CN114486852B - 检测目标分子的方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种检测目标分子的方法，其包括使介质颗粒并与包含所述目标分子的样品混合，其中利用所述介质颗粒对辅助分子进行双组分表面增强拉曼光谱检测，所述辅助分子单分子光谱的光谱数量与产生光谱信号的光谱数量的比值为至少50％；同时利用所述介质颗粒对辅助分子进行表面增强拉曼光谱检测，所述辅助分子产生的信号强度在任意时间间隔的相关性系数的绝对值在0.3以下。本申请所述的方法可以实现液相数字化表面增强拉曼光谱检测，该检测方法操作简便，并可以达到单分子水平的检测灵敏度。

Description

检测目标分子的方法

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种检测目标分子的方法。

背景技术

拉曼光谱是一种指纹式的非弹性散射光谱，可以反映分子结构和内部化学键的振转信息，是一种无损、特异的检测分析手段。虽然拉曼散射信号本身很弱，但表面增强拉曼光谱可以将吸附分子的拉曼散射强度增强高达十个数量级。表面增强拉曼光谱的高灵敏度和高特异性使其在环境、食品、生物、医疗等多个领域，在定性识别、精准定量等应用场景中具有极大的优势与价值。

表面增强拉曼光谱技术中对于所吸附分子极强的信号增强能力来源于表面增强拉曼基底表面的热点区域，热点区域内具有高等离激元电磁场，可以用于放大位于其中的分子的拉曼信号。但该增强能力与基底尺寸、表面形貌、分子吸附取向、分子与基底距离等多种因素高度相关，因而纳米尺度的微小差异就会引起信号强度的巨大变化。对于低浓度的分子检测，所检测到的信号往往来源于单个分子产生的表面增强拉曼信号，信号波动尤为显著。由于测试体系中，表面增强拉曼基底、分子吸附等条件无法控制在该微观尺度内完全一致，故当前基于信号强度的技术无法实现对目标分子的准确定量。

Alexandre G.Brolo等人首次提出了数字化表面增强拉曼光谱的概念，基于分子出现表面增强拉曼散射信号的频率而非信号强度，来克服由于信号波动所导致的定量不准确。但是上述技术的实施采用固相表面增强拉曼芯片，固相芯片由于制造工艺的重复性差、热点数量有限等局限，没有办法进行技术推广以及无法从本质上突破分子定量的检测限。虽然当前采用电子束刻蚀等方法可以一定程度上提高芯片上热点分布的均匀性，但仪器复杂、成本高昂，且依然无法完全解决包括分子分布均匀等其他诸多问题。

由此可见，表面增强拉曼光谱由于检测体系的均匀性问题、重复性问题、检测限问题以及检测过程的复杂度高、成本高昂，仍极大地限制了其在定性识别、精准定量等应用场景中的应用价值。因此亟待获得可解决上述缺陷的新型表面增强拉曼光谱检测方法。

发明内容

本申请提供了一种检测目标分子的方法，具体提供了一种液相数字化表面增强拉曼光谱检测的方法。本申请所述的检测目标分子的方法可以具有以下性质中的至少一种：(1)表面增强拉曼颗粒的多样性高，可根据目标分子的性质进行选择，所述表面增强拉曼颗粒的制备方法和/或修饰方式多样；(2)在所述方法的检测过程中，所述表面增强拉曼颗粒在检测体系中具有良好的分散性；(3)在所述方法的检测过程中，所述目标分子在检测体系中具有良好的分散性；(4)所述方法操作简便，成本低廉，适用于大批量检测；(5)可以对目标分子进行单分子水平的精确定量；(6)可以实现对目标分子的高通量定量；(7)可以无需对目标分子进行破坏和/或标记；(7)所述方法的重复性好，检测结果可靠性高，定量误差可控(即数字化定量可以增加检测的光谱总量来降低计数误差)；(8)所述方法可以基本不受单分子波动(例如单分子的吸附取向、增强因子的差异性等多种不确定性因素)的影响。本申请选择了合适的介质颗粒来实现了所述检测目标分子的方法，所述合适的介质颗粒既具有对目标分子的单分子水平的检测灵敏度；又可以在所述方法的检测过程中保证稳定性。本申请还提供了本申请所述的介质颗粒在液相数字化表面增强拉曼光谱检测中的应用。

一方面，本申请提供了一种检测目标分子的方法，其包括以下步骤：a)使介质颗粒并与包含所述目标分子的样品混合，其中所述介质颗粒显示下述性质：1)利用所述介质颗粒对辅助分子进行双组分表面增强拉曼光谱检测(BiASERS)，其中所述辅助分子单分子光谱的光谱数量与产生光谱信号的光谱数量的比值为至少约50％；和，2)利用所述介质颗粒对辅助分子进行表面增强拉曼光谱检测，其中所述辅助分子在任意时间间隔产生的信号强度之间的相关性系数的绝对值为约0.3以下。

在某些实施方式中，所述检测包括定性检测和/或定量检测。

在某些实施方式中，所述检测包括单分子水平定量检测。

在某些实施方式中，所述样品以溶液的形式存在。

在某些实施方式中，所述介质颗粒分散在溶液中。

在某些实施方式中，所述介质颗粒与所述样品混合于液相体系。

在某些实施方式中，混合包括所述介质颗粒与所述样品在液相体系中孵育。

在某些实施方式中，所述目标分子包括小分子和/或大分子。

在某些实施方式中，所述大分子包括肽和/或蛋白质。

在某些实施方式中，所述介质颗粒包括金属纳米粒子溶胶、金属纳米粒子和/或纳米结构基底。

在某些实施方式中，所述介质颗粒包括表面增强拉曼颗粒。

在某些实施方式中，所述介质颗粒包括羟胺-银胶体颗粒、柠檬酸-银胶体颗粒和/或柠檬酸-金胶体颗粒。

在某些实施方式中，所述辅助分子包括小分子和/或大分子。

在某些实施方式中，所述辅助分子的种类与所述目标分子的种类相同。

在某些实施方式中，所述双组分表面增强拉曼光谱检测包括检测第一样品，所述第一样品包含所述介质颗粒以及至少两种所述辅助分子。

在某些实施方式中，所述双组分表面增强拉曼光谱检测包括以下步骤：至少一次降低所述第一样品中所述至少两种辅助分子的浓度。

在某些实施方式中，所述降低为与所述第一样品中所述辅助分子的原始浓度相比，每种所述辅助分子的浓度每次降低至少0.1个数量级。

在某些实施方式中，所述降低为与所述第一样品中所述辅助分子的原始浓度相比，每种所述辅助分子的浓度每次降低约0.1-约1个数量级。

在某些实施方式中，所述双组分表面增强拉曼光谱检测包括以下步骤：检测所述降低后所述第一样品中每种所述辅助分子所产生的光谱信号。

在某些实施方式中，在单张光谱中，当所述辅助分子所产生的光谱信号占所述单张光谱的光谱信号的至少85％，所述单张光谱为所述辅助分子单分子光谱。

在某些实施方式中，当所述辅助分子单分子光谱的光谱数量与产生光谱信号的光谱数量的比值为至少50％，所述介质颗粒具有针对所述辅助分子的单分子水平的检测灵敏度。

在某些实施方式中，所述表面增强拉曼光谱检测包括检测第二样品，所述第二样品包含所述介质颗粒以及至少一种所述辅助分子。

在某些实施方式中，所述表面增强拉曼光谱检测包括检测所述辅助分子产生的信号强度。

在某些实施方式中，所述表面增强拉曼光谱检测包括根据所述信号强度，计算在任意时间间隔产生的所述信号强度之间的相关性系数。

在某些实施方式中，当所述相关性系数的绝对值为约0.3以下，所述介质颗粒具有针对所述表面增强拉曼光谱检测的稳定性。

在某些实施方式中，当所述相关性系数的绝对值为约0.3以下，所述介质颗粒在至少60分钟内具有所述稳定性。

在某些实施方式中，所述方法包括以下步骤：b)对所述混合的所述介质颗粒和包含所述目标分子的样品进行拉曼检测，获得所述目标分子的拉曼光谱。

在某些实施方式中，所述拉曼检测包括表面增强拉曼光谱检测。

在某些实施方式中，所述拉曼检测包括数字化表面增强拉曼光谱检测。

在某些实施方式中，所述方法包括以下步骤：c)根据所述目标分子的拉曼光谱，获得所述目标分子在每张所述拉曼光谱中对应的丰度值。

在某些实施方式中，所述检测目标分子的方法包括以下步骤：根据不包含所述目标分子的空白样本的丰度值确定判断所述目标分子存在的阈值。

在某些实施方式中，所述检测目标分子的方法包括以下步骤：根据所述样本中所述目标分子被判断为存在的次数和/或频率获得所述目标分子在所述样品中的浓度。

在某些实施方式中，所述检测目标分子的方法包括以下步骤：根据所述样本中所述目标分子被判断为存在的次数和/或频率的数学映射关系获得所述目标分子在所述样品中的浓度。

在某些实施方式中，所述检测目标分子的方法包括以下步骤：调整包含所述目标分子的样品中所述目标分子的浓度。

在某些实施方式中，所述检测目标分子的方法包括以下步骤：调整所述介质颗粒与所述目标分子的结合能力。

在某些实施方式中，所述检测目标分子的方法包括以下步骤：调整包含所述目标分子的样品的理化性质。

在某些实施方式中，所述检测目标分子的方法包括以下步骤：调整所述拉曼检测所需的设备的参数。

在某些实施方式中，所述检测目标分子的方法包括以下步骤：调整每次拉曼检测中所述拉曼光谱的总数；和/或被检测为所述目标分子阳性的所述拉曼光谱的总数。

在某些实施方式中，所述检测目标分子的方法包括以下步骤：调整所述拉曼检测的次数。

在某些实施方式中，所述拉曼检测包括液相表面增强拉曼光谱检测。

另一方面，本申请提供了本申请所述的介质颗粒在液相数字化表面增强拉曼光谱检测目标分子中的应用。

在某些实施方式中，所述介质颗粒与所述目标分子混合于液相体系。

在某些实施方式中，所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测定量检测所述目标分子的浓度。

本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

附图说明

本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：

图1显示的是本申请所述羟胺-银胶体颗粒溶液的消光光谱。

图2显示的是本申请所述羟胺-银胶体颗粒溶液的透射电镜结果。

图3显示的是利用羟胺-银胶体颗粒溶液的本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测判断结晶紫是否存在的阈值。

图4显示的是利用羟胺-银胶体颗粒溶液的本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测结晶紫的数字化处理结果。

图5显示的是利用羟胺-银胶体颗粒溶液的本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测超低浓度结晶紫的定量标准曲线。

图6显示的是本申请所述柠檬酸-金胶体颗粒溶液的消光光谱。

图7显示的是本申请所述柠檬酸-金胶体颗粒溶液的透射电镜结果。

图8显示的是利用柠檬酸-金胶体颗粒溶液的本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测判断硝基苯硫酚是否存在的阈值。

图9显示的是利用柠檬酸-金胶体颗粒溶液的本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测硝基苯硫酚的数字化处理结果。

图10显示的是利用柠檬酸-金胶体颗粒溶液的本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测超低浓度硝基苯硫酚的定量标准曲线。

图11显示的是利用羟胺-银胶体颗粒溶液的本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测判断血红蛋白是否存在的阈值。

图12显示的是利用羟胺-银胶体颗粒溶液的本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测血红蛋白的数字化处理结果。

