JPH11290079A - ジャイレース遺伝子を用いた結核菌群構成細菌の同定・検出方法 - Google Patents
ジャイレース遺伝子を用いた結核菌群構成細菌の同定・検出方法Info
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- JPH11290079A JPH11290079A JP10098879A JP9887998A JPH11290079A JP H11290079 A JPH11290079 A JP H11290079A JP 10098879 A JP10098879 A JP 10098879A JP 9887998 A JP9887998 A JP 9887998A JP H11290079 A JPH11290079 A JP H11290079A
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Landscapes
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【解決手段】 DNA ジャイレースβサブユニットをコー
ドするDNA を指標として結核菌群を構成する細菌の同定
及び検出を行うこと結核菌群構成細菌の同定及び検出方
法。この方法は、以下の（１）〜（４）の工程を含む。 （１）DNA ジャイレースβサブユニットをコードするDN
A 中の結核菌群構成細菌間で塩基配列の異なる領域を含
むオリゴヌクレオチドを合成する （２）（１）で合成したオリゴヌクレオチド、dNTP、DN
A ポリメラーゼ及び試料とする細菌のDNA を含む溶液を
調整する （３）（２）で調整した溶液をポリメラーゼ連鎖反応が
起こり得る条件で繰り返し加熱する （４）（３）の操作後の溶液について、電気泳動を行
い、その電気泳動パターンから細菌の同定を行う 【効果】 結核菌群を構成する菌種について迅速な同定
及び検出を可能にする。
ドするDNA を指標として結核菌群を構成する細菌の同定
及び検出を行うこと結核菌群構成細菌の同定及び検出方
法。この方法は、以下の（１）〜（４）の工程を含む。 （１）DNA ジャイレースβサブユニットをコードするDN
A 中の結核菌群構成細菌間で塩基配列の異なる領域を含
むオリゴヌクレオチドを合成する （２）（１）で合成したオリゴヌクレオチド、dNTP、DN
A ポリメラーゼ及び試料とする細菌のDNA を含む溶液を
調整する （３）（２）で調整した溶液をポリメラーゼ連鎖反応が
起こり得る条件で繰り返し加熱する （４）（３）の操作後の溶液について、電気泳動を行
い、その電気泳動パターンから細菌の同定を行う 【効果】 結核菌群を構成する菌種について迅速な同定
及び検出を可能にする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、結核菌群を構成す
る細菌のDNAジャイレースβサブユニットをコードするD
NA （以下「gyrB DNA」という）の塩基配列の違いを利
用した結核菌群構成細菌の同定・検出法に関するもので
あり、さまざまな産業分野での利用が可能であるが、と
りわけ医学、疫学、獣医学の分野に有用である。
る細菌のDNAジャイレースβサブユニットをコードするD
NA （以下「gyrB DNA」という）の塩基配列の違いを利
用した結核菌群構成細菌の同定・検出法に関するもので
あり、さまざまな産業分野での利用が可能であるが、と
りわけ医学、疫学、獣医学の分野に有用である。
【０００２】
【従来の技術】結核は、世界で9千万人が毎年新たに罹
患し、3千万人が毎年死亡する最も重要な感染症にも関
わらず、その対策は十分ではない。その原因菌である結
核菌群には分類上、ヒトに対して起病性のある結核菌
（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、Mycobacter
ium tuberculosis）、ウシ（型）菌（マイコバクテリウ
ム・ボビス、Mycobacterium bovis）及びアフリカ菌
（マイコバクテリウム・アフリカヌム、Mycobacterium
africanum）とヒトに対する起病性のないネズミ（型）
菌（マイコバクテリウム・ミクロティ、Mycobacterium
microti）の4菌種が含まれる。従来、これらの結核菌を
はじめとする抗酸菌の検査の主たるものはZiehl-Neelse
n法による塗抹染色、小川培地を用いた分離培養法なら
びに薬剤感受性試験であった。その後の技術の発展によ
りBACTEC 460 TB システム、Septi-CheckAFB、MGIT (My
cobacteria Growth Indicator Tube) などの新規培養技
術が開発された。
患し、3千万人が毎年死亡する最も重要な感染症にも関
わらず、その対策は十分ではない。その原因菌である結
核菌群には分類上、ヒトに対して起病性のある結核菌
（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、Mycobacter
ium tuberculosis）、ウシ（型）菌（マイコバクテリウ
ム・ボビス、Mycobacterium bovis）及びアフリカ菌
（マイコバクテリウム・アフリカヌム、Mycobacterium
africanum）とヒトに対する起病性のないネズミ（型）
菌（マイコバクテリウム・ミクロティ、Mycobacterium
microti）の4菌種が含まれる。従来、これらの結核菌を
はじめとする抗酸菌の検査の主たるものはZiehl-Neelse
n法による塗抹染色、小川培地を用いた分離培養法なら
びに薬剤感受性試験であった。その後の技術の発展によ
りBACTEC 460 TB システム、Septi-CheckAFB、MGIT (My
cobacteria Growth Indicator Tube) などの新規培養技
術が開発された。
【０００３】他方、分子生物学的手法を取り入れた方法
も新たに開発された。DNAの相同性を利用した菌種の鑑
別・同定、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、「PCR」とい
う）法による検出、挿入配列IS6110を用いる結核菌の亜
分類といった方法がすでに実用段階に入っている。なか
でもPCR法を用いる場合、培養を必要とせず迅速な判定
を得るのに適している。その際、用いられる遺伝子は多
くの場合rRNA遺伝子であるが、近年、rRNA遺伝子より進
化速度の速いタンパク質をコードする遺伝子、なかでも
gyrB DNAを用いることによってより詳細で正確な分類・
同定ができることが示された。（Yamamoto, S. and S.
