CN104964959A - 用于豆制品和饮料中碱性嫩黄o快速检测的拉曼光谱法及试剂配方与使用方法 - Google Patents

Abstract

一种用于豆制品和饮料中碱性嫩黄O快速检测的拉曼光谱法及试剂配方与使用方法，其特征在于，采用银胶体水溶液A作为表面增强试剂和含一定浓度Cl^-的水溶液B为辅助试剂以增强碱性嫩黄O的拉曼光谱信号，以波数780cm^-1附近的特征拉曼光谱信号进行碱性嫩黄O测试。针对豆制品(豆排卷、豆皮和腐竹)试样以85％～90％的乙腈水溶液为提取试剂进行提取，用含有饱和乙腈的正己烷溶液进行除脂处理；针对饮料试样，经离心后直接测试。本发明方法可进行食品试样中碱性嫩黄O的定性检测初筛；也可采用外标法根据碱性嫩黄O拉曼光谱信号强度与其含量的线性关系，对食品试样中碱性嫩黄O进行定量检测，操作简便，快速，试剂、耗材成本低廉，易于普及推广。

Description

用于豆制品和饮料中碱性嫩黄O快速检测的拉曼光谱法及试剂配方与使用方法

技术领域

本发明涉及一种色素类违禁添加物的快速检测技术，尤其涉及豆制品和饮料中碱性嫩黄O现场快速检测的拉曼光谱法、试剂配方及使用方法。

背景技术

食品安全问题已成为全球关注的焦点，食品安全事件波及面广，造成的社会影响和经济损失巨大，也对人类生活环境乃至健康安全构成越来越严重的威胁。苏丹红事件、吊白块事件以及红心鸭蛋风波，引起了国内外的广泛关注。一次次的食品安全问题和危机检验着食品监管部门的能力，如何保障食品安全成为全社会共同关注的问题。

碱性嫩黄O碱性嫩黄O，，别名盐基淡黄O、盐基槐黄、碱性荧光黄GR等，英文名称为Basic flavine O，是一种芳香胺类碱性工业染料，可用于蚕丝、腈纶、皮革、纸、麻的染色，但严禁作为食品添加剂。毒理学资料表明碱性嫩黄O对皮肤黏膜有轻度刺激，可引起结膜炎、皮炎和上呼吸道刺激症状，人接触或者吸入碱性嫩黄O都会引起中毒，长期接触会致癌。因此中国卫生部将其列在《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单(第一批)至(第五批)》中，禁止在食品中使用。但在食品中非法添加非食用色素的现象在市场上已经层出不穷，如碱性橙、碱性嫩黄O等，这些为工业用途的化工产品，属于食品中的禁用添加物质，却被多次检测出来。目前，食品中碱性橙的测定尚无国家标准方法，国内有一些相关的文献报道检测碱性嫩黄O的方法主要有，高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法。质谱法虽然灵敏度高，但是，其前处理步骤复杂，仪器设备的投入比较大，难于普及推广，且前处理操作复杂，时间冗长，有机溶剂污染环境。

对于常见的快速检测技术，往往缺乏配套的样品前处理技术，导致基质干扰严重，检测结果不准确，不能对违禁非法添加样品进行准确、可靠的检测与控制。

发明内容

本发明的目的是提供一种豆制品和饮料中非法添加物碱性嫩黄O的快速检测方法，采用提取萃取处理技术和表面增强拉曼光谱法对食品中是否添加了碱性嫩黄O进行快速检测，成本低廉，可现场应用。

为适应上述需求，本发明提供简单的食品(如豆制品、饮料)前处理方法，提供检测试剂配方及其制备方法，提供碱性嫩黄O现场快速的定性和定量分析方法。其步骤如下：

1.提取

用85％～90％的乙腈水溶液作为试样提取试剂。准确称取豆制品(豆皮、腐竹、豆排卷)试样1.0g，加入4ml提取剂与试样混匀，于室温、8000～10000rpm下离心2～5分钟，吸取离心后的上层溶液，加入2ml提取剂，涡旋1～3分钟，以8000～10000rpm离心1～3分钟，弃去上层溶液，下层含待测物溶液，将乙腈的提取剂溶液用一次蒸馏水或去离子水按3∶1的质量比稀释，过0.22μm滤膜过滤，待测；取饮料(功能性饮料和碳酸性饮料)称取10mL、混匀、离心，在8000rpm下离心3min，过0.22滤膜待测。滤液加入至预先加好一定量试剂A和B的检测池中。

