MXPA06012516A - Deteccion y tipificacion de cepas bacterianas - Google Patents

Abstract

Se describen métodos para la detección y tipificación de cepas bacterianas de productos alimenticios y complementos dietéticos, muestras ambientales, muestras in vivo/in vitro, y para el estudio de la diversidad natural de las especies;las aplicaciones potenciales incluyen también el desarrollo de productos y/o la detección y diferenciación de nuevas cepas bacterianas.

Description

DETECCIÓN Y TIPIFICACIÓN DE CEPAS BACTERIANAS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a métodos para la detección y tipificación de cepas bacterianas, específicamente cepas de Lactobacillus.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La diferenciación rápida y precisa de cepas bacterianas es importante cuando se hacen diagnósticos médicos, en estudios epidemiológicos, y para el estudio de la diversidad evolutiva entre las bacterias. Existen varios métodos para la tipificación o detección de cepas bacterianas, incluyendo RFLP, hibridación y secuenciación. Se han observado polimorfismos de ADN de microsatélites epidemiológicamente informativos en diferentes cepas de Helicobacter pylori (Marshall et al. (1996) J. Appl. Bacterio!. 81 : 509-517). Asimismo, se han usado elementos de ADN repetitivos de Mycobacterium tuberculosis para el tráfico eficiente de cepas (Van Soolingen et al. (1993) J. Clin. Microbio!. 31 : 1987-1995). Además, se ha usado la variación de repeticiones de secuencia cortas (SSR) para diferenciar las cepas de Haemophilus influenzae aisladas de diferentes pacientes (van Belkum et al. (1997) Infect. Immun. 65: 5017-5027). Sin embargo, los métodos actuales disponibles para diferenciar específicamente cepas bacterianas, tales como cepas de Lactobacillus acidophilus, se basan en la secuenciación de genes de ARNr 16S, que es sólo precisa al nivel de especie, o en procedimientos de electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) largos y difíciles. Los loci de CRISPR (repetición palindrómica corta regularmente espaciada agrupada; llamada también SPIDR (repeticiones directas entremezcladas por espaciadores), VNTR (número variable de repeticiones en tándem), SRVR (repeticiones cortas regularmente variables) y SRSR (repeticiones cortas regularmente espaciadas)), descritos por Jansen et al. (2002) OMICS J. Integr. Biol. 6: 23-33, constituyen una familia novedosa de secuencias de repetición que está presente en Bacteria y Archaea, pero no en Eukarya. Los loci de repetición consisten típicamente de tramos repetitivos de nucleótidos con una longitud de 25 a 37 pares de bases alternados por espaciadores de ADN no repetitivos de longitud casi igual. Hasta la fecha, se han identificado loci de CRISPR en más de cuarenta microorganismos (Jansen et al. (2002) OMICS J. Integr. Biol. 6: 23-33), pero de las bacterias lácticas, sólo se han descrito de especies de Streptococcus. A pesar de su descubrimiento hace más de 15 años en E. coli (Ishino eí al. (1987) J. Bacteriol. 169: 5429-5433), no se ha descubierto aún función fisiológica alguna. Las secuencias de nucleótidos de las repeticiones están en general altamente conservadas dentro de una especie, pero muestran poca similitud entre las especies. Se ha mostrado también que la variabilidad entre los loci de CRISPR no se debe principalmente a cambios de bases de nucleótidos individuales, sino más bien a deleciones/inserciones de regiones enteras de espaciador y repetición. Estas propiedades han llevado al uso de los loci de CRISPR como una herramienta de tipificación de cepas en Mycobacterium (Groenen et al. (1993) Mol. Microbio!. 10: 1057-1065). Puesto que los métodos para diferenciar las bacterias Lactobacillus, específicamente L. acidophilus, no son precisos al nivel de cepa o bien son técnicamente demandantes, es deseable el desarrollo de nuevos métodos para la diferenciación de cepas de Lactobacillus.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proveen composiciones y métodos para la detección y tipificación de bacterias, en particular una cepa de bacterias Lactobacillus, por ejemplo, una cepa de Lactobacillus acidophilus. Las composiciones de la invención incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas de Lactobacillus acidophilus que comprenden una región de ADN, de preferencia localizadas entre los genes para ADN polimerasa (po/A) y una fosforribosilamina-glicina ligasa ipurü) putativa, que consiste de una o más copias de una secuencia de ADN repetitiva de aproximadamente 20 a 40 pares de bases, tal como aproximadamente 25 a 35 pares de bases o de aproximadamente 27 a 30 pares de bases, entremezcladas con secuencias del espaciador no repetitivas de casi la misma longitud. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de 29 pares de bases que está presente 32 veces, y está separada por el mismo número de secuencias del espaciador de 32 pares de bases. Las composiciones de la invención incluyen también moléculas de ácido nucleico aisladas de Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei y Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, que comprenden secuencias repetitivas identificadas originalmente en una región de CRISPR. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de 28 pares de bases de L. brevis. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de 28 pares de bases de L. casei. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de 28 pares de bases de L. delbrueckii ssp. bulgaricus. Moléculas de ácido nucleico variantes suficientemente idénticas a las secuencias de nucleótidos, son abarcadas también por la presente invención. Además, se contemplan fragmentos y fragmentos suficientemente idénticos de las secuencias de nucleótidos. Específicamente, la presente invención provee moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una o más secuencias de nucleótidos presentes en SEQ ID NOS: 1-50. La presente invención provee además moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden de 1 a 140 repeticiones de una secuencia de nucleótidos de la invención, o una variante de las mismas. En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico aisladas comprenden más de 5 repeticiones, más de 10 repeticiones, menos de 50 repeticiones, o menos de 35 repeticiones de una secuencia de nucleótidos de la invención, o una variante de las mismas.

