は、十分に同一であるとして、本明細書において定義される：少なくとも約４５％、５５％もしくは６５％の同一性、好ましくは少なくとも約７０％もしくは７５％の同一性、より好ましくは少なくとも約７８％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％もしくは９０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性。

天然に発生する改変体は、集団（例えば、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの集団）内に存在し得る。このような改変体は、周知の分子生物学技術（例えば、ＰＣＲ）および上記のハイブリダイゼーションを使用することにより同定され得る。合成により得られるヌクレオチド配列（例えば、部位特異的変異誘発またはＰＣＲ媒介性変異誘発により生成される配列）であって、依然として株の鑑別または検出を可能にする配列もまた、改変体として含まれる。１つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失は、これらの置換、付加または欠失が株を鑑別する能力に影響しないように本明細書において開示されるヌクレオチド配列に導入され得る。ここで、株の鑑別は、本明細書で開示される方法または当該分野において公知の方法のいずれかに基づき、これらの方法としては、ＲＦＬＰ、配列決定およびハイブリダイゼーションが挙げられるが、これらに限定されない。ＣＲＩＳＰＲ反復領域の改変体の例は、配列番号２〜７および配列番号３７〜４８において見出され得る。

（配列同一性）
本発明により包含されるヌクレオチド配列は、特定の配列同一性を有する。「配列同一性」により、指定の比較ウィンドウ（ｗｉｎｄｏｗ）により最大の一致について２つの配列を整列させる場合に、同一であるヌクレオチド残基が意図される。「比較ウィンドウ」により、最適な整列のための、２つのヌクレオチド配列の隣接するセグメントが意図される。ここで、第二の配列は、第一の配列と比較されるように、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。

一般的に、核酸アラインメントについて、比較ウィンドウは少なくとも２０個の長さの隣接するヌクレオチドであり、必要に応じて、３０、４０、５０、１００、またはそれ以上の長さであり得る。当業者は、ギャップを含むことに起因する高い類似性を回避するために、代表的に、ギャップペナルティが導入され、そしてこれが一致の個数から減算されることを理解する。

２つのヌクレオチド配列のパーセント同一性を決定するために、アラインメントが実行される。２つの配列のパーセント同一性は、比較ウィンドウにおいて２つの配列により共有される同一残基の個数の関数である（すなわち、パーセント同一性＝同一残基の個数／全残基の個数×１００）。一実施形態において、配列は同じ長さである。下記の方法に類似する方法は、２つの配列間のパーセント同一性を決定するために使用され得る。これらの方法は、ギャップの許容を伴うか、または伴わないで使用され得る。

数学的アルゴリズムが、２つの配列のパーセント同一性を決定するために使用され得る。数学的アルゴリズムの非限定的な例は、以下のアルゴリズムである：ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４のアルゴリズム（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３〜５８７７において、改良された）；ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１〜１７のアルゴリズム；Ｓｍｉｔｈら（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的な相同性アルゴリズム；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３の全体的なアラインメントアルゴリズム；および、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４〜２４４８の局所アラインメントの探索方法。

これらの数学的アルゴリズムに基づく、種々のコンピュータ実行は、配列同一性の決定を可能にするように設計されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＢＬＡＳＴＮプログラムは、上記のＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）のアルゴリズムに基づく。本発明のヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を得るための探索は、ＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、ワード長さ＝１２）により実行され得る。ギャップ付きアラインメントは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載されるＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ ２．０における）を使用することにより取得され得る。分子間のかすかな関連性を検出するために、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴが使用され得る。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）上記を参照のこと。全てのＢＬＡＳＴプログラムについて、それぞれのプログラムの初期パラメーターが使用され得る。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。アラインメントはまた、目視により手動で実行され得る。

