CN112285089B - 表面增强拉曼散射基底引入内标分子的方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了表面增强拉曼散射基底引入内标分子的方法及其制备的基底和应用，所述方法包括以下步骤：提供表面增强拉曼散射基底，滴加内标分子溶液在基底上，利用惰性气体吹干基底，获得内标分子标记的表面增强拉曼散射基底。本申请的方法操作简单，普适性强。本申请的方法制备的表面增强拉曼散射基底能够检测水体中孔雀石绿，具有很好的应用潜力。

Description

表面增强拉曼散射基底引入内标分子的方法

技术领域

本申请涉及表面增强拉曼散射基底制备领域，特别是涉及表面拉曼增强拉曼散射基底引入内标分子的方法及其制备的基底和应用。

背景技术

表面增强拉曼散射(SERS)因其独特的分子指纹和无损检测能力已经成为一种广泛应用的分析技术，但是，由于SERS信号的再现性普遍不理想，制约了其在定量分析领域的应用。

采用内标法是提高SERS定量分析结果准确度的有效方法之一，常用的内标法主要有3种方式：(1)合成核壳结构的纳米粒子，将内标分子嵌入到核与壳之间；(2)构建具有拉曼信号的SERS基底；(3)将分析物与其同位素混合，以同位素的信号为内标信号。这些内标法都能克服测量条件和微环境等各种干扰的影响，实现SERS精确定量。但是，这些方法较为繁琐，普适性不强，不能大面积推广，而且监管过程往往需要精密仪器。

发明内容

本申请针对表面增强拉曼散射基底引入内标分子的操作繁琐，普适性不强等问题，提供了一种表面增强拉曼散射基底引入内标分子的方法。

表面增强拉曼散射基底引入内标分子的方法，包括以下步骤：提供表面增强拉曼散射基底，滴加内标分子溶液在基底上，利用惰性气体吹干基底表面，获得内标分子标记的表面增强拉曼散射基底。

可选的，所述表面增强拉曼散射基底的载体为硅片或氧化铝，金属纳米粒子附着在载体表面，金属纳米粒子可以是金、银或铜。

所述滴加是通过移液枪等工具滴加在具有载体金属纳米粒子所在的区域。

可选的，所述基底为Au NBPs coffee ring SERS基底、Au NPs/Si SERS芯片或AuNPs/Al₂O₃ SERS芯片。

其中，Au NBPs coffee ring SERS基底的制备方法：(1)0.5μL-1.0μL Au NBPs(1.0x 10^-9-1.0x 10^-8M)滴加于洁净干燥的硅片表面；(2)氮气吹干处理后，即可得到AuNBPs coffee ring SERS基底。

Au NPs/Si SERS芯片：来源于蔚海光学仪器(上海)有限公司。

Au NPs/Al₂O₃ SERS芯片：来源于深圳拓扑科技。

提供不同的基底验证引入内标分子的方法的普适性，其验证步骤如下：

(1)将4-巯基苯甲酸分别滴加到三种不同的表面增强拉曼散射基底上；

(2)经氮气吹干处理后，得到4-巯基苯甲酸标记的表面增强拉曼散射基底；

(3)将罗丹明6G分别滴加到4-巯基苯甲酸标记的基底以及在未标记的基底；

(4)经氮气吹干处理后，使用共聚焦显微拉曼仪进行检测。

可选的，所述内标分子溶液的溶剂为水。

可选的，所述内标分子带有巯基基团，且其Zeta电势与待测分子的相反。巯基基团具有吸附性，能够增强待测分子在金纳米基底上的吸附能力，从而提高拉曼信号强度。

Zeta电势指剪切面的电位，是表征胶体分散系稳定性的重要指标，其正负代表粒子带何种电荷，由于分散粒子表面带有电荷而吸引周围的相反电荷的离子。在表面拉曼散射基底的表面引入选择带不同Zeta电势(正/负)的内标分子，能够吸引相反电荷的待测分子，提升待测分子与基底的纳米粒子的结合能力，增强拉曼信号；此外，引入内标分子增强了拉曼基底分散系的稳定性，提高定量检测的重复性。

可选的，所述内标分子溶液的滴加量为0.5μL～1.0μL。

其中，内标分子的用量的确定过程，包括以下步骤：

(1)根据待测物的含量标准的检测需求，选择内标分子的浓度范围；

(2)将不同浓度的内标分子溶液分别滴加在Au NBPs coffee ring SERS基底上；

(3)用氮气吹干，获得不同浓度内标分子溶液标记的表面增强拉曼活性基底；

(4)将待测分子溶液滴加到标记的表面增强拉曼活性基底；

(5)氮气吹干后，使用共聚焦显微拉曼仪进行检测。

所述惰性气体是指不与基底和内标分子发生反应的气体物质，可选的，所述惰性气体包括氮气、氦气和氩气。利用流动的惰性气体带走溶解内标分子的溶剂，惰性气体的流速为3-5L/min。