Harayama 1995 Appl. Environ. Microbiol. 61: 1104-1
109.Yamamoto, S. and S. Harayama 1996 Int. J. Sys
t. Bacteriol. 46: 506-511.Harayama, S. and S. Yama
moto 1996 p250-258 In Molecular Biology of Pseudom
onas T. Nakazawa, K. Fukuda, D. Haas, S. Silver (e
ds) ASM press, Washington, D.C., 山本 敏、原山重
明、化学と生物 1996 第34巻 第3号 p. 149-151.,
山本 敏、原山重明、農芸化学会誌 1997 第71巻 第9
号 p.894-897.)
も新たに開発された。DNAの相同性を利用した菌種の鑑
別・同定、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、「PCR」とい
う）法による検出、挿入配列IS6110を用いる結核菌の亜
分類といった方法がすでに実用段階に入っている。なか
でもPCR法を用いる場合、培養を必要とせず迅速な判定
を得るのに適している。その際、用いられる遺伝子は多
くの場合rRNA遺伝子であるが、近年、rRNA遺伝子より進
化速度の速いタンパク質をコードする遺伝子、なかでも
gyrB DNAを用いることによってより詳細で正確な分類・
同定ができることが示された。（Yamamoto, S. and S.
Harayama 1995 Appl. Environ. Microbiol. 61: 1104-1
109.Yamamoto, S. and S. Harayama 1996 Int. J. Sys
t. Bacteriol. 46: 506-511.Harayama, S. and S. Yama
moto 1996 p250-258 In Molecular Biology of Pseudom
onas T. Nakazawa, K. Fukuda, D. Haas, S. Silver (e
ds) ASM press, Washington, D.C., 山本 敏、原山重
明、化学と生物 1996 第34巻 第3号 p. 149-151.,
山本 敏、原山重明、農芸化学会誌 1997 第71巻 第9
号 p.894-897.)
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】結核菌群の細菌は生育
速度が通常の細菌よりも遅く、培養を必要とする同定法
を用いて結果を得るには二から三週間の時間を必要とす
る。そこで、培養を必要としないPCR法を用いた方法が
結核菌群の細菌を同定する場合必要不可欠な方法といえ
る。しかしながら、従来用いられてきた rRNA遺伝子を
標的とするPCR法に基く同定法では、結核菌群を構成す
る4菌種のrRNA遺伝子塩基配列の間で違いがないため結
核菌群を構成する4菌種を区別することは不可能であっ
た。本発明は、このような従来法の問題を解決し、結核
菌群構成細菌の迅速な同定・検出方法を提供することを
目的とする。
速度が通常の細菌よりも遅く、培養を必要とする同定法
を用いて結果を得るには二から三週間の時間を必要とす
る。そこで、培養を必要としないPCR法を用いた方法が
結核菌群の細菌を同定する場合必要不可欠な方法といえ
る。しかしながら、従来用いられてきた rRNA遺伝子を
標的とするPCR法に基く同定法では、結核菌群を構成す
る4菌種のrRNA遺伝子塩基配列の間で違いがないため結
核菌群を構成する4菌種を区別することは不可能であっ
た。本発明は、このような従来法の問題を解決し、結核
菌群構成細菌の迅速な同定・検出方法を提供することを
目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため鋭意検討を重ねた結果、gyrB DNAの塩基
配列の一部が結核菌群を構成する各細菌間で異なってい
ることを見出し、本発明を完成した。即ち、本発明は、
gyrB DNAを指標として結核菌群を構成する細菌の同定を
行うことを特徴とする結核菌群構成細菌の同定方法であ
る。また、本発明は、gyrB DNAを指標として結核菌群を
構成する細菌の検出を行うことを特徴とする結核菌群構
成細菌の検出方法である。
を解決するため鋭意検討を重ねた結果、gyrB DNAの塩基
配列の一部が結核菌群を構成する各細菌間で異なってい
ることを見出し、本発明を完成した。即ち、本発明は、
gyrB DNAを指標として結核菌群を構成する細菌の同定を
行うことを特徴とする結核菌群構成細菌の同定方法であ
る。また、本発明は、gyrB DNAを指標として結核菌群を
構成する細菌の検出を行うことを特徴とする結核菌群構
成細菌の検出方法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の結核菌群構成細菌の同定・検出方法は、gyrB D
NAを指標とすることを特徴とする。同定・検出の対象と
する結核菌群構成細菌としては、マイコバクテリウム・
ツベルクローシス、マイコバクテリウム・ボビス、マイ
コバクテリウム・アフリカヌム、及びマイコバクテリウ
ム・ミクロティを挙げることができる。gyrB DNAを指標
とした同定・検出方法としては、以下に述べる二つの方
法を例示することができる。
本発明の結核菌群構成細菌の同定・検出方法は、gyrB D
NAを指標とすることを特徴とする。同定・検出の対象と
する結核菌群構成細菌としては、マイコバクテリウム・
ツベルクローシス、マイコバクテリウム・ボビス、マイ
コバクテリウム・アフリカヌム、及びマイコバクテリウ
ム・ミクロティを挙げることができる。gyrB DNAを指標
とした同定・検出方法としては、以下に述べる二つの方