图13显示的是利用羟胺-银胶体颗粒溶液的本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测超低浓度血红蛋白的定量标准曲线。

图14显示的是利用羟胺-银胶体颗粒溶液的本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测判断A12是否存在的阈值。

图15显示的是利用羟胺-银胶体颗粒溶液的本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测A12的数字化处理结果。

图16显示的是利用羟胺-银胶体颗粒溶液的本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测超低浓度A12的定量标准曲线。

图17a-17c显示的是判断羟胺-银胶体颗粒是否适于用作本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测中的表面增强拉曼颗粒的结果。

图18a-18c显示的是判断柠檬酸-银胶体颗粒是否适于用作本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测中的表面增强拉曼颗粒的结果。

图19a-19c显示的是判断柠檬酸-金胶体颗粒是否适于用作本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测中的表面增强拉曼颗粒的结果。

图20显示的是判断羟胺-银纳米颗粒是否适于用作本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测中的表面增强拉曼颗粒的结果。

图21显示的是判断柠檬酸-银纳米星颗粒是否适于用作本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测中的表面增强拉曼颗粒的结果。

图22显示的是判断羟胺-银纳米颗粒是否适于用作本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测中的表面增强拉曼颗粒的结果。

图23显示的是判断柠檬酸-银纳米星颗粒是否适于用作本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测中的表面增强拉曼颗粒的结果。

图24显示的是判断羟胺-银纳米颗粒是否适于用作本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测中的表面增强拉曼颗粒的结果。

图25显示的是利用羟胺-银胶体颗粒溶液的本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测判断催产素是否存在的阈值。

图26显示的是利用羟胺-银胶体颗粒溶液的本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测催产素的数字化处理结果。

图27显示的是利用羟胺-银胶体颗粒溶液的本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测超低浓度催产素的定量标准曲线。

图28显示的是利用羟胺-银胶体颗粒溶液的本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测判断福美双是否存在的阈值。

图29显示的是利用羟胺-银胶体颗粒溶液的本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测福美双的数字化处理结果。

图30显示的是利用羟胺-银胶体颗粒溶液的本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测超低浓度福美双的定量标准曲线。

图31显示的是利用羟胺-银胶体颗粒溶液的本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测判断百草枯是否存在的阈值。

图32显示的是利用羟胺-银胶体颗粒溶液的本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测百草枯的数字化处理结果。

图33显示的是利用羟胺-银胶体颗粒溶液的本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测超低浓度百草枯的定量标准曲线。

图34显示的是增加数字化表面增强拉曼光谱检测中包含的光谱总数能够提高本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测超低浓度待检测分子的准确性。

图35显示的是增加探测体积能够提高本申请所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测超低浓度待检测分子的准确性。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。

术语定义

在本申请中，术语“目标分子”通常是指其存在、不存在或浓度需要根据本申请所述的方法来确定的物质。所述目标分子可以为单独的分子、也可以是分子的复合物。所述目标分子可以为大分子，例如可以为蛋白质(例如可以为抗体，例如单克隆抗体)、可以为由细菌、酵母、哺乳动物、植物或昆虫细胞表达的DNA和/或RNA，可以为肽和/或蛋白质；所述目标分子可以为小分子，例如可以为核苷、核苷酸和/或氨基酸；例如可以为矿物质；可以为化学物质(例如可以为农药、毒品、污染物、药物)，例如可以为化合物(例如可以为有机物，可以为无机物)、肽和多肽，低聚糖、糖改性的蛋白、聚合物、金属螯合物、离子。

在本申请中，术语“介质颗粒”通常是指为确定所述目标分子是否存在，或者确定所述目标分子的浓度提供帮助的物质。所述介质颗粒可以与所述目标分子接触，并在接触后的检测中帮助所述目标分子产生信号。所述检测的方法可以借助所述信号来检测所述目标分子的有无和/或浓度。在本申请中，所述检测的方法可以为拉曼光谱检测(例如可以为表面增强拉曼光谱检测，可以为数字化的表面增强拉曼光谱检测，可以为液相数字化的表面增强拉曼光谱检测)。在本申请中，所述的信号可以为所述目标分子的拉曼光谱。在本申请中，所述的介质颗粒可以为拉曼光谱检测所需的基底。例如，所述的介质颗粒可以为表面增强拉曼颗粒。在本申请中，所述介质颗粒可以为金属纳米粒子溶胶、金属纳米粒子和/或纳米结构基底。例如，所述介质颗粒可以为羟胺-银胶体颗粒、柠檬酸-银胶体颗粒和/或柠檬酸-金胶体颗粒。

在本申请中，术语“辅助分子”通常是指为确定所述介质颗粒是否可以用于本申请所述的方法所需要的物质。本申请中，所述介质颗粒可以与所述辅助分子接触，并在接触后的检测中帮助所述辅助分子产生信号。判断所述辅助分子产生信号是否符合某一阈值，从而确定所述介质颗粒是否可用于本申请所述的方法。在本申请中，所述检测的方法可以为拉曼光谱检测，例如可以为双组分表面增强拉曼光谱检测(BiASERS)，例如可以为数字化表面增强拉曼光谱检测。在本申请中，所述的信号可以为所述目标分子的拉曼光谱，和/或可以为基于所述拉曼光谱的数据结算获得的结果。在本申请中，所述辅助分子的种类可以根据所述目标分子的种类进行调整。例如，所述辅助分子的种类可以与所述目标分子的种类相同。所述辅助分子的种类也可以与所述目标分子的种类不同。在本申请中，所述辅助分子可以包括小分子和/或大分子。

在本申请中，术语“拉曼光谱检测”通常是指用光照射样品而从样品获得的拉曼光谱数据，从而对分子进行鉴别和/或表征的方法。在所述拉曼光谱检测中，可以用例如来自激光器并具有已知波长(例如可以为可见的，或近红外的，或紫外的)的光照射样品。所述光可以与所述样品的分子中的电子云相互作用，并且因这个相互作用而产生具有与入射激光存在波长位移的散射光信号。该波长位移可以表示分子的振动能量级和/或旋转能量级之间的差异。这个波长位移的确切本质可以取决于所述样品中的分子，也可以包括斯托克斯位移(其中发射的光子具有比入射或照射光子更长的波长)和/或反斯托克斯位移(其中发射的光子具有比入射光子更短的波长)。每个分子可以产生一个独特的光谱特征标记，该标记可以被称为拉曼标记或拉曼光谱。所述拉曼标记即可以被用于鉴别和表征所述分子。例如，可以将所述拉曼标记(拉曼光谱)与已知的拉曼标记库相比较(例如，通过处理器)，以便于鉴别所述样品中的分子。拉曼光谱检测可以参考Richard L.McCreery，RamanSpectroscopy for Chemical Analysis和美国专利US8107069、US 8081305等实施。

在本申请中，术语“双组分表面增强拉曼光谱检测(BiASERS)”通常是指用包含两种以上目标分子的样品进行表面增强拉曼光谱检测的方法，其也可以称为Bi-analyteSERS。所述双组分表面增强拉曼光谱检测的方法可以参见Le Ru,E.C.；Meyer,M.；Etchegoin,P.G.,Proof of single-molecule sensitivity in surface enhanced Ramanscattering(SERS)by means of a two-analyte technique.J.Phys.Chem.B 2006,110(4),1944-1948。在本申请中，所述双组分表面增强拉曼光谱检测可用于确定所述介质颗粒是否具有单分子的检测能力。例如，所述双组分表面增强拉曼光谱检测中，在两种以上所述辅助分子的高浓度条件下，所获得的产生光谱信号的光谱中大多数为同时呈现两种以上辅助分子的信号的光谱；当逐渐降低所述辅助分子的浓度时，所获得的产生光谱信号的光谱中大多数为只有一种辅助分子的信号的光谱。由此获得的来源于只有一种辅助分子的信号的光谱可用于判断所述介质颗粒是否具有单分子的检测能力。

在本申请中，术语“表面增强拉曼光谱检测”通常是指Surface-enhanced RamanScattering，SERS，其是一种增强拉曼散射的表面敏感技术，从而可以提高拉曼光谱检测的灵敏度。所述表面增强拉曼光谱检测又可以称为表面增强拉曼散射检测。所述表面增强拉曼光谱检测可以通过吸附在金属表面(例如粗糙的金属表面)和/或具有纳米结构的溶胶上来增强拉曼散射。例如所述表面增强拉曼光谱检测可以将拉曼光谱的信号增强至少10个数量级。又例如，所述表面增强拉曼光谱检测可以是指通过在特殊制备的一些金属良导体表面或溶胶中，在激发区域内，由于样品表面或近表面的电磁场的增强导致吸附分子的拉曼散射信号比普通拉曼散射(NRS)信号大大增强的现象而提高拉曼光谱检测的灵敏度的检测方法。所述表面增强拉曼光谱检测可以提供非破坏性的、超灵敏的表征。

在本申请中，术语“数字化表面增强拉曼光谱检测”通常是指可以数字化定量进行所述表面增强拉曼光谱检测的方法。本申请中，在进行所述表面增强拉曼光谱检测时，可以将“存在所述目标分子”定义为“1”；将“不存在所述目标分子”定义为“0”，通过计算“1”的次数与所述产生光谱信号的光谱数量的比值来对所述目标分子进行定量。在本申请中，根据所述数字化表面增强拉曼光谱检测的结果，可以用于判断所述介质颗粒是否满足所述拉曼光谱检测所需的稳定性要求(例如可以不发生颗粒沉降、团聚、增多或探测体积内颗粒、所述目标分子的数量减少)。

在本申请中，术语“表面增强拉曼颗粒”通常是指用于进行所述表面增强拉曼光谱检测的基底。所述表面增强拉曼颗粒可以为贵金属溶胶(例如可以为金、银纳米粒子溶胶)。其中具有不同形状大小和表面功能的纳米粒子可以根据表面增强拉曼光谱检测的不同检测样品而选择。所述表面增强拉曼颗粒可以为固相，例如可以为粗糙的金属电极、组装在滤纸表面的纳米粒子和/或具有微观形貌金属岛膜。例如，所述表面增强拉曼颗粒可以为羟胺-银胶体颗粒、柠檬酸-银胶体颗粒和/或柠檬酸-金胶体颗粒。

在本申请中，术语“单分子水平定量检测”通常是指可以以非常低的含量水平(例如pg)对待检测样品中分析物的单个分子进行的检测和/或定量。

在本申请中，术语“溶液”通常是指一种纯物质以分子或离子的状态均相、稳定的分布在另一种纯物质得到的分散体系。在本申请中，所述溶液可以为液态。所述溶液可以为胶体。所述溶液可以具有流动性。

在本申请中，术语“液相体系”通常是指物质均匀组成、拥有均匀的物理和化学性质的一个液体的系统。例如，所述液相体系可以为一个包含液体的系统。

在本申请中，术语“第一样品”通常是指包含所述介质颗粒和至少两种所述辅助分子的样品。在本申请中，所述第一样品可以用于所述双组分表面增强拉曼光谱检测。在本申请中，所述第一样品可以用于判断所述介质颗粒是否具有单分子的检测能力。

