JP5683060B2 - 細菌株の検出および型決定 - Google Patents
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Description
本発明は、細菌株(特に、Lactobacillus株)を検出および型決定するための方法に関する。
医学的診断を行うとき、疫学的研究において、そして細菌間の進化学的多様性を研究するために、細菌株の迅速かつ正確な鑑別が重要である。種々の方法が、細菌株を型決定または検出するために存在し、それらとしては、RFLP、ハイブリダイゼーションおよび配列決定が挙げられる。疫学的に情報価値のあるマイクロサテライトDNAの多型性は、Helicobacter pyloriの異なる株において観察されてきた(非特許文献1)。同様に、Mycobacterium tuberculosisの反復DNAエレメントが、株の有効な追跡のために使用されてきた(非特許文献2)。加えて、短い配列反復(SSR)のバリエーションは、異なる患者から単離されたHaemophilus influenzae株を鑑別するために使用されてきた(非特許文献3)。しかしながら、細菌株(例えば、Lactobacillus acidophilus株)を詳細に鑑別するために利用可能な現行の方法は、その種レベルに限り正確な16SrRNA遺伝子配列決定、または長くかつ困難なパルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)手順のいずれかに基づく。
Marshallら J.Appl.Bacteriol.(1996)81:509〜517 Van Soolingenら J.Clin.Microbiol.(1993)31:1987〜1995 van Belkumら Infect.Immun.(1997)65:5017〜5027 Jansenら OMICS J.Integr.Biol.(2002)6:23〜33 Ishinoら J.Bacteriol.(1987)169:5429〜5433 Groenenら Mol.Microbiol.(1993)10:1057〜1065
細菌(特に、細菌のLactobacillus株(例えば、Lactobacillus acidophilus株))を検出および型決定するための組成物および方法が提供される。本発明の組成物としては、Lactobacillus acidophilusから単離された核酸分子が挙げられる。この核酸分子は、好ましくはDNAポリメラーゼIの遺伝子(polA)と推定上のホスホリボシルアミン−グリシンリガーゼの遺伝子(purD)との間に位置し、約20〜40塩基対(例えば、約25〜35塩基対または約27〜30塩基対)の反復DNA配列の1つ以上のコピーから構成される、DNA領域を含む。この反復DNA配列は、ほぼ同じ長さの非反復性のスペーサーで分散される。一実施形態において、単離された核酸分子は、32回存在する29塩基対の配列を含み、そして同じ数の32塩基対のスペーサーによって区分される。
本発明は、Lactobacillus株(Lactobacillus acidophilus、L.brevis、L.caseiおよびL.delbrueckiiが挙げられる)のような細菌株を検出および/または型決定するための方法および組成物に関する。これらの方法は、医療の安全性診断もしくは食品の安全性診断、または研究において使用され得る。「型決定」または「鑑別」により、細菌株の同定(ヌクレオチド配列に基づいて(すなわち、制限酵素消化によりもたらされるバンドパターンを分析することにより)、細菌株が他の株と異なることを同定することを含む)が意図される。「検出」により、サンプル内の細菌種の存在または不在の確認が意図される。本発明の組成物としては、CRISPR遺伝子座の一部であり、L.acidophilus、L.brevis、L.caseiおよびL.delbrueckiiから単離された、核酸分子が挙げられる。「CRISPR領域」または「CRISPR遺伝子座」により、ヌクレオチド配列の反復性ストレッチが意図され、この反復は、長さ約20〜約40塩基対であり、ほぼ同じ長さの非反復性のDNAスペーサーと交互にされる。頭字語CRISPR、SPIDR、VNTRおよびSRVRは、間隙を有する反復を持つヌクレオチド配列を説明するために各々使用されている。
CRISPR遺伝子座は、最初にE.coliにおいて認識された、分散型の短い配列の反復(SSR)の明確なクラスである(Ishinoら(1987)J.Bacteriol.169:5429〜5433;Nakataら(1989)J.Bacteriol.171:3553〜3556)。同様の分散型SSRが、Haloferax mediterranei、Streptococcus pyogenes、AnabaenaおよびMycobacterium tuberculosisで同定されている(Groenenら(1993)Mol.Microbiol.10:1057〜1065;Hoeら(1999)Emerg.Infect.Dis.5:254〜263;Masepohlら(1996)Biochim.Biophys.Acta 1307:26〜30;Mojicaら(1995)Mol.Microbiol.17:85〜93)。