DE2326756B2 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure - Google Patents

Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure

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Description

Gegenstand der Patentanmeldung P 22 37 940.4 ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure, in welchem man auf eine Harnsäure enthaltende Probe Uricase und Katalase in Gegenwart von Äthanol unter Luftzutritt einwirken läßt, dadurch gekennzeichnet, daß man den entstandenen Acetaldehyd unter Einwirkung von Alkoholdehydrogenase mit NADH 7U Äthanol rückreduziert und die Abnahme der NADH-Konzentration durch spektrophotometrische Bestimmung mißt, wobei das Verfahren bei einem pH von 6,8—7,1 durchgeführt wird und dem Reaktionsgemisch so viel Äthanol zugegeben wird, daß dessen Konzentration die Grenzen von 03—0,7 Vol.-% nicht überschreitet.
Es wurde nun gefunden, daß sich die volle enzymatische Harnsäure-Bestimmung auch dann quantitativ und ohne Störung durch Fremdsubstanzen durchführen läßt, wenn man das obengenannte Verfahren bei einem pH-Wert von 63—6,8 durchführt.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt in analoger Weise wie in der Stammanmeldung beschrieben.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel I
a. Reagentien und Reagenzlösungen
1. Phosphat-Puffer (pH 6,4)
6,647 g Kaliumdihydrogenphosphat und 2,538 g Dinatrium-hydrogenphosphat-dihydrat werden in 1000 ml bidestilliertem Wasser gelöst
2. NADH-Lösung
25 mg NADH werden in 10 ml einer einprozentigen Natriumbicarbonatlösung gelöst Die Lösung ist ca. 10 Tage haltbar.
3. Äthanol (absolut)
4. Alkohol-Dehydrogenase (Boehringer Mannheim)
Kristpllsuspension in 3,2 M Ammoniumsulfatlösung, pH ca. 6. Sp. Aktivität 200 U/mg (25° C)
5. Katalase (Boehringer Mannheim)
Lösung in 30% Glycerin/10% Äthanol. Sp. Aktivität 260 000 U/ml (25° C)
6. Uricase (Boeringer Mannheim)
Lösung in 50% Glycerin pH 10,2 50 mM Glycin; ίο 0,13 N Natriumcarbonat Sp. Aktivität 4,5 U/mg (25°C)
7. Harnsäure-Standardlösung (12 mg/100 ml)
12 mg Harnsäure werden mit 0,1 n· Natronlauge gelöst und auf 100 ml aufgefüllt
b. Durchführung der Harnsäure-Bestimmung
In eine 1-cm-Küvette werden nacheinander 2,0 ml Phosphatpuffer (1), 0,15 ml NADH-Lösung (2), 0,01 ml Äthanol, 0,01 ml Alkohol-dehydrogenase, 0,005 ml Katalase und schließlich 0,1 ml der Probe pipettiert
Es wird nach jedem Pipettieren kurz gemischt und der erste Extinktionswert (E\) bei 366 μιη 10 Minuten nach Zugabe der Probe abgelesen. Unmittelbar nach dem Ablesen von Ei werden 10 μΙ Uricase einpipettiert Nach weiteren 10 Minuten wird der zweite Extinktionswert (E2) bei derselben Wellenlänge abgelesen. Der Leerwert (L) wird gegen Wasser bestimmt.
Der Harnsäuregehalt wird wie folgt berechnet:
„ (E,-E2)-L = AE
AE χ 131 = mg% Harnsäure
Der Faktor 131 wurde empirisch bestimmt.
Harnsäure-Bestimmung von S Proben
)5 Es wurde uie Harnsäure-Standardlösung (vgl. auch Beispiel la, Punkt 7) parallel nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und nach dem Verfahren von Praetorius bestimmt. Man erhält für das erfindungsgemäße Verfahren die folgenden Werte (mg/100 ml):
j 12,2 12,2 12.2 11,6 lÜT]
Wie ersichtlich, wurden im Mittel 100% Harnsäure-Werte wiedergefunden.
Beispiel 2
Die in Beispiel I verwendeten Reagentien 1 —6 können vorteilhafterweise auch, entsprechend den im Abschnitt b) genannten Volumenverhältnissen, für einen oder mehrere Tests gemischt werden.
Man kann das dem Gemisch entnommene Testvolumen dann in einem einzigen weiteren Pipettierungsschritt mit der zu prüfenden Probe (Serum oder Urin, oder andere Hamsäiire-haltige Lösungen) versetzten, so daß die aufwendigen Einzelpipettierungen entfallen.
Dieses Reagentiengemisch ist beschränkt haltbar.

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure, in welchem man auf eine Harnsäure enthaltende Probe Uricase und Katalase in Gegenwart von Äthanol unter Luftzutritt einwirken läßt, den entstandenen Acetaldehyd unter Einwirkung von Alkoholdehydrogenase mit NADH zu Äthanol rückreduziert und die Abnahme der NADH-Konzentration durch spektrophotometrische Bestimmung mißt, wobei dem Reaktionsgemisch so viel Äthanol zugegeben wird, daß dessen Konzentration die Grenzen von 03—0,7 VoL-% nicht überschreitet, gemäß Patentanmeldung P2237940.4. dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren bei einem pH-Wert von 6,3—6,8 durchführt
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