在本申请中，术语“第二样品”通常是指包含所述介质颗粒和至少一种所述辅助分子的样品。在本申请中，所述第二样品可以用于所述数字化表面增强拉曼光谱检测。在本申请中，所述第二样品可以判断所述介质颗粒是否满足所述拉曼光谱检测所需的稳定性要求。在本申请中，所述“第一”和所述“第二”仅为代指为判断所述介质颗粒是否满足所述拉曼光谱检测的要求而需要使用的包含所述介质颗粒的样品，并没有任何优先级和顺序的含义。在某些情况下，所述第一样品可以与所述第二样品相同。

在本申请中，术语“光谱信号”通常是指本申请涉及的拉曼光谱检测(例如可以为表面增强拉曼光谱检测，可以为数字化的表面增强拉曼光谱检测，可以为液相数字化的表面增强拉曼光谱检测)所产生的拉曼光谱中的光谱信号。

在本申请中，术语“信号强度”通常是指反映信号强弱的指标。例如，所述信号强度可以为所述光谱信号所产生的信号强度。

在本申请中，术语“约”通常与数值连接使用时，可以指包括值的集合或范围。例如，“约X”包括为X±20％、±10％、±5％、±2％、±1％、±0.5％、±0.2％，或±0.1％的值的范围，其中X为数值。

发明详述

一方面，本申请提供了一种检测目标分子的方法，其包括以下步骤：a)使介质颗粒并与包含所述目标分子的样品混合，其中所述介质颗粒显示下述性质：1)利用所述介质颗粒对辅助分子进行双组分表面增强拉曼光谱检测(BiASERS)，其中所述辅助分子单分子光谱的光谱数量与产生光谱信号的光谱数量的比值为至少约50％；和，2)利用所述介质颗粒对辅助分子进行表面增强拉曼光谱检测，其中所述辅助分子在任意时间间隔产生的信号强度之间的相关性系数的绝对值为约0.3以下。

在本申请中，所述检测可以包括定性检测和/或定量检测。例如，所述检测包括单分子水平定量检测。例如，所述检测可以确定在所述样品中是否存在所述目标分子的单个分子。因此本申请所述的方法可以用于目标分子的精确定量。

在本申请中，所述步骤a)可以为之后的检测步骤提供合适的所述介质颗粒和所述样品。在本申请中，所述步骤a)可以为之后的检测提供待检测的包含所述介质颗粒和所述样品的混合物。其中，所述步骤a)可以在液相中进行。所述步骤a)可以通过调节液相体系(例如调节pH、离子浓度等)促进所述目标分子和所述介质颗粒的结合。

在本申请中，可以通过一些试验方法(例如双组分表面增强拉曼光谱检测和/或数字化表面增强拉曼光谱检测)，借助所述辅助分子选择合适的介质颗粒。具体而言，可以利用所述介质颗粒对辅助分子进行双组分表面增强拉曼光谱检测，通过所述辅助分子单分子光谱的光谱数量与产生光谱信号的光谱数量的比值判断所述介质颗粒是否具有对所述辅助分子的单分子水平的检测灵敏度。若是，则可以认为该介质颗粒也可以对所述目标分子具有单分子水平的检测灵敏度。具体而言，可以利用所述介质颗粒对辅助分子进行表面增强拉曼光谱检测，通过在任意时间间隔产生的所述信号强度之间的相关性系数的绝对值判断所述介质颗粒是否可以在本申请所述的检测目标分子的方法中保持稳定性(例如悬浮稳定性，例如在液相体系中的悬浮稳定性)。因此，步骤a)通过选择合适的介质颗粒(即所述介质颗粒对所述目标分子具有单分子水平的检测灵敏度，并且在所述检测目标分子的方法中保持稳定性)，从而在液相体系中借助所述介质颗粒对所述目标分子进行检测。

在本申请中，所述样品可以以溶液的形式存在。例如，所述目标分子可以溶解在溶剂中(例如水，例如乙醇)。例如所述样品可以为包含目标分子的溶液。

在本申请中，所述介质颗粒可以分散在溶液中。例如，所述介质颗粒可以分散在可分散所述介质颗粒的液体中(例如可以先分散在合适的液体中，还可以进一步稀释，例如加水稀释)。在本申请中，所述包含介质颗粒的溶液中，可以通过消光光谱和/或透射电镜对所述介质颗粒的性质和/或形貌进行检测。

在本申请中，所述介质颗粒可以与所述样品可以混合于液相体系。例如，所述样品可以与包含所述介质颗粒的溶液按一定的体积比例进行混合(例如，所述样品和所述包含所述介质颗粒的溶液可以以约1:20、约1:15、约1:10、约1:9、约1:8、约1:7、约1:6、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1的比例进行混合)。在本申请中，所述混合可以使用例如超声等手段促进所述介质颗粒与包含所述目标分子的样品的溶液充分地均匀混合。

在本申请中，混合包括所述介质颗粒可以与所述样品在液相体系中孵育。例如，所述孵育可以在避光条件下进行。例如，所述孵育的时间可以为至少约0.5小时、至少约1小时、至少约1.5小时、至少约2小时或更多。

在本申请中，所述目标分子可以包括小分子和/或大分子。例如，所述大分子可以为生物大分子。例如，所述大分子可以包括肽和/或蛋白质。所述大分子可以为天然来源的大分子，也可以为人工修饰获得的大分子。在本申请中，所述大分子可以为相对分子质量至少为5000的分子。所述大分子还可以包括聚合物。在本申请中，所述小分子可以为单质、化合物(例如有机物或无机物)。例如，所述小分子可以包括核苷、核苷酸和/或氨基酸。

在本申请中，所述介质颗粒可以包括金属纳米粒子溶胶、金属纳米粒子和/或纳米结构基底。在本申请中，所述介质颗粒可以包括表面增强拉曼颗粒。例如，所述介质颗粒可以包括羟胺-银胶体颗粒、柠檬酸-银胶体颗粒和/或柠檬酸-金胶体颗粒。

在本申请中，所述辅助分子可以包括小分子和/或大分子。在本申请中，所述辅助分子的种类可以与所述目标分子的种类相同。在本申请中，可以根据目标分子的种类选择对应的所述辅助分子的种类(例如可以根据目标分子的种类选择相同种类的分子作为所述辅助分子)。

在本申请中，所述双组分表面增强拉曼光谱检测可以包括检测第一样品，所述第一样品包含所述介质颗粒以及至少两种(例如可以为至少2种、至少3种、至少4种或更多种)所述辅助分子。

在本申请的所述双组分表面增强拉曼光谱检测中，在两种以上所述辅助分子的高浓度条件下，所获得的产生光谱信号的光谱中大多数可以为同时呈现两种以上辅助分子的信号的光谱；当逐渐降低所述辅助分子的浓度时，所获得的产生光谱信号的光谱中大多数可以为只有一种辅助分子的信号的光谱。由此获得的来源于只有一种辅助分子的信号的光谱可用于判断所述介质颗粒是否具有单分子的检测能力。

在本申请中，所述双组分表面增强拉曼光谱检测可以包括以下步骤：至少一次(例如可以为至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、至少10次或更多次)降低所述第一样品中所述至少两种(例如可以为至少2种、至少3种、至少4种或更多种)辅助分子的浓度。

在本申请中，所述降低为与所述第一样品中所述辅助分子的原始浓度相比，每种所述辅助分子的浓度可以每次降低至少0.1个数量级(例如，可以降低至少约0.1个数量级、至少约0.2个数量级、至少约0.3个数量级、至少约0.4个数量级、至少约0.5个数量级、至少约0.6个数量级、至少约0.7个数量级、至少约0.8个数量级、至少约0.9个数量级、至少约1.0个数量级、至少约1.5个数量级、至少约2.0个数量级或更多)。

在本申请中，所述降低为与所述第一样品中所述辅助分子的原始浓度相比，每种所述辅助分子的浓度可以每次降低约0.1-约1个数量级(例如，可以降低约0.1-约1个数量级、约0.2-约1个数量级、约0.3-约1个数量级、约0.4-约1个数量级、约0.5-约1个数量级、约0.1-约0.9个数量级、约0.2-约0.9个数量级、约0.3-约0.9个数量级、约0.4-约0.9个数量级、约0.5-约0.9个数量级、约0.1-约0.8个数量级、约0.2-约0.8个数量级或约0.3-约0.8个数量级)。

在本申请中，所述双组分表面增强拉曼光谱检测可以包括以下步骤：检测所述降低后所述第一样品中每种所述辅助分子所产生的光谱信号。

在本申请中，所述双组分表面增强拉曼光谱检测还可以包括以下步骤，统计产生光谱信号的所有光谱的光谱数量。

在本申请中，在单张光谱中，当所述辅助分子所产生的光谱信号占所述单张光谱的光谱信号的至少85％(例如，可以为至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更多)，所述单张光谱可以被认为是所述辅助分子单分子光谱。

在本申请中，当所述辅助分子单分子光谱的光谱数量与产生光谱信号的光谱数量的比值为至少50％(例如，可以为至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更多)，所述介质颗粒可以具有针对所述辅助分子的单分子水平的检测灵敏度。在本申请中，当所述辅助分子单分子光谱的光谱数量与产生光谱信号的光谱数量的比值为至少50％(例如，可以为至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更多)，所述介质颗粒可以具有针对所述目标分子的单分子水平的检测灵敏度。

在本申请中，所述表面增强拉曼光谱检测可以包括检测第二样品，所述第二样品包含所述介质颗粒以及至少一种(例如可以为至少1中、至少2种、至少3种、至少4种或更多种)所述辅助分子。

在本申请中，所述表面增强拉曼光谱检测可以包括检测所述辅助分子产生的信号强度。所述表面增强拉曼光谱检测可以通过以上的计数来统计在所述数字化表面增强拉曼光谱检测的过程中，所述辅助分子产生的信号强度随着扫描过程(例如可以用扫描的区域大小和/或扫描的总时长来表征)的变化情况。

在本申请中，所述数字化表面增强拉曼光谱检测可以包括根据所述信号强度，计算所述辅助分子在任意时间间隔(例如可以为间隔约至少1秒、间隔约至少2秒、间隔约至少3秒、间隔约至少4秒、间隔约至少5秒、间隔约至少6秒、间隔约至少7秒、间隔约至少8秒、间隔约至少9秒或更长的时间间隔)产生的信号强度之间的相关性系数。例如，可以计算所述辅助分子在任意时间间隔的两个时间点时的信号强度之间的相关性系数。例如，可以通过处于任意时间间隔的多个不同时间点时的信号强度，分别任选两个相邻的时间点时的信号强度，从而计算针对这两个任选的相邻时间点时的信号强度间相关性系数。可以通过这样一系列的相关性系数的平均值判断所述介质颗粒是否可以在本申请所述的检测目标分子的方法中保持稳定性。

在本申请中，如果所述相关性系数的绝对值为约0.3以下(例如，所述相关性系数的绝对值|r|可以为约0.3以下，为约0.25以下，约0.2以下，约0.15以下，约0.1以下，约0.05以下或更低)，则可以认为所述介质颗粒可以在本申请所述的检测目标分子的方法中保持稳定性。例如，如果所述信号强度随着扫描逐渐上升、下降或产生显著变化，则所述拟合曲线的斜率会显著提高(例如，所述介质颗粒产生了沉降、团聚等)，则可以认为所述介质颗粒无法在本申请所述的检测目标分子的方法中保持稳定性。

在本申请中，当所述相关性系数的绝对值为约0.3以下(例如，所述相关性系数的绝对值|r|可以为约0.3以下，为约0.25以下，约0.2以下，约0.15以下，约0.1以下，约0.05以下或更低)，所述介质颗粒可以具有针对所述数字化表面增强拉曼光谱检测的稳定性，或者，所述介质颗粒可以具有针对本申请所述检测目标分子的方法的稳定性。

