KR20110102863A - Ｐｃｒ 프라이머를 이용한 녹강병 및 백강병의 진단 - Google Patents

Ｐｃｒ 프라이머를 이용한 녹강병 및 백강병의 진단 Download PDF

Info

Publication number
KR20110102863A
KR20110102863A KR1020110088887A KR20110088887A KR20110102863A KR 20110102863 A KR20110102863 A KR 20110102863A KR 1020110088887 A KR1020110088887 A KR 1020110088887A KR 20110088887 A KR20110088887 A KR 20110088887A KR 20110102863 A KR20110102863 A KR 20110102863A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
present
primer
pcr
pathogen
pathogens
Prior art date
Application number
KR1020110088887A
Other languages
English (en)
Inventor
최지영
김종길
최영철
남성희
정길상
김원태
박관호
Original Assignee
대한민국(농촌진흥청장)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국(농촌진흥청장) filed Critical 대한민국(농촌진흥청장)
Priority to KR1020110088887A priority Critical patent/KR20110102863A/ko
Publication of KR20110102863A publication Critical patent/KR20110102863A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 녹강병 및 백강병 진단용 프라이머 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 유용곤충(꽃무지 및 장수풍뎅이)에 주로 발생하는 곰팡이인 녹강병원균(Metarhizium anisopliae , 메타리지움 아니소플리애)와 백강병원균(Beauveria bassiana, 뷰베리아 바시아나)을 종 특이적으로 각각 또는 동시에 PCR을 통하여 진단할 수 있는 진단용 프라이머 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명의 메타리지움 아니소플리애 또는 뷰베리아 바시아나 병원균 검출방법은 상기 병원균에 종 특이적으로 결합하는 뉴클레오타이드 서열을 이용하기 때문에, 극소량의 병원균이 존재하여도 이를 조기에 정확한 감도로 검출할 수 있다. 또한, 상기 병원균을 각각의 절차에 의해 검출하거나 단지 한 번의 절차만으로 동시에 검출할 수 있는 장점을 갖기 때문에 식약용 곤충에 가장 문제가 되는 메타리지움 아니소플리에 또는 뷰베리아 바시아나 병원균 예방과 방제에 시간과 비용을 절약하여 자원화 곤충의 안정적인 대량생산에 기여할 수 있다.

