JPH06205697A - サンプル中の微生物の検出方法 - Google Patents

サンプル中の微生物の検出方法

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JPH06205697A
JPH06205697A JP5236715A JP23671593A JPH06205697A JP H06205697 A JPH06205697 A JP H06205697A JP 5236715 A JP5236715 A JP 5236715A JP 23671593 A JP23671593 A JP 23671593A JP H06205697 A JPH06205697 A JP H06205697A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明はサンプル中の微生物の存在を迅速に
同定する方法を提供することを目的とする。 【構成】 本発明方法は、サンプル容器を複数の別々の
区域へ分け、その各々を微生物の存在について別々にモ
ニターするものである。 【効果】 サンプルを本発明容器へ入れると、モニター
する量が少ない（サンプルと比較して）ので検出が簡易
化し；微生物検出が濃度依存性現象であるので、微生物
汚染の存在を検出しうる速度が上昇する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はサンプル中の微生物の強
化した検出方法およびその装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】サンプルの微生物の検出方法は一般に時
間がかかりそして骨の折れる臨床的方法である。普通行
う場合には、少量のサンプル、いわゆる接種材料を微生
物増殖促進培地へ置く。次いでこの系を適当な条件で培
養し、適当な時間経過後に結果を読み取る。
【０００３】プレートを毎日検査しスコアを付ける。微
生物の推測される種類および使用する培地の種類に応じ
て、増殖していないプレートは一般に４〜８日間廃棄さ
れない。非常に高濃度の微生物を有する少量のサンプル
については、上記手段は良好に働く。増殖可能な微生物
が低濃度のためにかなり多量の液状サンプルが必要な場
合にはサンプルを液状培地の数倍量で希釈し、混合物を
培養して増殖を検出する。普通、増殖可能な微生物の存
在を試験する滅菌サンプルたとえば血液サンプルは、増
殖の検出が可能になるまで１〜数日間を要するであろ
う。ビンを毎日詳しく調べる。増殖していないビンは一
般に５〜７日間は廃棄されない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】すなわち、この培養時
間を減らす必然性がある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記のことは本発明方法
により実現される。簡単には、本発明方法において、サ
ンプル容器は複数の別々の領域へ分けられ、その各々が
微生物の存在について別々にモニターされうる。サンプ
ルをこの容器へ入れると、モニターする量が少ない（サ
ンプルと比較して）ので検出が簡単になる；なぜなら、
微生物検出は濃度依存性現象であり、微生物汚染の存在
を検出しうるスピードが増加するからである。
【０００６】図１は、格子組式区画部（ｉｎｔｅｒｌｏ
ｃｋｉｎｇ ｄｉｖｉｄｅｒｓ）を用いてサンプルを複
数の区画へ分けるための好ましい装置を表し；（ａ）は
一面を貫通した装置を示し；（ｂ）は側面図であり；そ
して（ｃ）は格子組式区画部の詳細図である。
【０００７】本発明は、サンプルを別々の領域へ分けそ
して各々を別個に分析することにより微生物の検出を強
化して必要な検出時間を短くすることによる、微生物検
出を強化する便利な方法を提供するものである。検出は
この系の細菌濃度に依存するため、個々の区画の各々の
分析は系においてより迅速に、そして全混合物の分析よ
りも全体的に低濃度で細菌の検出をすることができるで
あろう。
【０００８】実施例としては、ベクトン、ディキンソン
アンド カンパニー（Becton，Dickinson and Compan
y) により市販されているBACTECＲ血液培養分析器シス
テムが陽性結果を得るために1X106 微生物／mlのほぼ限
界濃度を必要とする。初期接種材料を培養基で50mlまで
希釈してわずか1CFU(0.02CFU/ml)を含む場合、この限界
濃度を達成するために合計26世代が必要であろうと計算
することができる。1個の生物は5X107 個以上の生物へ
増殖するであろう。平均世代時間30分で、これは検出時
間13時間に換算できる( 増殖開始前に遅れ（ｌａｇ）が
ないと仮定して) 。
【０００９】本発明の好ましい実施態様において、サン
プル50mlを各々0.5ml の100 個の区画へ分ける。1X106C
FU/ml の有効濃度を必要とするであろう。これは生物を
含むセルにおいて19世代すなわち約9.5 時間で達成され
( 上述のように世代時間が同じでそして時間的遅れがな