パーセント配列同一性を決定するために使用され得る別のプログラムは、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）上記の数学的アルゴリズムを使用するＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）である。ＡＬＩＧＮプログラムおよびＢＬＡＳＴプログラムに加えて、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム、ＧＡＰプログラム、ＦＡＳＴＡプログラムおよびＴＦＡＳＴＡプログラムが、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ １０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．、９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｄ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡから利用可能）の一部であり、そして配列アラインメントを実行するために使用され得る。好ましいプログラムは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）上記のアルゴリズムを使用するＧＡＰバージョン１０である。別に記載されない限り、本明細書で提供される配列同一性の値は、以下のパラメーターによるＧＡＰバージョン１０を使用することにより得られる値をいう：ＧＡＰウェイト ５０および長さウェイト ３ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリクスを使用する％同一性。他の同等なプログラムもまた使用され得る。「同等なプログラム」により、任意の配列比較プログラムが意図される。このプログラムは、ＧＡＰバージョン１０により生成される対応するアラインメントと比較される場合に、任意の２つの問題の配列に対して、同一のヌクレオチド残基の一致を有するアラインメントと同一のパーセント配列同一性とを生成する。

以下の実施例は、例示として提供されるのであって、限定として提供されるのではない。

（実験）
（実施例１．ＤＮＡ分析）
反復ＤＮＡについて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｓ’ Ｋｏｄｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅを使用する「反復および一致の分析」により、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭ（登録商標）由来のゲノムＤＮＡ配列を分析した。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の特徴を有するとして、ＤＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌＡ）（ＯＲＦ １５５０）と推定上のホスホリボシルアミン−グリシンリガーゼ（ｐｕｒＤ）（ＯＲＦ １５５１）との間の１つの遺伝子間領域を同定した。この領域は、約２．４ｋｂの長さであり、そして３２塩基対のスペーサーにより区分される３２回の完全な２９塩基対の反復を含む（図１および図２を参照のこと）。

ＣＲＩＳＰＲ領域の多くの特徴が、図２において見出され得る。２９塩基対の反復が強調される。反復の最初のヌクレオチドは、ＡまたはＧのいずれかである。反復の最後のヌクレオチドは、反復番号２１においてＴからＣに変わる。１つの不完全な逆方向反復が、最後の反復において下線により示される。最初の反復は、２つのＡ→Ｔの塩基置換を含む。第２６番目の反復は、１つのＣ→Ｔの塩基置換を含む。２つの配列が、スペーサー領域において反復される：１つは２回反復され（太活字かつ縁どり）、そして１つは３回反復される（太活字かつ大文字）。第１６番目のスペーサー領域は、その他のものと比べ、１塩基長い。

（実施例２．遺伝子間領域のＰＣＲ）
ｐｏｌＡとｐｕｒＤとの間の遺伝子間領域全体（予想される産物の大きさ＝２５８２塩基対）を増幅するように、プライマーを設計した。プライマーは、以下の２つである：

各々の反応のために、ＰＣＲ反応混合物（ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ＩＩ（２×濃度） ２５．０μｌ；各々のプライマー（２０μＭ） １．０μｌ；テンプレート（３００ｎｇ／μｌ） １μｌ；Ｈ_２Ｏで全量を５０．０μｌにする）を調製した。反応条件は、以下の条件であった：９５℃で５分間を１サイクル；９５℃で３０秒間の第一工程と、５４℃で３０秒間の第二工程と、６８℃で３分間の第三工程とを４０サイクル；６８℃で７分間を１サイクル。

このＰＣＲを、１６個のＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株について実行した。以前に他の手段（すなわち、ＰＦＧＥ、マイクロアレイ、１６Ｓ配列決定など）によりＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭ（登録商標）と同一であると示された、全てのＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株は、同じ大きさのＰＣＲアンプリコンを生成した。以前にＮＣＦＭ（登録商標）と異なることが示された、３つの株（ＡＴＣＣ ４３５６、ＡＴＣＣ ４３５７および株Ｂ）は、異なる大きさのアンプリコンを示した。試験されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ株およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ株は、ＰＣＲ産物を生成しなかった。

４つの株はＰＣＲ産物を生成しないことが見出された：Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ５２１、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ 株Ｆ、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ 株ＧおよびＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ 株Ｈ。

