JP2023082805A - Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｏｂｉｌｉｓ菌の検出法 - Google Patents
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Abstract
【課題】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｏｂｉｌｉｓ菌の迅速な検出方法を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるタンパク質を指標として検出する方法であって、例えば、それぞれ特定の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマー対として、検査対象試料から抽出されたＤＮＡにＰＣＲを適用する。【選択図】図９
Description
本発明は、Streptococcus mobilis(旧名Okadaella gastrococcus)菌の検出法に関する。
特許文献１には、胃腸疾患を引き起こす能力があるとされるOkadaella gastrococcus（新名Streptococcus mobilis）菌についての開示がある。この細菌はテトラサイクリン、メトロニダゾール、Ｈ２拮抗薬を使用するいわゆる３剤抗生物質療法に耐性を示す。３剤抗生物質療法は胃炎・胃潰瘍の原因であるとされているピロリ菌の除去に用いられる方法である。ところが、近年、３剤抗生物質療法が適用されたヒトの中にも胃炎・胃潰瘍の患者が存在することが見いだされ、Streptococcus mobilis菌の存在が胃炎・胃潰瘍の原因の一つであると推測されている。事実、胃炎・胃潰瘍患者の胃にStreptococcus mobilis菌（以下、S.mobilis菌と称する場合がある。）が存在していることも報告されている（特許文献１）。また、S. mobilis菌慢性感染患者に胃がんが発生した例もあり、胃がんとの関連が疑われるとの報告もある（非特許文献１）。Okadaella gastrococcus（以下、Og菌と称する場合がある。）菌の分子系統樹解析により、StreptococcusのMitis属に含まれることから、新名Streptococcus mobilisが提唱されている。この文献では、Og菌とS. mobilis菌は同一菌で、名称は交換使用可能とする。
しかしながら、特許文献１に記載されたS. mobilis菌の遺伝子配列は公知であるもののこれまでのところ、このS. mobilis菌を特異的に検出する方法は知られていなかった。また、微生物が有する遺伝子の塩基配列は一部分の塩基が他の塩基に置換されたいわゆるＳＮＰs（Single Nucleotide Polymorphisms：一塩基多型）を生じることも公知であるが、これらのS. mobilis菌にもＳＮＰsを生じているかも不明であり、ＳＮＰsを生じたS. mobilis菌についても検出する必要があった。
Takayuki Okada et.al., Am. J. Gastroenterol., Abstract S61, Vol 100, 2005
本発明は、例えば、Streptococcus mobilis菌の迅速な検出法を提供することを課題としている。
本発明に係る検出方法は、Streptococcus mobilis菌が保有する特定のアミノ酸配列を有するタンパク質又は当該アミノ配列をコードする塩基配列を指標とすることを特徴とする。
本発明に係る方法によると、Streptococcus mobilis菌を迅速に検出できる。
本発明に係る方法は、Og菌が有するタンパク質ＯＲＦ２５（以下「ＯＲＦ２５タンパク質」と称する。）を指標とする方法である。また、ＯＲＦ２５タンパク質をコードする塩基配列（終止コドンを含む。以下「ｏｒｆ２５遺伝子」と称する。）を指標とする方法でもある。ｏｒｆ２５遺伝子は、Og菌が有する全塩基配列を解析することで見いだされたＯＲＦ（Open Reading Frame）のうち、Og菌を特異的に検出できるＯＲＦの一つである。
ＯＲＦ２５タンパク質は配列番号１～３の何れかで示されるアミノ酸配列からなる。また、配列番号１～３に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても、本発明に係るOg菌の検出指標とされ得る。ここで、本明細書において、上記「１又は複数個」は、本発明の一実施形態において、１～９個であり、好ましくは１～５個である。なお、1または数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、または他のアミノ酸による置換を受けたポリペプチドが、その生物学的活性を維持することは知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci U S A.1984 Sep;81(18):5662-5666.、Zoller et al., Nucleic Acids Res. 1982 Oct 25;10(20):6487-6500.、Wang et al., Science. 1984 Jun 29;224(4656):1431-1433.）。
ＯＲＦ２５タンパク質を検出する方法としては、感染症などの検査法として用いられるタンパク質を検出できる一般的な方法であればよく、例えば、抗ＯＲＦ２５タンパク質抗体を用いたイムノクロマトグラフィや蛍光抗体法、固相化した抗ＯＲＦ２５抗体を用いた酵素免疫測定法（例えば、ＥＩＡ法やＥＬＩＳＡ法）、ウェスタンブロッティング法などが例示される。また、ＯＲＦ２５タンパク質を指標とする方法には、例えばヒトを含む各種の動物体内で発現した抗ＯＲＦ２５抗体を検出する方法も含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「相同性（homology）」または「配列相同性（sequence homology）」は、共通祖先からの分岐によって生じた（ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの一次構造（すなわち、配列）上の）類似性を指す。また、「相同性検索（ホモロジーサーチ）」は、異なる分子の配列（例えば、ポリペプチド配列、ヌクレオチド配列）の類似度に基づいて比較を行うことで、「相同性」を検出・解析する手法をいう。相同性を検出・解析する際、「配列類似度（配列類似性、または"sequence similarity"）」がその指標として利用され得る。「配列類似度」は、解析対象の複数の配列（例えば、２つのポリペプチド配列）間の同一残基の一致率（"percent identity"、以下、便宜上、「配列一致度（％）」という。）、またはその配列間で類似する物理化学的性質が保存された残基（以下、「類似残基」という）の一致率（"percent similarity"、以下、便宜上、「類似配列一致度（％）」とする。）として定義づけられる。すなわち、観測される配列類似度に基づき、「相同性」の有無について議論できる。