在本申请中，如果所述相关性系数的绝对值为约0.3以下(例如，所述相关性系数的绝对值|r|可以为约0.3以下，为约0.25以下，约0.2以下，约0.15以下，约0.1以下，约0.05以下或更低)，所述介质颗粒可以在至少60分钟(例如，可以为至少约60分钟、至少约65分钟、至少约70分钟、至少约75分钟、至少约80分钟、至少约85分钟、至少约90分钟、至少约95分钟、至少约100分钟、至少约105分钟、至少约110分钟、至少约115分钟、至少约120分钟或更多)内具有所述稳定性。

在某些情形下，可以通过一些试验方法(例如双组分表面增强拉曼光谱检测和/或消光光谱检测)选择合适的介质颗粒。具体而言，可以通过所述介质颗粒的消光光谱，判断所述介质颗粒是否可以在本申请所述的检测目标分子的方法中保持稳定性(例如悬浮稳定性，例如在液相体系中的悬浮稳定性)。因此，步骤a)通过选择合适的介质颗粒(即所述介质颗粒对所述目标分子具有单分子水平的检测灵敏度，并且在所述检测目标分子的方法中保持稳定性)，从而在液相体系中借助所述介质颗粒对所述目标分子进行检测。

在本申请中，如果所述介质颗粒(例如可以处于被分散在溶液的状态中)在消光光谱检测过程中保持不变，则可以认为所述介质颗粒没有在该溶液中发生沉降，因此可以在本申请所述的检测目标分子的方法中保持稳定性。所述消光光谱检测可以通过所述介质颗粒的消光峰来衡量。如果在所述消光光谱检测的过程中(例如可以为至少180分钟)，所述介质颗粒的消光峰的强度的初值和末值的相差值为约5％以下(例如，所述初值和末值的相差值可以通过以下的公式计算：相差值＝(末值-初值)/初值×100％)(例如，可以为约5％以下、约4.5％以下、约4％以下、约3.5％以下、约3％以下、约2.5％以下、约2％以下、约1.5％以下、约1％以下、约0.5％以下或更低)；和/或，所述介质颗粒的消光峰的强度的相对标准差为约2％以下(例如，可以为约1.9％以下、约1.8％以下、约1.7％以下、约1.6％以下、约1.5％以下、约1.4％以下、约1.3％以下、约1.2％以下、约1.1％以下、约1.0％以下或更低)，则可以认为所述介质颗粒可以在本申请所述的检测目标分子的方法中保持稳定性。反之，如果所述介质颗粒的消光峰的强度的相对标准差过大，或者所述介质颗粒的消光峰的强度的初值和末值的相差值过大，则所述介质颗粒可能在溶液中发生沉降，因此可以认为此时该介质颗粒无法在本申请所述的检测目标分子的方法中保持稳定性。

在某些情形下，可以通过一些试验方法(例如双组分表面增强拉曼光谱检测和/或数字化表面增强拉曼光谱检测)，借助所述辅助分子选择合适的介质颗粒。具体而言，可以利用所述介质颗粒对辅助分子进行表面增强拉曼光谱检测，通过所述辅助分子所产生的拉曼光谱的均一性，判断所述介质颗粒是否可以在本申请所述的检测目标分子的方法中保持稳定性(例如悬浮稳定性，例如在液相体系中的悬浮稳定性)。因此，步骤a)通过选择合适的介质颗粒(即所述介质颗粒对所述目标分子具有单分子水平的检测灵敏度，并且在所述检测目标分子的方法中保持稳定性)，从而在液相体系中借助所述介质颗粒对所述目标分子进行检测。

在本申请中，如果所述辅助分子在进行表面增强拉曼光谱检测的过程中，所述辅助分子的特征峰的峰面积随时间变化不大，产生的信号强度保持稳定，则可以认为所述介质颗粒可以在本申请所述的检测目标分子的方法中保持稳定性。例如，当所述辅助分子的浓度为10^-7M时，如果所述辅助分子的特征信号强度的相对标准差可以为约50％以下(例如可以为约50％以下、约45％以下、约40％以下、约35％以下、约30％以下、约25％以下、约20％以下、约15％以下、约10％以下、约5％以下或更低)，则可以认为此时所述介质颗粒可以在本申请所述的检测目标分子的方法中保持稳定性。

在本申请中，所述方法可以包括以下步骤：b)对所述混合的所述介质颗粒和包含所述目标分子的样品进行拉曼检测，获得所述目标分子的拉曼光谱。

在本申请中，可以选择与所述目标分子和/或所述介质颗粒相吻合的激光波长、激光功率、扫描步长和/或照射时间。进行所述拉曼检测时，所述混合的所述介质颗粒和包含所述目标分子的样品可以以载体(例如可以为毛细管、载玻片、孔板或皿)承载的形式，在液体体系的内部进行所述拉曼检测的激光扫描。

在本申请中，所述拉曼检测可以包括表面增强拉曼光谱检测。例如，所述拉曼检测可以包括数字化表面增强拉曼光谱检测。在本申请中，可以将“存在所述目标分子”定义为“1”，将“不存在所述目标分子”定义为“0”。可以通过统计所述“1”的次数并将其除以总扫描的点数的比值换算为所述目标分子在所述样品中的浓度。

在本申请中，所述方法可以包括以下步骤：c)根据所述目标分子的拉曼光谱，获得所述目标分子在每张所述拉曼光谱中对应的丰度值。例如，所述丰度值可以通过以下参数计算得出：所述目标分子的特征峰强度、所述目标分子的特征峰峰面积、对所述目标分子的光谱拟合得出的相对系数。

在本申请中，可以针对不同的所述目标分子，相应地调整所述目标分子可能所在的样品、调整本申请所述检测目标分子的方法(例如所述拉曼检测，例如所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测)所需的检测试剂和/或检测仪器，和/或调整本申请所述检测目标分子的方法(例如所述拉曼检测，例如液相数字化表面增强拉曼光谱检测)涉及的计算步骤中的计算方法和/或参数，从而进一步地提高本申请所述检测目标分子的方法(例如所述拉曼检测，例如液相数字化表面增强拉曼光谱检测)的可靠性(例如，进一步降低检测误差，和/或，进一步提高检测的可靠性)。

在本申请中，所述检测目标分子的方法可以包括稀释、浓缩和/或提取所述包含目标分子的样品的步骤。在某些情况下，可以通过稀释、浓缩和/或提取的手段，调整所述样品中所述目标分子的浓度，从而可以使本申请的所述方法更可靠地(例如，进一步降低检测误差，和/或，进一步提高检测的可靠性)检测到所述目标分子。

在本申请中，所述检测目标分子的方法可以包括对本申请所述介质颗粒(例如所述表面增强拉曼颗粒)进行调整(例如，对所述表面增强拉曼颗粒进行修饰)的步骤。例如，在某些情况下，可以通过修饰所述表面增强拉曼颗粒，使所述表面增强拉曼颗粒与所述目标分子的结合能力改变(例如提高)，从而可以使本申请的所述方法更可靠地(例如，进一步提高检出率，进一步降低检测误差，和/或，进一步提高检测的可靠性)检测到所述目标分子。例如，在所述目标分子的浓度一定的情况下，可以通过修饰所述表面增强拉曼颗粒，增加或者减少所测得的所有拉曼光谱中所述目标分子被判断为存在的次数和/或频率。

在本申请中，所述检测目标分子的方法可以包括对本申请所述包含目标分子的样品进行调整(例如，对所述样品的理化性质(例如温度、盐度、酸碱度和/或粘稠度)进行调整)的步骤。例如，在某些情况下，可以通过调整所述样品(例如加热、搅拌、适当增加盐度和/或适当减少粘稠度)，使所述样品中所述目标分子的运动能力改变(例如提高)，从而可以使本申请的所述方法更可靠地(例如，进一步提高检出率，进一步降低检测误差，和/或，进一步提高检测的可靠性)检测到所述目标分子。例如，在所述目标分子的浓度一定的情况下调整所述样品(例如加热、搅拌、适当增加盐度和/或适当减少粘稠度；或者，冷却、静置、适当减少盐度和/或适当增加粘稠度)，增加或者减少所测得的所有拉曼光谱中所述目标分子被判断为存在的次数和/或频率。

在本申请中，所述检测目标分子的方法可以包括对所述方法涉及的设备(例如进行所述拉曼检测所需的仪器)的参数(例如激光波长、探测面积/体积、功率密度、量子效率等)进行调整的步骤。例如，在某些情况下，可以通过调整所述参数，使所述方法检测到所述目标分子的几率改变(例如提高)，从而可以使本申请的所述方法更可靠地(例如，进一步提高检出率，进一步降低检测误差，和/或，进一步提高检测的可靠性)检测到所述目标分子。例如，在所述目标分子的浓度一定的情况下，调整所述参数(例如适当增加探测体积；使检测仪器的波长和/或功率密度适应于所述目标分子；和/或适当提高量子效率)可以提高所测得的所有拉曼光谱中所述目标分子被判断为存在的次数和/或频率。

在本申请中，所述检测目标分子的方法可以包括基于所述目标分子被判断为存在的次数、频率、和/或基于存在的次数和/或频率的数学映射关系来判断所述样品中所述目标分子的有无和/或浓度的步骤。例如，所述方法可以不完全依赖于具体的所述目标分子被判断为存在的次数、频率，还可以基于该次数和/或频率对应的映射关系。

在本申请中，所述检测目标分子的方法可以包括调整(例如增加/减少)每次检测中测试光谱总数/测得阳性光谱的数量的步骤。在某些情况下，通过上述调整，可以控制(例如减少)所述检测目标分子的方法的理论计数误差，从而使本申请的所述方法更可靠地(例如，进一步降低检测误差，和/或，进一步提高检测的可靠性)检测到所述目标分子。在某些情况下，通过上述调整，可以控制(例如提高)本申请所述方法的检测灵敏度，从而使本申请的所述方法可以实现对包含不同浓度含量范围的所述目标分子的样本，均进行可靠地定性和/或定量检测。

在本申请中，所述检测目标分子的方法可以包括调整(例如增加)数字化表面增强拉曼光谱检测(例如液相数字化表面增强拉曼光谱检测)的次数。在某些情况下，通过上述调整(例如可以进行2次以上(例如2次、3次、4次、5次或更多次)液相数字化表面增强拉曼光谱检测)，可以使本申请的所述方法更可靠地(例如，进一步降低检测误差，和/或，进一步提高检测的可靠性)检测到所述目标分子。

在本申请中，所述检测目标分子的方法可以对所述目标分子进行定量分析(例如可以控制定量分析的准确性；和/或可重复性)。

在本申请中，所述检测目标分子的可以方法包括以下步骤：根据不包含所述目标分子的空白样本的丰度值确定判断所述目标分子存在的阈值。在本申请中，所述阈值可以以空白对照(可以为不包含所述目标分子的溶剂)的相应值进行对照而计算得出。例如，可以将所述阈值设定为所述空白对照的丰度值的平均值+3倍标准差；或者，可以将所述阈值设定为所述空白对照的丰度值的平均值+5倍标准差。

在本申请中，所述检测目标分子的可以方法包括以下步骤：根据所述样本中所述目标分子被判断为存在的次数和/或频率获得所述目标分子在所述样品中的浓度。在本申请中，可以对包含高浓度的所述目标分子的所述样品进行稀释，从而进一步增大定量检测的准确性。

