CN102286607B - 一种甘油三磷酸脱氢酶活性检测试剂盒 - Google Patents

一种甘油三磷酸脱氢酶活性检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种甘油三磷酸脱氢酶活性检测试剂盒，包括细胞裂解液L，工作液A，工作液B，DHAP液，GPDH标准品；此试剂盒的操作方法简单，从细胞培养到最后的读数均在一个孔板中完成，适用于96孔板，因此使用此法可进行大样本高通量实验。

Description

一种甘油三磷酸脱氢酶活性检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种甘油三磷酸脱氢酶(GPDH)活性检测试剂盒，属于生物试剂技术领域。
背景技术
细胞培养中，脂肪前体细胞经过诱导分化成成熟脂肪细胞，在细胞内沉积脂滴，通常检测脂肪细胞分化的方法有染色法(油红0染色等)，RT-PCR(逆转录-聚合酶链反应)靶基因法，还有就是酶活生物化学测定法。在所有报道的酶活检测方法中，GPDH(甘油三磷酸脱氢酶)法是最常用的方法。GPDH活性代表了脂肪细胞的诱导分化程度。
目前已有的GPDH检测方法需要大量的细胞，而且由于细胞富集和酶提取等多步操作使传统方法受到很大限制。而本试剂盒提供的方法是96孔板模式，从细胞培养开始到最终的读数，所有步骤都是在一个孔板中完成，达到了最小程度的实验处理。与传统的方法相比，我们的方法适用于建立脂肪分化的高通量实验，实验简便，准确性高。美国和日本等发达国家有商业化的GPDH测定试剂盒(GPDH assay)，但价格非常昂贵。
例如美国生产的试剂盒组成包括底物试剂，包含NADH和DHAP；酶提取试剂。500次反应(96孔板)价格是594美金，每孔折合1.2美金。日本TAKARA公司提供的试剂盒包括GPDH底物试剂，酶提取缓冲液和稀释缓冲液。GPDH底物试剂包括DHAP，NADH和最佳缓冲液。96次反应(96孔板)，价格是529美金，每孔折合5.5美金。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种甘油三磷酸脱氢酶活性检测试剂盒。
一种甘油三磷酸脱氢酶活性检测试剂盒，包括细胞裂解液L，工作液A，工作液B，DHAP液，GPDH标准品；
所述细胞裂解液L，以配制50ml为例：0.1-0.3g Tris-base粉剂和0.01-0.02gEDTA粉剂溶于去离子水，再加2-6ul的b-巯[qiú]基乙醇，盐酸调PH到7.3-7.7，补水到50ml，4℃保存；
工作液A，以配制40ml为例：0.02-0.04g EDTA溶于去离子水中，加500-1000ul三乙醇胺和：0.2-0.4ul b-巯基乙醇，盐酸调PH到7.7，补水到40ml，4℃保存；
工作液B，以配制20ml为例：取0.01-0.03g NADH粉剂溶于去离子水，用NaOH溶液配成PH值等于11的溶液，终体积20ml，4℃保存；
DHAP液，以配制20ml为例：0.01-0.02g DHAP粉剂溶于去离子水，补水到20ml，4℃保存。
本试剂盒包括细胞裂解液L、工作液A、工作液B、DHAP液。试剂盒配制所需的DHAP和NADH买于美国SIGMA公司，折算后每孔0.2元人民币，其他试剂价格非常便宜，最终每孔价格不超过0.3元人民币。
此试剂盒的操作方法简单，从细胞培养到最后的读数均在一个孔板中完成，适用于96孔板，因此使用此法可进行大样本高通量实验。
附图说明
图1为标准曲线图；
图2为GPDH浓度与酶活性线性相关图；
图3为脂肪细胞分化过程中GPDH活性检测。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1
试剂盒组成：细胞裂解液L，工作液A，工作液B，DHAP液，GPDH标准品；
细胞裂解液L配制(50ml)：0.1-0.3g Tris-base粉剂和0.01-0.02g EDTA粉剂溶于去离子水，再加2-6ul的b-巯[qiú]基乙醇，盐酸调PH到7.3-7.7，补水到50ml，4℃保存；
工作液A(40ml)：0.02-0.04g EDTA溶于去离子水中，加500-1000ul三乙醇胺和：0.2-0.4ul b-巯基乙醇，盐酸调PH到7.7，补水到40ml，4℃保存；
工作液B(20ml)：取0.01-0.03g NADH粉剂溶于去离子水，用NaOH溶液配成PH值等于11的溶液，终体积20ml，4℃保存；
DHAP液(20ml)：0.01-0.02g DHAP粉剂溶于去离子水，补水到20ml，4℃保存；
实施例2
此方法测定原理：
Figure BSA00000547979800031
GPDH催化磷酸二羟丙酮(DHAP)转化成甘油三磷酸(Gly-3-p)，同时NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)转化成NAD，NADH水溶液在340nm处有吸收，因此，GPDH活性是通过测定340nm吸收光的降低来确定的。