本明細書において使用される「配列一致度（％）」および「類似配列一致度（％）」は、２配列の解析対象範囲（以下、「比較ウィンドウ」という）で最適な状態に並置（アライメント）された配列２つを比較することによって算出される。具体的には、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の比較ウィンドウ内の部分には、２つの配列の最適なアライメントについての基準配列（他の配列に付加が含まれていればギャップが生じることもあるが、ここでの基準配列は付加も欠失もないものとする）と比較したときに、付加または欠失（すなわちギャップ）が含まれる場合がある。そして、同一残基（ヌクレオチド残基またはアミノ酸残基）が、並置されたいずれの配列にも認められる位置を特定し、その特定された位置の個数（「同一残基数」）を（比較ウィンドウ内の）「総位置数」で除算した上で、１００を乗算することで、「配列一致度」を算出する。同様に、「同一残基数」の代わりに、物理化学的性質が保存された残基の数「類似残基数」を特定することで、「類似配列一致度」を算出することが可能である。
相同性検索には、従来技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価し得る。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、例えば、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）を用いてポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列類似度に基づき相同性を評価し得る。ＢＬＡＳＴについては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６７－２２６８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６－２７２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２などが参照される。検索の結果は、例えば、ＰｏｓｉｔｉｖｅｓまたはＩｄｅｎｔｉｔｉｅｓとして数値化される。
ｏｒｆ２５遺伝子は、ＯＲＦ２５タンパク質をコードする。検出指標とされ得る塩基配列は、配列番号１～３の何れかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１～３に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列又はこれらの塩基配列と９０％以上、好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９７％以上の配列一致度を有する塩基配列である。配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列として配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドが、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドが、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする配列番号６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドが、検出指標とされる。また、配列番号４～６に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドの他にも、配列番号４～６の何れかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列一致度が９０％以上、好ましくは９４％、さらに好ましくは９７％以上あるポリヌクレオチドもOg菌の検出指標とされ得る。本発明において配列一致度は、BLAST（NCBI BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）によって求められた値によって判断される。また、本発明に係るＯＲＦ２５タンパク質をコードする塩基配列を指標とする方法には、ＯＲＦ２５タンパク質をコードするポリヌクレオチドのみならず、当該ポリヌクレオチドからタンパク質を合成する際に複製されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を指標とすることもできる。
ｏｒｆ２５遺伝子を検出する方法は、ポリヌクレオチドを検出できる一般的な方法であれば制約されることなく使用できる。例えばｏｒｆ２５遺伝子に相補的に結合し得る検出用のプローブ（例えば蛍光プローブ）を用いる方法や検査対象試料から抽出されたポリヌクレオチドを電気泳動などで分離して発色又は蛍光物質による発光にて検出する方法が例示される。使用し得る検出用のプローブはｏｒｆ２５遺伝子の全領域又は一部領域に相補的に結合し得るプローブであって、全領域に結合し得るプローブは、例えば配列番号４～６に示された塩基配列とそれぞれ相補的に結合し得る塩基配列からなるプローブが示される。また、一部領域に相補的に結合し得るプローブは、例えば、配列番号４～６に示された塩基配列を有するｏｒｆ２５遺伝子の５´末端から５０番目～１７６番目の領域である配列番号７～９に示す塩基配列のそれぞれと相補的な塩基配列を有するプローブや、同遺伝子の５´末端から１７７番目～４３２番目の領域である配列番号１０～１２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブが示される。なお、相補的なプローブはＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、配列番号４～６に示された塩基配列や配列番号７～１２に示された塩基配列と６０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは９０％以上の配列一致度がある塩基配列と相補的に結合し得る塩基配列を有するプローブでもあり得る。