Las composiciones incluyen también iniciadores de PCR para la amplificación de esta región en una especie de Lactobacillus, que incluye L. acidophilus, L. brevis, L. casei y L delbrueckii. Se contemplan también secuencias de nucleótidos que son complementarias a una secuencia de nucleótidos de la invención, o que hibridan con una secuencia de la invención. Se incluyen además métodos y equipos para la detección de la presencia de una secuencia de ácido nucleico de la invención en una muestra, y métodos y equipos para la tipificación de bacterias, que incluyen cepas de Lactobacillus, en particular cepas de L. acidophilus, L. brevis, L. casei y delbrueckii. Se proveen métodos para la tipificación de una bacteria que tiene una región de CRISPR. Los métodos comprenden obtener una muestra que comprenda la bacteria; amplificar una región de ADN que comprenda la región de CRISPR, o un fragmento de la misma en la muestra, para crear ADN amplificado; añadir al ADN amplificado por lo menos una enzima de restricción que reconozca uno o más sitios en el ADN amplificado; incubar la enzima de restricción con el ADN amplificado por un tiempo suficiente para formar fragmentos de restricción; determinar el número de los fragmentos de restricción y su tamaño; y tipificar la bacteria con base en el número y tamaño de los fragmentos de restricción. Se provee también un método para la tipificación de una cepa bacteriana de Lactobacillus. El método comprende obtener una muestra, amplificar una región de ADN que comprenda por lo menos una de las secuencias de nucleótidos expuesta en SEQ ID NOS: 1 a 7 y 37 a 48, o una variante de las mismas en la muestra para crear ADN amplificado, y tipificar la cepa bacteriana con base en el ADN amplificado. Los métodos pueden comprender además añadir al ADN amplificado por lo menos una enzima de restricción que reconozca uno o más sitios en el ADN amplificado, incubar la enzima de restricción con el ADN amplificado por un tiempo suficiente para formar fragmentos de restricción, determinar el número de los fragmentos de restricción y su tamaño, y tipificar la cepa bacteriana con base en el número y tamaño de los fragmentos de restricción. En forma alternativa, los métodos pueden comprender además secuenciar el ADN amplificado para obtener resultados de secuenciación, y tipificar la cepa bacteriana con base en los resultados de secuenciación. En una modalidad, la especie de Lactobacillus es L. acidophilus. El ADN amplificado puede obtenerse proveyendo un primer iniciador que se una a una secuencia repetitiva en una región de CRISPR, proveyendo un segundo iniciador que se una a ADN que flanquee (es decir, corriente arriba o corriente abajo de) la región de CRISPR, usando los iniciadores en una reacción de PCR para crear ADN amplificado, separando el ADN amplificado en un gel para producir un patrón de bandas distinto que muestre el número y el tamaño del ADN amplificado, y tipificando la cepa bacteriana con base en el patrón de bandas. El número y el tamaño de las bandas son característicos de la cepa. El ADN amplificado puede obtenerse en forma alternativa proveyendo un primer iniciador que se una a una región de ADN corriente arriba de la región de CRISPR, y un segundo iniciador que se una a una región de ADN corriente abajo de la región de CRISPR, usando los iniciadores en una reacción de PCR para crear ADN amplificado, separando el ADN amplificado sobre un gel para producir una banda que muestre el tamaño del ADN de CRISPR amplificado, y tipificando la cepa bacteriana con base en el tamaño de la banda. El tamaño del ADN amplificado es característico de la cepa. Se proveen métodos para la detección de la presencia de una especie de Lactobacillus en una muestra. Los métodos comprenden obtener una muestra, amplificar una región de ADN que comprenda por lo menos una de las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NOS: 1 a 7 y 37 a 48, o una variante de las mismas para crear ADN amplificado, y detectar el ADN amplificado. Los métodos pueden comprender además añadir al ADN amplificado por lo menos una enzima de restricción que reconozca uno o más sitios en el ADN amplificado, incubar la enzima de restricción con el ADN amplificado por un tiempo suficiente para formar fragmentos de restricción, determinar el número de los fragmentos de restricción y su tamaño, detectar la presencia de una especie de Lactobacillus con base en el número y tamaño de los fragmentos de restricción. En forma alternativa, los métodos pueden comprender además secuenciar el ADN amplificado para obtener resultados de secuenciación, y detectar la presencia de una especie de Lactobacillus con base en los resultados de secuenciación. Los métodos de la presente invención son útiles para la detección y tipificación de cepas bacterianas que incluyen cepas de Lactobacillus, tales como cepas de L. acidophilus, L. brevis, L. casei y L. delbrueckii, en productos alimenticios y complementos dietéticos, que incluyen pienso (forraje) y complementos del pienso, en muestras in vivo/in vitro, y para el estudio de la diversidad natural de la especie de muestras ambientales. Los métodos son también útiles para el desarrollo de productos e identificación de nuevas cepas bacterianas, en particular cepas de Lactobacillus.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra una región intergénica en Lactobacillus acidophilus que tiene rasgos de un locus de CRISPR. La figura 2 muestra las secuencias de nucleótidos de las regiones de repetición en la región intergénica (SEQ ID NO: 1 ). Las repeticiones de 29 pares de bases están resaltadas (SEQ ID NOS: 2 a 7). Una repetición invertida imperfecta está indicada por una raya en la última repetición. Las regiones del espaciador (SEQ ID NOS: 8 a 35) y una región flanqueante (SEQ ID NO: 36) no están resaltadas. Dos secuencias están repetidas en la región del espaciador; una está repetida dos veces (contorneada y en negritas) (SEQ ID NO: 15), y una está repetida tres veces (en mayúsculas y en negritas) (SEQ ID NO: 13). Las figuras 3A, 3B, 3C y 3D consisten de micrografías de varios experimentos de electroforesis en gel de agarosa. La figura 3A muestra productos de PCR, y las figuras 3B, 3C y 3D muestran los resultados de los fragmentos de restricción. A. Campo M - escala de ADN de 1 Kb; campo 1 -NCFM®; campo 2 - cepa C; campo 3 - cepa D; campo 4 - ATCC 4356; campo 5 - cepa B; campo 6 - cepa E. B. Campo M - escala de ADN de 50 pb; campo 1 - NCFM®; campo 2 - cepa C; campo 3 - cepa D; campo 4 - ATCC 4356; campo 5 - ATCC 4357; campo 6 - cepa B. C. Campo M - escala de ADN de 50 pb; campo 1 - NCFM®; campo 2 - cepa C; campo 3 - cepa D; campo 4 - ATCC 4356; campo 5 - ATCC 4357; campo 6 - cepa B. D. Campo M - escala de ADN de 50 pb; campo 1 - NCFM®; campo 2 - cepa C; campo 3 - cepa D; campo 4 -ATCC 4356; campo 5 - ATCC 4357; campo 6 - cepa B. La figura 4 es una micrografía de productos de PCR de las siguientes cepas: campo 1 - L. acidophilus NCFM®; campo 2 - acidophilus Lac-1 ; campo 3 - L. acidophilus Lac-2; campo 4 - L. acidophilus Lac-3; campo 5 - L. acidophilus ATCC 4355; campo 6 - L. acidophilus ATCC 4356; campo 7 - L. acidophilus ATCC 4357; campo 8 - L. acidophilus ATCC 4796; campo 9 -L. helveticus ATCC 521 ; campo 10 - L. acidophilus ATCC 832; campo 11 - L. acidophilus ATCC 9224; campo 12 - L acidophilus ATCC 11975; campo 13 -L. acidophilus ATCC 314; campo 14 - L. gasseri ATCC 43121 ; campo 15 - L. acidophilus Lac-4; campo 16 - L. acidophilus Lac-5; campo 17 - L. amylovorus ATCC 33198; campo 18 - L. gallinarum ATCC 33199; campo 19 - L gasseri ATCC 33323; campo 20 - L. johnsonii ATCC 33200; campo 21 - L. crispatus Lcr-1 ; campo 22 - L. helveticus Lhe-1 ; campo 23 - control (sin ADN). La figura 5 es una micrografía de bandas que resultan de amplificación por PCR seguida de digestión por restricción de las siguientes cepas: campo 1 - L. acidophilus NCFM®; campo 2 - L. acidophilus Lac-1 ; campo 3 - L. acidophilus Lac-2; campo 4 - L. acidophilus Lac-3; campo 5 - L. acidophilus ATCC 4355; campo 6 - L. acidophilus ATCC 4356; campo 1 - L. acidophilus ATCC 4357; campo 8 - . acidophilus ATCC 4796; campo 9 - L. acidophilus ATCC 832; campo 10 - L. acidophilus ATCC 9224; campo 11 - . acidophilus ATCC 11975; campo 12 - L. acidophilus ATCC 314; campo 13 - L. acidophilus Lac-4; campo 14 - L. acidophilus Lac-5. La figura 6 es una micrografía que muestra electroforesis en gel de campo pulsado de L. acidophilus NCFM® (campo 1 ); L. acidophilus Lac-1 (campo 2); L. acidophilus Lac-3 (campo 3); y L. acidophilus ATCC 4356 (campo 4). La figura 7 muestra una secuencia de repetición de L. acidophilus (Lac) (SEQ ED NO: 37); L. brevis (Lbr) (SEQ ID NO: 38); L. casei (Lea) (SEQ ID NO: 45); y L delbrueckii ssp. bulgaricus (Lde) (SEQ ID NO: 46). Nucleótidos variantes y sus posiciones se muestran más adelante en la secuencia principal.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos y composiciones para la detección y/o tipificación de cepas bacterianas, tales como cepas de Lactobacillus, que incluyen Lactobacillus acidophilus, L. brevis, L. casei y L. delbrueckii. Estos métodos pueden usarse en diagnósticos de seguridad médica y de alimentos, o en investigación. Por "tipificación" o "diferenciación", se entiende la identificación de la cepa de una bacteria, que incluye identificación que sea distinta de otras cepas con base en su secuencia de nucleótidos (es decir, analizando el patrón de bandas que resulta de digestión por enzimas de restricción). Por "detección" se entiende la verificación de la presencia o ausencia de una especie de bacteria en una muestra. Las composiciones de la invención incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas de L. acidophilus, L. brevis, L. casei y L. delbrueckii que forman parte de un locus de CRISPR. Por "región de CRISPR" o "locus de CRISPR", se entiende un tramo repetitivo de secuencia de nucleótidos, en donde las repeticiones tienen aproximadamente 20 a aproximadamente 40 pares de bases de longitud, y están alternadas por espaciadores de ADN no repetitivos de tamaño casi igual. Cada uno de los acrónimos CRISPR, SPIDR, VNTR y SRVR se ha usado para describir una secuencia de nucleótidos que tiene repeticiones espaciadas. Además, la presente invención provee métodos y equipos para la tipificación de bacterias que puede usarse para determinar similitudes y/o diferencias entre cepas bacterianas, en particular cepas de Lactobacillus, que incluyen L. acidophilus, L. brevis, L, casei y L. delbrueckii, y métodos y equipos para la detección de la presencia o ausencia de una especie de Lactobacillus en una muestra. Más particularmente, los métodos implican un método semiautomatizado rápido para la detección y/o tipificación de cepas de organismos procarióticos, tal como Lactobacillus, en donde una secuencia de ADN de CRISPR es amplificada y usada para diferenciar entre cepas de Lactobacillus, o para la detección de una especie de Lactobacillus. Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención comprenden las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NOS: 1 a 50, y variantes y fragmentos de las mismas. La presente invención abarca también moléculas que son complementarias a estas secuencias de ácido nucleico, o que hibpdan con estas secuencias. Las composiciones de ácido nucleico abarcadas por la presente invención son aisladas o sustancialmente purificadas. Por "aisladas" o "sustancialmente purificadas", se entiende que las moléculas de ácido nucleico, o fragmentos o variantes biológicamente activos, están sustancialmente o esencialmente libres de componentes presentes normalmente en asociación con el ácido nucleico en su estado natural. Dichos componentes incluyen otro material celular, medios de cultivo de producción recombinante, y varios químicos usados en la síntesis química de los ácidos nucleicos. De preferencia, un ácido nucleico "aislado" de la presente invención está libre de secuencias de ácido nucleico que flanquean el ácido nucleico de interés en el ADN genómico del organismo del cual el ácido nucleico se derivó (como es el caso de secuencias codificantes presentes en los extremos 5' ó 3'). Sin embargo, la molécula puede incluir algunas bases o porciones adicionales que no afecten deletéreamente las características básicas de la composición. Por ejemplo, en varias modalidades, el ácido nucleico aislado contiene menos de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb o 0.1 kb de secuencia de ácido nucleico asociado normalmente con el ADN genómico de las células de las cuales se derivó. Las composiciones y los métodos de la presente invención pueden usarse para detectar especies de Lactobacillus, que incluyen L. acidophilus, L. brevis, L. casei y L. delbrueckii, o para tipificar cepas bacterianas, que incluyen cepas de L. acidophilus estrechamente relacionadas, tanto en el laboratorio como en productos comerciales. Esto es útil para el desarrollo de productos, así como para investigación en diversidad y evolución de especies bacterianas, y en la identificación de nuevas cepas bacterianas, incluyendo nuevas cepas de Lactobacillus.