法を例示することができる。
【０００７】Ａ）PCR を利用する方法 この方法は以下のように行う。 （１）gyrB DNA中の結核菌群構成細菌間で塩基配列の異
なる領域を含むオリゴヌクレオチドを合成する。各細菌
のgyrB DNAの塩基配列は、図１及び図２に示すように既
に決定されているので、上記オリゴヌクレオチドは、こ
の図に基づき合成することができる。好ましいオリゴヌ
クレオチドとしては、例えば、配列番号６、配列番号
８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列
番号１６、又は配列番号１８記載のアミノ酸配列をコー
ドするオリゴヌクレオチドを挙げることができ、特に好
ましいオリゴヌクレオチドとしては配列番号５、配列番
号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列
番号１５、又は配列番号１７で表されるオリゴヌクレオ
チドを挙げることができる。
なる領域を含むオリゴヌクレオチドを合成する。各細菌
のgyrB DNAの塩基配列は、図１及び図２に示すように既
に決定されているので、上記オリゴヌクレオチドは、こ
の図に基づき合成することができる。好ましいオリゴヌ
クレオチドとしては、例えば、配列番号６、配列番号
８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列
番号１６、又は配列番号１８記載のアミノ酸配列をコー
ドするオリゴヌクレオチドを挙げることができ、特に好
ましいオリゴヌクレオチドとしては配列番号５、配列番
号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列
番号１５、又は配列番号１７で表されるオリゴヌクレオ
チドを挙げることができる。
【０００８】（２）上記で合成したオリゴヌクレオチ
ド、dNTP、DNA ポリメラーゼ及び試料とする細菌のDNA
を含む溶液を調製する。溶液中に含まれる各成分の濃度
は、通常のPCR に使用する反応溶液と同様でよい。試料
とする細菌のDNA は精製されたものである必要はなく、
例えば、菌体の破砕物をそのまま使用してもよい。
ド、dNTP、DNA ポリメラーゼ及び試料とする細菌のDNA
を含む溶液を調製する。溶液中に含まれる各成分の濃度
は、通常のPCR に使用する反応溶液と同様でよい。試料
とする細菌のDNA は精製されたものである必要はなく、
例えば、菌体の破砕物をそのまま使用してもよい。
【０００９】（３）上記で調製した溶液をPCR が起こり
得る条件で繰り返し加熱する。加熱の温度、サイクル等
はPCR が起こり得る範囲内であれば特に限定されない
が、図１及び図２に示すように結核菌群を構成する細菌
間のgyrB DNAの相同性が高いので、アニーリング時の温
度はかなり高く設定することが望ましい。具体的には、
６８℃以上に設定することが望ましい。合成したオリゴ
ヌクレオチドと試料として添加した細菌のDNA が、ハイ
ブリダイズすることができれば、加熱の繰り返しにより
PCR が起こり、増幅産物が生成する。一方、合成したオ
リゴヌクレオチドと試料として添加した細菌のDNA が、
ハイブリダイズすることができれなければ、PCR は起こ
らず、増幅産物は生成しない。 （４）上記操作後の溶液について電気泳動を行う。溶液
中に増幅産物が含まれていれば、それに対応したバンド
が泳動ゲル上に現れる。従って、その電気泳動パターン
から細菌の同定、検出を行うことができる。
得る条件で繰り返し加熱する。加熱の温度、サイクル等
はPCR が起こり得る範囲内であれば特に限定されない
が、図１及び図２に示すように結核菌群を構成する細菌
間のgyrB DNAの相同性が高いので、アニーリング時の温
度はかなり高く設定することが望ましい。具体的には、
６８℃以上に設定することが望ましい。合成したオリゴ
ヌクレオチドと試料として添加した細菌のDNA が、ハイ
ブリダイズすることができれば、加熱の繰り返しにより
PCR が起こり、増幅産物が生成する。一方、合成したオ
リゴヌクレオチドと試料として添加した細菌のDNA が、
ハイブリダイズすることができれなければ、PCR は起こ
らず、増幅産物は生成しない。 （４）上記操作後の溶液について電気泳動を行う。溶液
中に増幅産物が含まれていれば、それに対応したバンド
が泳動ゲル上に現れる。従って、その電気泳動パターン
から細菌の同定、検出を行うことができる。
【００１０】Ｂ）制限酵素断片を利用する方法 この方法は、以下のように行う。 （１）結核菌群構成細菌のgyrB DNAの一部と同一なオリ
ゴヌクレオチドと前記DNA の一部と相補的なオリゴヌク
レオチドを合成する。各細菌のgyrB DNAの塩基配列は、
図１及び図２に示すように既に決定されているので、前
記オリゴヌクレオチドは、この図に基づき合成すること
ができる。好ましいオリゴヌクレオチドとしては、例え
ば、配列番号２記載のアミノ酸配列をコードするオリゴ
ヌクレオチドと配列番号４記載のアミノ酸配列をコード
するオリゴヌクレオチドを挙げることができ、特に好ま
しいオリゴヌクレオチドとしては配列番号１で表される
オリゴヌクレオチドと配列番号３で表されるオリゴヌク
レオチドを挙げることができる。
ゴヌクレオチドと前記DNA の一部と相補的なオリゴヌク
レオチドを合成する。各細菌のgyrB DNAの塩基配列は、
図１及び図２に示すように既に決定されているので、前
記オリゴヌクレオチドは、この図に基づき合成すること
ができる。好ましいオリゴヌクレオチドとしては、例え
ば、配列番号２記載のアミノ酸配列をコードするオリゴ
ヌクレオチドと配列番号４記載のアミノ酸配列をコード
するオリゴヌクレオチドを挙げることができ、特に好ま
しいオリゴヌクレオチドとしては配列番号１で表される