CRISPR遺伝子座は、反復の構造により他のSSRと異なり、短く規則的に間隔の空いた反復(SRSR)と称されている(Jansenら(2002)OMICS J.Integ.Biol.6:23〜33;Mojicaら(2000)Mol.Microbiol.36:244〜246)。これらの反復は、一定の長さを有する特有の介在配列により、常に規則的に間隔を空けられる、クラスター内に生じる短いエレメントである(Mojicaら(2000)Mol.Microbiol.36:244〜246)。これらの反復配列は株間において高く保存されるが、分散型の反復の数およびスペーサー領域の配列は、株間で異なる(van Embdenら(2000)J.Bacteriol.182:2393〜2401)。CRISPR領域を同定するための方法は、当該分野において周知である(例えば、上記引用文献(これらの全体が、本明細書において参考として援用される)ならびに実施例1において使用される方法を参照のこと)。本発明の方法は、L.acidophilusに関する実験により、本明細書において例示されるが、当業者は、これらの方法が、CRISPR領域を有するあらゆる細菌の検出および/または株の同定のために使用され得ることを認識する。
Tm=81.5℃+16.6(logM)+0.41(%GC)−0.61(%form)−500/L
ここで、
Mは、一価の陽イオンのモル濃度であり、
%GCは、DNA中のグアノシンヌクレオチドとシトシンヌクレオチドとのパーセンテージであり、
%formは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、そして、
Lは、塩基対のハイブリッドの長さである。Tmは、相補的な標的配列のうちの50%が、完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度(規定のイオン強度およびpHの下で)である。
本発明は、L.acidophilus、L.brevis、L.casei、L.delbrueckii由来のCRISPR遺伝子座のヌクレオチド配列またはその改変体およびフラグメントを含む単離された核酸分子を含む。核酸分子の「フラグメント」により、ヌクレオチド配列の一部が意図される。核酸分子のフラグメントは、種々の細菌(Lactobacillus種が挙げられる)由来のCRISPR領域を検出および/または鑑別するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得るか、あるいはCRISPR領域のPCR増幅におけるプライマーとして使用され得る。核酸のフラグメントはまた、マクロアレイまたはマイクロアレイとみなされ得るものを含む物理的な基板に結合され得る(例えば、米国特許第5,837,832号および同第5,861,242号)。このような核酸のアレイは、標的配列に対する十分な同一性で核酸分子を同定するために使用され得る。「核酸分子」により、DNA分子(例えば、cDNAまたはゲノムDNA)およびRNA分子(例えば、mRNA)ならびに、ヌクレオチド類似体を使用して生成されるDNA類似体またはRNA類似体が意図される。核酸分子は、単鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖DNAである。ヌクレオチドフラグメントは、上記のようなハイブリダイゼーションプローブまたはPCRプライマーとして使用され得る。CRISPR領域の核酸分子のフラグメントは、少なくとも約15、20、50、75、100、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900ヌクレオチドまたは本明細書に開示される全長CRISPR領域のヌクレオチド配列に存在する全ヌクレオチドの個数以下(例えば、配列番号1についての1953)を含む。
本発明により包含されるヌクレオチド配列は、特定の配列同一性を有する。「配列同一性」により、指定の比較ウィンドウ(window)により最大の一致について2つの配列を整列させる場合に、同一であるヌクレオチド残基が意図される。「比較ウィンドウ」により、最適な整列のための、2つのヌクレオチド配列の隣接するセグメントが意図される。ここで、第二の配列は、第一の配列と比較されるように、付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含み得る。
(実施例1.DNA分析)
反復DNAについて、Applied Maths’ Kodon software packageを使用する「反復および一致の分析」により、Lactobacillus acidophilus NCFM(登録商標)由来のゲノムDNA配列を分析した。CRISPR遺伝子座の特徴を有するとして、DNAポリメラーゼI(polA)(ORF 1550)と推定上のホスホリボシルアミン−グリシンリガーゼ(purD)(ORF 1551)との間の1つの遺伝子間領域を同定した。この領域は、約2.4kbの長さであり、そして32塩基対のスペーサーにより区分される32回の完全な29塩基対の反復を含む(図1および図2を参照のこと)。
polAとpurDとの間の遺伝子間領域全体(予想される産物の大きさ=2582塩基対)を増幅するように、プライマーを設計した。プライマーは、以下の2つである:
実施例2に記載されるように、23種の細菌サンプルについてPCRを実行した。試験された全てのL.acidophilus株のPCR増幅は、PCRアンプリコンをもたらした一方で、試験された全ての他の種は、PCRアンプリコンをもたらさなかった(図4を参照のこと)。全ての試験された株を、16S配列決定を使用して確認した。それゆえ、この方法は、L.acidophilusに対し特異的である。
各々の株についてより特色のあるパターンを生成するために、CRISPRのPCR産物を、10本〜24本の間のバンドを生成した3種の酵素による制限消化に供した:AluI−10本のバンド;MseI−19本のバンド;Tsp509I−24本のバンド。
実施例2および4に記載されるように、14株のL.acidophilus株を、CRISPR遺伝子座の増幅および制限酵素消化の両方に供した。7つの異なるバンドパターンが生成され、この方法が株間を鑑別し得ることを示唆した(図5を参照のこと)。
実施例5において議論される14株のL.acidophilus株に対して、PFGEを実行した。PFGEの結果により、実施例2〜5に記載されるPCR/消化方法を使用することにより得られた結果を確かにした(図6を参照のこと)。NCFM(登録商標)株およびLac−1株は、同一のPFGEおよびPCR/消化の結果を示したが、Lac−3およびATCC 4356とは異なっていた。
実施例1に記載されるように、CRISPR配列について、他のLactobacillus種を分析した。CRISPR配列は、L.brevis、L.caseiおよびL.delbrueckii ssp.bulgaricusにおいて見出された。反復配列を図7に示し、改変ヌクレオチドを主配列の下に示す。分析された領域内において、L.acidophilusでは32回の反復が存在し、L.brevisでは12回の反復が存在し、L.caseiでは21回の反復が存在し、そしてL.delbrueckii ssp.bulgaricusでは17回の反復が存在した。
L.delbrueckii ssp.bulgaricusの全CRISPR領域を増幅するように、プライマーを設計した。実施例2に記載されるように、PCR反応混合物を調製し、そして10株のL.delbrueckii ssp.bulgaricus株についてPCRを実行した。PCR産物を、実施例4に記載されるように、AluI、MseIおよびTsp509Iによる制限消化に供した。DNAをゲル電気泳動により分離し、そしてバンドパターンを分析した。異なるバンドパターンの検出は、L.delbrueckii ssp.bulgaricusの異なる株の存在を示唆する。
Claims (8)
- サンプル内のLactobacillus acidophilus細菌株を型決定するための方法であって、該方法は、
a)反復配列を含むDNA領域を該サンプル内で増幅し、そして増幅されたDNAを作製する工程であって、増幅されるべき領域内の該反復配列の各々が、配列番号1に記載の遺伝子間領域に含まれる反復配列に対して少なくとも86%同一であり、該配列番号1に記載の遺伝子間領域に含まれる反復配列が、配列番号2〜7に記載の配列である、工程;および
b)該増幅されたDNAに基づいて、該細菌株を型決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記増幅されるべきDNA領域が配列番号1に記載の配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルは、食品、栄養補助食品、動物飼料および動物飼料栄養補助食品からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記増幅されたDNAは、PCRにより得られ、該PCRは、配列番号49に記載の配列を含むプライマーと配列番号50に記載の配列を含むプライマーを使用して実行される、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、該方法はさらに、
a)前記増幅されたDNA内の1箇所以上の部位を認識する少なくとも1種の制限酵素を、該増幅されたDNAに添加する工程;
b)該制限酵素と該増幅されたDNAとを、制限フラグメントを形成するのに十分な時間でインキュベートする工程;
c)該制限フラグメントの数と大きさとを決定する工程;そして
d)該制限フラグメントの数と大きさとに基づいて、前記細菌株を型決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記制限酵素は、AluI、MseIおよびTsp5091からなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、該方法はさらに、
a)前記増幅されたDNAを配列決定して、配列決定の結果を得る工程;そして
b)該配列決定の結果に基づいて、前記細菌株を型決定する工程、
を包含する、方法。 - サンプル内のLactobacillus acidophilus株を型決定するためのキットであって、該キットは、増幅されたDNAを作製する工程での使用のための、配列番号49および配列番号50のヌクレオチド配列を有するポリメラーゼ連鎖反応のプライマーと、該増幅されたDNA内の1箇所以上の部位を認識する少なくとも1つの制限酵素と、使用説明書とを備える、キット。
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