プルーブは、例えば、配列番号４～６に示された塩基配列やこれと６０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは９０％以上の配列一致度がある塩基配列を有するポリヌクレオチドの相補鎖、配列番号７～１２に示された塩基配列やこれと６０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは９０％以上の配列一致度がある塩基配列を有するポリヌクレオチドの相補鎖であり得る。プローブは蛍光物質や32Ｐのような放射性同位元素などを用いて標識され得る。標識されたプライマーの作製のためには、例えばニックトランスレーション法やランダムプライマーＤＮＡラベル法（ランダムプライム法）が用いられる。プローブは特定の塩基長を有する単一のプローブのみからなるものであっても、異なる塩基長を有する複数のプローブを含むものであっても差し支えない。
本明細書において「相補的に結合し得る（ポリヌクレオチド）」とは、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る（ポリヌクレオチド）」と交換可能に使用されるものである。この「ストリンジェントな条件」は、当該分野で慣用される周知の条件をいう。具体的には、「ストリンジェントな条件」は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件、例えば、配列一致度が一定基準より高いポリヌクレオチド対がハイブリダイズし、それより低いポリヌクレオチド対がハイブリダイズしない条件を意味する。
「ストリンジェントな条件」は配列依存的であり、そして種々の環境パラメータによって異なる。この点、ポリヌクレオチド（核酸）のハイブリダイゼーションの一般的な指針は、例えば、Tijssen(1993)、Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I, Chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay",Elsevier, New Yorkに見出される。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェントな条件に影響する要素としては温度、塩濃度など複数の要素が考えられ、例えば、Ausubo et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照することでその詳細が理解できる。いわゆる「高度にストリンジェントな条件」の一例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、６５～６８℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および５０％ ホルムアミド、４２℃といった条件である。このような条件の達成については、例えば、Molecular Cloning 2nd ed., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, DNA Cloning 1:Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press(1995)などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。また、「中程度のストリンジェントな条件」は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することができ、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、3rd ed.Vol.1、7.42-7.45 Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001に示される。
ｏｒｆ２５遺伝子の検出に際し、予め対象遺伝子の増幅産物（遺伝子の全領域でも、一部の領域であってもよい）を得ることが好ましい。増幅産物を得る方法としていわゆるＰＣＲ（polymerase chain reaction）法が用いられ得る。増幅産物の検出方法も特に制限されることはなく、増幅後に増幅産物を電気泳動により分離してエチジウムブロマイドなどの染色剤を用いて目的とする増副産物の確認を行う方法、増幅産物である二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する試薬（インターカレーター：TB Green，SYBR Greenなど）をＰＣＲ反応系に加える方法、増幅したＤＮＡに結合した蛍光標識したプローブを用いるいわゆるＴａｑＭａｎ法のように、増幅を行いながら増幅産物の検出を行うリアルタイムＰＣＲで検出する方法が例示される。
ＰＣＲ法において必要となるプライマーセットとして、例えば（１）配列番号１３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（プライマー）と配列番号１４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（プライマー）からなるプライマーセット（ｏｒｆ２５遺伝子の全領域を増幅する）、（２）配列番号１５で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（プライマー）と配列番号１６で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（プライマー）からなるプライマーセット（ｏｒｆ２５遺伝子の５´末端から５０番目～１７６番目の領域を増幅する）、（３）配列番号１７で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（プライマー）と配列番号１４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（プライマー）からなるプライマーセット（ｏｒｆ２５遺伝子の５´末端から１７７番目～４３２番目の領域を増幅する）が例示される。