Description

ＰＣＲ 프라이머를 이용한 녹강병 및 백강병의 진단{Detection of Green Muscardine and White Muscardine Using PCR Primers}
본 발명은 녹강병(메타리지움 아니소플리애)과 백강병(뷰베리아 바시아나) 진단용 PCR　프라이머 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것이다.
녹강병(Green Muscardine)은 곰팡이병으로서 메타리지움 아니소플리애 (Metarhizium anisopliae)가 그 원인균이다. 녹강병에 감염된 곤충의 감염초기에는 특이한 병징이 나타나지 않지만, 병세가 진전됨에 따라 다른 곰팡이병과 유사한 병징이 나타난다. 감염 2-5일 후에 윤곽이 선명한 검은 반점이 형성된다. 감염 5-8일 뒤에 죽으며, 죽은 곤충은 빨리 경화되고, 죽은 2-3일 후 마디나 기문 등에 균사가 나오면서 점차 몸 전체가 백색의 균사 또는 담자경으로 덮이게 되어 백강병원균인(Beauveria bassiana)으로 잘못 진단하기 쉽다. M. anisopliae는 낮은 습도조건(<50%)에서도 분생포자를 퍼뜨릴 수 있기 때문에 병원성이 매우 높다고 할 수 있다.
백강병(White Muscardine)의 원인균은 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana)이며, 이병에 감염된 곤충은 초기에 별다른 병징을 발견할 수 없으나, 병세가 진전되면서 식욕이 부진해지고 활동이 활발하지 못하며, 표면에 반점이 형성한다. 감염말기에는 곤충이 탈수상태가 되어 죽게 된 뒤 충체가 딱딱해지고, 곤충의 표피에는 백색의 균사와 담자경으로 덮이고 나중에 백색의 분생포자가 형성된다. 이러한 특징은 녹강병의 중기 증상과 비슷하기 때문에 대부분 녹강병과 오인하는 경우가 많이 발생한다.
현재 녹강병 및 백강병의 진단은 유충의 육안관찰, 즉 유충의 딱딱함 또는 표면의 분생자 색깔 등에 주로 의존하고 있으며, 이러한 불확실한 진단법은 녹강병과 백강병의 오진을 초래할 수 있고 두 병원균의 병원성이 10배 이상 차이나는 시국에 불필요한 소독약제 과다사용으로 환경오염문제를 야기할 수도 있다. 녹강병 및 백강병의 정밀진단을 위해 주로 배양학적 방법이 주로 사용되었으나, 이러한 방법의 경우 상당한 시간과 기술이 필요하다는 단점이 있다. 따라서, 상기 병원균을 조기에 높은 감도로 진단할 수 있는 방법 및 각각의 병원균을 동시에 진단할 수 있는 방법에 대한 관심이 대두되고 있는 상황이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 메타리지움 아니소플리애 또는 뷰베리아 바시아나 병원균을 동시 또는 이시에 정확한 감도로 진단할 수 있는 검출방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 상기 병원균에 종 특이적으로 결합 가능한 뉴클레오타이드 서열을 발굴하였고, 이를 이용할 경우 동시 또는 이시에 상기 병원균을 조기에 정확한 감도로 진단할 수 있다는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 메타리지움 아니소플리애 또는 뷰베리아 바시아나 병원균 진단용 PCR 프라이머 및 이를 이용한 상기 병원균의 검출방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 NC-F1 프라이머(서열목록 제1서열) 및 NC-R1 프라이머(서열목록 제2서열)로 이루어진 녹강병 진단용 PCR(polymerase chain reaction) 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기의 프라이머 세트를 포함하는 녹강병 병원균(메타리지움 아니소플리애 , Metarhizium anisopliae)의 검출용 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트(Kit)를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 녹강병 감염 진단방법을 제공한다:
(a) 시료(sample)로부터 DNA를 준비하는 단계; 및
(b) (i) 상기 준비된 DNA, 그리고 (ⅱ) NC-F1 프라이머(서열목록 제1서열) 및 NC-R1 프라이머(서열목록 제2서열)로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 J-1 프라이머(서열목록 제3서열) 및 J-2 프라이머(서열목록 제4서열)로 이루어진 백강병 진단용 PCR(polymerase chain reaction) 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기의 프라이머 세트를 포함하는 백강병 병원균(뷰베리아 바시아나 , Beauveria bassiana)의 검출용 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트(Kit)를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 백강병 감염 진단방법을 제공한다:
(a) 시료(sample)로부터 DNA를 준비하는 단계; 및
(b) (i) 상기 준비된 DNA, 그리고 (ⅱ) J-1 프라이머(서열목록 제3서열) 및 J-2 프라이머(서열목록 제4서열)로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 녹강병 및 백강병 감염의 동시 진단방법을 제공한다:
(a) 시료(sample)로부터 DNA를 준비하는 단계; 및
(b) (i) 상기 준비된 DNA, 그리고 (ⅱ) NC-F1 프라이머(서열목록 제1서열) 및 NC-R1 프라이머(서열목록 제2서열)로 이루어진 프라이머 세트와 J-1 프라이머(서열목록 제3서열) 및 J-2 프라이머(서열목록 제4서열)로 이루어진 프라이머 세트를 동시에 이용하여 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계.
본 발명자들은 메타리지움 아니소플리애 또는 뷰베리아 바시아나 병원균을 동시(Duplex 방식) 또는 이시(Monoplex 방식)에 정확한 감도로 진단할 수 있는 검출방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 상기 병원균에 종 특이적으로 결합 가능한 뉴클레오타이드 서열을 발굴하였고, 이를 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행할 경우 동시 또는 이시에 상기 병원균을 조기에 정확한 감도로 진단할 수 있다는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 방법을 각각의 단계에 따라 상세하게 설명하면 다음과 같다;
단계 (a): 시료( sample )로부터 DNA 의 준비
본 발명의 방법에 따르면, 우선 메타리지움 아니소플리애 또는 뷰베리아 바시아나 병원균 또는 상기 병원균의 DNA를 포함하는 시료 또는 상기 병원균에 감염되었는지 여부를 판단하고자 하는 시료를 준비한다. 본 발명의 시료는 예를 들어, 곤충의 성충 또는 유충의 충체 또는 추출물 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 검출방법은 메타리지움 아니소플리애(녹강병원균) 또는 뷰베리아 바시아나(백강병원균) 병원균을 검출할 수 있으며, 상기 두 가지 병원균을 동시에 검출할 수도 있다.
본 발명의 시료로부터 DNA를 준비하는 방법은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있고, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
단계 (b): 중합효소 연쇄반응( PCR )액의 제조
이어서, 상기 DNA 및 유전자 증폭반응을 위한 프라이머를 포함하는 중합효소 연쇄반응액을 제조한다. 본 명세서에서, 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
본 발명의 가장 큰 특징 중의 하나는 유용 곤충에서 발생하는 곰팡이병으로 종래의 방법으로 진단하기 어려웠던 메타리지움 아니소플리애 또는 뷰베리아 바시아나 병원균을 종 특이적으로 조기에 효과적으로 검출 또는 진단할 수 있는 특정 서열을 발굴하였다는 점이다. 상기 특정서열은 예컨대, GenBank 등록된 18S rRNA 유전자의 서열정보를 blastn 프로그램을 통하여 특이성을 확인한 후 제작할 수 있다. 본 발명의 프라이머의 구체적인 예는 서열목록 제1서열과 제3서열(전방향 프라이머) 및 제2서열과 제4서열(역방향 프라이머)에 기재되어 있다.
본 발명의 중합효소 연쇄반응액은 상기한 DNA 및 프라이머 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 중합효소 연쇄반응액이 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 중합효소 연쇄반응액은 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.
단계 (c): 중합효소 연쇄반응의 수행
최종적으로, 상기 중합효소 연쇄반응액을 이용하여 원하는 DNA 서열에 대한 증폭반응을 수행한다.
본 명세서에 기재된 용어“증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법 등에 따라 실시할 수 있다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 검출방법을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 메타리지움 아니소플리애 또는 뷰베리아 바시아나 병원균 유전자의 존재를 조사한다.