これらの株を、同定のためにＭＩＤＩ Ｌａｂｓに送付し、以下のように同定された：

６つの株についてのＰＣＲの結果を図３Ａに示す。異なる大きさのバンドは、数種の株のＣＲＩＳＰＲ領域において顕著な相違があることを示す。

（実施例３．ＰＣＲ増幅方法は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの検出に特異的である）
実施例２に記載されるように、２３種の細菌サンプルについてＰＣＲを実行した。試験された全てのＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株のＰＣＲ増幅は、ＰＣＲアンプリコンをもたらした一方で、試験された全ての他の種は、ＰＣＲアンプリコンをもたらさなかった（図４を参照のこと）。全ての試験された株を、１６Ｓ配列決定を使用して確認した。それゆえ、この方法は、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓに対し特異的である。

（実施例４．遺伝子間領域の制限消化）
各々の株についてより特色のあるパターンを生成するために、ＣＲＩＳＰＲのＰＣＲ産物を、１０本〜２４本の間のバンドを生成した３種の酵素による制限消化に供した：ＡｌｕＩ−１０本のバンド；ＭｓｅＩ−１９本のバンド；Ｔｓｐ５０９Ｉ−２４本のバンド。

ＡｌｕＩ：６つのＣＲＩＳＰＲのＰＣＲ産物を、ＡｌｕＩにより消化し、そして２％アガロースゲル上で分離した（図３Ｂ）。３つの株（ＡＴＣＣ ４３５６、ＡＴＣＣ ４３５７および株Ｂ）は、バンディングのパターンにおいて相違を示した。これらの結果は、これらの３つの株が固有であることを示唆する他の試験（マイクロアレイ、トランスポザーゼ−ＰＣＲ、ＰＦＧＥ）の結果と一致する（データは示していない）。

ＭｓｅＩ：６つのＣＲＩＳＰＲのＰＣＲ産物を、ＭｓｅＩにより消化し、そして３％アガロースゲル上で分離した（図３Ｃ）。

Ｔｓｐ５０９Ｉ：６つのＣＲＩＳＰＲのＰＣＲ産物を、Ｔｓｐ５０９Ｉにより消化し、そして３％アガロースゲル上で分離した（図３Ｄ）。

（実施例５．ＰＣＲ増幅とそれに続く酵素消化は、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株を鑑別し得る）
実施例２および４に記載されるように、１４株のＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株を、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の増幅および制限酵素消化の両方に供した。７つの異なるバンドパターンが生成され、この方法が株間を鑑別し得ることを示唆した（図５を参照のこと）。

（実施例６．ＰＣＲ／消化の産物は、ＰＦＧＥの結果と一致する）
実施例５において議論される１４株のＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株に対して、ＰＦＧＥを実行した。ＰＦＧＥの結果により、実施例２〜５に記載されるＰＣＲ／消化方法を使用することにより得られた結果を確かにした（図６を参照のこと）。ＮＣＦＭ（登録商標）株およびＬａｃ−１株は、同一のＰＦＧＥおよびＰＣＲ／消化の結果を示したが、Ｌａｃ−３およびＡＴＣＣ ４３５６とは異なっていた。

（実施例７．他のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種におけるＣＲＩＳＰＲ領域の同定）
実施例１に記載されるように、ＣＲＩＳＰＲ配列について、他のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種を分析した。ＣＲＩＳＰＲ配列は、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉおよびＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓにおいて見出された。反復配列を図７に示し、改変ヌクレオチドを主配列の下に示す。分析された領域内において、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓでは３２回の反復が存在し、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓでは１２回の反復が存在し、Ｌ．ｃａｓｅｉでは２１回の反復が存在し、そしてＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓでは１７回の反復が存在した。

（実施例８．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の株型決定）
Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの全ＣＲＩＳＰＲ領域を増幅するように、プライマーを設計した。実施例２に記載されるように、ＰＣＲ反応混合物を調製し、そして１０株のＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ株についてＰＣＲを実行した。ＰＣＲ産物を、実施例４に記載されるように、ＡｌｕＩ、ＭｓｅＩおよびＴｓｐ５０９Ｉによる制限消化に供した。ＤＮＡをゲル電気泳動により分離し、そしてバンドパターンを分析した。異なるバンドパターンの検出は、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの異なる株の存在を示唆する。

