CN103196890B

CN103196890B - 基于表面增强散射拉曼光谱饲料中三聚氰胺的速测方法

Info

Publication number: CN103196890B
Application number: CN201310146553.3A
Authority: CN
Inventors: 程劼; 王石; 苏晓鸥
Original assignee: Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology for Agro Products of CAAS
Current assignee: Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology for Agro Products of CAAS
Priority date: 2013-04-24
Filing date: 2013-04-24
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2033-04-24
Also published as: CN103196890A

Abstract

本发明公开了一种基于表面增强散射拉曼光谱饲料中三聚氰胺的速测方法，首先采用正丁醇或乙酸乙酯为提取溶剂，并采用酸性水溶液和有机溶剂作为净化萃取溶剂对提取液进行液液萃取净化；然后向纳米金胶体溶液或者纳米银胶体溶液中加入净化后的待测液和含有Cl^-的盐水溶液，混合液为最后上机检测液；用785nm激光源拉曼光谱对检测试剂进行光谱扫描，以707±4cm^-1为三聚氰胺的定性特征峰位移；以731±4cm^-1对应峰强进行归一化，以707±4cm^-1对应峰强度进行三聚氰胺含量计算。实现了饲料中三聚氰胺的现场、快速检测。

Description

基于表面增强散射拉曼光谱饲料中三聚氰胺的速测方法

技术领域

本发明涉及一种饲料中三聚氰胺的检测方法，尤其涉及一种基于表面增强散射拉曼光谱饲料中三聚氰胺的速测方法。

背景技术

三聚氰胺(Melamine)简称三胺，学名三氨三嗪，俗称蜜胺，蛋白精，是一种重要的氮杂环有机化工原料，主要用于生产三聚氰胺—甲醛树脂，用于木材加工、塑料等行业，因为每个三聚氰胺分子中含有6个氮原子，在原有的粗蛋白含量的凯氏定氮法中，是通过氮的含量来确定蛋白质的含量，这就给不法分子带来了可乘之机，通过添加含氮量高的廉价工业原料来提高其氮的含量，造成蛋白含量虚假增高。2007年3月，美国发生多起猫、狗宠物中毒死亡事件。美国食品药品管理局调查发现初步认为宠物食品中含有的三聚氰胺是导致猫、狗中毒死亡的原因。近期，三聚氰胺毒奶粉事件“卷土重来”，严重威胁到老百姓的生命安全。饲料安全作为食品安全的源头，直接关系到人民群众身体健康，是人民切身利益所在，提高饲料检测技术水平，研发出快速便捷的分析测试技术，对保障食品安全具有重要意义。

SERRS（Surface-enhanced Resonant Raman Spectroscopy,表面增强散射拉曼光谱）具有分析速度快，灵敏度高，检测成本低等特点，它能检测到吸附在贵金属表面的小分子化合物，给出丰富的结构信息。SERRS在小分子化合物如三聚氰胺、孔雀石绿方面检测的研究已有相关报道，然而，检测方法基本上是针对食品，如牛奶，谷物，加工食品，但对基质复杂、种类繁多的饲料样品，未见相关报道。

在现有技术中，饲料中三聚氰胺的检测方法主要有酶联免疫(ELISA)、液相色谱(HPLC)、气质联用(GC-MS)、近红外(NIR)等方法。目前应用较多的是中国农业部发布的农业行业标准-饲料中三聚氰胺的测定（NY/T1372-2007），该标准方法利用HPLC法和GC-MS法，并以GC-MS法作为确证法，这两种方法分析时间长，前处理繁琐，GC-MS更需要衍生化操作，不适合现场快速检测；现有的ELISA快速筛选法虽然较为简便，但该法受环境条件的限制，常常出现“假阳性”情况，给检测工作带来不便；利用近红外进行三聚氰胺检测受近红外方法本身限制，不能满足ppm级的监管要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种能实现现场、快速检测的基于表面增强散射拉曼光谱饲料中三聚氰胺的速测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的基于表面增强散射拉曼光谱饲料中三聚氰胺的速测方法，包括步骤：

A、样品前处理：

采用正丁醇或乙酸乙酯为提取溶剂，获得待测饲料样品的提取液，所述待测饲料样品与提取溶剂的比按1g待测饲料样品加入5mL提取溶剂计；

采用酸性水溶液和有机溶剂作为净化萃取溶剂对所述提取液进行液液萃取净化，获得待测液，所述有机溶剂为乙酸乙酯：正丁醇体积比=6:1的混合液或乙酸乙酯；

B、制备检测试剂：

向纳米金胶体溶液或者纳米银胶体溶液中加入前处理后的待测液，并加入含有Cl^-的盐水溶液，涡旋混合均匀后，混合液为最后的上机检测液；

C、定性检测：

用激光能量为200mw/785nm激光源拉曼光谱对所述检测试剂进行光谱扫描，以707±4cm^-1为三聚氰胺的拉曼特征吸收位移；

D、定量检测：

以731±4cm^-1对应峰强进行归一化，以707±4cm^-1对应峰强度进行三聚氰胺含量计算。

由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明实施例提供的基于表面增强散射拉曼光谱饲料中三聚氰胺的速测方法，采用正丁醇或乙酸乙酯为提取溶剂,从待测饲料样品中提取三聚氰胺提取液，并采用酸性水溶液和有机溶剂作为净化萃取溶剂对所述提取液进行液液萃取，利用纳米粒子的对小分子化合物的增强作用，结合SERRS高灵敏度、快速分析的特点，实现了饲料中三聚氰胺的现场、快速检测。