在本申请中，本申请所述的方法可以为液相数字化表面增强拉曼光谱检测。例如，本申请所述的方法可以在液相体系下混合所述目标分子和所述介质颗粒，从而进行数字化表面增强拉曼光谱检测。

另一方面，本申请提供了本申请所述的介质颗粒在液相数字化表面增强拉曼光谱检测目标分子中的应用。

在本申请中，所述介质颗粒可以与所述目标分子混合于液相体系。例如，所述介质颗粒可以与所述目标分子混合于溶液中。

在本申请中，所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测可以定量检测所述目标分子的浓度。

本申请提供了以下的实施方式：

1.检测目标分子的方法，其包括以下步骤：

a)使介质颗粒并与包含所述目标分子的样品混合，其中所述介质颗粒显示下述性质：

1)利用所述介质颗粒对辅助分子进行双组分表面增强拉曼光谱检测(BiASERS)，其中所述辅助分子单分子光谱的光谱数量与产生光谱信号的光谱数量的比值为至少约50％；和，

2)利用所述介质颗粒对辅助分子进行表面增强拉曼光谱检测，其中所述辅助分子在任意时间间隔产生的信号强度之间的相关性系数的绝对值为约0.3以下。

2.根据实施方式1所述的方法，其中所述检测包括定性检测和/或定量检测。

3.根据实施方式1-2中任一项所述的方法，其中所述检测包括单分子水平定量检测。

4.根据实施方式1-3中任一项所述的方法，其中所述样品以溶液的形式存在。

5.根据实施方式1-4中任一项所述的方法，其中所述介质颗粒分散在溶液中。

6.根据实施方式1-5中任一项所述的方法，其中所述介质颗粒与所述样品混合于液相体系。

7.根据实施方式1-6中任一项所述的方法，其中混合包括所述介质颗粒与所述样品在液相体系中孵育。

8.根据实施方式1-7中任一项所述的方法，其中所述目标分子包括小分子和/或大分子。

9.根据实施方式8所述的方法，其中所述大分子包括肽和/或蛋白质。

10.根据实施方式1-9中任一项所述的方法，其中所述介质颗粒包括金属纳米粒子溶胶、金属纳米粒子和/或纳米结构基底。

11.根据实施方式1-10中任一项所述的方法，其中所述介质颗粒包括表面增强拉曼颗粒。

12.根据实施方式1-11中任一项所述的方法，其中所述介质颗粒包括羟胺-银胶体颗粒、柠檬酸-银胶体颗粒和/或柠檬酸-金胶体颗粒。

13.根据实施方式1-12中任一项所述的方法，其中所述辅助分子包括小分子和/或大分子。

14.根据实施方式1-13中任一项所述的方法，其中所述辅助分子的种类与所述目标分子的种类相同。

15.根据实施方式1-14中任一项所述的方法，其中所述双组分表面增强拉曼光谱检测包括检测第一样品，所述第一样品包含所述介质颗粒以及至少两种所述辅助分子。

16.根据实施方式15所述的方法，其中所述双组分表面增强拉曼光谱检测包括以下步骤：至少一次降低所述第一样品中所述至少两种辅助分子的浓度。

17.根据实施方式16所述的方法，其中所述降低为与所述第一样品中所述辅助分子的原始浓度相比，每种所述辅助分子的浓度每次降低至少0.1个数量级。

18.根据实施方式16-17中任一项所述的方法，其中所述降低为与所述第一样品中所述辅助分子的原始浓度相比，每种所述辅助分子的浓度每次降低约0.1-约1个数量级。

19.根据实施方式1-18中任一项所述的方法，其中所述双组分表面增强拉曼光谱检测包括以下步骤：检测所述降低后所述第一样品中每种所述辅助分子所产生的光谱信号。

20.根据实施方式19所述的方法，其中在单张光谱中，当所述辅助分子所产生的光谱信号占所述单张光谱的光谱信号的至少85％，所述单张光谱为所述辅助分子单分子光谱。

21.根据实施方式19-20中任一项所述的方法，其中当所述辅助分子单分子光谱的光谱数量与产生光谱信号的光谱数量的比值为至少50％，所述介质颗粒具有针对所述辅助分子的单分子水平的检测灵敏度。

22.根据实施方式1-21中任一项所述的方法，其中所述表面增强拉曼光谱检测包括检测第二样品，所述第二样品包含所述介质颗粒以及至少一种所述辅助分子。

23.根据实施方式1-22中任一项所述的方法，其中所述表面增强拉曼光谱检测包括检测所述辅助分子产生的信号强度。

24.根据实施方式23所述的方法，其中所述表面增强拉曼光谱检测包括根据所述信号强度，计算在任意时间间隔产生的所述信号强度之间的相关性系数。

25.根据实施方式24所述的方法，其中当所述相关性系数的绝对值为约0.3以下，所述介质颗粒具有针对所述表面增强拉曼光谱检测的稳定性。

26.根据实施方式24-25中任一项所述的方法，其中当所述相关性系数的绝对值为约0.3以下，所述介质颗粒在至少60分钟内具有所述稳定性。

27.根据实施方式1-26中任一项所述的方法，其包括以下步骤：

b)对所述混合的所述介质颗粒和包含所述目标分子的样品进行拉曼检测，获得所述目标分子的拉曼光谱。

28.根据实施方式27所述的方法，其中所述拉曼检测包括表面增强拉曼光谱检测。

29.根据实施方式27-28中任一项所述的方法，其中所述拉曼检测包括数字化表面增强拉曼光谱检测。

30.根据实施方式29所述的方法，其包括以下步骤：

c)根据所述目标分子的拉曼光谱，获得所述目标分子在每张所述拉曼光谱中对应的丰度值。

31.根据实施方式30所述的方法，其中所述检测目标分子的方法包括以下步骤：根据不包含所述目标分子的空白样本的丰度值确定判断所述目标分子存在的阈值。

32.根据实施方式31所述的方法，其中所述检测目标分子的方法包括以下步骤：根据所述样本中所述目标分子被判断为存在的次数和/或频率获得所述目标分子在所述样品中的浓度。

33.根据实施方式30-32中任一项所述的方法，其中所述检测目标分子的方法包括以下步骤：根据所述样本中所述目标分子被判断为存在的次数和/或频率的数学映射关系获得所述目标分子在所述样品中的浓度。

34.根据实施方式30-33中任一项所述的方法，其中所述检测目标分子的方法包括以下步骤：调整包含所述目标分子的样品中所述目标分子的浓度。

35.根据实施方式30-34中任一项所述的方法，其中所述检测目标分子的方法包括以下步骤：调整所述介质颗粒与所述目标分子的结合能力。

36.根据实施方式30-35中任一项所述的方法，其中所述检测目标分子的方法包括以下步骤：调整包含所述目标分子的样品的理化性质。

37.根据实施方式30-36中任一项所述的方法，其中所述检测目标分子的方法包括以下步骤：调整所述拉曼检测所需的设备的参数。

38.根据实施方式30-37中任一项所述的方法，其中所述检测目标分子的方法包括以下步骤：调整每次拉曼检测中所述拉曼光谱的总数；和/或被检测为所述目标分子阳性的所述拉曼光谱的总数。

39.根据实施方式30-38中任一项所述的方法，其中所述检测目标分子的方法包括以下步骤：调整所述拉曼检测的次数。

40.根据实施方式28-39中任一项所述的方法，其中所述拉曼检测包括液相表面增强拉曼光谱检测。

41.实施方式1-40中任一项所述的介质颗粒在液相数字化表面增强拉曼光谱检测目标分子中的应用。

42.根据实施方式41所述的应用，其中所述介质颗粒与所述目标分子混合于液相体系。

43.根据实施方式1-42中任一项所述的应用，其中所述液相数字化表面增强拉曼光谱检测定量检测所述目标分子的浓度。

不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请发明的各个技术方案，而不用于限制本申请发明的范围。

实施例

实施例1以羟胺-银胶体颗粒(Hya-Ag NPs)为表面增强拉曼颗粒液相数字化表面增强拉曼光谱检测结晶紫(crystal violet，CV)

1、羟胺-银胶体颗粒的制备

合成100ml Hya-Ag NPs体系，盐酸羟胺21mg(Aladdin,99％)，氢氧化钠18mg(RHAWN,≥98％)溶于90mL水中，快速加入含有硝酸银17mg(Aladdin,99.8％)的水溶液10mL，快速振荡，溶液颜色最终稳定为黄色。羟胺-银胶体颗粒溶液的消光光谱参见图1，羟胺-银胶体颗粒溶液的透射电镜结果参见图2。

2、待测样品准备

配置不同浓度的CV(Absin，95％)-乙醇(Sinopharm，≥99.7％)溶液，将该溶液以1∶9的体积比例与羟胺-银胶体颗粒溶液混合，加入后进行超声振荡，使混合均匀，避光孵育1小时，短暂超声、振荡防止颗粒沉淀。

3、拉曼测试

取10μL溶液于毛细管内，置于拉曼共聚焦光谱仪，以638nm作为激光波长，激光功率12.67mW，10倍物镜，以10μm作为扫描步长，进行平台移动区域的扫描模式获取表面增强拉曼光谱。

4、定量计算

测得拉曼光谱后去除基线，选取800cm^-1作为CV特征拉曼峰，计算780-820cm^-1的峰面积来进行计算。求得空白对照(其中所述空白对照为不包含CV的乙醇溶液与羟胺-银胶体颗粒溶液以1∶9的体积比例混合得到的溶液)相对应的峰面积值的平均值加三倍标准差为200(counts·cm^-1)作为判断每一场光谱中是否存在CV的贡献的阈值(参见图3)。

图3中，将780-820cm^-1的峰面积作为定量指标，其中所述空白对照在该拉曼位移处的峰面积数值结果如图3所示。取阈值为≥平均值+3倍标准差，因此本实施例采用200(counts·cm^-1)作为判断是否存在CV的阈值(TH)。

对于所有待测样品的表面增强拉曼光谱，对是否存在CV进行逐一地判断，将判断为“存在CV”的光谱定义为“1”，将“不存在CV”的光谱定义为“0”(参见图4)。图4中，左列显示了不同浓度的CV在羟胺-银胶体颗粒溶液条件下，600个顺序扫描点的800cm^-1处峰面积值，其中TH表示是否存在CV的阈值。右列显示了将左列的数据进行数字化处理后的结果。其中定义为“1”的数码以竖线的形式标出。

计算出现”1“的次数与总测试光谱的比值，可以对应到CV在测试样品中的浓度。通过建立超低浓度的CV定量标准曲线(参见图5)，可以实现对超低浓度的CV的定量。图5中，4个点为不同浓度的CV在羟胺-银胶体颗粒溶液条件下三次测试的平均频率值；标准差为每个浓度下平均频率值的标准差；黑线为拟合直线y＝ax+b，其中R²＝0.99。

实施例2以柠檬酸-金胶体(Citrate-Au NPs)为表面增强拉曼颗粒液相数字化表面增强拉曼光谱检测硝基苯硫酚(4-Nitrobenzenethiol,4-NBT)

1、柠檬酸-金胶体颗粒的制备

合成550mL Citate-Au NPs体系，氯金酸240mg溶于500mL水中，煮沸，加入1％柠檬酸钠溶液50mL，继续煮沸约40分钟，溶液最终变为酒红色后稳定，快速冷却终止反应。柠檬酸-金胶体颗粒溶液的消光光谱的消光光谱参见图6，柠檬酸-金胶体颗粒溶液的透射电镜结果参见图7。