また、（４）配列番号１８で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（プライマー）と配列番号１９で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（プライマー）からなるプライマーセット（ｏｒｆ２５遺伝子の５´末端から９４番目～３０１番目の領域を増幅する）、（５）配列番号２０で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（プライマー）と配列番号２１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（プライマー）からなるプライマーセット（ｏｒｆ２５遺伝子の５´末端から９３番目～１９４番目の領域を増幅する）も例示される。もっとも、配列番号４～６で示される塩基配列と相補的に結合し得るポリヌクレオチドであれば、所望するｏｒｆ２５遺伝子の全領域又はその一部領域を増幅できる限り使用し得るものであり、これらの各プライマーの塩基配列から１～５個程度のヌクレオチドが置換、欠失、挿入された塩基配列からなるプライマーも使用し得る。例えば、（６）配列番号２３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（プライマー）と配列番号１４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（プライマー）からなるプライマーセット（例えば配列番号５で示されるｏｒｆ２５遺伝子の全領域を増幅する）、（７）配列番号２４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（プライマー）と配列番号２５で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（プライマー）からなるプライマーセット（例えば配列番号５で示されるｏｒｆ２５遺伝子の５´末端から１７７番目～４３２番目の領域を増幅する）、（８）配列番号２６で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（プライマー）と配列番号１４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（プライマー）からなるプライマーセット（例えば配列番号５で示されるｏｒｆ２５遺伝子の５´末端から１７７番目～４３２番目の領域を増幅する）である。
ＰＣＲを行う際の反応液の組成や、反応条件である反応温度や反応サイクル数、反応時間などは当業者が適宜設定できる事項であり、その一例として実施例で示された反応液の組成や反応条件が例示される。
本発明に係る検出用キットは、ｏｒｆ２５遺伝子を特異的に増幅し得るプライマーセットを含む。ｏｒｆ２５遺伝子を増幅し得るプライマーセットとしては、例えば前記（１）～（８）のプライマーセットを含み得る。当該検出用キットは、さらにＰＣＲ反応用の試薬、例えば、増幅用の反応組成物を構成する緩衝液、反応用核酸、前記検出用のプローブの他、リアルタイムＰＣＲにおける検出用のイ３ンターカレーターやＴａｑＭａｎ法に用いられるＴａｑＭａｎプローブを含み得る。あるいはｏｒｆ２５遺伝子の全長あるいは標的ＤＮＡと反応しうる部分的ＤＮＡも含み得る。
本発明に係る検出法は、上記のようにＯＲＦ２５タンパク質やｏｒｆ２５遺伝子を指標とする方法であって、検出に先立ってＯＲＦ２５タンパク質を含むと疑われるサンプルやｏｒｆ２５遺伝子を含むと疑われるサンプルが検査対象試料から作製されることが望まれる。検査対象試料としては、Og菌の感染が疑われる被験者からの細胞（例えば、胃から穿刺採取された細胞）、被験者からの体液（例えば、胃液、唾液、血清などの血液、糞便、尿）や吐瀉物などが例示される。検査対象試料は、そのままをサンプルとしたのでは指標となるタンパク質や遺伝子を検出できないおそれもあるので、検査対象試料から不要な成分を除いてＯＲＦ２５タンパク質やｏｒｆ２５遺伝子を検出しやすくする。サンプルの調製法は、感染症などの検査法などで使用される一般的な方法であればよく、例えばOg菌の培養に適した条件で培養して得られた細胞を回収する方法や、さらに回収した細胞を溶菌、遠心分離、抽出などの方法によりＯＲＦ２５タンパク質やｏｒｆ２５遺伝子を含む分画画分を調製する方法が例示される。また、ｏｒｆ２５遺伝子を指標とする場合には、前記のプライマーセットを用いて検査対象試料から作製されたサンプルや検査対象試料そのものを用いて増幅させることが望ましい。
以下、本発明について下記の実施例に基づきさらに詳細に説明するが，本発明は下記実施例に限られるものではないのは言うまでもない。
〔ＲＡＳＴサーバーによる検索〕
特許文献１に記載されたOg菌と同じ性質を有する菌株が臨床から新たに分離されたので、これらの菌株について遺伝子解析を行ったところ異なる塩基配列を有する新たな２つの株が見いだされた。以下では、便宜的に特許文献１に記載された菌株をOg1株、新たに分離された２つの菌株をそれぞれOg2株、Og3株とする。まず、Og1株のゲノムデータを基にしてＲＡＳＴサーバー（Rapid Annotation using Subsystem Technology）を用いて全てｏｒｆの推定を行い、Og菌を特異的に検出できる可能性のあるｏｒｆ（open reading frame）を探索したところ、２０２０のｏｒｆのうち４９個のｏｒｆが特異的に検出できる可能性のあるｏｒｆであると推測された（図１参照）。なお、図１には各ｏｒｆ領域を増幅するプライマーの結合位置が示されている。
特許文献１に記載されたOg菌と同じ性質を有する菌株が臨床から新たに分離されたので、これらの菌株について遺伝子解析を行ったところ異なる塩基配列を有する新たな２つの株が見いだされた。以下では、便宜的に特許文献１に記載された菌株をOg1株、新たに分離された２つの菌株をそれぞれOg2株、Og3株とする。まず、Og1株のゲノムデータを基にしてＲＡＳＴサーバー（Rapid Annotation using Subsystem Technology）を用いて全てｏｒｆの推定を行い、Og菌を特異的に検出できる可能性のあるｏｒｆ（open reading frame）を探索したところ、２０２０のｏｒｆのうち４９個のｏｒｆが特異的に検出できる可能性のあるｏｒｆであると推測された（図１参照）。なお、図１には各ｏｒｆ領域を増幅するプライマーの結合位置が示されている。
〔Og菌の分類〕