2.提取试剂配方及使用方法

豆制品(豆皮、腐竹、豆排卷)：提取剂4mL(乙腈的3.5ml，一次蒸馏水或去离子水0.5ml)；萃取剂：含有饱和乙腈的正己烷溶液。

3.检测

将滤液加入至预先加好一定量试剂A和B的检测池中，涡旋或摇振均匀，置检测池于便拉曼光谱仪检测室中在200～2500cm^-1的范围内进行拉曼光谱扫描得到拉曼光谱图，拉曼谱图中如在780cm^-1(波数误差＜15cm^-1)处有特征峰，则判断样品添加了碱性嫩黄O，反之则判定样品没有添加碱性嫩黄O。本发明的拉曼光谱法，所述水为二次蒸馏水或去离子水。

4.试剂A为银胶体水溶液，按照公知的方法制备即可；试剂B为可使A凝聚的含Cl^-1的电介质，Cl^-1浓度范围为0.1M～0.65M，优选为0.1M；pH为1-9，优选为7。

所述试剂的用量如下：

(1)试剂A：100-300μL，优选为100μL；

(2)试剂B：100-300μL，优选为100μL。

(3)试样滤液的加样量：100-500μL，豆制品优选为100μL、饮料优选为400μL。

5.本发明所述拉曼光谱仪的激光光源发射波长为785nm，是手持式、便携式或台式仪器。目前，中国检验检疫科学研究院、中检国研(北京)科技有限公司、必达泰克公司可提供满足测试要求的便携式拉曼光谱仪。

利用本发明时，后期的数据采集及结果分析步骤如下：

(1)用便携式拉曼光谱仪进行检测，激光能量参数选择300mw，积分参数选择3次，这两个参数调节最佳拉曼峰强度，连续扫描拉曼光谱3次，最后得3次扫描光谱的平均光谱。每一个光谱的扫描范围是200-2500cm^-1，完成一个光谱扫描时间是1min。

(2)用具有背景扣除功能的数据处理软件进行数据处理，获得基线平坦的拉曼图谱，由于波数在200-300cm^-1与2100-2500cm^-1之间谱图无明显特征峰且谱图之间差别很小，所以选择300-2100cm^-1之间作为本实验的考察范围。

(3)对比阴性豆制品和饮料样品、阳性豆制品和饮料样品拉平基线后的拉曼光谱图，如780cm^-1(波数误差＜15cm^-1)处出现了明显的拉曼峰，且信噪比≥3，则初步判断为添加了碱性嫩黄O的阳性样品，如780cm^-1(波数误差＜15cm^-1)处没有明显的峰，则初步判断为没有添加碱性嫩黄O的阴性样品。因此，780cm^-1(波数误差＜15cm^-1)处的特征峰是检测食品中是否添加了碱性嫩黄O的重要依据，通过该特征峰可以对豆制品和饮料样品碱性嫩黄O进行初筛分析。

(4)定量分析：根据780cm^-1(波数误差＜15cm^-1)特征频率处碱性嫩黄O所对应的相对信号强度与其浓度的线性关系做标准曲线，用该标准曲线可对豆制品、饮料中碱性嫩黄O进行定量分析。

本发明的表面增强拉曼光谱法，样品前处理简单，无需过柱净化过程，直接采用振荡提取，然后将萃取净化，实验耗材成本低廉，进行食品定性和定量分析，通过拉曼谱图780cm^-1(波数误差＜15cm^-1)是否有碱性嫩黄O特征峰，判断豆制品和饮料中是否添加碱性嫩黄O。其豆制品检出限线性范围和回收率见表1，饮料检出限线性范围和回收率见表2。该方法操作简便快速，线性关系良好，分析结果直观可视，如使用便携式拉曼检测仪则可实现现场快速检测，可对食品中是否添加了碱性嫩黄O进行现场快速的定量和定性检测。

表1.饮料中碱性嫩黄O测定结果

样品	碱性嫩黄检出限(μg/L)	线性范围(μg/L)	回收率
				功能性饮料	5	5-60	102.7％(25μg/L)
碳酸饮料	2.5	2.5-20	97.9％(6μg/L)

表2.豆制品中碱性嫩黄O测定结果

样品	碱性嫩黄检出限(mg/kg)	线性范围(mg/kg)	回收率
				豆皮	0.3	0.3-1	102.0％(8mg/kg)
腐竹	0.1	0.1-1	93.3％(0.3mg/kg)
				豆排卷	0.1	0.1-0.9	96.0％(0.6mg/kg)