附图说明

图1为本发明实施例中饲料基质中三聚氰胺(浓度为5μg.g^-1)特征拉曼光谱图；

图2为本发明实施例中特征吸收峰(707cm^-1）强度随饲料中三聚氰胺赋值浓度变化趋势图；

图3为本发明实施例中饲料基质中添加三聚氰胺浓度与特征吸收峰（707±4cm^-1）强度线性关系示意图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例作进一步地详细描述。

本发明的基于表面增强散射拉曼光谱饲料中三聚氰胺的速测方法，其较佳的具体实施方式是：

包括步骤：

A、样品前处理：

B、制备检测试剂：

C、定性检测：

D、定量检测：

所述步骤A包括以下任一种方法：

方法一：称取1.0g饲料，加入5mL正丁醇，涡旋震荡提取30s，12500rpm离心1min，移取上清液3mL，加入3mL PH=3-4的HCl水溶液，涡旋离心，移取下层液500uL，加入10μL1M浓度的NaOH溶液和500μL乙酸乙酯：正丁醇体积比=6:1的混合液，涡旋离心，移取上层液加入500μL pH=3-4的HCl水溶液，涡旋离心，下层液为待测液；

方法二：称取1.0g饲料，加入5mL乙酸乙酯，涡旋震荡提取30s，12500rpm离心，移取上清液3mL，加入3mLpH=3-4的HCl水溶液，涡旋离心，移取下层液500μL，加入10μL1M浓度的NaOH溶液和500μL乙酸乙酯，涡旋离心，移取上层液加入500μL pH=3-4的HCl水溶液，涡旋离心，下层液为待测液。

所述步骤B中，应用合成纳米粒子的方法合成纳米金胶体溶液或者纳米银胶体溶液，所述纳米金的粒径为50-60nm，取所述胶体溶液300-600μL，加入前处理后的待测液30-50μL，再加入1%NaCl溶液或0.05%CaCl₂溶液50-100μL，涡旋混合均匀后，混合液为最后的上机检测液。

所述步骤C中，光谱扫描时间10s，扫描次数2，平滑参数1。

所述步骤D中，以731cm^-1±4cm^-1对应峰强度为100单位，进行谱图归一化，通过数据处理使光谱图基线平滑，以707±4cm^-1对应峰强度进行三聚氰胺含量计算。

本发明采用正丁醇或乙酸乙酯为提取溶剂，待测饲料样品与提取溶剂的比按1g待测饲料样品加入5mL提取溶剂计；并采用酸性水溶液和有机溶剂作为净化萃取溶剂对提取液进行液液萃取，利用纳米粒子的对小分子化合物的增强作用，结合SERRS高灵敏度、快速分析的特点，实现了饲料中三聚氰胺的现场、快速检测。

本发明的基于表面增强散射拉曼光谱饲料中三聚氰胺的速测方法，样品前处理步骤简单（对于饲料这一类复杂的基质样品，仅需简单的液液萃取操作），每个样品检测时间少于5min；灵敏度完全能满足目前监管的需要（仪器检测限0.2μg.g^-1，方法检测限2μg.g^-1）；方法回收率高（85%以上）；线性良好（R²=0.991）；重复性良好（RSD≤8%），实现对饲料中三聚氰胺的现场快速检测。

具体实施例，包括步骤：

（1）样品前处理：

方法一：准确称取1.0g饲料，加入5mL正丁醇，涡旋提取30s，12500rpm离心1min，移取上清液3mL,加入3mL PH=3-4的HCl水溶液，涡旋离心，移取下层液500uL，加入10μL1M浓度的NaOH溶液，500μL乙酸乙酯：正丁醇混合液（V/V=6:1），涡旋离心，移取上层液加入500μL pH=3-4HCl水溶液，涡旋离心，下层液为待测液。

方法二：准确称取1.0g饲料，加入5mL乙酸乙酯，涡旋震荡提取30s，12500rpm离心，移取上清液3mL,加入3mLpH=3-4的HCl水溶液，涡旋离心，移取下层液500μL，加入10μL1M浓度的NaOH溶液，500μL乙酸乙酯，涡旋离心，移取上层液加入500μL pH=3-4的HCl水溶液，涡旋离心，下层液为待测液。