Og菌のｏｒｆを探索したところ、Og菌が有する塩基数、ＧＣ含有率、ＣＤＳ、ＲＮＡ数が近似する細菌としてS. parasanguinis標準株 (S. parasanguinis ATCC 1591) 及びS. parasanguinis FW213株（Taiwan株）が見いだされたために、これらの２株を含む数種の菌株を用いて系統樹を作成した。系統樹は、各細菌が有するリボソームＲＮＡの１６Ｓユニットの領域から２３Ｓユニットの領域（１６Ｓ－２３Ｓ region）における塩基配列に基づき、近接接合法を応用したソフトウェアを用いて作成した。得られた系統樹を図２に示す。
Og菌のｏｒｆを探索したところ、Og菌が有する塩基数、ＧＣ含有率、ＣＤＳ、ＲＮＡ数が近似する細菌としてS. parasanguinis標準株 (S. parasanguinis ATCC 1591) 及びS. parasanguinis FW213株（Taiwan株）が見いだされたために、これらの２株を含む数種の菌株を用いて系統樹を作成した。系統樹は、各細菌が有するリボソームＲＮＡの１６Ｓユニットの領域から２３Ｓユニットの領域（１６Ｓ－２３Ｓ region）における塩基配列に基づき、近接接合法を応用したソフトウェアを用いて作成した。得られた系統樹を図２に示す。
さらにOg1株とS. parasanguinis FW213株についてＡＮＩ解析（Average Nucleotide
Identity calculator from Kostas Lab）を行ったところ、一致率（Identity）が９４.３％となった。この結果、Og1株とS. parasanguinis FW213株は異なる菌種に属し、また、新たに検出されたOg2株とOg3株もOg1株と同じ菌種に属することが確認された。
Identity calculator from Kostas Lab）を行ったところ、一致率（Identity）が９４.３％となった。この結果、Og1株とS. parasanguinis FW213株は異なる菌種に属し、また、新たに検出されたOg2株とOg3株もOg1株と同じ菌種に属することが確認された。
〔Og菌を特異的に検出できる領域の探索〕
上記で見つかった４９の候補ｏｒｆについて、S. parasanguinis FW213株、S. parasanguinis 標準株、その他Og菌と区別すべきストレプトコッカス属に属する数種の菌株との相同性を遺伝子情報データベースにより検索した。相同性検索は、ＢＬＡＳＴ（NCBI BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）により行った。その結果を表１に示した。その結果、表１の上から２５番目にある４３２ｂｐのｏｒｆ領域が、Og菌を特異的に検出できる対象であると考えられた。この対象をｏｒｆ２５遺伝子としてさらに検討を加えた。
上記で見つかった４９の候補ｏｒｆについて、S. parasanguinis FW213株、S. parasanguinis 標準株、その他Og菌と区別すべきストレプトコッカス属に属する数種の菌株との相同性を遺伝子情報データベースにより検索した。相同性検索は、ＢＬＡＳＴ（NCBI BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）により行った。その結果を表１に示した。その結果、表１の上から２５番目にある４３２ｂｐのｏｒｆ領域が、Og菌を特異的に検出できる対象であると考えられた。この対象をｏｒｆ２５遺伝子としてさらに検討を加えた。
３つのOg菌のｏｒｆであるｏｒｆ２５遺伝子の塩基配列のアライメントを図３に示した。図３に示されたOg1株の塩基配列（Og1-orf25）は配列番号４で、Og2株の塩基配列（Og2-orf25）は配列番号５で、Og3株の塩基配列（Og3-orf25）は配列番号６で示される。
〔ｏｒｆ２５遺伝子の検出〕
図３に示すOg1株の塩基配列に基づき、ｏｒｆ２５遺伝子を増幅するためのプライマーセットを作製し、ｏｒｆ２５遺伝子の全領域及び一部領域の増幅を行い、増幅産物の検出を試みた。フォワード側プライマーとして３つのプライマー（Og25-Hyb-startF、Og25-Hyb-50F、Og25-Hyb-177F：それぞれの塩基配列を配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７で示す。）を、リバース側プライマーとして２つのプライマー（Og25-Hyb-176R、Og25-Hyb-endR：それぞれの塩基配列を配列番号１６、配列番号１４で示す。）を作製した。増幅は図４に示す３組の組み合わせ（プライマーセットorf25、プライマーセットorf25_5'、プライマーセットorf25_3'）で行った。プライマーセットorf25（Og25-Hyb-startFとOg25-Hyb-endRの組み合わせ）はｏｒｆ２５の全領域を、プライマーセットorf25_5'（Og25-Hyb-50FとOg25-Hyb-176Rの組み合わせ）は５´末端から５０番目の塩基から１７６番目の塩基までの領域を、プライマーセットorf25_3'（Og25-Hyb-177FとOg25-Hyb-endR）は５´末端から１７７番目の塩基から３´末端までの領域を増幅させるようにした。
図３に示すOg1株の塩基配列に基づき、ｏｒｆ２５遺伝子を増幅するためのプライマーセットを作製し、ｏｒｆ２５遺伝子の全領域及び一部領域の増幅を行い、増幅産物の検出を試みた。フォワード側プライマーとして３つのプライマー（Og25-Hyb-startF、Og25-Hyb-50F、Og25-Hyb-177F：それぞれの塩基配列を配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７で示す。）を、リバース側プライマーとして２つのプライマー（Og25-Hyb-176R、Og25-Hyb-endR：それぞれの塩基配列を配列番号１６、配列番号１４で示す。）を作製した。増幅は図４に示す３組の組み合わせ（プライマーセットorf25、プライマーセットorf25_5'、プライマーセットorf25_3'）で行った。プライマーセットorf25（Og25-Hyb-startFとOg25-Hyb-endRの組み合わせ）はｏｒｆ２５の全領域を、プライマーセットorf25_5'（Og25-Hyb-50FとOg25-Hyb-176Rの組み合わせ）は５´末端から５０番目の塩基から１７６番目の塩基までの領域を、プライマーセットorf25_3'（Og25-Hyb-177FとOg25-Hyb-endR）は５´末端から１７７番目の塩基から３´末端までの領域を増幅させるようにした。