オリゴヌクレオチドと配列番号３で表されるオリゴヌク
レオチドを挙げることができる。
【００１１】（２）上記で合成した２種類のオリゴヌク
レオチドをプライマーとし、試料とする細菌のDNA を鋳
型として、PCR を行う。試料とする細菌のDNA は精製さ
れたものである必要はなく、例えば、菌体の破砕物をそ
のまま使用してもよい。PCR は通常の方法で行うことが
できる。 （３）上記で増幅されたDNA 断片を制限酵素で消化す
る。使用する制限酵素は結核菌群を構成する細菌間で異
なる断片を生じさせるようなものであれば特に限定され
ない。このような制限酵素としては、例えば、Rsa I 及
びTaq I を挙げることができる。
レオチドをプライマーとし、試料とする細菌のDNA を鋳
型として、PCR を行う。試料とする細菌のDNA は精製さ
れたものである必要はなく、例えば、菌体の破砕物をそ
のまま使用してもよい。PCR は通常の方法で行うことが
できる。 （３）上記で増幅されたDNA 断片を制限酵素で消化す
る。使用する制限酵素は結核菌群を構成する細菌間で異
なる断片を生じさせるようなものであれば特に限定され
ない。このような制限酵素としては、例えば、Rsa I 及
びTaq I を挙げることができる。
【００１２】（４）上記で消化された断片について電気
泳動を行う。消化されたDNA 断片はその長さに応じた位
置に現れる。従って、その電気泳動パターンから細菌の
同定、検出を行うことができる。 本発明の同定・検出方法としては、上記の二つの方法を
代表例として挙げることができるが、これらの方法以外
でも、gyrB DNAを指標とする限り、本発明の同定・検出
方法に含まれる。上記の方法以外の同定・検出方法とし
ては、例えば、gyrB DNAをPCR により増幅し、その増幅
断片の塩基配列を決定し、細菌の同定・検出を行う方法
や、gyrB DNA中の結核菌群構成細菌間で塩基配列の異な
る領域を含むオリゴヌクレオチドを合成し、これをプロ
ーブとしてサザンブロッティングを行い、細菌の同定・
検出を行う方法などを挙げることができる。
泳動を行う。消化されたDNA 断片はその長さに応じた位
置に現れる。従って、その電気泳動パターンから細菌の
同定、検出を行うことができる。 本発明の同定・検出方法としては、上記の二つの方法を
代表例として挙げることができるが、これらの方法以外
でも、gyrB DNAを指標とする限り、本発明の同定・検出
方法に含まれる。上記の方法以外の同定・検出方法とし
ては、例えば、gyrB DNAをPCR により増幅し、その増幅
断片の塩基配列を決定し、細菌の同定・検出を行う方法
や、gyrB DNA中の結核菌群構成細菌間で塩基配列の異な
る領域を含むオリゴヌクレオチドを合成し、これをプロ
ーブとしてサザンブロッティングを行い、細菌の同定・
検出を行う方法などを挙げることができる。
【００１３】
【実施例】〔実施例１〕結核菌群構成細菌４種と他のマ
イコバクテリウム属に属する細菌５種の合計９種の細菌
から純化DNA を10ng調製した。これらのDNA を鋳型と
し、配列番号１及び配列番号３記載のオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとしてPCR を行った。ＰＣＲによる増幅
条件は以下の通りである。
イコバクテリウム属に属する細菌５種の合計９種の細菌
から純化DNA を10ng調製した。これらのDNA を鋳型と
し、配列番号１及び配列番号３記載のオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとしてPCR を行った。ＰＣＲによる増幅
条件は以下の通りである。
【００１４】 ９５℃ 10分 １サイクル 95℃ １分、68℃１分、72℃１分 30サイクル 72℃ 10分 １サイクル プライマー濃度 各１ μM dNTP 各100 μM Ampli Taq GOLDTM及び添付のPCR buffer Iを使用（米国
Perkin Elmer社）
Perkin Elmer社）
【００１５】PCR による増幅産物をアガロースゲル電気
泳動法によって解析した。この結果を図３に示す。な
お、レーンと菌種の関係は以下の通りである。 レーン1:マイコバクテリウム・ツベルクローシス レーン2:マイコバクテリウム・ボビス レーン3:マイコバクテリウム・アフリカヌム レーン4:マイコバクテリウム・ミクロティ レーン5:マイコバクテリウム・カンサシイ（Mycobacter
ium kansasii） レーン6:マイコバクテリウム・ガストリ（Mycobacteriu
m gastri） レーン7:マイコバクテリウム・アブセサス（Mycobacter
ium abscessus） レーン8:マイコバクテリウム・ケローネ（Mycobacteriu
m chelonae） レーン9:マイコバクテリウム・トリビアーレ（Mycobact
erium trviale）
泳動法によって解析した。この結果を図３に示す。な
お、レーンと菌種の関係は以下の通りである。 レーン1:マイコバクテリウム・ツベルクローシス レーン2:マイコバクテリウム・ボビス レーン3:マイコバクテリウム・アフリカヌム レーン4:マイコバクテリウム・ミクロティ レーン5:マイコバクテリウム・カンサシイ（Mycobacter
ium kansasii） レーン6:マイコバクテリウム・ガストリ（Mycobacteriu
m gastri） レーン7:マイコバクテリウム・アブセサス（Mycobacter
ium abscessus） レーン8:マイコバクテリウム・ケローネ（Mycobacteriu
m chelonae） レーン9:マイコバクテリウム・トリビアーレ（Mycobact
erium trviale）
【００１６】〔実施例２〕４種の結核菌群構成細菌から
純化DNA を10ng調製した。これらのDNA を鋳型とし、配