Detección y diferenciación de cepas bacterianas Los loci de CRISPR son una clase distinta de repeticiones de secuencia cortas entremezcladas (SSRs) que fueron reconocidas por primera vez en E. coli (Ishino et al. (1987) J. Bacteriol 169: 5429-5433; Nakata et al. (1989) J. Bacteriol. 171 : 3553-3556). Se han identificado SSRs entremezcladas similares en Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena y Mycobacterium tuberculosis (Groenen et al. (1993) Mol. Microbiol. 10: 1057-1065; Hoe et al. (1999) Emerg. Infecí. Dis. 5: 254-263; Masepohl et al. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1307: 26-30; Mojica et al. (1995) Mol. Microbiol. 17: 85-93). Los loci de CRISPR difieren de otras SSRs por la estructura de las repeticiones, las cuales han sido denominadas repeticiones cortas regularmente espaciadas (SRSRs) (Janssen et al. (2002) OMICS J.

Integ. Biol. 6: 23-33; Mojica et al. (2000) Mol. Microbiol. 36: 244-246). Las repeticiones son elementos cortos que ocurren en grupos, que están siempre regularmente espaciadas por secuencias intermedias únicas con una longitud constante (Mojica eí al. (2000) Mol. Microbiol. 36: 244-246). Aunque las secuencias de repetición están altamente conservadas entre las cepas, el número de repeticiones entremezcladas y las secuencias de las regiones del espaciador difieren de cepa a cepa (van Embden eí al. (2000) J. Bacteriol. 182: 2393-2401 ). Métodos para la identificación de regiones de CRISPR, son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, las referencias anteriores, las cuales se incorporan en su totalidad en la presente como referencia, así como los métodos usados en el ejemplo 1 ). Los métodos de la presente invención se ejemplifican en la presente por medio de experimentos que implican a L. acidophilus; sin embargo, el experto en la técnica reconocería que los métodos pueden usarse para la detección y/o identificación de la cepa de cualquier bacteria que tenga una región de CRISPR. El número de nucleótidos en una repetición es en general de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 pares de bases, pero puede ser aproximadamente 20 a aproximadamente 39 pares de bases, aproximadamente 20 a aproximadamente 37 pares de bases, aproximadamente 20 a aproximadamente 35 pares de bases, aproximadamente 20 a aproximadamente 33 pares de bases, aproximadamente 20 a aproximadamente 30 pares de bases, aproximadamente 21 a aproximadamente 40 pares de bases, aproximadamente 21 a aproximadamente 39 pares de bases, aproximadamente 21 a aproximadamente 37 pares de bases, aproximadamente 23 a aproximadamente 40 pares de bases, aproximadamente 23 a aproximadamente 39 pares de bases, aproximadamente 23 a aproximadamente 37 pares de bases, aproximadamente 25 a aproximadamente 40 pares de bases, aproximadamente 25 a aproximadamente 39 pares de bases, aproximadamente 25 a aproximadamente 37 pares de bases, aproximadamente 25 a aproximadamente 35 pares de bases, o aproximadamente 28 ó 29 pares de bases. El número de repeticiones puede variar de aproximadamente 1 a aproximadamente 140, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100, de aproximadamente 2 a aproximadamente 100, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100, de aproximadamente 10 a aproximadamente 100, de aproximadamente 15 a aproximadamente 100, de aproximadamente 20 a aproximadamente 100, de aproximadamente 25 a aproximadamente 100, de aproximadamente 30 a aproximadamente 100, de aproximadamente 35 a aproximadamente 100, de aproximadamente 40 a aproximadamente 100, de aproximadamente 45 a aproximadamente 100, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100, de aproximadamente 1 a aproximadamente 135, de aproximadamente 1 a aproximadamente 130, de aproximadamente 1 a aproximadamente 125, de aproximadamente 1 a aproximadamente 120, de aproximadamente 1 a aproximadamente 115, de aproximadamente 1 a aproximadamente 110, de aproximadamente 1 a aproximadamente 105, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100, de aproximadamente 1 a aproximadamente 95, de aproximadamente 1 a aproximadamente 90, de aproximadamente 1 a aproximadamente 80, de aproximadamente 1 a aproximadamente 70, de aproximadamente 1 a aproximadamente 60, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, de aproximadamente 10 a aproximadamente 140, de aproximadamente 10 a aproximadamente 130, de aproximadamente 10 a aproximadamente 120, de aproximadamente 10 a aproximadamente 110, de aproximadamente 10 a aproximadamente 95, de aproximadamente 10 a aproximadamente 90, de aproximadamente 20 a aproximadamente 80, de aproximadamente 30 a aproximadamente 70, de aproximadamente 30 a aproximadamente 60, de aproximadamente 30 a aproximadamente 50, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40, o aproximadamente 32. Las secuencias de nucleótidos descritas en la presente pueden usarse para detectar especies de Lactobacillus, y/o para diferenciar cepas bacterianas, incluyendo diferenciación de cepas NCGM® de L. acidophilus de otras cepas de L. acidophilus. La detección y/o diferenciación se basa en la identificación de regiones de CRISPR novedosas en NCFM® de L. acidophilus, L. brevis, L. casei y L. delbrueckii subespecie bulgaricus. Puesto que estas regiones de CRISPR son específicas de cepa, cualquier método que ponga a prueba la presencia de estas secuencias específicas, es contemplado por la presente invención. La presente invención es aplicable a pruebas médicas, pruebas de alimentos, pruebas agrícolas y pruebas ambientales. Se describen pruebas de diagnóstico para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en una muestra. Estos métodos comprenden obtener una muestra, amplificar una región de ADN que comprenda por lo menos una de SEQ ID NOS: 1 a 7 y 37 a 48, o una variante de la misma para crear ADN amplificado, y detectar el ADN amplificado. La detección del ADN amplificado es específica de una especie de Lactobacillus. Diferentes cepas de una especie de Lactobacillus, como es el caso de una especie de L. acidophilus, pueden tener diferentes tamaños de ADN amplificado. Por lo tanto, este método puede usarse también como una herramienta para diferenciación de cepas. El método puede comprender además secuenciar el ADN amplificado, y detectar la presencia de una especie de Lactobacillus, como es el caso de L. acidophilus, L. brevis, L. casei o L. delbrueckii, con base en los resultados de secuenciación. En forma alternativa, el método puede comprender además añadir al ADN amplificado por lo menos una enzima de restricción que reconozca uno o más sitios en el ADN amplificado, incubar la enzima de restricción con el ADN amplificado por un tiempo suficiente para formar fragmentos de restricción, determinar el número y tamaño de los fragmentos de restricción, y detectar la presencia de una especie de Lactobacillus, tal como L. acidophilus, L. brevis, L. casei o . delbrueckii, con base en el número y tamaño de los fragmentos de restricción. Se proveen métodos para la tipificación de una cepa bacteriana de Lactobacillus. Estos métodos comprenden obtener una muestra, amplificar una región de ADN que comprenda por lo menos una de las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NOS: 1 a 7 y 37 a 48, o una variante de las mismas en la muestra para crear ADN amplificado, y tipificar la cepa bacteriana con base en el ADN amplificado. Esta tipificación puede hacerse añadiendo al ADN amplificado por lo menos una enzima de restricción que reconozca uno o más sitios en el ADN amplificado, incubar la enzima de restricción con el ADN amplificado por un tiempo suficiente para formar fragmentos de restricción, determinar el número de los fragmentos de restricción y su tamaño, y tipificar la cepa bacteriana con base en el número y tamaño de los fragmentos de restricción. La tipificación puede hacerse también secuenciando el ADN amplificado, y tipificando la cepa bacteriana con base en los resultados de secuenciación. En una modalidad, la región de ADN que se amplificará comprende SEQ ID NO: 1. En otra modalidad, la región de ADN comprende una secuencia de nucleótidos que tenga por lo menos 75% de identidad de secuencia con por lo menos una de SEQ ID NOS: 1 a 7 y 37 a 48. El ADN amplificado puede obtenerse proveyendo un primer iniciador que se una a una región de ADN que flanquee la región de CRISPR, tal como ADN corriente arriba de la región de CRISPR, y un segundo iniciador que se una a una región de ADN que flanquee la región de CRISPR, tal como ADN corriente abajo de la región de CRISPR; usando los iniciadores en una reacción de PCR para crear ADN amplificado; separando el ADN amplificado sobre un gel para producir una banda que muestre el tamaño del ADN de CRISPR amplificado; y tipificando la cepa bacteriana con base en el tamaño de la banda. El tipo del ADN amplificado es característico de la cepa de Lactobacillus. En una modalidad, el primer iniciador se une a una región de ADN corriente arriba de la región de CRISPR, tal como la que se expone en SEQ ID NO: 49, y el segundo