ＰＣＲの反応液組成は表２に、ＰＣＲの増幅条件は表３に示した。得られた増幅産物を、アガロースゲルを用いた電気泳動により分離し、それぞれの増幅領域に対応して作製した３つのＤＮＡプローブ(orf25、orf25_5'、orf25_3')を用いたブロッティングによって、増副産物の確認を行った。
また、前記探索時に見いだされたS. parasanguinis FW213株が有する１つのｏｒｆ（「ｏｒｆ－ａｎｏｔｈｅｒ２遺伝子」と称する。）の塩基配列（図１３にFW213-orf25-homologで示され、その塩基配列は配列番号２２で示される。）の一部領域がOg菌のｏｒｆ２５遺伝子の一部領域とよく似ていたことから、前記３組のプライマーセットはS. parasanguinis FW213株を検出しないことの確認を行った。また、Og菌３株のｏｒｆ－ａｎｏｔｈｅｒ２遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列番号３２（Og1株：図１３にOg1-orf25-homologで示される。）、配列番号３３（Og2株：図１３にOg2-orf25-homologで示される。）、配列番号３４（Og3株：図１３にOg3-orf25-homologで示される。）に示した。このとき、参考として図１１に示すS. parasanguinis FW213株の塩基配列に基づき、３つのフォワード側プライマーと、２つのリバース側プライマーを作製して、Og1株とS. parasanguinis FW213株の検出を試みた。確認には、ｏｒｆ－ａｎｏｔｈｅｒ２遺伝子の全領域を増幅するプライマーセット（orf-homolog-FW213）と、同ｏｒｆ遺伝子の５´末端から５６番目の塩基から同末端から１８２番目の塩基までの領域を増幅するプライマーセット（orf-homolog-FW213_5'）と、同ｏｒｆ遺伝子の５´末端から１８３番目の塩基から３´終端までの領域を増幅するプライマーセット（orf-homolog-FW213_3'）、及びそれぞれの増幅領域に結合する32Ｐで標識されたＤＮＡプローブを用いた。32Ｐで標識されたＤＮＡプローブはランダムプライマー法により作製した。図４にOg菌のｏｒｆ２５遺伝子の増幅に用いられたプライマーセットを、図５にS. parasanguinis FW213株のｏｒｆ２５homologueの増幅に用いられたプライマーセットを、図６に両者の増幅領域を対比させた図を示す。
その結果を図７に示した。図７に示されたように、Og1株のｏｒｆ２５遺伝子の塩基配列を基に作製された３組のプライマーセットで得られた増幅産物はOg1株由来のＰＣＲ産物（図７に示すProbe）とは反応したが、S. parasanguinis FW213株のｏｒｆ－ａｎｏｔｈｅｒ２遺伝子から得られたＰＣＲ産物（同Probe）とは反応しなかった。また、S. parasanguinis FW213株のｏｒｆ－ａｎｏｔｈｅｒ２遺伝子の塩基配列を基に作製された３組のプライマーセットで得られた増幅産物は、S. parasanguinis FW213株由来のＰＣＲ産物（同Probe）とは反応したが、Og1株由来のＰＣＲ産物とは反応しなかった。ＤＮＡtemplateは、細菌からＤＮＡサンプルを調製するための一般的な調製方法により調製した。図１４にＰＣＲに用いたプライマーセットの増幅領域を示した。
〔Og2株、Og3株の増幅〕
次に、Og1株とS. parasanguinis FW213株について、前記で作製したＤＮＡプローブとOg1株、Og2株、Og3株、S. parasanguinis FW213株とS. parasanguinis 標準株由来の菌体ＤＮＡを用いたブロッティングによってそれぞれの標的遺伝子の検出を試みた。その結果を図８に示した。その結果、Og1株のｏｒｆ２５の塩基配列を基に作製した３種のＤＮＡプローブは、Og1株、Og2株、Og3株とそれぞれ反応を示した。なお、S. parasanguinis FW213株の塩基配列を基に作製した３つのＤＮＡプローブはS. parasanguinis標準株を除く全ての菌に反応を示した。従って、３株のOg菌が有するｏｒｆ２５遺伝子はOg菌が有する特有の遺伝子であり、この領域を検出することでOg菌を特異的に検出できることが確認された。また、前記S. parasanguinis FW213株のｏｒｆ－ａｎｏｔｈｅｒ２遺伝子と同様の配列領域を有する領域が、Og菌にも存在し、当該領域はｏｒｆ２５遺伝子とは異なる位置にあると結論づけられた（図１３参照）。
次に、Og1株とS. parasanguinis FW213株について、前記で作製したＤＮＡプローブとOg1株、Og2株、Og3株、S. parasanguinis FW213株とS. parasanguinis 標準株由来の菌体ＤＮＡを用いたブロッティングによってそれぞれの標的遺伝子の検出を試みた。その結果を図８に示した。その結果、Og1株のｏｒｆ２５の塩基配列を基に作製した３種のＤＮＡプローブは、Og1株、Og2株、Og3株とそれぞれ反応を示した。なお、S. parasanguinis FW213株の塩基配列を基に作製した３つのＤＮＡプローブはS. parasanguinis標準株を除く全ての菌に反応を示した。従って、３株のOg菌が有するｏｒｆ２５遺伝子はOg菌が有する特有の遺伝子であり、この領域を検出することでOg菌を特異的に検出できることが確認された。また、前記S. parasanguinis FW213株のｏｒｆ－ａｎｏｔｈｅｒ２遺伝子と同様の配列領域を有する領域が、Og菌にも存在し、当該領域はｏｒｆ２５遺伝子とは異なる位置にあると結論づけられた（図１３参照）。
Og1株のｏｒｆ２５遺伝子の塩基配列を基に作製した３種類のプローブ（orf25、orf25_5'、orf25_3'）を用いて、種々の菌株について32Ｐで標識された上記ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションを行った。各菌株を培地上に載せたニトロセルロース膜上に植菌し、培養後菌体ＤＮＡをアルカリ処理後、３種類のプローブでコロニーハイブリダイゼーションを行った。その結果を図９及び図１０に示した。３種のプローブは、それぞれOg1株、Og2株、Og3株について反応を示したが、その他の菌株については反応を示さなかった。また、ロシア人の胃食道接合部炎・胃炎・胃潰瘍患者からの胃穿刺標本より培養されたOg菌と思われる菌（図１０に示すＮｏ．２１やＮｏ．２２）についても良好な反応を示し、これらの患者から採取された菌はOg菌であると推定される。