いと仮定して) 、3.5 時間の短縮に変換される。サンプ
ル50mlを各々0.05mlの1000個の区画へ分けると、各々の
生物が1X106CFU/ml 以上に増殖するためにはわずか16世
代すなわち8 時間が必要なだけである。
【００１０】検査される区画の数およびこれら区画の容
積を特定用途にしたがってまたは装置の制限的指令によ
り変化させることができることは容易に認識される。区
画が相互に有効に離れているかぎりは、この分画を達成
するさらに別の手段は重要ではない。
【００１１】図１はこの分画に対する好ましい装置を示
し、これは格子組式区画部により一面を複数の区画に分
けられた培養ビンからなる。これらは別々の区画を平行
六面体形状に形成し、各々は同じ容積である。実際の使
用ではこれら区画部の高さは、使用する場合、培養する
間たとえば振とう器のような攪拌装置中での培養の間に
容量を完全に含むのに十分でなければならない。
【００１２】実際には、接種材料をビンへ入れ、次にこ
のビンを区画部を含む一面上に置きサンプルを別々の区
画へ分ける。次いでビンを培養し、いずれかの都合のよ
い方法で増殖について分析する。好ましい分析方法に
は、比色法、蛍光測定法、放射測定法、比濁法および赤
外線分析法がある。
【００１３】区画の形状および/ または容積は、各区画
について同一形状および容積が好ましいが変更可能なこ
とは認識されるべきである。
【００１４】微生物の迅速な検出に加えてこの方法は先
行技術より有利な2 つの別の主な利点を有する。第一
は、この方法が菌血症または敗血症の定量化を可能にす
る。第二は、この方法が多種微生物とも適合性があるこ
とであり、この方法はほとんどの環境下で生物の初期レ
ベルが低い限りは混合種から単離した培養物を作るであ
ろう。
【００１５】ワムポール ラボラトリーズ(Wampole Lab
oratories)より市販されてるアイソレーター(Isolator)
7.5 ミクロバイアルチューブ(Microbial Tube)は、遠心
分離により血液種から微生物を濃縮するための装置およ
びシステムである。この方法は30分の遠心回転で25工程
を越える手法を含む非常に時間と手間のかかるものであ
る。この方法はこれが元の血液サンプルにおける微生物
の数を推定しうるただ1 つの商業ベースの方法であるの
で、広く受け入れられてきた。ドーン(Dorn)らによるこ
の方法の評価(J．Clin．Micr.，9．p391-396) により、
遠心分離法によってのみもたらされる定量化は機会的感
染と皮膚の不潔とを区別しそして抗生物質療法の効果を
判定するにおいて幾つかの場合有用であることを証明し
た" 、と結論した。スリバン(Sullivan)ら(Pediatric
s，69，699-702) は子供の菌血症の程度は臨床疾患の深
刻さと関連することを示した。
【００１６】本発明方法において、原サンプルにおける
微生物の数の推定は増殖を示した区画の数を数えるのと
同じくらい簡単である。陽性凹部（ｗｅｌｌ）の数が全
凹部の数と比較して少ない場合、この推定は非常に正確
であることが予想されうる。陽性凹部の数が増えると、
推定の正確度および信頼性が悪くなる。しかしながら、
迅速な検出が最も都合のよいほとんどの種類の型たとえ
ば血液は一般に10cfu/ml未満の微生物数を有する。培地
で希釈すれば、凹部の10% 未満が陽性になるであろう。
【００１７】さらに、原サンプルにおける二種以上の微
生物の存在はほとんどのシステムで大きな問題である。
これは血液培養において重要で、しばしば発生する。多
種微生物菌血症が化膿性エピソードの18% 程の多さで報
告されそしてより高い死亡率に結びつく。全サンプルを
一つのビンへ入れるような場合、迅速に増殖する微生物
たとえば大腸菌に対し非常に容易で、他の存在する生物
が失われる。他の生物は検出されないかまたは同定およ
び感受性試験のために単離したコロニーを増殖するのに
さらに18〜24時間を必要とする。
【００１８】本発明方法において、少数の生物が存在す
る場合、各生物が別々の凹部へ入る可能性が高い。数種
が存在する場合、したがって各陽性凹部は一つの生物の
結果であり、したがって純粋な培養物であることが予想
されうる。もし一種( たとえば大腸菌) が原サンプル中
で主流の場合、ほとんどの陽性凹部に培養物があること
が期待される; しかし残りの陽性凹部における別の種の
増殖に影響を及ぼしたり妨げたりするものではない。す
なわち、複数の微生物の検出が非常に簡易化される。
【００１９】さらに、微生物の世代時間が長い、たとえ
ばミコバクテリアたとえば結核と関連するものの場合、
検出時間が非常に少なくなる。これにより診断がより速
くなり、そして治療をより早期に開始することができ
る。
【００２０】
【実施例】以下の実施例は本発明の特定の好ましい実施
態様を提供するものであるが、全ての実施態様の例示で
あることを意図するものではない。
【００２１】実施例１ 本発明方法の利点を説明するために、世代時間２０分ま
たは３０分で３０分の遅れ（１２時間の場合１日）と仮
定して、培養基中８０mlまで希釈された８mlアリコート