iniciador se une a una región de ADN corriente abajo de la región de CRISPR, tal como la que se expone en SEQ ID NO: 50. En forma alternativa, el ADN amplificado puede obtenerse proveyendo un primer iniciador que se una a una secuencia repetitiva en una región de CRISPR; proveyendo un segundo iniciador que se una a un ADN que flanquee (es decir, corriente arriba o corriente abajo de) la región de CRISPR: usando los iniciadores en una reacción de PCR para crear ADN amplificado; separando el ADN amplificado sobre un gel para producir un patrón de bandas distinto que muestre el número y los tamaños del ADN amplificado; y tipificando la cepa bacteriana con base en el patrón. El número y los tamaños de las bandas sirven de diagnóstico de la cepa de Lactobacillus. En una modalidad, el primer iniciador se une a cualquiera de SEQ ID NOS: 2 a 7 y 37 a 48, y el segundo iniciador se une a ADN que flanquee cualquiera de SEQ ID NOS: 2 a 7 y 37 a 48. Este método en donde un iniciador se une a cualquiera de SEQ ID NOS: 2 a 7 y 37 a 48 produce muchas bandas de tamaños variables, dependiendo del número y espaciamiento de las repeticiones en relación al iniciador anclado. Por ejemplo, si la región de repetición está presente cinco veces, el iniciador complementario a la región de repetición se unirá en cinco sitios, y generará cinco bandas que pueden visualizarse como una huella digital sobre un gel de agarosa o poliacrilamida. Los productos de PCR pueden amplificarse a diferentes grados, y algunas de las bandas resultantes pueden no visualizarse por lo tanto tan fácilmente como otras, si es que pueden visualizarse. El patrón de bandas distinto muestra el número y tamaño del ADN amplificado, y puede usarse para caracterizar cepas de Lactobacillus, incluyendo las cepas de L. acidophilus, L. brevis, L. casei y L. delbrueckii. El término "muestra" se usa para incluir tejidos, células y fluidos biológicos presentes en un sujeto o aislados del mismo, así como células de cultivos de partida (semilla madre apilada/acomodada, concentrada, desecada, liofilizada, congelada) o productos alimenticios/lácteos/forrajeros que posean dichos cultivos, o derivados del uso de dichos cultivos. La muestra puede ser un complemento dietético, producto fermentado para bioprocesamiento, o un sujeto que haya ingerido una sustancia que comprende la secuencia de nucleótidos. Es decir, el método de detección de la invención puede usarse para detectar ADN genómico que comprenda una secuencia de nucleótidos descrita en una muestra tanto in vitro como in vivo. Técnicas in vitro para la detección de ADN genómico que comprende las secuencias de nucleótidos descritas incluyen, pero no están limitadas a, hibridaciones Southern. Los resultados obtenidos con una muestra del alimento, complemento, cultivo, producto o sujeto, pueden compararse con resultados obtenidos con una muestra de un cultivo, producto o sujeto de control. En una modalidad, la muestra contiene ADN genómico de un cultivo de partida. La amplificación de la región de ADN deseada puede lograrse por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo reacción en cadena de polimerasa (PCR). Por "amplificación", se entiende la producción de copias adicionales de una secuencia de ácido nucleico. Esta se lleva a cabo en general usando tecnologías de PCR bien conocidas en la técnica (Dieffenbach y Dveksler (1995) PCR Primer, a Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York). Por "reacción en cadena de polimerasa" o "PCR", se entiende un método tal como el descrito en las patentes de E.U.A. Nos. 4,683,195 y 4,683,202, incorporadas en la presente como referencia, que describen un método para incrementar la concentración de un segmento de una secuencia objetivo en una mezcla de ADN genómico sin clonación o purificación. La longitud del segmento amplificado de la secuencia objetivo deseada es determinada por las posiciones relativas de dos oligonucleótidos iniciadores entre sí y, por lo tanto, esta longitud es un parámetro controlable. En virtud del aspecto repetitivo del procedimiento, el método es referido como "PCR". Puesto que los segmentos amplificados deseados de la secuencia objetivo llegan a ser las secuencias predominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se dice que son "amplificados por PCR". En un procedimiento de PCR, pueden diseñarse oligonucleótidos iniciadores para su uso en reacciones de PCR para amplificar el locus de CRISPR completo o parte del mismo. Por "iniciador", se entiende un oligonucleótido, ya sea que ocurra en forma natural como en una digesta de restricción purificada o producido sintéticamente, el cual es capaz de actuar como un punto de inicio de la síntesis cuando se pone bajo condiciones en las cuales se induce la síntesis de un producto de extensión del iniciador que es complementario a una cadena de ácido nucleico (es decir, en presencia de nucleótidos y un agente inductor tal como ADN polimerasa y a una temperatura y pH adecuados). El iniciador es de preferencia de cadena sencilla para eficiencia máxima en amplificación, pero en forma alternativa puede ser de doble cadena. Si es de doble cadena, el iniciador se trata primero para separar sus cadenas antes de que sea usado para preparar los productos de extensión. De preferencia, el iniciador es un oligodesoxirribonucleótido. El iniciador debe ser suficientemente largo para iniciar la síntesis de productos de extensión en presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los iniciadores dependerán de muchos factores, que incluyen temperatura, fuente del iniciador y el uso del método. Los iniciadores de PCR son de preferencia de por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud, y más preferiblemente de por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Las composiciones de la invención incluyen oligonucleótidos iniciadores que pueden usarse para amplificar estas regiones repetitivas. Ejemplos de iniciadores de PCR que pueden usarse en los métodos de la invención, incluyen iniciadores que se unen a una región de ADN genómico que flanquea la región de CRISPR, tal como los presentes en SEQ ID NOS: 49 y 50, o un iniciador que se una a SEQ ID NO: 36, o iniciadores que se unan dentro de la región de CRISPR, o una combinación de los mismos. Los iniciadores delantero e inverso están diseñados para amplificar una región de CRISPR completa o parte de la misma. Por "flanqueante", se entiende una región 5' (corriente arriba) o 3' (corriente abajo) de la secuencia. En algunas modalidades, por lo menos un iniciador se une a una secuencia de ADN que flanquea la región de CRISPR. En algunas modalidades, un iniciador se une a la primera secuencia repetitiva (por ejemplo, SEQ ID NO: 2), y un iniciador se une a una secuencia de ADN flanqueante (por ejemplo, SEQ ID NO: 36), amplificando por lo tanto la región de CRISPR entera. En algunas modalidades, ambos iniciadores se unen a regiones de ADN que flanquean la región de CRISPR. Iniciadores que estén diseñados para unirse a ADN que flanquee una región de CRISPR serían específicos de especie, ya que no se esperaría que este ADN flanqueante comparta suficiente identidad de secuencia entre todas las especies de Lactobacillus. Las secuencias repetitivas en estas regiones de CRISPR muestran homología de nucleótidos entre sí (véase figura 7). Las secuencias repetitivas de L. acidophilus son por lo menos 86% idénticas entre sí. Las secuencias repetitivas de L. brevis son por lo menos 82% idénticas entre sí. Las secuencias repetitivas de L. delbrueckii ssp. bulgaricus son por lo menos 89% idénticas entre sí. Las secuencias repetitivas de L. acidophilus son por lo menos 57% idénticas a las secuencias repetitivas de L. brevis. Las secuencias repetitivas de L. acidophilus son por lo menos 71 % idénticas a las secuencias repetitivas de L. casei. Las secuencias repetitivas de L. acidophilus son por lo menos 75% idénticas a las secuencias repetitivas de L. delbrueckii. Las secuencias repetitivas de L. brevis son por lo menos 64% idénticas a las secuencias repetitivas de L. casei. Las secuencias repetitivas de L. brevis son por lo menos 64% idénticas a las secuencias repetitivas de L. delbrueckii. Y las secuencias repetitivas de L. casei son por lo menos 71 % idénticas a las secuencias repetitivas de L. delbrueckii. Si se conoce la secuencia de ADN que flanquea la región de CRISPR, el experto en la técnica sería capaz de diseñar iniciadores para amplificar la región de CRISPR con base en esta secuencia flanqueante conocida. Si no se conoce aún la secuencia de ADN que flanquea la región de CRISPR, el experto en la técnica sería capaz de determinar esta secuencia flanqueante usando métodos conocidos en la técnica. El genoma entero de NCFM de L. acidophilus se provee en la solicitud provisional de E.U.A. No. 60/622,712 y en Altermann eí al (2005) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 102: 3906-3912, cita incorporada en su totalidad en la presente como referencia. El genoma de L plantarum se provee en Kleerebezem eí al. (2003) Proc. Nati.