列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配
列番号１３、配列番号１５、配列番号１７で表されるオ
リゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行った。PCR
による増幅条件は実施例１と同じである。PCR による
増幅産物をアガロースゲル電気泳動法によって解析し
た。この結果を図４に示す。なお、レーンと菌種の関係
は以下の通りである。
純化DNA を10ng調製した。これらのDNA を鋳型とし、配
列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配
列番号１３、配列番号１５、配列番号１７で表されるオ
リゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行った。PCR
による増幅条件は実施例１と同じである。PCR による
増幅産物をアガロースゲル電気泳動法によって解析し
た。この結果を図４に示す。なお、レーンと菌種の関係
は以下の通りである。
【００１７】 レーン１：マイコバクテリウム・ツベルクローシス レーン２：マイコバクテリウム・ボビス レーン３：マイコバクテリウム・アフリカヌム レーン４：マイコバクテリウム・ミクロティ 図４に示すように、配列番号５及び配列番号７で表され
るオリゴヌクレオチドをプライマーとした場合はマイコ
バクテリウム・ツベルクローシスでのみ増幅産物が観察
され、配列番号９及び配列番号１１で表されるオリゴヌ
クレオチドをプライマーとした場合はマイコバクテリウ
ム・ボビスでのみ増幅産物が観察され、配列番号５及び
配列番号１３で表されるオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとした場合はマイコバクテリウム・アフリカヌム及び
マイコバクテリウム・ミクロティで増幅産物が観察さ
れ、配列番号１５及び配列番号１７で表されるオリゴヌ
クレオチドをプライマーとした場合はマイコバクテリウ
ム・ミクロティでのみ増幅産物が観察された。以上の結
果から、プライマーと菌種との関係をまとめると以下の
ようになる。
るオリゴヌクレオチドをプライマーとした場合はマイコ
バクテリウム・ツベルクローシスでのみ増幅産物が観察
され、配列番号９及び配列番号１１で表されるオリゴヌ
クレオチドをプライマーとした場合はマイコバクテリウ
ム・ボビスでのみ増幅産物が観察され、配列番号５及び
配列番号１３で表されるオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとした場合はマイコバクテリウム・アフリカヌム及び
マイコバクテリウム・ミクロティで増幅産物が観察さ
れ、配列番号１５及び配列番号１７で表されるオリゴヌ
クレオチドをプライマーとした場合はマイコバクテリウ
ム・ミクロティでのみ増幅産物が観察された。以上の結
果から、プライマーと菌種との関係をまとめると以下の
ようになる。
【００１８】
【表１】
【００１９】〔実施例３〕４種の結核菌群構成細菌から
純化DNA を10ng調製した。これらのDNA を鋳型とし、配
列番号１及び配列番号３で表されるオリゴヌクレオチド
をプライマーとしてPCR を行った。PCR による増幅条件
は実施例１と同じである。PCR による増幅産物を制限酵
素RsaI及びTaqIで消化し、それによって生ずるDNA 断片
をアガロースゲル電気泳動法によって解析した。この結
果を図５に示す。なお、レーンと菌種の関係は以下の通
りである。
純化DNA を10ng調製した。これらのDNA を鋳型とし、配
列番号１及び配列番号３で表されるオリゴヌクレオチド
をプライマーとしてPCR を行った。PCR による増幅条件
は実施例１と同じである。PCR による増幅産物を制限酵
素RsaI及びTaqIで消化し、それによって生ずるDNA 断片
をアガロースゲル電気泳動法によって解析した。この結
果を図５に示す。なお、レーンと菌種の関係は以下の通
りである。
【００２０】 レーン１：マイコバクテリウム・ツベルクローシス レーン２：マイコバクテリウム・ボビス レーン３：マイコバクテリウム・アフリカヌム レーン４：マイコバクテリウム・ミクロティ
【００２１】〔実施例４〕配列番号１、配列番号３、配
列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配
列番号１３、配列番号１５、及び配列番号１７で表され
るオリゴヌクレオチドをプライマーとし、結核臨床患者
より単離された株 KPM KY631の菌体破砕液を用いてPCR
を行った。PCR による増幅産物をアガロースゲル電気泳
動法によって解析したところ、配列番号１と配列番号
３、及び配列番号５と配列番号７に示した組み合わせで
のみ増幅産物が観察されたので、 KPM KY631は結核菌マ
イコバクテリウム・ツベルクローシスと同定された（表
１及び図４）。
列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配
列番号１３、配列番号１５、及び配列番号１７で表され
るオリゴヌクレオチドをプライマーとし、結核臨床患者
より単離された株 KPM KY631の菌体破砕液を用いてPCR
を行った。PCR による増幅産物をアガロースゲル電気泳
動法によって解析したところ、配列番号１と配列番号
３、及び配列番号５と配列番号７に示した組み合わせで
のみ増幅産物が観察されたので、 KPM KY631は結核菌マ
イコバクテリウム・ツベルクローシスと同定された（表
１及び図４）。
【００２２】〔実施例５〕配列番号１と配列番号３で表
されるオリゴヌクレオチドをプライマーとし、結核臨床
患者より単離された株 KPM KY590の菌体破砕液を用いて
PCRを行い、増幅されたDNA 断片の塩基配列を決定した