ｏｒｆ２５遺伝子の一部領域を増幅可能なプライマーセットを新たに作製し、ＰＣＲによる増幅産物からOg菌の検出を試みた。新たに作製したプライマーセット（Og-Hypo25F：配列番号１８と、Og-Hypo25R：配列番号１９）を表４に示す。
表２、表３に示す条件下で増幅した増幅産物は、アガロースゲルを用いた電気泳動を行い、蛍光標識されたプローブにより確認した。その結果を図１１に示す。レーン４に示した通りロシア人の胃食道接合部炎・胃炎・胃潰瘍患者からの胃穿刺標本より培養されたOg菌と思われる菌(PI-1)からも特異的な増幅産物を得ることができた。
また、表５に示すプライマーセット（Og-ORF25-RT-F：配列番号２０と、Og-ORF25-RF-R：配列番号２１）を用いてリアルタイムＰＣＲによりOg1株を検出したところ、良好なピークを示した一方、参考例としてS. parasanguinis FW213株について適用したところピークを示さなかった（結果は図示せず）。
本発明は、例えば、胃潰瘍、胃がん、その他の人体病理に関与していると考えられるS. mobilis菌を迅速に検出することに利用できる。
Claims (13)
- 配列番号１、配列番号２、配列番号３の何れかで示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列から１～９個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入されたアミノ配列からなるタンパク質を指標とするStreptococcus mobilis菌の検出法。
- 請求項１に記載されたタンパク質をコードするポリヌクレオチド又は当該ポリヌクレオチドの塩基配列と９０％以上の配列一致度のある塩基配列からなるポリヌクレオチドを指標とするStreptococcus mobilis菌の検出法。
- 配列番号４、配列番号５、配列番号６の何れかで示される記載された塩基配列又はこれら何れかの塩基配列と９０％以上の配列一致度のある塩基配列からなるポリヌクレオチドを指標とするStreptococcus mobilis菌の検出法。
- Streptococcus mobilis菌を検出するために用いられるＰＣＲ用プライマーセットであって、下記（１）～（８）の何れかのプライマーセット。
（１）配列番号１３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド又は
配列番号１３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの塩基配列から１～５個のヌクレオチド残基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなり、配列番号４～６に記載の塩基配列と相補的に結合し得るポリヌクレオチド、と
配列番号１４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド又は
配列番号１４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの塩基配列から１～５個のヌクレオチド残基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなり、配列番号４～６で示される塩基配列と相補的に結合し得るポリヌクレオチド
（２）配列番号１５で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド又は
配列番号１５で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの塩基配列から１～５個のヌクレオチド残基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなり、配列番号４～６で示される塩基配列と相補的に結合し得るポリヌクレオチド、と
配列番号１６で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド又は
配列番号１６で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの塩基配列から１～５個のヌクレオチド残基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなり、配列番号４～６で示される塩基配列と相補的に結合し得るポリヌクレオチド
（３）配列番号１７で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド又は
配列番号１７で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの塩基配列から１～５個のヌクレオチド残基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなり、配列番号４～６で示される塩基配列と相補的に結合し得るポリヌクレオチド、と、
配列番号１４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド又は
配列番号１４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの塩基配列から１～５個のヌクレオチド残基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなり、配列番号４～６で示される塩基配列と相補的に結合し得るポリヌクレオチド
（４）配列番号１８で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド又は
配列番号１８で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの塩基配列から１～５個のヌクレオチド残基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなり、配列番号４～６で示される塩基配列と相補的に結合し得るポリヌクレオチド、と、
配列番号１９で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド又は
配列番号１９で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの塩基配列から１～５個のヌクレオチド残基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなり、配列番号４～６で示される塩基配列と相補的に結合し得るポリヌクレオチド