Acad. Sci. U.S.A. 100: 1990-1995. El genoma completo de L. johnsonii se provee en Pridmore eí al. (2004) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 101 : 2512-2517. Métodos para el diseño de iniciadores de PCR y clonación por PCR se conocen en general en la técnica, y se describen en Sambrook eí al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Véase también Innis eí al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); e Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Métodos conocidos de PRC incluyen, pero no están limitados a, métodos que usan iniciadores pares, iniciadores anidados, iniciadores específicos individuales, iniciadores degenerados, iniciadores específicos de genes, iniciadores específicos de vectores, iniciadores parcialmente sin coincidencia, y similares. Con la PCR, es posible amplificar una sola copia de una secuencia objetivo específica a un nivel detectable por varias metodologías diferentes (por ejemplo, hibridación con una sonda marcada; incorporación de iniciadores biotinilados, seguida de detección de conjugado de avidina-enzima; incorporación de desoxinucleótido trifosfatos marcados con 32P, tales como dCTP o dATP, en el segmento amplificado). Además del ADN genómico, cualquier secuencia de oligonucleótidos puede amplificarse con la serie adecuada de moléculas iniciadoras. En particular, los segmentos amplificados creados por el procedimiento de PCR mismo son, por sí mismos, moldes eficientes para amplificación por PCR subsiguientes. La amplificación en PCR requiere "reactivos de PCR" o "materiales de PCR", que se definen en la presente como todos los reactivos necesarios para llevar a cabo la amplificación, salvo la polimerasa, los iniciadores y el molde. Los reactivos de PCR incluyen normalmente precursores de ácido nucleico (dCTP, dTTP, etc.) y regulador de pH. Una vez que el ADN que comprende el locus de CRISPR, o una porción del mismo, ha sido amplificado, puede ser digerido (cortado) entonces con una enzima de restricción. Como se usa en la presente, los términos "endonucleasas de restricción" y "enzimas de restricción" se refieren a enzimas bacterianas, cada una de las cuales corta ADN de doble cadena en o cerca de una secuencia de nucleótidos específica. Las enzimas de restricción son bien conocidas en la técnica y pueden obtenerse fácilmente, por ejemplo, de una variedad de fuentes comerciales (por ejemplo, New England Biolabs, Inc., Beverly, Massachusetts). Asimismo, métodos para el uso de enzimas de restricción son en general también bien conocidos y de rutina en la técnica. Enzimas de restricción preferidas, son las que producen entre 10 y 24 fragmentos de ADN cuando cortan el locus de CRISPR (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 ). Ejemplos de dichas enzimas incluyen, pero no están limitados a, Alu\, Mse\ y Tsp5091. Los fragmentos de ADN obtenidos usando enzimas de restricción pueden detectarse, por ejemplo, como bandas por electroforesis en gel. Pueden usarse enzimas de restricción para crear polimorfismos de la longitud del fragmento de restricción (RFLPs). Los RFLPs son, en esencia, instantáneas únicas de la huella digital de una pieza de ADN, ya sea un cromosoma entero (genoma), o una parte del mismo, tal como la región del genoma que comprende el locus de CRISPR novedoso de L. acidophilus descrito en la presente invención. Los RFLPs se generan cortando ("restringiendo") una molécula de ADN con una endonucleasa de restricción. Muchos cientos de dichas enzimas se han aislado, como los obtenidos naturalmente por bacterias. En esencia, las bacterias usan dichas enzimas como un sistema defensivo, que reconoce y entonces digiere (restringe) cualquier molécula de ADN extraña que podría entrar a la célula bacteriana (por ejemplo, una infección viral). Se ha encontrado que cada una de los muchos cientos de diferentes enzimas de restricción cortan (es decir, "digieren" o "restringen") ADN en una secuencia diferente de los 4 nucleótidos básicos (A, T, G, C) que constituyen todas las moléculas de ADN, por ejemplo, una enzima podría específicamente y solamente reconocer la secuencia A-A-T-G-A-C, mientras que otra podría específicamente y solamente reconocer la secuencia G-T-A-C-T-A, etc. Dependiendo de la enzima única involucrada, dichas secuencias de reconocimiento pueden variar en longitud, desde tan pocos como 4 nucleótidos hasta tantos como 21 nucleótidos. Cuanto más larga sea la secuencia de reconocimiento, resultarán menos fragmentos de restricción, ya que mientras más largo sea el sitio de reconocimiento, menor será la probabilidad de que se encuentre repetitivamente por todo el ADN. Después de la digestión, los fragmentos individuales resultantes se separan de algún otro con base en su tamaño. Cualquier método adecuado para la separación de ADN es contemplado por los métodos de la presente invención e incluyen, pero no están limitados a, electroforesis en gel, cromatografía de líquidos de alto rendimiento (CLAR), espectroscopia de masa y el uso de un dispositivo microfluídico. En una modalidad, los fragmentos de ADN se separan por electroforesis en gel de agarosa. La electroforesis en gel separa diferentes moléculas cargadas dimensionadas por su velocidad de movimiento a través de un gel estacionario bajo la influencia de una corriente eléctrica. Estos fragmentos de ADN separados pueden visualizarse fácilmente, por ejemplo, por tinción con bromuro de etidio, y observando el gel bajo iluminación UV. El patrón de bandas refleja los tamaños del ADN digerido por restricción. En forma alternativa, para la realización de RFLP en el locus de CRISPR amplificado, la secuencia del ADN amplificado puede obtenerse por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo métodos de secuenciación automáticos y manuales. Véase, por ejemplo, Sambrook eí al. ( 1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York; Roe eí al. (1996) ADN Isolation and Sequencing (Essential Techniques Series, John Wiley & Sons). Otros métodos que usan regiones repetitivas de CRISPR novedosas de la invención para detectar y/o tipificar cepas de Lactobacillus, son contemplados también por la invención. Estos métodos incluyen métodos de hibridación, ya sea usando una molécula de ácido nucleico de la invención como sonda, o una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar con una secuencia de nucleótidos descrita de la presente invención. Véase, por ejemplo, Sambrook eí al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). En las técnicas de hibridación, las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, productos amplificados por PCR, u otros oligonucleótidos, y pueden comprender la secuencia de nucleótidos conocida completa o parte de la misma que se describe en la presente. Además, puede marcarse con un grupo detectable tal como 32P, o cualquier otro marcador detectable, tales como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor de enzima. El término "marcada", con respecto a la sonda, se usa para abarcar la marcación directa de la sonda por acoplamiento (es decir, enlazando físicamente) una sustancia detectable a la sonda, así como marcación indirecta de la sonda por reactividad con otro reactivo que sea marcado directamente. Ejemplos de marcación indirecta incluyen marcación de extremo de una sonda de ADN con biotina, de modo que pueda detectarse con estreptavidina marcada por fluorescencia. Pueden obtenerse sondas por hibridación marcando oligonucleótidos sintéticos con base en las secuencias de nucleótidos de la región de CRISPR conocidas descritas en la presente. En una modalidad, la secuencia de nucleótidos de la región de CRISPR de L. acidophilus entera (SEQ ID NO: 1 ) se usa como sonda para detectar y/o diferenciar una cepa de L. acidophilus. En otra modalidad, la sonda es un fragmento de una secuencia de nucleótidos descrita en la presente, tal como una sonda que consiste de una secuencia repetitiva individual, como se encuentra en cualquiera de SEQ ID NOS: 2-7 y 37-48. En otra modalidad, la sonda es una secuencia presente en una región del espaciador, por ejemplo, en cualquiera de SEQ ID NOS: 8-35. En otra modalidad, la sonda es una región flanqueante, tal como la de SEQ ID NO: 36. La sonda de hibridación comprende típicamente una región de secuencia de nucleótidos que híbrida bajo condiciones severas con por lo menos aproximadamente 10, de preferencia aproximadamente 20, más preferiblemente aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 ó 400 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos de la región de CRISPR de la invención, o un fragmento o variante de la misma. La preparación de sondas para hibridación se conoce en general en la técnica y se describe en Sambrook eí al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York), cita incorporada en la presente como referencia. Secuencias sustancialmente idénticas hibridarán entre sí bajo condiciones severas. Por "condiciones severas", se entiende condiciones bajo las cuales una sonda hibridará con su secuencia objetivo a un grado detectablemente mayor que con otras secuencias (por ejemplo, por lo menos 2 veces más sobre la base). Condiciones severas son bien conocidas en la técnica, y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York (1989)), 6.3.1 -6.3.6. Cuando se usen sondas, condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sales sea menor que ion sodio a aproximadamente 1.5 M, típicamente concentración de ion sodio (u otras sales) a aproximadamente 0.01 a 1.0 M a pH 7.0 a 8.3, y la temperatura es por lo menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, mayores de 50 nucleótidos). Los lavados post-hibridación son instrumentales en el control del carácter específico. Los dos factores críticos son la concentración iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para la detección de secuencias que hibridan con una secuencia objetivo de longitud completa o de casi longitud completa, la temperatura bajo condiciones severas se selecciona para que sea aproximadamente 5°C menor que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una concentración iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones severas abarcarían temperaturas en la escala de 1 °C a 20°C menor que el Tm, dependiendo del grado deseado de severidad que de otra manera se calificaría en la presente. Para híbridos de ADN-ADN, el Tm puede determinarse usando la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284: Tm = 81.5°C + 16.6 (logM) + 0.41 (% de GC) -0.61 (% de formamida) - 500/L; en donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, % de GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % de formamida es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. El Tm es la temperatura (bajo concentración iónica y pH definidos) a la cual 50% de una secuencia objetivo complementaria híbrida con una sonda con correspondencia perfecta. La capacidad para detectar secuencias con grados variables de homología puede obtenerse haciendo variar la severidad de las condiciones de hibridación y/o lavado. Para secuencias objetivo que son 100% idénticas (sondeo homólogo), deben obtenerse condiciones de severidad que no permitan no coincidencia. Al permitirse que ocurra no coincidencia de residuos de nucleótido, pueden detectarse secuencias con un menor grado de similitud (sondeo heterólogo). Por cada 1% de no coincidencia, el Tm es reducido aproximadamente a 1 °C; por lo tanto, pueden manipularse condiciones de hibridación y/o lavado que permitan la hibridación de secuencias de un porcentaje de identidad objetivo. Por ejemplo, si se prefieren secuencias con >90% de identidad de secuencia, el Tm puede disminuirse alrededor de 10°C. Ejemplos de condiciones de baja severidad incluyen hibridación con una solución de regulador de pH de formamida a 30-35%, NaCI a 1 M, SDS (dodecil sulfato de sodio) a 1 % a 37°C, y un lavado en 1X a 2X SSC (20X SSC = NaCI a 3.0 M/citrato de sodio a 0.3 M) a 50 a 55°C. Ejemplos de condiciones de severidad moderada incluyen hibridación en formamida a 40 a 45%, NaCI a 1.0 M, SDS a 1 % a 37°C, y un lavado en 0.5X a 1X SSC a 55 a 60°C. Ejemplos de condiciones de alta severidad incluyen hibridación en formamida a 50%, NaCI a 1 M, SDS a 1 % a 37°C, y un lavado en 0.1 X SSC a 60 a 65°C. Opcionalmente, los reguladores de pH de lavado pueden comprender SDS a aproximadamente 0.1% a aproximadamente 1%. La duración de la hibridación es en general menor de aproximadamente 24 horas, usualmente de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas. Una guía extensiva para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I, capítulo 2 (Elsevier, New York); y Ausubel eí al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York). Véase Sambrook eí al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Se contemplan también métodos que abarcan técnicas de hibridación para detectar o diferenciar cepas bacterianas. Estos incluyen, pero no están limitados a, Southern blotting (véase, por ejemplo, Van Embden eí al. (1993) J Clin. Microbiol. 31 : 406-409), pruebas de cambio de movilidad (véase, por ejemplo, la solicitud publicada de E.U.A. No. 20030219778), pruebas de secuenciación que usan disposiciones de oligonucleótidos (véase, por ejemplo, Pease eí al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 : 5022-5026), espoligotipificación (véase, por ejemplo, Kamerbeek eí al. (1997) J. Clin. Microbiol. 35: 907-914), hibridación in situ fluorescente (véase, por ejemplo, Amann eí al. (1990) J Bacteriol. 172: 762-770) y pruebas de rastreo de heterodúplex o análisis de movilidad de heterodúplex (véase, por ejemplo, White eí al. (2000) J. Clin. Micro. 38: 477-482). La invención abarca también equipos para la detección de la presencia de los ácidos nucleicos de la presente invención en una muestra. Dichos equipos pueden usarse para la tipificación o detección de cepas de Lactobacillus presentes, por ejemplo, en un producto alimenticio o cultivo de partida, o en un sujeto que ha consumido un material probiótico. Por ejemplo, el equipo puede comprender iniciadores de PCR para amplificación de un locus de CRISPR, así como una polimerasa y otros materiales de PCR para su uso en la amplificación de ADN. El equipo puede contener también una o más enzimas de restricción para su uso en análisis de RFLP. El equipo puede contener un agente o compuesto marcado capaz de detectar una secuencia de ácido nucleico descrita en una muestra, y medios para determinar la cantidad de la secuencia de ácido nucleico descrita en la muestra (por ejemplo, una sonda de oligonucleótidos que se une a una secuencia de ácido nucleico de la invención, por ejemplo, cualquiera de SEQ ID NOS: 1-50). Para equipos basados en oligonucleótidos, el equipo puede comprender, por ejemplo: (1 ) un oligonucleótido, un oligonucleótido marcado detectablemente que hibride con una secuencia de ácido nucleico descrita, o (2) un par de iniciadores útiles para la amplificación de una molécula de ácido nucleico descrita. El equipo puede comprender también, por ejemplo, un agente regulador de pH, un conservador o un agente estabilizador de proteínas. El equipo puede comprender también componentes necesarios para la detección del agente detectable (por ejemplo, una enzima o un substrato). El equipo puede contener también una muestra de control o una serie de muestras de control (tanto positivas como negativas) que puedan ponerse a prueba y compararse con la muestra de prueba contenida. Cada componente del equipo está incluido usualmente dentro de un contenedor individual, y todos los varios contenedores están dentro de un empaque individual junto con instrucciones para su uso. En una modalidad, el equipo comprende sondas múltiples en cualquier formato de disposiciones, tales como las que se describen, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. Nos. 5,412,087 y 5,545,531 y en la publicación internacional No. WO 95/00530, incorporada en la presente como referencia. Las sondas para su uso en la disposición pueden sintetizarse directamente sobre la superficie de la disposición, como se describe en la publicación internacional No. WO 95/00530, o antes de la inmovilización sobre la superficie de la disposición (Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis a Practica! Approach (IRL Press, Oxford, Inglaterra). Las sondas pueden ser inmovilizadas sobre la superficie usando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia, tales como las descritas en la patente de E.U.A. No. 5,412,087. Las sondas pueden ser una secuencia de ácido nucleico o péptidos, de preferencia purificada. Las disposiciones pueden usarse para seleccionar organismos, muestras o productos para diferenciar entre cepas de Lactobacillus, o para verificar la presencia de una especie de Lactobacillus, tal como NCFM® de . acidophilus. La unión a una sonda de captura es detectada, por ejemplo, por una señal generada de una marca unida a la molécula de ácido nucleico que comprenda la secuencia de ácido nucleico descrita. El método puede incluir poner en contacto la molécula que comprende el ácido nucleico descrito con una primera disposición que tenga una pluralidad de sondas de captura, y una segunda disposición que tenga una pluralidad de sondas de captura diferentes. Los resultados de cada hibridación pueden compararse para analizar diferencias en el contenido entre una primera y una segunda muestra. La primera pluralidad de sondas de captura puede ser de una muestra de control, por ejemplo, una muestra que se sabe contiene NCFM® de L. acidophilus, o de un sujeto de control, por ejemplo, un alimento, incluyendo un pienso o complemento del pienso, un complemento dietético, una muestra de cultivo de partida, o un fluido biológico. La segunda pluralidad de sondas de captura puede ser de una muestra experimental, por ejemplo, un sujeto que haya consumido un material probiótico, una muestra de cultivo de partida, un alimento o un fluido biológico. Estas pruebas pueden ser especialmente útiles en procedimientos de control de calidad y de selección microbiana, en donde la detección de materiales no deseables es esencial. La detección de secuencias de nucleótidos particulares puede ser también útil en la determinación de la composición genética de alimentos, productos de fermentación o microbios industriales, o microbios presentes en el sistema digestivo de animales o humanos que hayan consumido probióticos.