ところ、得られた塩基配列が結核菌マイコバクテリウム
・ツベルクローシスの塩基配列と一致したので、KPM KY
590は結核菌マイコバクテリウム・ツベルクローシスと
同定された（図１及び図２）。
されるオリゴヌクレオチドをプライマーとし、結核臨床
患者より単離された株 KPM KY590の菌体破砕液を用いて
PCRを行い、増幅されたDNA 断片の塩基配列を決定した
ところ、得られた塩基配列が結核菌マイコバクテリウム
・ツベルクローシスの塩基配列と一致したので、KPM KY
590は結核菌マイコバクテリウム・ツベルクローシスと
同定された（図１及び図２）。
【００２３】〔実施例６〕配列番号１と配列番号３で表
されるオリゴヌクレオチドをプライマーとし、結核に罹
患したウシより単離された株の菌体破砕液を用いてPCR
を行った。PCR による増幅産物を制限酵素RsaI及びTaqI
でそれぞれ消化し、それによって生ずるDNA 断片をアガ
ロースゲル電気泳動法によって解析したところ、マイコ
バクテリウム・ボビスから得られるパターンと一致した
ので、この菌株はマイコバクテリウム・ボビスと同定さ
れた（図５）。
されるオリゴヌクレオチドをプライマーとし、結核に罹
患したウシより単離された株の菌体破砕液を用いてPCR
を行った。PCR による増幅産物を制限酵素RsaI及びTaqI
でそれぞれ消化し、それによって生ずるDNA 断片をアガ
ロースゲル電気泳動法によって解析したところ、マイコ
バクテリウム・ボビスから得られるパターンと一致した
ので、この菌株はマイコバクテリウム・ボビスと同定さ
れた（図５）。
【００２４】
【発明の効果】本発明は、従来の方法では迅速に同定及
び検出することが困難であった結核菌群を構成する４菌
種について迅速な同定及び検出を可能にし、医学、疫
学、獣医学の現場でのこれらの菌種の分類を可能にす
る。
び検出することが困難であった結核菌群を構成する４菌
種について迅速な同定及び検出を可能にし、医学、疫
学、獣医学の現場でのこれらの菌種の分類を可能にす
る。
【００２５】
配列番号：1 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 配列 TCGGACGCGT ATGCGATATC
【００２６】配列番号：2 配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 配列 Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｓ
ｅｒ
ｅｒ
【００２７】配列番号：３ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 配列 ACATACAGTT CGGACTTGCG
【００２８】配列番号：4 配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 配列 Arg Lys Ser Glu Leu Tyr Val
【００２９】配列番号：5 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 配列 ＧＡＡＧＡＣＧＧＧＧ ＴＣＡＡＣＧＧＴＧ
【００３０】配列番号：６ 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 配列 Lys Thr Gly Ser Thr Val
【００３１】配列番号：7 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 配列 CCTTGTTCAC AACGACTTTC GC
【００３２】配列番号：8 配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 配列 Ａｌａ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｌ
ｙｓ
ｙｓ
【００３３】配列番号：９ 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 配列 GAAGACGGGG TCAACGGTA
【００３４】配列番号：10 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 配列 Lys Thr Gly Ser Thr Val
【００３５】配列番号：11 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 配列 ＣＣＡＧＴＧＧＧＴＣ ＡＧＣＴＧＴＴＣＡ
【００３６】配列番号：１２ 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 配列 Glu Gln Leu Thr His Trp
【００３７】配列番号：13 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 配列 CCTTGTTCAC AACGACTTTC GA
【００３８】配列番号：14 配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 配列 Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｌ
ｙｓ
ｙｓ
【００３９】配列番号：１５ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 配列 AGATCAAGCG CGACGGGTAT
【００４０】配列番号：16 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 配列 Ile Lys Arg Asp Gly Tyr
【００４１】配列番号：17 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 配列 ＣＣＡＧＴＧＧＧＴＣ ＡＧＣＴＧＴＴＣＧ