본 발명에서 중합효소 연쇄반응은 변성(denaturation) 단계, 어닐링(annealing) 단계 및 신장(extension) 단계를 포함하는 사이클이 수회 반복되어 행해진다. 본 발명에서 용어 "사이클"은 표적 핵산의 1 카피 (copy)를 생성하는 과정을 의미한다. 상기 변성, 어닐링 및 신장 단계에서의 온도 및 시간 조건은 당업자가 적합한 조건을 선택할 수 있으며 특정의 범위로 한정되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 중합효소 연쇄반응은 (i) 90-100℃에서 25-35 초간의 변성(denaturation) 과정, (ⅱ) 50-60℃에서 25-35 초간의 어닐링(annealing) 과정 및 (ⅲ) 70-75℃에서 50-70초간 신장(extension) 과정을 20-50회 반복하는 단계를 포함한다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2 +와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 검출방법은 단계 (c)의 중합효소 연쇄반응의 결과물을 분석하는 단계 (d)를 추가적으로 포함한다. 이 분석과정에서 중합효소 연쇄반응에 의해 원하는 크기의 DNA가 증폭된 것으로 분석 되면, 시료에 메타리지움 아니소플리애 및/또는 뷰베리아 바시아나 병원균이 있는 것으로 판정한다. 중합효소 연쇄반응의 결과물의 분석은 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 메타리지움 아니소플리애 또는 뷰베리아 바시아나 병원균 유전자의 존재를 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, 시료(samples)에서 메타리지움 아니소플리애 또는 뷰베리아 바시아나 병원균 유전자가 증폭된 경우에는 메타리지움 아니소플리애 및/또는 뷰베리아 바시아나 병원균에 감염된 것으로 진단된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 검출방법은 서열목록 제1서열, 제2서열, 제3서열 및 제4서열의 프라이머를 동시에 이용하여 실시되며(멀티플렉스 증폭), 상기 방법은 메타리지움 아니소플리애 및 뷰베리아 바시아나 병원균을 동시에 검출하는 방법인 것이다.
즉, 본 발명의 검출방법을 이용할 경우 메타리지움 아니소플리애 병원균 또는 뷰베리아 바시아나 병원균을 검출하여 상기 병원균에 감염이 되었는지 여부를 진단할 수 있으며, 상기 병원균을 동시에 검출할 수도 있다.
본 발명의 가장 큰 특징 중 다른 하나는 식약용 곤충을 사육하는 농가에서 가장 문제가 되는 메타리지움 아니소플리애 병원균 또는 뷰베리아 바시아나 병원균을 조기에 신속하고 높은 감도로 검출하거나 진단할 수 있다는 것이다. 본 발명의 검출방법 또는 진단방법을 이용할 경우 기존의 현미경을 이용한 진단 방법보다 1,000 배 이상 검출 감도가 높기 때문에 상기 메타리지움 아니소플리애 병원균 또는 뷰베리아 바시아나 병원균에 의한 질병의 조기진단에 용이하며 특이성이 뛰어나 병원균 감염여부를 진단하는데 매우 유용하게 이용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 시료 중 메타리지움 아니소플리애 또는 뷰베리아 바시아나 병원균이 단지 10 spores/㎖ 존재만으로도 본 발명의 검출방법 또는 진단방법을 이용하여 정확하고 신속하게 감염여부를 진단할 수 있으며(참고: 도 2 및 4), 상기 두 가지 병원균을 단지 한 번의 절차만으로 동시에 검출 또는 진단 할 수 있다(참고: 도 5).
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 메타리지움 아니소플리애 또는 뷰베리아 바시아나 병원균 유래 프라이머 및 이를 이용한 상기 병원균의 검출방법을 제공한다.
(ⅱ)본 발명의 메타리지움 아니소플리애 또는 뷰베리아 바시아나 병원균의 검출방법은 상기 병원균에 종 특이적으로 결합하는 뉴클레오타이드 서열을 이용하기 때문에, 극소량의 병원균이 존재하여도 이를 조기에 정확한 감도로 진단할 수 있는 새로운 접근법이다.
(ⅲ) 본 발명의 검출방법은 메타리지움 아니소플리애 또는 뷰베리아 바시아나 병원균을 각각의 절차에 의해 진단하거나 상기 두 가지 병원균을 단지 한 번의 절차만으로 동시에 검출 또는 진단 할 수 있는 장점을 갖기 때문에 식약용 곤충에 가장 문제가 되는 메타리지움 아니소플리애 또는 뷰베리아 바시아나 병원균 예방과 방제에 시간과 비용을 절약하여 자원화 곤충의 안정적인 대량생산에 기여할 수 있다.
도 1은 녹강병 진단 프라이머(NC-F1와 NC-R1)를 이용한 PCR결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 녹강병 진단 프라이머(NC-F1와 NC-R1)를 이용한 PCR 검출 감도를 나타내는 도면이다.
도 3은 백강병 진단 프라이머(J-1와 J-2)를 이용한 PCR결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 백강병 진단 프라이머(J-1와 J-2)를 이용한 PCR 검출 감도를 나타내는 도면이다.
도 5는 녹강병 진단 프라이머(NC-F1와 NC-R1)와 백강병 진단 프라이머(J-1와 J-2)를 이용한 PCR 동시 검출 결과를 나타내는 도면이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: DNA 분리와 PCR 조건