Fragmentos y variantes La invención incluye moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden la secuencia de nucleótidos de un locus de CRISPR de . acidophilus, L. brevis, L. casei, L. delbrueckii, o variantes y fragmentos de las mismas. Por "fragmento" de una molécula de ácido nucleico, se entiende una porción de la secuencia de nucleótidos. Pueden usarse fragmentos de moléculas de ácido nucleico como sondas de hibridación para detectar y/o diferenciar regiones de CRISPR de varias bacterias, incluyendo especies de Lactobacillus, o pueden usarse como iniciadores en la amplificación por PCR de regiones de CRISPR. Fragmentos de ácidos nucleicos pueden ser unidos también a un substrato físico para comprender lo que puede considerarse como una macrodisposición o microdisposición (véanse, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,837,832 y 5,861 ,242). Dichas disposiciones de ácidos nucleicos pueden usarse para identificar moléculas de ácido nucleico con identidad suficiente para las secuencias objetivo. Por "molécula de ácido nucleico", se entiende moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm), y análogos del ADN o ARN generados usando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser de cadena sencilla o de doble cadena, pero es de preferencia ADN de doble cadena. Puede usarse un fragmento de nucleótido como una sonda de hibridación o iniciador de PCR como se describió anteriormente. Los fragmentos de moléculas de ácido nucleico de la región de CRISPR comprenden por lo menos aproximadamente 15, 20, 50, 75, 100, 2.00, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 nucleótidos, o hasta el número total de nucleótidos presentes en una secuencia de nucleótidos de la región de CRISPR de longitud completa, como se describe en la presente (por ejemplo, 1953 para SEQ ID NO: 1 ). Se contemplan en la presente invención variantes de las secuencias de nucleótidos. Por "variante" se entiende una secuencia suficientemente idéntica. Por consiguiente, la invención abarca moléculas de ácido nucleico aisladas que sean suficientemente idénticas a cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NOS: 1 -50, o moléculas de ácido nucleico que hibriden con cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NOS: 1-50, o un complemento de las mismas, bajo condiciones severas. En general, secuencias de nucleótidos que tienen por lo menos aproximadamente 45%, 55% o 65% de identidad, de preferencia por lo menos aproximadamente 70% o 75% de identidad, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 78%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% o 90%, muy preferiblemente por lo menos aproximadamente 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NOS: 1-50, se definen en la presente como suficientemente idénticas. Pueden existir variantes de ocurrencia natural dentro de una población (por ejemplo, la población de L. acidophilus). Dichas variantes pueden identificarse usando técnicas de biología molecular bien conocidas, tales como PCR e hibridación como se describió anteriormente. Secuencias de nucleótidos derivadas sintéticamente, por ejemplo, secuencias generadas por mutagénesis dirigida a sitio o mutagénesis mediada por PCR, que permitan aún la diferenciación o detección de cepas, se incluyen también como variantes. Pueden introducirse una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en una secuencia de nucleótidos descrita en la presente, de modo que las sustituciones, adiciones o deleciones no afecten la capacidad para diferenciar cepas con base en cualquiera de los métodos descritos en la presente o conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitados a, RFLP, secuenciación e hibridación. Ejemplos de variantes de una región de repetición de CRISPR pueden encontrarse en SEQ ID NOS: 2-7 y 37-48.