【００４２】配列番号：１８ 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 配列 Glu Gln Leu Thr His Trp
【図１】結核菌群を構成する４細菌のgyrB DNAの塩基配
列を示す図である（前半部分）。
列を示す図である（前半部分）。
【図２】結核菌群を構成する４細菌のgyrB DNAの塩基配
列を示す図である（後半部分）。
列を示す図である（後半部分）。
【図３】結核菌群を構成する細菌に特異的なプライマー
を用いたPCR による増幅産物の電気泳動写真である。
を用いたPCR による増幅産物の電気泳動写真である。
【図４】結核菌群を構成する各細菌に特異的なプライマ
ーを用いたPCR による増幅産物の電気泳動写真である。
ーを用いたPCR による増幅産物の電気泳動写真である。
【図５】PCR 産物を制限酵素により消化した断片の電気
泳動写真である。
泳動写真である。
【手続補正書】
【提出日】平成１０年４月２１日
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:32）
Claims (18)
- 【請求項１】 DNA ジャイレースβサブユニットをコー
ドするDNA を指標として結核菌群を構成する細菌の同定
を行うことを特徴とする結核菌群構成細菌の同定方法。 - 【請求項２】 結核菌群を構成する細菌が、マイコバク
テリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・ボ
ビス、マイコバクテリウム・アフリカヌム、及びマイコ
バクテリウム・ミクロティであることを特徴とする請求
項１記載の結核菌群構成細菌の同定方法。 - 【請求項３】 結核菌群を構成する細菌の同定を行う方
法が、以下の（１）〜（４）の工程を含むことを特徴と
する請求項１又は２記載の結核菌群構成細菌の同定方
法。 （１）DNA ジャイレースβサブユニットをコードするDN
A 中の結核菌群構成細菌間で塩基配列の異なる領域を含
むオリゴヌクレオチドを合成する （２）（１）で合成したオリゴヌクレオチド、dNTP、DN
A ポリメラーゼ及び試料とする細菌のDNA を含む溶液を
調製する （３）（２）で調製した溶液をポリメラーゼ連鎖反応が
起こり得る条件で繰り返し加熱する （４）（３）の操作後の溶液について、電気泳動を行
い、その電気泳動パターンから細菌の同定を行う - 【請求項４】 オリゴヌクレオチドが、配列番号６、配
列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１
４、配列番号１６、又は配列番号１８記載のアミノ酸配
列をコードするオリゴヌクレオチドであることを特徴と
する請求項３記載の結核菌群構成細菌の同定方法。 - 【請求項５】 オリゴヌクレオチドが、配列番号５、配
列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、
配列番号１５、又は配列番号１７で表されるオリゴヌク
レオチドであることを特徴とする請求項３記載の結核菌
群構成細菌の同定方法。 - 【請求項６】 結核菌群を構成する細菌の同定を行う方
法が、以下の（１）〜（４）の工程を含むことを特徴と
する請求項１又は２記載の結核菌群構成細菌の同定方
法。 （１）結核菌群構成細菌のDNA ジャイレースβサブユニ
ットをコードするDNA の一部と同一なオリゴヌクレオチ
ドと前記DNA の一部と相補的なオリゴヌクレオチドを合
成する （２）（１）で合成した２種類のオリゴヌクレオチドを
プライマーとし、試料とする細菌のDNA を鋳型として、
ポリメラーゼ連鎖反応を行う （３）（２）で増幅されたDNA 断片を制限酵素で消化す
る （４）（３）で消化された断片について電気泳動を行
い、その電気泳動パターンから結核菌群構成細菌の同定
を行う - 【請求項７】 プライマーとして用いる２種類のオリゴ
ヌクレオチドが、配列番号１及び配列番号３で表される
オリゴヌクレオチドであり、かつ用いる制限酵素がRsa
I 及びTaq I であることを特徴とする請求項６記載の結
核菌群構成細菌の同定方法。 - 【請求項８】 DNA ジャイレースβサブユニットをコー
ドするDNA 中の結核菌群構成細菌間で塩基配列の異なる
領域を含むオリゴヌクレオチドを有することを特徴とす
る結核菌群構成細菌用同定キット。 - 【請求項９】 結核菌群構成細菌のDNA ジャイレースβ
サブユニットをコードするDNA の一部と同一なオリゴヌ
クレオチド、前記DNA の一部と相補的なオリゴヌクレオ
チド、及び制限酵素を有することを特徴とする結核菌群
構成細菌用同定キット。 - 【請求項１０】 DNA ジャイレースβサブユニットをコ
ードするDNA を指標として結核菌群を構成する細菌の検
出を行うことを特徴とする結核菌群構成細菌の検出方
法。 - 【請求項１１】 結核菌群を構成する細菌が、マイコバ
クテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・
ボビス、マイコバクテリウム・アフリカヌム、及びマイ
コバクテリウム・ミクロティであることを特徴とする請
求項１０記載の結核菌群構成細菌の検出方法。 - 【請求項１２】 結核菌群を構成する細菌の検出を行う
方法が、以下の（１）〜（４）の工程を含むことを特徴
とする請求項１０又は１１記載の結核菌群構成細菌の検
出方法。 （１）DNA ジャイレースβサブユニットをコードするDN
A 中の結核菌群構成細菌間で塩基配列の異なる領域を含
むオリゴヌクレオチドを合成する （２）（１）で合成したオリゴヌクレオチド、dNTP、DN
A ポリメラーゼ及び試料とする細菌のDNA を含む溶液を