DNA 분리는 Qiamp Tissue Kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 메뉴얼에 기재된 방법으로 하였다. PCR 반응조건은 주형이 되는 DNA를 1본쇄로 변성시키기 위하여 95℃에서 5분간 열처리한 후, 95℃에서 30초간 DNA를 변성시키는 단계(denaturation), 53-55℃에서 30초간 프라이머와 접촉시키는 단계(annealing), 72℃에서 1분간 DNA를 합성하는 단계(extension)의 3단계를 반응주기로 35회 반복하여 PCR증폭을 실시하며, 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켜 PCR반응을 종료하였다. 총 PCR 소요시간은 1시간 48분이었다.
실시예 2: 특이 프라이머 제작
녹강병원균의 리보좀 RNA(ribosomal RNA) 유전자로부터 896 bp 크기의 유전자 단편을 증폭할 것으로 예상되는 NC-F1(5'-GACCCGTCTTGAAACACACG GA-3') (서열번호 1: 22 mer)와 NC-R1(5'-TCCGGAAGGAACCAGCTACTA-3') (서열번호 2: 21 mer) 프라이머는 GenBank 등록된 (등록번호: FJ876298) 18S ribosomal RNA 유전자의 서열정보를 blastn 프로그램을 통해 특이성을 확인 후 제작하였다.
한편, 백강병원균의 리보좀 RNA(ribosomal RNA) 유전자로부터 500 bp 크기의 유전자 단편을 증폭할 것으로 예상되는 J-1(5'-AAGCTTCGACATGGTCTG-3') (서열번호 3: 18 mer)와 J-2(5'-GGAGGTGGTGAGGTTCTGTT-3') (서열번호 4: 20 mer) 프라이머는 GenBank 등록된 (등록번호: DQ449651) 18S ribosomal RNA 유전자의 서열정보를 blastn 프로그램을 통해 특이성을 확인 후 제작하였다.
실시예 3: 특이 프라이머를 이용한 녹강병 및 백강병의 개별 및 동시진단
제작된 NC-F1와 NC-R1 프라이머가 녹강병의 진단에, J-1과 J-2 프라이머가 백강병의 진단에 효과적으로 적용될 수 있는지의 여부를 PCR 기법을 이용하여 확인하였다. 3종의 백강병원균〔Beauveria bassiana ATTC 7159(시료번호 1), Beauveria bassiana KACC 40039(시료번호 2), Beauveria bassiana KACC 40214(시료번호 3)〕및 3종의 녹강병원균〔Metarhizium anisopliae ATCC20500(시료번호 4), Metarhizium anisopliae KACC 40029(시료번호 5), Metarhizium anisopliae KACC 40969(시료번호 6)〕로부터 DNA를 분리한 다음 상기 프라이머를 사용하여 PCR 증폭실험을 수행하였다. NC-F1와 NC-R1 프라이머를 사용하여 PCR를 수행한 결과 다른 꿀벌 병원균에서는 반응산물이 생성되지 않았으나 3종의 녹강병원균에서는 예상했던 대로 896 bp 길이의 반응산물이 생성되었다(도 1). 한편, J-1와 J-2 프라이머를 사용하여 PCR를 수행한 결과 다른 병원균에서는 반응산물이 생성되지 않았으나 3종의 백강병원균에서는 예상했던 대로 500 bp 길이의 반응산물이 생성되었다(도 3). 또한 제작된 프라이머 세트로 동시진단 가능여부를 PCR 기법을 이용하여 확인하였다. Beauveria bassiana ATTC 7159(시료번호 1), Metarhizium anisopliae ATCC20500(시료번호 2), B. bassiana + M. anisopliae(시료번호 3), 멸균증류수(시료번호 4)로부터 DNA를 분리한 다음 상기 프라이머 두 세트를 사용하여 PCR 증폭실험을 수행한 결과, 시료번호 3번에서만 500 bp와 896 bp 길이의 반응산물이 생성되었다(도 5). 이러한 결과로부터 본 발명자들에 의해 선정된 프라이머를 사용하여 PCR 기법을 수행함으로써 녹강병 및 백강병의 감염 여부를 정확히 개별진단 및 동시진단 할 수 있음을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Detection of Green Muscardine and White Muscardine Using Primers <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NC-F1 Primer <400> 1 gacccgtctt gaaacacacg ga 22 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NC-R1 Primer <400> 2 tccggaagga accagctact a 21 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J-1 Primer <400> 3 aagcttcgac atggtctg 18 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J-2 Primer <400> 4 ggaggtggtg aggttctgtt 20