（５）配列番号２０で示される塩基配列からなりポリヌクレオチド又は
配列番号２０で示される塩基配列からなりポリヌクレオチドの塩基配列から１～５個のヌクレオチド残基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなり、配列番号４～６で示される塩基配列と相補的に結合し得るポリヌクレオチド、と、
配列番号２１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド又は
配列番号２１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの塩基配列から１～５個のヌクレオチド残基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなり、配列番号４～６で示される塩基配列と相補的に結合し得るポリヌクレオチド
（６）配列番号２３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド又は
配列番号２３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの塩基配列から１～５個のヌクレオチド残基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなり、配列番号４～６に記載の塩基配列と相補的に結合し得るポリヌクレオチド、と
配列番号１４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド又は
配列番号１４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの塩基配列から１～５個のヌクレオチド残基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなり、配列番号４～６で示される塩基配列と相補的に結合し得るポリヌクレオチド
（７）配列番号２４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド又は
配列番号２４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの塩基配列から１～５個のヌクレオチド残基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなり、配列番号４～６で示される塩基配列と相補的に結合し得るポリヌクレオチド、と
配列番号２５で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド又は
配列番号２５で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの塩基配列から１～５個のヌクレオチド残基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなり、配列番号４～６で示される塩基配列と相補的に結合し得るポリヌクレオチド
（８）配列番号２６で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド又は
配列番号２６で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの塩基配列から１～５個のヌクレオチド残基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなり、配列番号４～６で示される塩基配列と相補的に結合し得るポリヌクレオチド、と、
配列番号１４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド又は
配列番号１４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの塩基配列から１～５個のヌクレオチド残基が置換、欠失、挿入された塩基配列からなり、配列番号４～６で示される塩基配列と相補的に結合し得るポリヌクレオチド - 配列番号４～６又は配列番号７～１２の何れかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又はこれら何れかのポリヌクレオチドと６０％以上、好ましくは７５％以上、望ましくは９０％以上の配列一致度を有するポリヌクレオチドに相補的に結合し得る塩基配列を有する検出用プローブ。
- ｏｒｆ２５遺伝子の一部分の領域又はその全部の領域を増幅し得るプライマーセットを含むStreptococcus mobilis菌の検出用キット。
- 前記プライマーセットは、請求項４に記載の何れかのプライマーセットである請求項６に記載のStreptococcus mobilis菌の検出用キット。
- ｏｒｆ２５遺伝子の一部分の領域又はその全部の領域を増幅し得るプライマーセットと、請求項５に記載の何れかの検出用プローブを含むStreptococcus mobilis菌の検出用キット。
- ｏｒｆ２５遺伝子の一部分の領域又はその全部の領域を増幅し得るプライマーセットを用いて、被験試料中のポリヌクレオチドを増幅させる工程と、当該工程により増幅された増幅産物を検出する工程を含むStreptococcus mobilis菌の検出法。
- 前記プライマーセットは、請求項４に記載の何れかのプライマーセットである請求項９に記載のStreptococcus mobilis菌の検出法。
- 配列番号１～３の何れかに記載されたアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列から１～９個のアミノ酸が置換、欠失、挿入されたアミノ配列からなるタンパク質に対する標識された抗体。
- 配列番号４、配列番号５、配列番号６の何れかに記載された塩基配列又はこれら何れかの塩基配列と９０％以上、好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９７％以上の配列一致度を有する塩基配列からなる単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号１～３の何れかに記載されたアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列から１～９個のアミノ酸が置換、欠失、挿入されたアミノ配列からなる単離されたタンパク質。
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