（2）检测试剂：

应用目前公开的合成纳米粒子的方法合成纳米金胶体溶液或者纳米银胶体溶液（如纳米金粒径为50-60nm），取纳米胶体溶液300-600μL，加入待测液30-50μL，加入含有Cl^-的盐水溶液(如1%NaCl溶液，0.05%CaCl₂溶液)50-100μL，涡旋混合均匀后，混合液为最后上机液。

（3）定性检测：

785nm激光源拉曼光谱，激光能量200mw，光谱扫描时间10s，扫描次数2，平滑参数1。以707±4cm^-1为三聚氰胺特征位移（如图1）为判定特征峰。

（4）定量检测：

以731cm^-1±4cm^-1对应峰强度为100单位，进行谱图归一化，通过数据处理使光谱图基线平滑。从图2可以看出，707cm^-1处的峰强度随着饲料基质中三聚氰胺赋值浓度的增大呈现有规律的增加。以707±4cm^-1对应峰强度结合线性曲线（见图3）进行三聚氰胺含量计算。

本发明技术方案带来的有益效果：

（1）饲料基质复杂，按照目前现有的标准方法样品前处理步骤繁琐，通常需要通过固相萃取柱进行净化处理，本发明通过简单的液液萃取进行净化，效果好，回收率高（回收率85%以上），选取PH=3-4HCl水溶液和乙酸乙酯：正丁醇混合液（V/V=6:1）或乙酸乙酯作为三聚氰胺的萃取溶剂，通过三聚氰胺在不同离子环境下的存在形式不同的原理（pH＞Pka时，三聚氰胺呈分子状态；PH＜PKa时，三聚氰胺呈离子状态），在样品前处理阶段实现快速净化。

（2）饲料基质复杂，在三聚氰胺特征吸收位移707±4cm^-1附近处常有干扰，特征吸收峰常常被掩盖。本发明在选择特异性提取溶剂与萃取溶剂的情况下，在分辨率不高（如8cm^-1）的拉曼光谱仪上实现707cm^-1与731cm^-1处峰的部分分离，实现对三聚氰胺实现定性定量分析。

（3）选取731cm^-1作为归一化峰的目的在于731cm^-1处的吸收位移通常为基质中存在蛋白的-NH₂吸收，基本上可以认定为本地吸收，以此作为归一化峰有利于定量分析。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims

1.一种基于表面增强散射拉曼光谱饲料中三聚氰胺的速测方法，其特征在于，包括步骤：

A、样品前处理：

采用酸性水溶液和有机溶剂作为净化萃取溶剂对所述提取液进行液液萃取净化，获得待测液，所述有机溶剂为乙酸乙酯：正丁醇体积比＝6:1的混合液或乙酸乙酯；

B、制备检测试剂：

C、定性检测：

D、定量检测：

以731±4cm^-1对应峰强进行归一化，以707±4cm^-1对应峰强度进行三聚氰胺含量计算；

所述步骤A包括以下任一种方法：

方法一：称取1.0g饲料，加入5mL正丁醇，涡旋震荡提取30s，12500rpm离心1min，移取上清液3mL，加入3mL PH＝3-4的HCl水溶液，涡旋离心，移取下层液500uL，加入10μL1M浓度的NaOH溶液和500μL乙酸乙酯:正丁醇体积比＝6:1的混合液，涡旋离心，移取上层液加入500μL pH＝3-4的HCl水溶液，涡旋离心，下层液为待测液；

方法二：称取1.0g饲料，加入5mL乙酸乙酯，涡旋震荡提取30s，12500rpm离心，移取上清液3mL，加入3mLpH＝3-4的HCl水溶液，涡旋离心，移取下层液500μL，加入10μL 1M浓度的NaOH溶液和500μL乙酸乙酯，涡旋离心，移取上层液加入500μL pH＝3-4的HCl水溶液，涡旋离心，下层液为待测液；

所述步骤B中，应用合成纳米粒子的方法合成纳米金胶体溶液或者纳米银胶体溶液，所述纳米金的粒径为50-60nm，取所述胶体溶液300-600μL，加入前处理后的待测液30-50μL，再加入1％NaCl溶液或0.05％CaCl₂溶液50-100μL，涡旋混合均匀后，混合液为最后的上机检测液。

2.根据权利要求1所述的基于表面增强散射拉曼光谱饲料中三聚氰胺的速测方法，其特征在于，所述步骤C中，光谱扫描时间10s，扫描次数2，平滑参数1。

3.根据权利要求2所述的基于表面增强散射拉曼光谱饲料中三聚氰胺的速测方法，其特征在于，所述步骤D中，以731cm^-1±4cm^-1对应峰强度为100单位，进行谱图归一化，通过数据处理使光谱图基线平滑，以707±4cm^-1对应峰强度进行三聚氰胺含量计算。