Identidad de secuencia Las secuencias de nucleótidos abarcadas por la presente invención tienen una cierta identidad de secuencia. Por "identidad de secuencia", se entiende los residuos de nucleótidos que son iguales cuando se alinean dos secuencias para correspondencia máxima sobre una ventana de comparación especificada. Por "ventana de comparación", se entiende un segmento contiguo de las dos secuencias de nucleótidos para alineación óptima, en donde la segunda secuencia puede contener adiciones o deleciones (es decir, espacios) en comparación con la primera secuencia. En general, para alineaciones de ácidos nucleicos, la ventana de comparación es de por lo menos 20 nucleótidos contiguos de longitud, y opcionalmente puede ser de 30, 40, 50, 100 nucleótidos, o más larga. Los expertos en la técnica entienden que para evitar una alta similitud debido a la inclusión de espacios, se introduce típicamente una penalización de espacios, y se resta del número de coincidencias. Para determinar el por ciento de identidad de dos secuencias de nucleótidos, se realiza una alineación. El por ciento de identidad de las dos secuencias, es una función del número de residuos idénticos compartidos por las dos secuencias en la ventana de comparación (es decir, por ciento de identidad = número de residuos idénticos/número total de residuos x 100). En una modalidad, las secuencias tienen la misma longitud. Pueden usarse métodos similares a los mencionados más adelante para determinar el por ciento de identidad entre dos secuencias. Los métodos pueden usarse con o sin que se permitan espacios. Pueden usarse algoritmos matemáticos para determinar el por ciento de identidad de dos secuencias. Ejemplos no limitativos de algoritmos matemáticos, son el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 2264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877; el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4: 11-17; el algoritmo de homología local de Smith eí al. (1981 ) Adv. Appl. Math. 2: 482; el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch (1970) J Mol. Biol. 48: 443-453; y el método de búsqueda para alineación local de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448. Se han diseñado varias implementaciones de cómputo basadas en estos algoritmos matemáticos que permiten la determinación de la identidad de secuencia. Los programas BLAST de Altschul eí al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990), citado anteriormente. Búsquedas para obtener secuencias de nucleótidos que sean homologas a secuencias de nucleótidos de la presente invención, pueden llevarse a cabo con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12. Pueden obtenerse alineaciones con espacios o intersticios usando BLAST con espacios o intersticios (en BLAST 2.0), como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389. Para detectar relaciones distantes entre moléculas, puede usarse PSI-BLAST. Véase Altschul eí al. (1997), citado anteriormente. Para todos los programas BLAST, pueden usarse los parámetros predeterminados de los programas respectivos. Véase www.ncbi.nlm.nih.gov. Puede realizarse también la alineación manualmente por inspección. Otro programa que puede usarse para determinar el por ciento de identidad de secuencia es el programa ALIGN (versión 2.0), que usa el algoritmo matemático de Myers y Miller (1988), citado anteriormente. Además de los programas ALIGN y BLAST, los programas BESTFIT, GAP, FASTA y TFASTA forman parte del paquete del software de GCG Wisconsin Genetics, versión 10 (disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, USA), y pueden usarse para llevar a cabo alineaciones de secuencias. El programa preferido es GAP versión 10, que usa el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970), citado anteriormente. A menos que se indique de otra manera, los valores de identidad de secuencia provistos en la presente se refieren a aquellos valores obtenidos usando el programa GAP versión 10, con los siguientes parámetros: % de identidad usando el peso de GAP de 50 y el peso de longitud de 3, y la matriz de puntuaciones nwsgapADN.cmp. Pueden usarse también otros programas equivalentes. Por "programa equivalente", se entiende cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualquier par de secuencias en cuestión, genera una alineación que tiene coincidencias de residuos de nucleótidos idénticas y un por ciento de identidad de secuencia idéntico cuando se compara con la alineación correspondiente generada por GAP versión 10. Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración, y no a manera de limitación.

Sección experimental EJEMPLO 1 Análisis de ADN Se analizó la secuencia de ADN genómico de NCFM® de Lactobacillus acidophilus para ADN repetitivo por medio de un "análisis de repetición y coincidencia", usando el paquete del software de Applied Maths' Kodon. Se identificó una región intergénica entre ADN polimerasa (po/A) (ORF 1550) y una fosforribosilamina-glicina ligasa ipurD) (ORF 1551 ) putativa con rasgos característicos de un locus de CRISPR. Esta región tiene aproximadamente 2.4 kb de longitud, y contiene 32 repeticiones casi perfectas de 29 pares de bases separados por espaciadores de 32 pares de bases (véase figuras 1 y 2). Muchos rasgos de la región de CRISPR pueden verse en la figura 2. Las repeticiones de 29 pares de bases están resaltadas. El primer nucleótido de la repetición es una A o una G. El último nucleótido de la repetición cambia de una T a una C en la repetición número 21. Una repetición invertida imperfecta está indicada por una raya en la última repetición. La primera repetición contiene dos sustituciones de bases A?T. La repetición 26 contiene una sustitución de bases C?T. Dos secuencias están repetidas en la región del espaciador; una está repetida dos veces (en negritas (y contorneada), y una está repetida tres veces (en negritas y mayúsculas). La región del espaciador 16 es una base más larga que las otras.

EJEMPLO 2 PCR de la región intergénica Se diseñaron iniciadores para amplificar la región intergénica entera entre po/A y purD (tamaño del producto esperado = 2582 pares de bases). Los iniciadores fueron los siguientes: 1550_F- 5' GCA TTA GTG TGC AAC CCA TCT GG 3' (SEQ ID NO: 49) 1551_R- 5' GAT CTG CTG GAT TGC TTC TAC CG 3* (SEQ ID NO: 50) Se preparó una mezcla de reacción de PCR para cada reacción (25.0 µl de AccuPrime SuperMix II (concentración de 2X); 1.0 µl de cada iniciador (20 µM); 1 µl de molde (300 ng/µl); H20 a 50.0 µl). Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 1 ciclo a 95°C por 5 minutos; 40 ciclos con un primer paso a 95°C por 30 segundos, un segundo paso a 54°C por 30 segundos, y un tercer paso a 68°C por 3 minutos; 1 ciclo a 68°C por 7 minutos. Esta PCR se llevó a cabo en 16 cepas de L. acidophilus. Todas las cepas de L. acidophilus que se había mostrado previamente eran idénticas a NCFM® de L. acidophilus por otros medios (es decir PFGE, microdisposiciones, secuenciación 16S, etc.), generaron el amplicón de PCR del mismo tamaño. Tres cepas que se había mostrado previamente son diferentes de NCFM® (ATCC 4356, ATCC 4357, y cepa B), exhibieron amplicones de diferente tamaño. Las cepas de Lactobacillus helveticus, Lactobacillus gasseri y Lactobacillus plantarum que se pusieron a prueba, no generaron un producto de PCR. Se encontraron cuatro cepas que no generaron un producto de PCR: ATCC 521 de L. acidophilus, cepa F de L. acidophilus, cepa G de L. acidophilus y cepa H de L. acidophilus. Estas cepas se enviaron a MIDI Labs para su identificación, y se identificaron de la manera siguiente: ATCC 521 de L. acidophilus L. helveticus Cepa F de L. acidophilus Pediococcus parvulus Cepa G de L. acidophilus L. gasseri Cepa H de L. acidophilus L. plantarum Los resultados de PCR para 6 cepas se muestran en la figura 3A. Las bandas de diferente tamaño indican que hubo diferencias significativas en la región de CRISPR de algunas cepas.

EJEMPLO 3 El método de amplificación por PCR es específico para la detección de Lactobacillus acidophilus Se llevó a cabo PCR en 23 muestras de bacterias como se describió en el ejemplo 2. La amplificación por PCR de todas las cepas de L. acidophilus puestas a prueba resultó en un amplicón de PCR, mientras que las demás especies puestas a prueba no lo hicieron (véase figura 4). Las especies de todas las cepas puestas a prueba se confirmaron usando secuenciación 16S. Por lo tanto, este método es específico para acidophilus.

EJEMPLO 4 Digestión por restricción de la región intergénica Para generar patrones más discriminatorios para cada cepa, los productos de PCR de CRISPR se sometieron a digestión por restricción con tres enzimas que generaron entre 10 y 24 bandas: Alu\ - 10 bandas; Mse\ - 19 bandas; 7sp5091 - 24 bandas. AluY. Seis productos de PCR de CRISPR fueron digeridos con Alu\ y separados sobre un gel de agarosa a 2% (figura 3B). Tres cepas exhibieron una diferencia en el patrón de bandas, ATCC 4356, ATCC 4357 y cepa B. Estos resultados están de acuerdo con los resultados de otras pruebas (microdisposición, análisis de transposasa por PCR, PFGE), que indican que estas tres cepas son únicas (datos no mostrados). Mse\: Seis productos de PCR de CRISPR fueron digeridos con Mse\ y separados sobre un gel de agarosa a 3% (figura 3C). 7sp5091 : Seis productos de PCR de CRISPR fueron digeridos con 7sp5091 , y separados sobre un gel de agarosa a 3% (figura 3D).