2、待测样品的准备

配置不同浓度的4-NBT-乙醇溶液，将该溶液以1∶9的体积比例与柠檬酸-金胶体颗粒溶液，混合后超声使混合均匀，静置孵育1小时，然后短暂超声、振荡，防止颗粒沉淀。

3、拉曼测试

取10μL溶液于毛细管内，置于拉曼共聚焦光谱仪，以638nm作为激光波长，激光功率12.67mW，10倍物镜，以10μm作为扫描步长，进行平台移动区域的扫描模式获取表面增强拉曼光谱。

4、定量计算

测得拉曼光谱后去除基线，选取1335cm^-1作为4-NBT特征拉曼峰，计算1305-1355cm^-1的峰面积来进行计算。求得空白对照(其中所述空白对照为不包含4-NBT的乙醇溶液与柠檬酸-金胶体颗粒溶液以1∶9的体积比例混合得到的溶液)相对应的峰面积值的平均值加三倍标准差为200(counts·cm^-1)作为判断每一场光谱中是否存在4-NBT的贡献的阈值(参见图8)。图8中，将1305-1355cm^-1的峰面积作为定量指标，其中所述空白对照在该拉曼位移处的峰面积数值结果如图8所示。取阈值为≥平均值+3倍标准差，因此本实施例采用200(counts·cm^-1)作为判断是否存在-4-NBT的阈值(TH)。

对于所有待测样品的表面增强拉曼光谱，对是否存在4-NBT进行逐一地判断，将判断为“存在4-NBT”的光谱定义为“1”，将“不存在4-NBT”的光谱定义为“0”(参见图9)。图9中，左列显示了不同浓度的4-NBT在柠檬酸-金胶体颗粒溶液条件下，600个顺序扫描点的1335cm^-1处峰面积值，其中TH表示是否存在4-NBT的阈值。右列显示了将左列的数据进行数字化处理后的结果。其中定义为“1”的数码以竖线的形式标出。

计算出现”1“的次数与总测试光谱的比值，可以对应到4-NBT在测试样品中的浓度。通过建立超低浓度的4-NBT定量标准曲线(参见图10)，可以实现对超低浓度的4-NBT的定量。图10中，4个点为不同浓度的4-NBT在柠檬酸-金胶体颗粒溶液条件下三次测试的平均频率值；标准差为每个浓度下平均频率值的标准差；黑线为拟合直线y＝ax+b，其中R²＝0.94。

实施例3以羟胺-银胶体颗粒(Hya-Ag NPs)为表面增强拉曼颗粒液相数字化表面增强拉曼光谱检测血红蛋白(hemoglobin)

1、羟胺-银胶体颗粒的制备

合成100ml Hya-Ag NPs体系，盐酸羟胺21mg(Aladdin,99％)，氢氧化钠18mg(RHAWN,≥98％)溶于90mL水中，快速加入含有硝酸银17mg(Aladdin,99.8％)的水溶液10mL，快速振荡，溶液颜色最终稳定为黄色。羟胺-银胶体颗粒溶液的消光光谱参见图1，羟胺-银胶体颗粒溶液的透射电镜结果参见图2。

2、待测样品准备

配置不同浓度的血红蛋白-水溶液，将该溶液以1∶9的体积比例与羟胺-银胶体颗粒溶液混合，加入后进行超声振荡，使混合均匀，短暂超声、振荡防止颗粒沉淀，立即进行测试。

3、拉曼测试

取10μL溶液于毛细管内，置于拉曼共聚焦光谱仪，以638nm作为激光波长，激光功率12.67mW，10倍物镜，以10μm作为扫描步长，进行平台移动区域的扫描模式获取表面增强拉曼光谱。

4、定量计算

测得拉曼光谱后去除基线，选取1245cm^-1作为血红蛋白特征拉曼峰，计算1220-1270cm-¹的峰面积来进行计算。求得空白对照(其中空白对照为超纯水与羟胺-银胶体颗粒溶液以1∶9的体积比例混合得到的溶液)相对应的峰面积值的平均值加三倍标准差为562(counts·cm^-1)作为判断每一张光谱中是否存在血红蛋白的贡献的阈值(参见图11)。

图11中，将1220-1270cm^-1的峰面积作为定量指标，其中所述空白对照在该拉曼位移处的峰面积数值结果如图11所示。取阈值为≥平均值+3倍标准差，因此本实施例采用562(counts·cm^-1)作为判断是否存在血红蛋白的阈值(TH)。

对于所有待测样品的表面增强拉曼光谱，对是否存在血红蛋白进行逐一地判断，将判断为“存在血红蛋白”的光谱定义为“1”，将“不存在血红蛋白”的光谱定义为“0”(参见图12)。图12中，左列显示了不同浓度的血红蛋白在羟胺-银胶体颗粒溶液条件下，200个顺序扫描点的1245cm^-1处峰面积值，其中TH表示是否存在血红蛋白的阈值。右列显示了将左列的数据进行数字化处理后的结果。其中定义为“1”的数码以竖线的形式标出。

计算出现“1”的次数与总测试光谱的比值，可以对应到血红蛋白在测试样品中的浓度。通过建立低浓度的血红蛋白定量标准曲线(图13)，可以实现对低浓度血红蛋白的定量。图13中，3个点为不同浓度的血红蛋白在羟胺-银胶体颗粒溶液条件下三次测试的平均频率值；标准差为每个浓度下平均频率值的标准差；黑线为拟合直线y＝ax+b，其中R²＝0.99。

实施例4以羟胺-银胶体颗粒(Hya-Ag NPs)为表面增强拉曼颗粒液相数字化表面增强拉曼光谱检测腺嘌呤核苷酸组成的核酸序列(A12)

1、羟胺-银胶体颗粒的制备

合成100ml Hya-Ag NPs体系，盐酸羟胺21mg(Aladdin,99％)，氢氧化钠18mg(RHAWN,≥98％)溶于90mL水中，快速加入含有硝酸银17mg(Aladdin,99.8％)的水溶液10mL，快速振荡，溶液颜色最终稳定为黄色。羟胺-银胶体颗粒溶液的消光光谱参见图1，羟胺-银胶体颗粒溶液的透射电镜结果参见图2。

2、待测样品准备

配置不同浓度的A12水溶液，将该溶液以1∶9的体积比例与羟胺-银胶体颗粒溶液混合，加入后进行超声振荡，使混合均匀，短暂超声、振荡防止颗粒沉淀，立即进行测试。

3、拉曼测试

取10μL溶液于毛细管内，置于拉曼共聚焦光谱仪，以638nm作为激光波长，激光功率12.67mW，10倍物镜，以10μm作为扫描步长，进行平台移动区域的扫描模式获取表面增强拉曼光谱。

4、定量计算

测得拉曼光谱后去除基线，选取728cm^-1作为A12特征拉曼峰，计算705-755cm-¹的峰面积来进行计算。求得空白对照(其中空白对照为超纯水与羟胺-银胶体颗粒溶液以1∶9的体积比例混合得到的溶液)相对应的峰面积值的平均值加三倍标准差为500(counts·cm^-1)作为判断每一张光谱中是否存在A12的贡献的阈值(参见图11)。

图14中，将705-755cm^-1的峰面积作为定量指标，其中所述空白对照在该拉曼位移处的峰面积数值结果如图14所示。取阈值为≥平均值+3倍标准差，因此本实施例采用500(counts·cm^-1)作为判断是否存在A12的阈值(TH)。

对于所有待测样品的表面增强拉曼光谱，对是否存在A12进行逐一地判断，将判断为“存在A12”的光谱定义为“1”，将“不存在A12”的光谱定义为“0”(参见图15)。图15中，左列显示了不同浓度的A12在羟胺-银胶体颗粒溶液条件下，200个顺序扫描点的728cm^-1处峰面积值，其中TH表示是否存在A12的阈值。右列显示了将左列的数据进行数字化处理后的结果。其中定义为“1”的数码以竖线的形式标出。

计算出现“1”的次数与总测试光谱的比值，可以对应到A12在测试样品中的浓度。通过建立低浓度的A12定量标准曲线(图16)，可以实现对低浓度A12的定量。图16中，3个点为不同浓度的A12在羟胺-银胶体颗粒溶液条件下三次测试的平均频率值；标准差为每个浓度下平均频率值的标准差；黑线为拟合直线y＝ax+b，其中R²＝0.98。

实施例5选择适于液相数字化表面增强拉曼光谱检测的表面增强拉曼颗粒

以双组分表面增强拉曼技术来验证表面增强拉曼颗粒的单分子检测能力，步骤如下：

(1)配制包含两种目标分子的待测液，将其与表面增强拉曼颗粒溶液均匀混合；

(2)将该混合样品进行Raman mapping测试；

(3)分析所获得的光谱，找出所获得光谱中包含目标分子信号的光谱；

(4)在所有包含目标分子信号的光谱中，分析光谱包含目标分子信号的情况，可以以某一种目标分子在产生信号中所贡献的比例为指标进行统计；

(5)当待测液中两种目标分子的浓度逐渐降低，若可以获得大量仅包含单种目标分子产生的信号的光谱，即认为该表面增强拉曼颗粒具有单分子检测灵敏度。

一、以羟胺-银胶体颗粒(Hya-Ag NPs)为待选的表面增强拉曼颗粒进行检测

结果如表1和图17所示：

表1

图17中，图17a显示了结晶紫信号强度在mapping区域的分布热图，其中比例尺为100μm；图17b显示了耐尔蓝信号强度在mapping区域的分布热图，其中比例尺为100μm；图17c显示了在有目标分子信号的光谱中结晶紫信号强度贡献比例。其中，当p<0.1或>0.9时，判断该光谱为单分子光谱；当0.1<p<0.9时，判断该光谱为包含两种分子的混合光谱。

二、以柠檬酸-银胶体颗粒(Citrate-Ag NPs)为待选的表面增强拉曼颗粒进行检测

结果如表2和图18所示：

表2

图18中，图18a显示了结晶紫信号强度在mapping区域的分布热图，其中比例尺为50μm；图18b显示了耐尔蓝信号强度在mapping区域的分布热图，其中比例尺为50μm；图18c显示了在有目标分子信号的光谱中结晶紫信号强度贡献比例。其中，当p<0.1或>0.9时，判断该光谱为单分子光谱；当0.1<p<0.9时，判断该光谱为包含两种分子的混合光谱。

三、以柠檬酸-金胶体颗粒(Citrate-Au NPs)为待选的表面增强拉曼颗粒进行检测

结果如表3和图19所示：

表3

图19中，图19a显示了结晶紫信号强度在mapping区域的分布热图，其中比例尺为50μm；图19b显示了耐尔蓝信号强度在mapping区域的分布热图，其中比例尺为50μm；图19c显示了在有目标分子信号的光谱中结晶紫信号强度贡献比例。其中，当p<0.1或>0.9时，判断该光谱为单分子光谱；当0.1<p<0.9时，判断该光谱为包含两种分子的混合光谱。

实施例6选择适于液相数字化表面增强拉曼光谱检测的表面增强拉曼颗粒

6.1以羟胺-银纳米颗粒(Hya-Ag NPs)为表面增强拉曼颗粒通过表面增强拉曼光谱检测结晶紫(crystal violet，CV)