（結論）：ＮＣＦＭ（登録商標）内の固有なＣＲＩＳＰＲ領域の同定は、検出方法および鑑別方法の開発のための有望な発見である。試験された２０株（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓとして指定される）のうち、１６株が、設計されたプライマーによりＣＲＩＳＰＲ−ＰＣＲフラグメントを生成した。フラグメントが増幅されなかった４つの株は、ＭＩＤＩ Ｌａｂｓにより、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ特異的であるこのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の位置を増強されたものの誤認として確認された。残りの１６株を、ＣＲＩＳＰＲ−ＰＣＲフラグメントの制限分析に供し、１２株が同一の制限パターンを有し、そして３株が固有のパターンを有することを明らかにした。これらの結果は、比較ゲノムマイクロアレイ分析、トランスポゼース−ＰＣＲ分析およびＰＦＧＥにより独立に生成されたデータにより支持される。

まとめると、比較的迅速かつ容易なＣＲＩＳＰＲ−ＰＣＲ／制限分析は、試験される真に異なるＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株に対して固有の切断パターンを生成した。この方法はまた、他のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉおよびＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉが挙げられる）においても適用され得る。

本明細書において言及される全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する分野での当業者の技術レベルを指示する。各々の個別の刊行物または特許出願が、参考として援用されることを具体的かつ個別に示されるように、本明細書において、全ての刊行物および特許出願は、その同一の範囲まで参考として援用される。

上記の発明は、明瞭な理解の目的のための例示および例として、多少詳細に記載されたが、特定の変更および改変が、添付の特許請求の範囲内において実施され得ることは明白である。

Claims (7)

1. サンプル内のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの種からなる群より選択されるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細菌株を型決定するための方法であって、該方法は、
   ａ）ＣＲＩＳＰＲ領域中の反復配列である配列番号２〜７および配列番号３７〜４８のいずれかに結合する第１のプライマーを提供し、かつ、該ＣＲＩＳＰＲ領域に隣接するＤＮＡに結合する第２のプライマーを提供することによるか、または該ＣＲＩＳＰＲ領域の上流のＤＮＡの領域に結合する第１のプライマーを提供し、該ＣＲＩＳＰＲ領域の下流に結合する第２のプライマーを提供することによって、配列番号２〜７および配列番号３７〜４８に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して少なくとも８６％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ領域を該サンプル内で増幅し、そして増幅されたＤＮＡを作製する工程；および
   ｂ）該増幅されたＤＮＡに基づいて、該細菌株を型決定する工程、
   を包含する、方法。
2. 前記増幅されるべきＤＮＡ領域が、配列番号２〜７および配列番号３７〜４８に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記サンプルは、食品、栄養補助食品、動物飼料および動物飼料栄養補助食品からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
4. 前記増幅されたＤＮＡは、ＰＣＲにより得られ、該ＰＣＲは、配列番号４９または配列番号５０に記載の配列を含む少なくとも１つのプライマーを使用して実行される、請求項１に記載の方法。
5. 請求項１に記載の方法であって、該方法はさらに、
   ａ）前記増幅されたＤＮＡ内の１箇所以上の部位を認識する少なくとも１種の制限酵素を、該増幅されたＤＮＡに添加する工程；
   ｂ）該制限酵素と該増幅されたＤＮＡとを、制限フラグメントを形成するのに十分な時間にわたりインキュベートする工程；
   ｃ）該制限フラグメントの数と大きさとを決定する工程；そして
   ｄ）該制限フラグメントの数と大きさとに基づいて、前記細菌株を型決定する工程、
   を包含する、方法。
6. 前記制限酵素は、ＡｌｕＩ、ＭｓｅＩおよびＴｓｐ５０９１からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
7. 請求項１に記載の方法であって、該方法はさらに、
   ａ）前記増幅されたＤＮＡを配列決定して、配列決定の結果を得る工程；そして
   ｂ）該配列決定の結果に基づいて、前記細菌株を型決定する工程、
   を包含する、方法。

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