附图说明

图1是碱性嫩黄O标准品水溶液的表面增强拉曼光谱图；

图2代表性饮料(碳酸饮料)阳性样品和阴性样品的表面增强拉曼光谱图(A.碳酸饮料阳性样品；B.碳酸饮料阴性样品)；

图3代表性饮料(功能性饮料)添加碱性嫩黄O的标准曲线图

图4代表性饮料(功能性饮料)阳性样品和阴性样品的表面增强拉曼光谱图(A.功能性饮料阳性样品；B.功能性饮料阴性样品)；

图5代表性饮料(功能性饮料)添加碱性嫩黄O百草枯的标准曲线图

图6代表性豆制品(豆皮)阳性样品和阴性样品的表面增强拉曼光谱图(A.豆皮阳性样品；B.豆皮阴性样品)；

图7代表性豆制品(豆皮)添加碱性嫩黄O的标准曲线图

图8代表性豆制品(腐竹)阳性样品和阴性样品的表面增强拉曼光谱图(A.腐竹阳性样品；B.腐竹阴性样品)；

图9代表豆制品(腐竹)添加碱性嫩黄O的标准曲线图

图10代表性豆制品(豆排卷)阳性样品和阴性样品的表面增强拉曼光谱图(A.腐竹阳性样品；B.腐竹阴性样品)；

图11代表豆制品(豆排卷)添加碱性嫩黄O的标准曲线图

具体实施方式

实施例1一种用于饮料中碱性嫩黄O现场快速检测的拉曼光谱法，包括以下具体的步骤：

样品制备：

称取饮料(功能性饮料和碳酸性饮料)称取10mL、混匀、离心，在室温下8000rpm下离心3min，过0.22滤膜待测。

2.取样：

1)取100μL试剂A加入到检测池中；

2)取0.1M的NaCl水溶液100μL(PH＝7)加入到预先加好试剂A的检测池中；

3)取滤液400μL加入到预先加好试剂A和NaCl的检测池中，待测。

3.检测

1)采用由中国检验检疫科学研究院研制的便携式拉曼光谱仪进行检测，激光光源发射波长为785nm，激光能量参数选择300mw，积分参数选择5次，这两个参数调节最佳拉曼峰强度，连续扫描拉曼光谱3次，最后得5次扫描光谱的平均光谱。每一个光谱的扫描范围是200-2500cm^-1，完成一个光谱扫描时间是2min。

2)用具有背景扣除功能的数据处理软件进行数据处理，获得基线平坦的拉曼图谱，选择300-2100cm^-1之间作为本实验的考察范围。

3)初筛分析，由拉曼谱图可看出780cm^-1(波数误差＜15cm^-1)处没有明显的峰，则初步判断该样品为没有添加碱性嫩黄O的饮料。

实施例2一种用于豆制品中碱性嫩黄O现场快速检测的拉曼光谱法，包括以下具体的步骤：

1.样品制备：准确称取取豆制品(豆皮、腐竹、豆排卷)1g。

2.提取：

1)将称取好的豆制品试样转移到10mL离心管中，加入4mL(乙腈的3.5mL，一次蒸馏水或去离子水0.5mL)溶液进行提取；

2)涡旋或摇振1～3min匀质后，于室温、8000～10000rpm下离心2-5分钟，取上清液于10mL离心管中。

3.萃取：

加入2ml萃取剂(正己烷)溶液，涡旋1～3分钟后，以8000～10000rpm离心1-3分钟，弃去上层正己烷，得到乙腈和水提取剂溶液。将乙腈的提取剂溶液用一次蒸馏水或去离子水按3∶1的质量比稀释，过0.22μm滤膜过滤，待测；

4.取样：

1)取100μL试剂A加入到检测池中；

2)取0.1M的NaCl水溶液100μL(PH＝7)加入到预先加好试剂A的检测池中；

3)取滤液100μL加入到预先加好试剂A和NaCl的检测池中，待测。

4.检测

1)采用由中国检验检疫科学研究院研制的便携式拉曼光谱仪进行检测，激光能量参数选择300mw，积分参数选择5次，这两个参数调节最佳拉曼峰强度，连续扫描拉曼光谱3次，最后得5次扫描光谱的平均光谱。每一个光谱的扫描范围是200-2500cm^-1，完成一个光谱扫描时间是2min。

2)用具有背景扣除功能的数据处理软件进行数据处理，获得基线平坦的拉曼图谱，选择300-2100cm^-1之间作为本实验的考察范围。

3)初筛分析，由拉曼谱图可看出780cm^-1(波数误差＜15cm^-1)处没有明显的峰，则初步判断该样品为没有添加碱性嫩黄O的豆制品。

Claims (6)