1、根据实施例1步骤1合成羟胺-银纳米颗粒。

2、待测样品准备

配置CV(Absin，95％)-乙醇(Sinopharm，≥99.7％)溶液，将该溶液以1∶9的体积比例与羟胺-银胶体颗粒溶液混合，CV终浓度为1nM，加入后进行超声振荡，使混合均匀，避光孵育1小时，短暂超声、振荡防止颗粒沉淀。

3、拉曼测试

取10μL溶液于毛细管内，置于拉曼共聚焦光谱仪，以638nm作为激光波长，激光功率12.67mW，10倍物镜，以10μm作为扫描步长，进行平台移动区域的扫描模式获取表面增强拉曼光谱。

4、定量计算

测得拉曼光谱后去除基线，选取800cm^-1作为CV特征拉曼峰，计算780-820cm^-1的峰面积来进行计算。根据光谱的时间序列计算光谱间的CV特征拉曼峰面积值的自相关函数。

结果如图20所示。图20反映了羟胺-银纳米颗粒增强CV时间序列光谱的自相关系数。其中自相关系数的计算步骤可以参考(Brockwell,P.J.,and R.A.Davis.1987.TimeSeries:Theory and Methods.Springer-Verlag.)。图20中任意时间间隔的光谱之间的相关性系数均呈现不相关(|r|<0.3)。可见羟胺-银胶体颗粒随时间扫描的光谱序列呈现“平稳”的状态，可以将羟胺-银胶体颗粒作为液相数字化表面增强拉曼光谱检测所需的表面增强拉曼颗粒。

6.2以柠檬酸-银纳米星颗粒(Citrate-Ag NSs)为表面增强拉曼颗粒通过表面增强拉曼光谱检测结晶紫(crystal violet，CV)

1、根据参考文献(Adianez Garcia-Leis,Irene Rivera-Arreba,SantiagoSanchez-Cortes.Morphological tuning of plasmonic silver nanostars bycontrolling the nanoparticle growth mechanism:Application in the SERSdetection of the amyloid marker Congo Red.Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects 2017,535,49-60.)合成柠檬酸-银纳米星颗粒。

2、待测样品准备

配置CV(Absin，95％)-乙醇(Sinopharm，≥99.7％)溶液，将该溶液以1∶9的体积比例与羟胺-银胶体颗粒溶液混合，CV终浓度为10pM，加入后进行超声振荡，使混合均匀，避光孵育1小时，短暂超声、振荡防止颗粒沉淀。

3、拉曼测试

取10μL溶液于毛细管内，置于拉曼共聚焦光谱仪，以638nm作为激光波长，激光功率12.67mW，10倍物镜，以10μm作为扫描步长，进行平台移动区域的扫描模式获取表面增强拉曼光谱。

4、定量计算

测得拉曼光谱后去除基线，选取800cm^-1作为CV特征拉曼峰，计算780-820cm^-1的峰面积来进行计算。根据光谱的时间序列计算光谱间的CV特征拉曼峰面积值的自相关函数。

结果如图21所示。图21反映了柠檬酸-银纳米星颗粒增强CV时间序列光谱的自相关系数。图21中任意时间间隔的光谱之间的相关性系数均呈中度/低度相关(|r|>0.3)。可见柠檬酸-银纳米星颗粒随时间扫描的光谱序列信号强度逐渐增大，不稳定，因此不能将该柠檬酸-银胶体颗粒作为液相数字化表面增强拉曼光谱检测所需的表面增强拉曼颗粒。

实施例7选择适于液相数字化表面增强拉曼光谱检测的表面增强拉曼颗粒

通过消光光谱来判断是否适于作为液相数字化表面增强拉曼光谱检测所需的表面增强拉曼颗粒。

7.1准备以羟胺-银纳米颗粒(Hya-Ag NPs)为表面增强拉曼颗粒通过表面增强拉曼光谱检测结晶紫(crystal violet，CV)

1、根据实施例1步骤1合成羟胺-银纳米颗粒。

2、取3mL该颗粒溶液于比色皿中，每30min在紫光可见光分光光度计中进行消光光谱测试，期间液体不取出、不晃动，保持静置。

结果如图22所示。图22为羟胺-银纳米颗粒随时间变化的消光光谱，结果显示消光峰光谱在3个小时内变化不明显，消光峰(～406nm处)强度的相对标准差为0.35％，3小时末值与初值相差约0.87％(计算方法为：(末值-初值)/初值×100％)，几乎不变。可见羟胺-银胶体颗粒随时间呈现“平稳”的状态，可以将羟胺-银胶体颗粒作为液相数字化表面增强拉曼光谱检测所需的表面增强拉曼颗粒。

7.2准备以柠檬酸-银纳米星颗粒(Citrate-Ag NSs)为表面增强拉曼颗粒通过表面增强拉曼光谱检测结晶紫(crystal violet，CV)

1、根据参考文献(Adianez Garcia-Leis,Irene Rivera-Arreba,SantiagoSanchez-Cortes.Morphological tuning of plasmonic silver nanostars bycontrolling the nanoparticle growth mechanism:Application in the SERSdetection of the amyloid marker Congo Red.Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects 2017,535,49-60.)合成柠檬酸-银纳米星颗粒。

2、取3mL该颗粒溶液于比色皿中，每30min在紫光可见光分光光度计中进行消光光谱测试，期间液体不取出、不晃动，保持静置。

结果如图23所示。图23为柠檬酸-银纳米星粒随时间变化的消光光谱，结果显示消光峰光谱在3个小时内变化明显，消光峰(～420nm处)强度的相对标准差为2.7％，3小时末值与初值相差约-8.2％(计算方法为：(末值-初值)/初值×100％)。可见柠檬酸-银纳米星颗粒随时间呈现“不稳定”的状态，因此无法将该柠檬酸-银纳米星颗粒作为液相数字化表面增强拉曼光谱检测所需的表面增强拉曼颗粒。

实施例8选择适于液相数字化表面增强拉曼光谱检测的表面增强拉曼颗粒

8.1以羟胺-银纳米颗粒(Hya-Ag NPs)为表面增强拉曼颗粒通过表面增强拉曼光谱检测结晶紫(crystal violet，CV)

(1)羟胺-银纳米颗粒与结晶紫-乙醇溶液以体积9∶1均匀混合，结晶紫分子在该混合样品中的终浓度为10^-7M，超声混合均匀，静置孵育30分钟，然后短暂超声、振荡，防止颗粒沉淀

(2)取10μL的样品注入毛细管中，设置参数(波长：638nm,功率：12.67mW，积分时间：0.1s，物镜：10倍，步长：10μm)，进行平台移动区域的扫描模式获取表面增强拉曼光谱

(3)测得拉曼光谱后去除基线，选取800cm^-1作为CV特征拉曼峰，计算780-820cm^-1的峰面积来进行计算所有获得的光谱对应的该CV-特征峰面积的相对标准差。

结果如图24所示。图24显示了羟胺-银纳米颗粒增强10^-7M CV的时间序列光谱集中CV-特征峰峰面积强度。结果显示CV-特征峰峰面积随时间变化不大，信号强度保持稳定，相对标准差仅15％，可见可以将羟胺-银胶体颗粒作为液相数字化表面增强拉曼光谱检测所需的表面增强拉曼颗粒。

实施例9以羟胺-银胶体颗粒(Hya-Ag NPs)为表面增强拉曼颗粒液相数字化表面增强拉曼光谱检测催产素(oxytocin)

1、羟胺-银胶体颗粒的制备

合成100mL Hya-Ag NPs体系，盐酸羟胺21mg(Aladdin,99％)，氢氧化钠18mg(RHAWN,≥98％)溶于90mL水中，快速加入含有硝酸银17mg(Aladdin,99.8％)的水溶液10mL，快速振荡，溶液颜色最终稳定为黄色。羟胺-银胶体颗粒溶液的消光光谱参见图1，羟胺-银胶体颗粒溶液的透射电镜结果参见图2。

2、待测样品准备

配置不同浓度的催产素-水溶液，将该溶液以1∶9的体积比例与羟胺-银胶体颗粒溶液混合，加入后进行超声振荡，使混合均匀，短暂超声、振荡防止颗粒沉淀，立即进行测试。

3、拉曼测试

取10μL溶液于毛细管内，置于拉曼共聚焦光谱仪，以532nm作为激光波长，激光功率37.3mW，10倍物镜，以10μm作为扫描步长，进行平台移动区域的扫描模式获取表面增强拉曼光谱。

4、定量计算

测得拉曼光谱后去除基线，选取653cm^-1作为催产素特征拉曼峰，计算625-675cm^-1的峰面积来进行计算。求得空白对照(其中空白对照为超纯水与羟胺-银胶体颗粒溶液以1∶9的体积比例混合得到的溶液)相对应的峰面积值的平均值加三倍标准差为1000(counts·cm^-1)作为判断每一张光谱中是否存在催产素的贡献的阈值(参见图25)。

图25中，将625-675cm^-1的峰面积作为定量指标，其中所述空白对照在该拉曼位移处的峰面积数值结果如图25所示。取阈值为≥平均值+3倍标准差，因此本实施例采用1000(counts·cm^-1)作为判断是否存在催产素的阈值(TH)。

对于所有待测样品的表面增强拉曼光谱，对是否存在催产素进行逐一地判断，将判断为“存在催产素”的光谱定义为“1”，将“不存在催产素”的光谱定义为“0”(参见图26)。图26中，左列显示了不同浓度的催产素在羟胺-银胶体颗粒溶液条件下，200个顺序扫描点的653cm^-1处峰面积值，其中TH表示是否存在催产素的阈值。右列显示了将左列的数据进行数字化处理后的结果。其中定义为“1”的数码以竖线的形式标出。

计算出现“1”的次数与总测试光谱的比值，可以对应到催产素在测试样品中的浓度。通过建立低浓度的催产素定量标准曲线(图27)，可以实现对低浓度催产素的定量。图27中，3个点为不同浓度的催产素在羟胺-银胶体颗粒溶液条件下三次测试的平均频率值；标准差为每个浓度下平均频率值的标准差；黑线为拟合直线y＝ax+b，其中R²＝0.96。

实施例10以羟胺-银胶体颗粒(Hya-Ag NPs)为表面增强拉曼颗粒液相数字化表面增强拉曼光谱检测豆芽匀浆中的福美双(thiram)

1、羟胺-银胶体颗粒的制备

合成100ml Hya-Ag NPs体系，盐酸羟胺21mg(Aladdin,99％)，氢氧化钠18mg(RHAWN,≥98％)溶于90mL水中，快速加入含有硝酸银17mg(Aladdin,99.8％)的水溶液10mL，快速振荡，溶液颜色最终稳定为黄色。羟胺-银胶体颗粒溶液的消光光谱参见图1，羟胺-银胶体颗粒溶液的透射电镜结果参见图2。

2、待测样品准备

配置不同浓度的福美双-豆芽匀浆混合液，经过0.22微米滤膜过滤后，将该滤液以1∶9的体积比例与羟胺-银胶体颗粒溶液混合，加入后进行超声振荡，使混合均匀，短暂超声、振荡防止颗粒沉淀，立即进行测试。

3、拉曼测试

取10μL溶液于毛细管内，置于拉曼共聚焦光谱仪，以638nm作为激光波长，激光功率12.67mW，10倍物镜，以10μm作为扫描步长，进行平台移动区域的扫描模式获取表面增强拉曼光谱。