Claims (3)

  1. J-1 프라이머(서열목록 제3서열) 및 J-2 프라이머(서열목록 제4서열)로 이루어진 백강병 진단용 PCR(polymerase chain reaction) 프라이머 세트.
  2. 상기 제 1 항의 프라이머 세트를 포함하는 백강병 병원균(뷰베리아 바시아나 , Beauveria bassiana)의 검출용 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트(Kit).
  3. 다음의 단계를 포함하는 백강병 감염 진단방법:
    (a) 시료(sample)로부터 DNA를 준비하는 단계; 및
    (b) (i) 상기 준비된 DNA, 그리고 (ⅱ) J-1 프라이머(서열목록 제3서열) 및 J-2 프라이머(서열목록 제4서열)로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계.
KR1020110088887A 2011-09-02 2011-09-02 Ｐｃｒ 프라이머를 이용한 녹강병 및 백강병의 진단 KR20110102863A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110088887A KR20110102863A (ko) 2011-09-02 2011-09-02 Ｐｃｒ 프라이머를 이용한 녹강병 및 백강병의 진단

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110088887A KR20110102863A (ko) 2011-09-02 2011-09-02 Ｐｃｒ 프라이머를 이용한 녹강병 및 백강병의 진단

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020090081867A Division KR20110024025A (ko) 2009-09-01 2009-09-01 Ｐｃｒ 프라이머를 이용한 녹강병 및 백강병의 진단

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20110102863A true KR20110102863A (ko) 2011-09-19

Family

ID=44954312

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110088887A KR20110102863A (ko) 2011-09-02 2011-09-02 Ｐｃｒ 프라이머를 이용한 녹강병 및 백강병의 진단

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20110102863A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2709256B2 (ja) マイコバクテリアプローブ
KR101232878B1 (ko) 깍지벌레류의 미토콘드리아 ｃｏｉ 유전자 ｄｎａ 바코딩 영역을 증폭하기 위한 중합효소연쇄반응용 프라이머
US10227660B2 (en) Strand-invasion based DNA amplification method
CA2692633A1 (en) Method for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences in a sample
US10745732B2 (en) Genetic marker for discriminating and detecting causative bacteria of fish Edwardsiellosis and Streptococcosis, and method for discriminating and detecting causative bacteria using same
CN101528946A (zh) 诊断虾病原体的序列
JP2018516594A5 (ko)
KR102055447B1 (ko) 중합효소연쇄반응 및 실시간중합효소연쇄반응을 이용한 세포치료제 또는 생물학적 의약품에 오염되는 진균을 검출하는 방법 및 이 방법에 사용하기 위한 키트
Galetto et al. Real-time PCR diagnosis and quantification of phytoplasmas
JP5000794B2 (ja) 標的核酸を増幅して検出するための方法
AU2011209624B2 (en) Methods and kits used in the detection of fungus
WO2016203740A1 (ja) 微生物の検査方法、微生物の検査キット、微生物検査用マイクロアレイ、カビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キット
KR102030245B1 (ko) 치쿤군야 바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 세트 및 이의 용도
KR101836741B1 (ko) 잿빛곰팡이병균 진단 방법
KR20110024025A (ko) Ｐｃｒ 프라이머를 이용한 녹강병 및 백강병의 진단
JP3449961B2 (ja) マルチプライマーｐｃｒ法による病原生物検出法
KR102076341B1 (ko) Lamp를 이용한 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 검출용 조성물 및 이의 용도
KR20110102863A (ko) Ｐｃｒ 프라이머를 이용한 녹강병 및 백강병의 진단
KR101913475B1 (ko) 잘록병균 진단 방법
JP5621992B2 (ja) カンジダ種を検出および同定するための方法
WO2019163672A1 (ja) 白癬菌の遺伝子をｌａｍｐ法により検出するためのプライマーセット及びそれを含むキット並びにそれらを用いて白癬菌を検出する方法
JP2008072951A (ja) Ｌａｍｐ法を用いたサルモネラｏ４群の血清型迅速検出法
JP4766878B2 (ja) ハイブリダイゼーションアッセイを使用する真正細菌群の検出、同定および識別
KR102298037B1 (ko) 역병균 및 뿌리썩음병균의 동시 진단 방법
KR102298035B1 (ko) 역병균의 진단 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application