1.一种用于豆制品和饮料中碱性嫩黄O快速检测的表面增强拉曼光谱法，其特征在于，吸取经前处理后的试样提取液或试样，置于预先加好一定量表面增强试剂A和辅助试剂B的检测池，涡旋或摇振均匀，用拉曼光谱仪于200～2500cm^-1范围内进行拉曼光谱扫描，以波数780cm^-1附近的拉曼光谱峰为碱性嫩黄O的特征拉曼光谱信号，采用外标法，根据碱性嫩黄O的拉曼光谱信号强度与碱性嫩黄O含量的线性关系，对试样中碱性嫩黄O进行现场快速的定量和定性检测。

2.根据权利要求1所述的豆制品和饮料中碱性嫩黄O快速检测的表面增强拉曼光谱法，其特征在于，包括如下操作步骤：

(1)试样前处理：

a.豆制品试样：准确称取豆制品(豆皮、腐竹、豆排卷)试样1g，加入4ml提取试剂，混合、于室温、8000～10000rpm下离心2～5min，吸取离心后的上层溶液，加入含有饱和乙腈的正己烷溶液2ml，涡旋1～3min，以8000～10000rpm离心1～3min，弃去上层正己烷溶液，用一次蒸馏水或去离子水将下层乙腈水溶液按3∶1的质量比稀释，过0.22μm滤膜过滤，待测；

b.饮料试样：准确称取一定量的饮料试样(碳酸饮料和功能性饮料等)离心，于室温、8000～10000rpm下离心3～5min，吸取离心后的匀质上清液，过0.22滤膜过滤，待测。

(2)检测：

a.小心吸取待测试液至预先加好一定量表面增强试剂A和辅助试剂B的检测池中，涡旋或摇振均匀，进行拉曼光谱扫描检测；

b.采用外标法并选用780cm^-1附近最高拉曼光谱峰所对应的波数为碱性嫩黄O检测的特征波数，根据碱性嫩黄O的拉曼光谱信号强度与碱性嫩黄O含量的线性关系，进行试样中碱性嫩黄O的快速定量和定性检测。

3.根据权利要求1所述的豆制品和饮料中碱性嫩黄O快速检测的表面增强拉曼光谱法，其特征在于，包括如下的试剂配方和使用方法：

用85％～90％的乙腈水溶液作为试样提取试剂，表面增强试剂A为银胶体水溶液(按照公知的方法制备即可)，辅助试剂B为可使A凝聚的含C1^-1的电介质；所述的电介质，其特征在于：Cl^-1的浓度范围为0.05M～0.25M，优选为0.1M；pH为1-9，优选为7；所述表面增强试剂A、辅助试剂B和待测试液的用量如下：

(1)试剂A：80-300μL，优选为100μL；

(2)试剂B：80-300μL，优选为100μL；

(3)待测试液用量为50-500μL。

4.根据权利要求1所述的豆制品和饮料中碱性嫩黄O快速检测的表面增强拉曼光谱法，其特征在于，所使用的拉曼光谱检测仪可以是手持式、便携式或台式仪器，应具备发射波长为785nm的激光光源，其波数误差＜15cm^-1，目前中国检验检疫科学研究院、中检国研(北京)科技有限公司、必达泰克公司等单位可提供满足测试要求的便携式拉曼光谱仪。

5.根据权利要求1所述的豆制品和饮料中碱性嫩黄O快速检测的表面增强拉曼光谱法，其特征在于，其操作步骤包括：

(1)取样：取80-300μL表面增强试剂A于检测池中，加入80-300μL辅助试剂B，小心吸取离心后的匀质试液100、200μL或400uL于检测池中；

(2)仪器参数设置：优选激光能量参数和积分时间参数得拉曼光谱仪最佳的拉曼峰强度，优选连续扫描光谱次数，得最佳平均的扫描光谱；

(3)扫描：用拉曼光谱检测仪在200～2500cm^-1的范围内扫描测试样品。

6.根据权利要求1所述的豆制品和饮料中碱性嫩黄O快速检测的表面增强拉曼光谱法，其数据采集及结果分析步骤包括：

(1)选定某一特征波数下的拉曼信号峰所对应的强度为内标基准，进行谱图归一化；

(2)用具有背景扣除功能的数据处理软件进行数据处理，获得基线平坦的拉曼图谱；

(3)定性分析：采集食品试样的拉曼光谱图，如碱性嫩黄O对应的特征峰780cm^-1处出现了明显的拉曼峰，且信噪比≥3，则初步判断为添加了碱性嫩黄O的阳性样品，如特征波数780cm^-1没有明显的峰，则初步判断为没有添加碱性嫩黄O的阴性样品；

(4)定量分析：根据特征波数780cm^-1特征波数处碱性嫩黄O所对应的相对信号强度与其浓度的线性关系做标准曲线，用该标准曲线可对食品中碱性嫩黄O进行定量分析。