试剂盒使用方法：
样本处理：
分化的脂肪细胞：诱导分化的脂肪细胞，PBS洗细胞1次，每孔细胞加100ul细胞裂解液L，裂解10分钟，5分钟吹打一次，裂解完后可以直接测量也可保存在-20℃直到测量。
配制工作溶液：按2∶1比例，取2ml A和1ml B混合即可，工作溶液现用现配。
GPDH标准品稀释：10mg/ml，用蒸馏水稀释。取1ul(10mg/ml)GPDH标准品溶于15ul蒸馏水，终体积16ul，终浓度0.625mg/ml，-20℃保存。
制备标准曲线时，将0.625mg/ml GPDH标准品分别稀释成0.03125mg/ml、0.015625mg/ml、0.0078125mg/ml、0.00390625mg/ml、0.001953125mg/ml、0mg/ml。
GPDH标准品活性测定：
参见下表1加样：
表1：GPDH测定加样流程
  蒸馏水(μL)   标准品(μL)   工作溶液(μL)
  空白管   10   90
  标准品   10   90
先加工作溶液90μL，再依次加入GPDH标准品10μL(96孔板加样体系)。37℃孵育10分钟；每孔同时加入10ul DHAP液开始反应(在酶标仪上用排枪加样)；立即测340nmOD值(0、0.5、1、1.5…、4分钟)；计算GPDH＝(ΔOD340/分×R×DR)/(6.22×L×D)；其中R为反应液总量，D为稀释样品量(标准品)，DR为稀释率；NADH在340nm消光系数＝6.22，L为光的路径长度＝1。标注：测量细胞样品，不加GPDH标准品。
因此在此反应体系中，GPDH活性可表示为：GPDH＝ΔOD340/分×R×DR/6.22×1×D＝ΔOD340/分×(10+90+10)×1/6.22×1×10＝1.7685ΔOD340/分；
通过上述公式，将各标准浓度的ΔOD340/分换算成酶活性，如下表：
Figure BSA00000547979800041
图1为标准曲线图，六个梯度稀释，六条直线的从下至上浓度分别是0.03125mg/ml、0.015625mg/ml、0.0078125mg/ml、0.00390625mg/ml、0.001953125mg/ml、0mg/ml。K值表示直线斜率，而ΔOD340/分＝2×K；R2表示散点线性相关程度，图1中，从上至下各浓度的散点线性相关程度都较高。从图1不难发现，GPDH浓度越高，斜率K值越大，ΔOD340/分越大，酶活性越高。
图2中，浓度以mg/ml为单位，活性是按照图1ΔOD340值，通过公式得出，之后绘成GPDH浓度和酶活性的线性相关图，相关系数R2＝0.988，非常高，说明此方法测量结果非常准确。
实施例3
如图3是本发明的一个具体实施例子，具体使用步骤如下：按105/孔接种前脂肪细胞到96孔板，待其长至融合(一般需要3天)。一旦融合，换诱导培养基进行诱导，孵育两天。孵育两天后换为正常生长培养基，每隔两天换液直至诱导完成。
取诱导第5天的细胞进行GPDH酶活测定，按操作步骤首先加裂解液100ul进行裂解，裂解十分钟后加工作液90ul，37℃孵育10分钟，酶标仪上加DHAP10ul，开始反应，并测量每孔OD值，并用水作为空白对照。
图3中，K表示斜率，R2表示散点线性相关程度，诱导5天的脂肪细胞的R2＝0.991，相关程度非常高，结果准确性非常高。
GPDH＝ΔOD340/分×R×DR/6.22×1×D＝ΔOD340/分×200×1/6.22×1×100＝1/3.11ΔOD340/分GPDH(水)＝0U，GPDH(诱导5天脂肪细胞)＝0.016U/ml。
R为反应液总量，D为稀释样品量(标准品/裂解液)，DR为稀释率；
反应液总量200ul包括裂解液100ul，工作液90ul和DHAP液10ul；稀释样品量就是裂解液的量100ul，样品没有稀释，故稀释率为1。
标注：ΔOD340/分＝2×K。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种甘油三磷酸脱氢酶活性检测试剂盒，其特征在于，包括细胞裂解液L，工作液A，工作液B，DHAP液，GPDH标准品；
所述细胞裂解液L，以配制50ml为例：0.1-0.3g Tris-base粉剂和0.01-0.02gEDTA粉剂溶于去离子水，再加2-6ul的b-巯基乙醇，盐酸调PH到7.3-7.7，补水到50ml，4℃保存；
工作液A，以配制40ml为例：0.02-0.04gEDTA溶于去离子水中，加500-1000ul三乙醇胺和0.2-0.4ul b-巯基乙醇，盐酸调PH到7.7，补水到40ml，4℃保存；
工作液B，以配制20ml为例：取0.01-0.03g NADH粉剂溶于去离子水，用NaOH溶液配成PH值等于11的溶液，终体积20ml，4℃保存；
DHAP液，以配制20ml为例：0.01-0.02g DHAP粉剂溶于去离子水，补水到20ml，4℃保存。 
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