EJEMPLO 5 La amplificación por PCR seguida de digestión enzimática, puede diferenciar cepas de L. acidophilus Se sometieron catorce cepas de L. acidophilus a amplificación del locus de CRISPR y digestión por enzimas de restricción, como se describe en los ejemplos 2 y 4. Se generaron siete patrones de bandas distintos, indicando que este método puede diferenciar entre cepas (véase figura 5).

EJEMPLO 6 Resultados de PFGE de la coincidencia de productos de PCR/digestión Se realizó PFGE en las catorce cepas de L. acidophilus discutidas en el ejemplo 5. Los resultados de PFGE confirmaron los obtenidos usando el método de PCR/digestión descrito en los ejemplos 2 a 5 (véase figura 6). Las cepas NCFM® y Lac-1 mostraron resultados de PFGE y PCR/digestión idénticos, pero difirieron de los de Lac-3 y ATCC 4356.

EJEMPLO 7 Identificación de regiones de CRISPR en otras especies de Lactobacillus Se analizaron otras especies de Lactobacillus para secuencias de CRISPR como se describió en el ejemplo 1. Se encontraron secuencias de CRISPR en L. brevis, L. casei y L. delbrueckii ssp. bulgaricus. Las secuencias de repetición se muestran en la figura 7, mostrándose nucleótidos variantes abajo de las secuencias principales. Dentro de las regiones analizadas, 32 repeticiones estuvieron presentes en L. acidophilus, 12 repeticiones estuvieron presentes en L. brevis, 21 repeticiones estuvieron presentes en . casei y 17 repeticiones estuvieron presentes en L. delbrueckii ssp. bulgaricus.

EJEMPLO 8 Tipificación de cepas de especies de Lactobacillus Se diseñan iniciadores para amplificar la región de CRISPR entera de L. delbrueckii ssp. bulgaricus. Se prepara una mezcla de reacción de PCR y se realiza PCR en diez cepas de L. delbrueckii ssp. bulgaricus, como se describió en el ejemplo 2. Los productos de PCR se someten a digestión por restricción con Alu\, Mse\ y 7sp5091 como se describe en el ejemplo 4. El ADN se separa por electroforesis en gel, y los patrones de bandas se analizan. La detección de diferentes patrones de bandas indica la presencia de diferentes cepas de L. delbrueckii ssp. bulgaricus. Conclusiones: La identificación de una región de CRISPR única en NCFM®, es un descubrimiento prometedor para el desarrollo de métodos de detección y diferenciación. De 20 cepas designadas como L. acidophilus puesto a prueba, 16 generaron un fragmento de CRISPR-PCR con los iniciadores diseñados. Las cuatro cepas para las cuales no se amplificó fragmento alguno, fueron confirmadas por MIDI Labs como mal identificadas -reforzando la posición de este locus de CRISPR como específico de L. acidophilus. Las 16 cepas restantes se sometieron a análisis de restricción del fragmento de CRISPR-PCR, revelando 12 cepas con patrones de restricción idénticos y 3 cepas con patrones únicos. Estos resultados son apoyados por datos que se han generado independientemente por medio de análisis comparativo de microdisposiciones del genoma, análisis de transposasa por PCR y PFGE. En resumen, un análisis de CRISPR-PCR/restricción relativamente rápido y fácil, generó patrones de fragmentación únicos para las cepas de L. acidophilus realmente diferentes puestas a prueba. El método puede aplicarse también en otras especies de Lactobacillus, incluyendo L. brevis, L. casei y L. delbrueckii. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la especificación, son indicativas del nivel de aptitud de los expertos en la técnica a la cual está invención pertenece. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en la presente como referencia, al mismo grado como si se indicara específicamente e individualmente que cada publicación o solicitud de patente individual se incorpora en la presente como referencia. Aunque la invención anterior se ha descrito en cierto detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será obvio que ciertos cambios y modificaciones pueden ponerse en práctica dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (22)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada del grupo que consiste de: a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 , o un complemento de la misma; b) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 , o un complemento de la misma; c) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID NOS: 2-50, o un complemento de la misma; d) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID NOS: 2-50, o un complemento de la misma; e) una molécula de ácido nucleico que comprende un fragmento de cualquiera de SEQ ID NOS: 1-50; y f) una molécula de ácido nucleico que comprende 1 a 140 repeticiones de por lo menos una de las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, o una variante de las mismas.

2.- Un método para la tipificación de una cepa bacteriana de Lactobacillus, que comprende: a) obtener una muestra; b) amplificar una región de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 75% de identidad de secuencia con por lo menos una de las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NOS: 1 -7 y 37-48 en dicha muestra, para crear ADN amplificado; y c) tipificar dicha cepa bacteriana con base en dicho ADN amplificado.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha región de ADN que será amplificada comprende SEQ ID NO: 1.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha región de ADN que será amplificada comprende por lo menos una de las secuencias de nucleótidos expuesta en SEQ ID NOS: 1-7 y 37-48.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha muestra se selecciona del grupo que consiste de un producto alimenticio, un complemento dietético, un pienso y un complemento del pienso.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha especie de Lactobacillus es L. acidophilus.

7 '.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha especie de Lactobacillus es L. brevis.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha especie de Lactobacillus es L. casei.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha especie de Lactobacillus es L. delbrueckii.

10.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho ADN amplificado se obtiene por PCR, y en donde dicha PCR se lleva a cabo usando por lo menos un iniciador que comprenda SEQ ID NO: 49 o SEQ ID NO: 50.

11.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque comprende: a) añadir a dicho ADN amplificado por lo menos una enzima de restricción que reconozca uno o más sitios en dicho ADN amplificado; b) incubar dicha enzima de restricción con dicho ADN amplificado por un tiempo suficiente para formar fragmentos de restricción; c) determinar el número de dichos fragmentos de restricción y su tamaño; y d) tipificar dicha cepa bacteriana con base en dicho número y tamaño de dichos fragmentos de restricción.

12.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque dicha enzima de restricción se selecciona del grupo que consiste de Alu\, Mse\ y Tsp5091.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque comprende: a) secuenciar dicho ADN amplificado para obtener resultados de secuenciación; y b) tipificar dicha cepa bacteriana con base en dichos resultados de secuenciación.

14.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho ADN amplificado se obtiene: a) proveyendo un primer iniciador que se une a cualquiera de SEQ ID NOS: 2-7 y 37-48; b) proveer un segundo iniciador que se une a ADN corriente abajo o corriente arriba de cualquiera de SEQ ID NOS: 2-7 y 37-48; y c) usar dichos primer y segundo iniciadores en una reacción de PCR para crear dicho ADN amplificado. 15.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho ADN amplificado se obtiene: a) proveyendo un primer iniciador que se une a una región corriente arriba de cualquiera de SEQ ID NOS: 2-7 y 37-48; b) proveer un segundo iniciador que se une a una región corriente abajo de cualquiera de SEQ ID NOS: 2-7 y 37-48; y c) usar dichos primer y segundo iniciadores en una reacción de PCR para crear dicho ADN amplificado. 16.- Un iniciador de reacción de cadena de polimerasa, cuya secuencia de nucleótidos comprende SEQ ID NO: 49, o una variante de la misma. 17.- Un iniciador de reacción de cadena de polimerasa, cuya secuencia de nucleótidos comprende SEQ ID NO: 50, o una variante de la misma. 18.- Un equipo para la detección de la presencia de una especie de Lactobacillus en una muestra, que comprende los iniciadores de la reacción en cadena de polimerasa de las reivindicaciones 16 y 17, e instrucciones para su uso. 19.- Un equipo para la tipificación de una cepa de Lactobacillus en una muestra, que comprende los iniciadores de la reacción en cadena de polimerasa de las reivindicaciones 16 y 17 para su uso en la creación de ADN amplificado, por lo menos una enzima de restricción que reconozca uno o más sitios en dicho ADN amplificado, e instrucciones para su uso. 20.- Un método para la detección de la presencia de una especie de Lactobacillus en una muestra, que comprende: a) obtener una muestra; b) amplificar una región de ADN que comprenda por lo menos una de SEQ ID NOS: 1-48, o una variante de la misma, para crear ADN amplificado; y c) detectar dicho ADN amplificado. 21.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque dicha amplificación se lleva a cabo usando por lo menos un iniciador que comprenda SEQ ID NO: 49 o SEQ ID NO: 50, o una variante del mismo. 22.- Un método para la tipificación de una bacteria que tiene una región de CRISPR, que comprende: a) obtener una muestra que comprenda dicha bacteria; b) amplificar una región de ADN que comprenda dicha región de CRISPR o un fragmento de la misma en dicha muestra para crear ADN amplificado; c) añadir a dicho ADN amplificado por lo menos una enzima de restricción que reconozca uno o más sitios en dicho ADN amplificado; d) incubar dicha enzima de restricción con dicho ADN amplificado por un tiempo suficiente para formar fragmentos de restricción; e) determinar el número de dichos fragmentos de restricción y su tamaño; y f) tipificar dicha bacteria con

base en dicho número y tamaño de dichos fragmentos de restricción.