本发明还提供了所述的方法制得的表面增强拉曼散射基底。

本发明还提供了所述的表面增强拉曼散射基底检测水体中孔雀石绿的方法，包括以下步骤：

提供金纳米双锥基底，滴加内标分子溶液在基底上；利用惰性气体吹干基底表面，获得内标分子标记的表面增强拉曼散射基底；滴加水样在基底上，氮气吹干，使用共聚焦显微拉曼仪进行检测。

可选的，所述内标分子为4-巯基苯甲酸。

由于待测分子为孔雀石绿，其带有负电荷，选择带正电的4-巯基苯甲酸作为内标分子，可以提高定量检测的重复性。

本申请的表面增强拉曼散射基底引入内标分子的方法，工艺步骤简单，且具有良好的普适性。

附图说明

图1为本发明表面增强拉曼散射基底引入内标分子的方法示意图；

图2为验证引入内标分子的方法的普适性的结果图；

图3为不同电荷和浓度的内标分子影响基底检测的效果图；

图4为内标分子标记的表面增强拉曼散射基底检测水样中孔雀石的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本申请所述的技术方案做进一步的说明，但本申请不仅限于此。

实施例1

将1.0μL 1.0x 10^-2mg/mL 4-巯基苯甲酸分别滴加到三种不同的的SERS基底上：AuNBPs coffee ring SERS基底、Au NPs/Si SERS芯片、Au NPs/Al₂O₃ SERS 芯片。

经5分钟氮气吹干处理后，得到三种4-巯基苯甲酸标记的SERS基底；将 1.0μL1.0x 10^-2mg/mL罗丹明6G分别滴加到三种4-巯基苯甲酸标记后的SERS 基底以及三种在作标记前的SERS基底；经5分钟氮气吹干处理后，使用共聚焦显微拉曼仪进行mapping检测。

图2中，A1、B1和C1分别为4-巯基苯甲酸标记前后的三种SERS基底用于检测罗丹明6G的拉曼光谱图(Au NBPs coffee ring SERS基底、Au NPs/Si SERS芯片、Au NPs/Al₂O₃SERS芯片)；A2、B2和C2分别为4-巯基苯甲酸标记的Au NBPs coffee ring SERS基底、AuNPs/Si SERS芯片、Au NPs/Al₂O₃ SERS 芯片进行重复多次检测罗丹明6G，得到的SERSmapping图；A3、B3和C3分别为未作任何内标分子标记的Au NBPs coffee ring SERS基底、Au NPs/Si SERS 芯片、Au NPs/Al₂O₃ SERS芯片进行重复多次检测罗丹明6G，得到的SERSmapping图。以拉曼信号强度的相对标准偏差(RSD)为评价基准，分别与未标记的三种SERS基底相比，4-巯基苯甲酸标记的三种SERS基底的相对标准偏差都显著降低，表明引入内标分子能够提升SERS基底的检测重现性，且该方法具有一定的普适性。

实施例2

将1.0μL带正电的分子—4-巯基苯甲酸，1.0μL带负电的分子—4-氨基苯硫酚，1.0μL带负电的分子(不含巯基)—5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)，分别滴加在Au NBPs coffeering SERS基底上；经5分钟氮气吹干处理后，即可得内标分子标记的表面增强拉曼活性基底；以带正电的分子—结晶紫为待测分子，在所述三种不同内标分子标记的表面增强拉曼活性基底表面滴加1.0μL结晶紫溶液；经5分钟氮气吹干处理，使用共聚焦显微拉曼仪进行mapping检测。

结果如图3(A)所示，内标分子和待测物的拉曼信号峰明显；利用拉曼仪 mapping图进行分析，图3(B)内标分子为4-巯基苯甲酸；图3(C)内标分子为4-氨基苯硫酚，当内标分子与待测分子的Zeta电势相反时，检测结果的相对标准偏差较小，即当内标分子与待测分子的Zeta电势相反时，SERS定量检测的信号重现性较高。

当内标分子采用负电荷分子且不带巯基官能团—5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)为内标分子时，内标分子的拉曼峰较弱，被结晶紫的拉曼信号所压制(图3(A))，但由于Zeta电势的影响，其检测结果的相对标准偏差较小(图3(D))。