4、定量计算

测得拉曼光谱后去除基线，选取1377cm^-1作为福美双特征拉曼峰，计算1355-1405cm^-1的峰面积来进行计算。求得空白对照(其中空白对照为不含有福美双的豆芽匀浆滤液与羟胺-银胶体颗粒溶液以1∶9的体积比例混合得到的溶液)相对应的峰面积值的平均值加三倍标准差为450(counts·cm^-1)作为判断每一张光谱中是否存在福美双的贡献的阈值(参见图28)。

图28中，将1355-1405cm^-1的峰面积作为定量指标，其中所述空白对照在该拉曼位移处的峰面积数值结果如图28所示。取阈值为≥平均值+3倍标准差，因此本实施例采用450(counts·cm^-1)作为判断是否存在福美双的阈值(TH)。

对于所有待测样品的表面增强拉曼光谱，对是否存在福美双进行逐一地判断，将判断为“存在福美双”的光谱定义为“1”，将“不存在福美双”的光谱定义为“0”(参见图29)。图29中，左列显示了不同浓度的福美双-豆芽匀浆滤液中，400个顺序扫描点的1377cm^-1处峰面积值，其中TH表示是否存在福美双的阈值。右列显示了将左列的数据进行数字化处理后的结果。其中定义为“1”的数码以竖线的形式标出。

计算出现“1”的次数与总测试光谱的比值，可以对应到福美双在测试样品中的浓度。通过建立低浓度的福美双定量标准曲线(图30)，可以实现对低浓度福美双的定量。图30中，4个点为不同浓度的福美双溶液三次测试的平均频率值；标准差为每个浓度下平均频率值的标准差；黑线为拟合直线y＝ax+b，其中R²＝0.99。

实施例11以羟胺-银胶体颗粒(Hya-Ag NPs)为表面增强拉曼颗粒液相数字化表面增强拉曼光谱检测湖水中的百草枯(paraquat)

1、羟胺-银胶体颗粒的制备

合成100ml Hya-Ag NPs体系，盐酸羟胺21mg(Aladdin,99％)，氢氧化钠18mg(RHAWN,≥98％)溶于90mL水中，快速加入含有硝酸银17mg(Aladdin,99.8％)的水溶液10mL，快速振荡，溶液颜色最终稳定为黄色。羟胺-银胶体颗粒溶液的消光光谱参见图1，羟胺-银胶体颗粒溶液的透射电镜结果参见图2。

2、待测样品准备

配置不同浓度的百草枯-湖水混合液，经过0.22微米滤膜过滤后，将该滤液以1∶9的体积比例与羟胺-银胶体颗粒溶液混合，加入后进行超声振荡，使混合均匀，短暂超声、振荡防止颗粒沉淀，立即进行测试。

3、拉曼测试

取10μL溶液于毛细管内，置于拉曼共聚焦光谱仪，以638nm作为激光波长，激光功率12.67mW，10倍物镜，以10μm作为扫描步长，进行平台移动区域的扫描模式获取表面增强拉曼光谱。

4、定量计算

测得拉曼光谱后去除基线，选取1644cm^-1作为百草枯特征拉曼峰，计算1620-1670cm^-1的峰面积来进行计算。求得空白对照(其中空白对照为不含有百草枯的湖水滤液与羟胺-银胶体颗粒溶液以1∶9的体积比例混合得到的溶液)相对应的峰面积值的平均值加三倍标准差为450(counts·cm^-1)作为判断每一张光谱中是否存在百草枯的贡献的阈值(参见图31)。

图31中，将1620-1670cm^-1的峰面积作为定量指标，其中所述空白对照在该拉曼位移处的峰面积数值结果如图31所示。取阈值为≥平均值+3倍标准差，因此本实施例采用450(counts·cm^-1)作为判断是否存在百草枯的阈值(TH)。

对于所有待测样品的表面增强拉曼光谱，对是否存在百草枯进行逐一地判断，将判断为“存在百草枯”的光谱定义为“1”，将“不存在百草枯”的光谱定义为“0”(参见图32)。图32中，左列显示了不同浓度的百草枯-湖水滤液中，400个顺序扫描点的1644cm^-1处峰面积值，其中TH表示是否存在百草枯的阈值。右列显示了将左列的数据进行数字化处理后的结果。其中定义为“1”的数码以竖线的形式标出。

计算出现“1”的次数与总测试光谱的比值，可以对应到百草枯在测试样品中的浓度。通过建立低浓度的百草枯定量标准曲线(图33)，可以实现对低浓度百草枯的定量。图33中，3个点为不同浓度的百草枯溶液三次测试的平均频率值；标准差为每个浓度下平均频率值的标准差；黑线为拟合直线y＝ax+b，其中R²＝0.99。

实施例12增加数字化表面增强拉曼光谱检测中包含的光谱总数/判断为存在目标分子的光谱数量来提高检测准确性

1.待测样品准备

配置1pM结晶紫-乙醇混合液，以1∶9的体积比例与羟胺-银胶体颗粒溶液混合，加入后进行超声振荡，使混合均匀，短暂超声、振荡防止颗粒沉淀，立即进行测试。

2、拉曼测试

取10μL溶液于毛细管内，置于拉曼共聚焦光谱仪，以638nm作为激光波长，激光功率12.67mW，10倍物镜，以10μm作为扫描步长，进行平台移动区域的扫描模式获取表面增强拉曼光谱，分别设定每次测试扫描所获得的光谱总数为100、200、300、600、1000张，并重复三次。

3、定量计算

如实例1所述，计算每一次测试的阳性率，对应于相同光谱总数的三次测试所得阳性率计算相对标准差，可以获得阳性率相对标准差与扫描光谱总数的关系曲线，如图34所示。该阳性率相对标准差可以直接反映定量的误差，因而可得，随着扫描光谱总数的增加而定量误差逐渐减小。上述变化趋势与对应于扫描光谱总数的理论计数误差的变化规律保持一致。

实施例13不同的镜头参数对数字化表面增强拉曼光谱检测中检测相同浓度的目标分子的检出率的影响

1.待测样品准备

配置不同浓度的结晶紫-乙醇混合液，以1∶9的体积比例与羟胺-银胶体颗粒溶液混合，加入后进行超声振荡，使混合均匀，短暂超声、振荡防止颗粒沉淀，立即进行测试。

2、拉曼测试

取10μL溶液于毛细管内，置于拉曼共聚焦光谱仪，以638nm作为激光波长，激光功率12.67mW，进行平台移动区域的扫描模式获取表面增强拉曼光谱，采用的扫描步长为10μm，物镜分别选用10倍，40倍和60倍镜头对每种样品分别进行测试。

3、定量计算

如实例1所述，计算每一次测试的阳性率，对应于每一种物镜镜头可以分别获得一条液相数字化表面增强拉曼光谱的结晶紫定量标准曲线(如图35所示)。

该实验中通过采用不同倍数的物镜来控制每张光谱采集时的探测体积，即对应于10倍、40倍、60倍物镜探测体积依次减小。随着探测体积减小，标准曲线的可定量浓度上限变高，曲线的斜率增大。

前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方式的范围内。

Claims (21)

1.检测目标分子的方法，其中所述检测包括单分子水平定量检测，其包括以下步骤：

a) 使介质颗粒与包含所述目标分子的样品混合，其中所述介质颗粒与所述样品混合于液相体系，其中所述样品以溶液的形式存在，其中所述介质颗粒分散在溶液中，其中所述介质颗粒显示下述性质：

1） 利用所述介质颗粒对辅助分子进行双组分表面增强拉曼光谱检测，其中所述双组分表面增强拉曼光谱检测包括检测第一样品，所述第一样品包含所述介质颗粒以及至少两种所述辅助分子；其中所述双组分表面增强拉曼光谱检测包括以下步骤：至少一次降低所述第一样品中所述至少两种辅助分子的浓度；检测所述降低后所述第一样品中每种所述辅助分子所产生的光谱信号；

以某一种辅助分子在产生光谱信号中所贡献的比例为指标进行统计，其中在单张光谱中，当某一种所述辅助分子所产生的光谱信号占所述单张光谱的光谱信号的至少85%，所述单张光谱为所述辅助分子单分子光谱；

其中所述辅助分子单分子光谱的光谱数量与产生光谱信号的光谱数量的比值为至少50%；和，

2）利用所述介质颗粒对辅助分子进行表面增强拉曼光谱检测，其中所述辅助分子在任意时间间隔产生的信号强度之间的相关性系数的绝对值为0.3以下；

b) 对所述混合的所述介质颗粒和包含所述目标分子的样品进行拉曼检测，获得所述目标分子的拉曼光谱；

其中所述拉曼检测包括数字化表面增强拉曼光谱检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述混合包括所述介质颗粒与所述样品在液相体系中孵育。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标分子包括小分子和/或大分子。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述大分子包括肽和/或蛋白质。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述介质颗粒包括金属纳米粒子溶胶、金属纳米粒子和/或纳米结构基底。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述介质颗粒包括羟胺-银胶体颗粒和/或柠檬酸-金胶体颗粒。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述辅助分子的种类与所述目标分子的种类相同。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述降低为与所述第一样品中所述辅助分子的原始浓度相比，每种所述辅助分子的浓度每次降低至少0.1个数量级。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述降低为与所述第一样品中所述辅助分子的原始浓度相比，每种所述辅助分子的浓度每次降低0.1-1个数量级。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述2）中，所述表面增强拉曼光谱检测包括检测第二样品，所述第二样品包含所述介质颗粒以及至少一种所述辅助分子。

11.根据权利要求1所述的方法，其中当所述相关性系数的绝对值为0.3以下，所述介质颗粒在至少60分钟内具有所述稳定性。

12.根据权利要求1所述的方法，其包括以下步骤：

c）根据所述目标分子的拉曼光谱，获得所述目标分子在每张所述拉曼光谱中对应的丰度值。

13.根据权利要求12所述的方法，其中检测目标分子的方法包括以下步骤：根据不包含所述目标分子的空白样本的丰度值确定判断所述目标分子存在的阈值。

14.根据权利要求13所述的方法，其中检测目标分子的方法包括以下步骤：根据所述样品中所述目标分子被判断为存在的次数和/或频率获得所述目标分子在所述样品中的浓度。

15.根据权利要求12-13中任一项所述的方法，其中检测目标分子的方法包括以下步骤：根据所述样品中所述目标分子被判断为存在的次数和/或频率的数学映射关系获得所述目标分子在所述样品中的浓度。

16.根据权利要求12-13中任一项所述的方法，其中检测目标分子的方法包括以下步骤：调整包含所述目标分子的样品中所述目标分子的浓度。

17.根据权利要求12-13中任一项所述的方法，其中检测目标分子的方法包括以下步骤：调整所述介质颗粒与所述目标分子的结合能力。

18.根据权利要求12-13中任一项所述的方法，其中检测目标分子的方法包括以下步骤：调整包含所述目标分子的样品的理化性质。

19.根据权利要求12-13中任一项所述的方法，其中检测目标分子的方法包括以下步骤：调整所述拉曼检测所需的设备的参数。

20.根据权利要求12-13中任一项所述的方法，其中检测目标分子的方法包括以下步骤：调整每次拉曼检测中所述拉曼光谱的总数，和/或被检测为所述目标分子阳性的所述拉曼光谱的总数。

21.根据权利要求12-13中任一项所述的方法，其中检测目标分子的方法包括以下步骤：调整所述拉曼检测的次数。

Images