調製する （３）（２）で調製した溶液をポリメラーゼ連鎖反応が
起こり得る条件で繰り返し加熱する （４）（３）の操作後の溶液について、電気泳動を行
い、その電気泳動パターンから細菌の検出を行う - 【請求項１３】 オリゴヌクレオチドが、配列番号６、
配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１
４、配列番号１６、又は配列番号１８記載のアミノ酸配
列をコードするオリゴヌクレオチドであることを特徴と
する請求項１２記載の結核菌群構成細菌の検出方法。 - 【請求項１４】 オリゴヌクレオチドが、配列番号５、
配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１
３、配列番号１５、又は配列番号１７で表されるオリゴ
ヌクレオチドであることを特徴とする請求項１２記載の
結核菌群構成細菌の検出方法。 - 【請求項１５】 結核菌群を構成する細菌の検出を行う
方法が、以下の（１）〜（４）の工程を含むことを特徴
とする請求項１０又は１１記載の結核菌群構成細菌の検
出方法。 （１）結核菌群構成細菌のDNA ジャイレースβサブユニ
ットをコードするDNA の一部と同一なオリゴヌクレオチ
ドと前記DNA の一部と相補的なオリゴヌクレオチドを合
成する （２）（１）で合成した２種類のオリゴヌクレオチドを
プライマーとし、試料とする細菌のDNA を鋳型として、
ポリメラーゼ連鎖反応を行う （３）（２）で増幅されたDNA 断片を制限酵素で消化す
る （４）（３）で消化された断片について電気泳動を行
い、その電気泳動パターンから結核菌群構成細菌の検出
を行う - 【請求項１６】 プライマーとして用いる２種類のオリ
ゴヌクレオチドが、配列番号１及び配列番号３で表され
るオリゴヌクレオチドであり、かつ用いる制限酵素がRs
a I 及びTaq I であることを特徴とする請求項１５記載
の結核菌群構成細菌の検出方法。 - 【請求項１７】 DNA ジャイレースβサブユニットをコ
ードするDNA 中の結核菌群構成細菌間で塩基配列の異な
る領域を含むオリゴヌクレオチドを有することを特徴と
する結核菌群構成細菌用検出キット。 - 【請求項１８】 結核菌群構成細菌のDNA ジャイレース
βサブユニットをコードするDNA の一部と同一なオリゴ
ヌクレオチド、前記DNA の一部と相補的なオリゴヌクレ
オチド、及び制限酵素を有することを特徴とする結核菌
群構成細菌用検出キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09887998A JP3634960B2 (ja) | 1998-04-10 | 1998-04-10 | ジャイレース遺伝子を用いた結核菌群構成細菌の同定・検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09887998A JP3634960B2 (ja) | 1998-04-10 | 1998-04-10 | ジャイレース遺伝子を用いた結核菌群構成細菌の同定・検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11290079A true JPH11290079A (ja) | 1999-10-26 |
| JP3634960B2 JP3634960B2 (ja) | 2005-03-30 |
Family
ID=14231457
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP09887998A Expired - Fee Related JP3634960B2 (ja) | 1998-04-10 | 1998-04-10 | ジャイレース遺伝子を用いた結核菌群構成細菌の同定・検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3634960B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1098003A3 (en) * | 1999-11-02 | 2004-05-26 | Marine Biotechnology Institute Co., Ltd. | Identification method and specific detection method of slow growing mycobacteria utilizing DNA gyrase gene |
| JP2010081889A (ja) * | 2008-09-30 | 2010-04-15 | Fujiya:Kk | 乳酸菌検出用ｐｃｒプライマー |
-
1998
- 1998-04-10 JP JP09887998A patent/JP3634960B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1098003A3 (en) * | 1999-11-02 | 2004-05-26 | Marine Biotechnology Institute Co., Ltd. | Identification method and specific detection method of slow growing mycobacteria utilizing DNA gyrase gene |
| JP2010081889A (ja) * | 2008-09-30 | 2010-04-15 | Fujiya:Kk | 乳酸菌検出用ｐｃｒプライマー |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3634960B2 (ja) | 2005-03-30 |
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