实施例3

将1.0μL不同浓度4-巯基苯甲酸(0mg/mL,1.0x 10^-1mg/mL,1.0x 10^-2 mg/mL,1.0x10^-3mg/mL,1.0x 10^-4mg/mL,1.0x 10^-5mg/mL)，分别滴加在Au NBPs coffee ring SERS基底上；用氮气进行干燥处理，5分钟后，即可得不同浓度4-巯基苯甲酸标记的表面增强拉曼活性基底；在上述六种不同浓度4-巯基苯甲酸标记的表面增强拉曼活性基底表面分别滴加1.0μL不同浓度结晶紫溶液 (1.0x 10^-1mg/mL,1.0x 10^-2mg/mL,1.0x 10^-3mg/mL,1.0x 10^{- 4}mg/mL,1.0x 10^-5 mg/mL,1.0x 10^-6mg/mL)；经5分钟氮气吹干处理，使用共聚焦显微拉曼仪进行 mapping检测。

如图3(E)所示，在内标分子浓度为0mg/mL时，SERS基底检测结晶紫的检测范围为1.0x 10^-6mg/mL-1.0x 10^-1mg/mL。随着内标分子的引入，SERS 基底检测结晶紫的检测范围也发生了一系列的变化，结果如图3(F)，当无内标时，基底对于结晶紫的检测范围在1.0x10^-6mg/mL-1.0x 10^-1mg/mL.当引入内标后，基底依然可以对1.0x 10^-6mg/mL-1.0x 10^-1mg/mL范围内的结晶紫进行检测，只是需要采用不同浓度内标分子。即当结晶紫的检测需求是在低浓度(1.0 x 10^-6mg/mL-1.0x 10^-5mg/mL)时，可以采用1.0x 10^-6mg/mL浓度的内标分子(4-巯基苯甲酸)；当结晶紫的检测需求是在高浓度(1.0x 10^-2mg/mL-1.0x 10^-1 mg/mL)时，可以采用1.0x 10^-2mg/mL浓度的内标分子(4-巯基苯甲酸)；当结晶紫的检测需求是在中浓度(1.0x 10^-4mg/mL-1.0x 10^-3mg/mL)时，可以采用 1.0x 10^-3mg/mL浓度的内标分子(4-巯基苯甲酸)。因此，可以根据待测分子的检测需求，对内标分子的浓度进行调控，来提高SERS检测的重现性。

实施例4

根据水样中孔雀石绿(Zeta电势电荷：-)的含量标准(2.0μg/L)，选择1.0 x 10^{- 5}mg/mL 4-巯基苯甲酸作为内标分子，将1.0μL内标分子滴加在Au NBPs coffee ring SERS基底，氮气吹干后制得4-巯基苯甲酸标记的SERS基底。将三种孔雀石绿加标水样(4.0μg/L、8.0μg/L、15μg/L)滴加到4-巯基苯甲酸标记的SERS基底，经5分钟氮气吹干处理，使用共聚焦显微拉曼仪进行mapping 检测。

图4(A)采用4-巯基苯甲酸标记的Au NBPs coffee ring SERS基底对三种加标水样(4.0μg/L、8.0μg/L、15μg/L)进行检测得到的拉曼光谱图。

图4(B)、(C)、(D)分别为加标15μg/L，8.0μg/L，4.0μg/L浓度的水样的比率(I₁₆₁₇/I₁₀₇₉)mapping图。

图E、F、G采用未用4-巯基苯甲酸标记的Au NBPs coffee ring SERS基底对三种加标水样(4.0μg/L、8.0μg/L、15μg/L)进行检测。其中E、F、G分别对应加标15μg/L，8.0μg/L，4.0μg/L浓度的水样的比率(I₁₆₁₇/I₁₀₇₉)mapping图。

4-巯基苯甲酸标记的SERS基底在检测加标样时，其拉曼信号的相对标准偏差都比未加标前的SERS基底低(B<E，C<F，D<G)，因此，4-巯基苯甲酸标记的SERS基底在对水样中孔雀石绿的检测中，信号重现性得到提升。

上述的对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明，本申请所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本申请并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本申请的权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.表面增强拉曼散射基底引入内标分子的方法，其特征在于，包括以下步骤：提供表面增强拉曼散射基底，滴加内标分子溶液在基底上，利用惰性气体吹干基底，获得内标分子标记的表面增强拉曼散射基底；

所述基底为Au NBPs coffee ring SERS基底、Au NPs/Si SERS芯片或Au NPs/Al₂O₃SERS芯片；

所述内标分子带有巯基基团，且其Zeta电势与待测分子的相反。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面增强拉曼散射基底的载体为硅片或氧化铝。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内标分子溶液的溶剂为水。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内标分子溶液的滴加量为0.5μL～1.0μL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述惰性气体包括氮气、氦气和氩气。

6.根据权利要求1-5任一所述的方法制得的表面增强拉曼散射基底。

7.利用权利要求6所述的表面增强拉曼散射基底检测水体中孔雀石绿的方法，包括以下步骤：滴加水样在内标分子标记的表面增强拉曼散射基底上，用惰性气体吹干，使用共聚焦显微拉曼仪进行检测。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述内标分子为4-巯基苯甲酸。

Images