について、1X106CFU/ml の限界濃度を達成するのに必要
な時間を測定するために一連の計算を行った。結果を表
１に示す。
【００２２】
【表１】 表１ 世代時間 総ＣＦＵ 限界値までの時間 短縮した時間 ８ml血液中 （分） (CFU/ml) ａ ｂ ２０分 １（０．１２５） ５６０ ４２０ １４０ 分 ２（０．２５０） ５４０ ４２０ １２０ 分 ８（１．０） ５００ ４２０ ８０ 分 １６（２．０） ４８０ ４２０ ６０ 分 ３２（４．０） ４６０ ４２０ ４０ 分 ３０分 １（０．１２５） ８２５ ６１５ ２１０ 分 ２（０．２５０） ７９５ ６１５ １８０ 分 ８（１．０） ７３５ ６１５ １２０ 分 １６（２．０） ７０５ ６１５ ９０ 分 ３２（４．０） ６７５ ６１５ ６０ 分 日数 日数 １２時間 １（０．１２５） １４．２５ １０．７５ ３．５日 ＋１日の ２（０．２５０） １３．７５ １０．７５ ３日 遅れ ８（１．０） １２．７５ １０．７５ ２日 １６（２．０） １２．２５ １０．７５ １．５日 ３２（４．０） １１．７５ １０．７５ １日 注 ａ．通常のシステム、一回の測定 ｂ．0.666ml 区画部120 個を有する本発明装置 明らかなように、本発明のシステムは特に生物の初期濃
度が薄いか、または世代時間が長い場合に時間が著しく
短縮する。
【００２３】実施例２ 市販の細菌検出システムと本発明方法の比較スピードを
評価するために、このシステムを微量滴定トレーを用い
て再現する。使用する三つのシステムを以下に記載す
る。
【００２４】蛍光微量滴定トレー（本発明）： トレーの製造；蛍光化合物トリス４，７−ジフェニル−
１，１０−フェナントロリン ルテニウム（II) クロリ
ド (Ｒｕ（ＤＰＰ）3 Ｃｌ2 ）を、ワッツ（Watts)およ
びクロスビィ(Crosby)の方法（J．Am．Chem．Soc.，9
3，3184(1971)) を用いて合成した。総量３．６mgの化
合物を２．０mlジメチルスルホキシド(D-5879，シグマ
ケミカル社, ミズリー州, セントルイス) に溶かし、次
いで得られた溶液を攪拌しながら、１３００mlシリコー
ンゴム形成溶液（水性エマルジョン＃3-5024, ダウコー
ニング社、ミシガン州ミットランド) へゆっくり加え
た。次いで混合物の３５μl アリコートを９６個の凹部
を有する平らな底面の白色微量滴定トレー（#011-010-7
901、ダイナテック社(Dynatech)、バージニア州シャン
ティリー) の各凹部へ分散させ、このシステムを続いて
一晩低湿度( ２５％ＲＨ未満）、６０℃の培養器中で硬
化した。硬化後、このトレーを以下の試薬の各々を用い
て、各凹部を数回浸漬または充填することにより洗浄
し、そして空にする；（ａ）無水エタノール、（ｂ）
０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７．２、（ｃ）加熱蒸留水
（約４５℃）および（ｄ）雰囲気温度蒸留水。
【００２５】バキュテイナー（Vacutainer) ＲＴＳＢ３
０mlに生物懸濁液５mlを接種した。次いで、ブロス懸濁
液を複数の２５０μl 凹部を有する蛍光トレーへピペッ
トで入れた。このトレーを蓋で覆い、湿った３５℃培養
器へ入れた。蛍光レベルを測定するために、トレーをフ
ルオロスカン（Fluoroskan)II 蛍光光度計(480-490帯域
瀘波励起フィルター/570 カットオン発光フィルター)
へ入れた。もし96箇所の凹部の平均について５０以上の
蛍光度（fluorescent counts)を有する場合、凹部は陽
性であると考える。各陽性凹部から１００μl を除き、
希釈しそしてＴＳＡ皿へ入れて生物同定を証明した。陰
性凹部を試験して何らの生物も存在しないことを証明し
た。
【００２６】放射分析用（14Ｃ）ＢＡＣＴＥＣＲのヒツ
ジ血液を含まない６Ｂ血液培養ビン 注射器を用いて、14Ｃ培地を含むビンに生物懸濁液５ml
を接種した。ビンを振とう器中で３７℃にて培養し、Ｂ
ＡＣＴＥＣＲ460 読み取り器を用いて時々読み取った。
ビンがもし14Ｃ０2 ０．００７５μCi以上を有する場
合、陽性と考えられた。この放射レベルは増殖指数（Gr
owth Index Number)３０に相当する。ＢＡＣＴＥＣＲビ
ンを、増殖指数が３０以上であるかまたは二つの連続し
た読み取り値の間の変化が１０以上になるまで読み取っ
た。１００μl のサンプルを各ビンから取り出し、生物
同定を証明するために薄くプレーティングした。生物を
有しない対照ビンもまた培養しそして試験品とした。
【００２７】放射分析用(14 Ｃ）ＢＡＣＴＥＣＲのヒツ
ジ血液を有する６Ｂ血液培養ビン 注射器を用いて、脱フィブリン化ヒツジ血液５mlを上記
のように同じＢＡＣＴＥＣＲビンへ加えそして混合し
た。次いで培地／血液混合物５mlを除き、生物懸濁液５
mlをビンへ加えた。ビンを振とう器中で３７℃にて培養
し、ＢＡＣＴＥＣＲ460 読み取り器を用いて時々読み取
った。増殖指数が３０以上になるかまたは二つの連続し
た読み取り値の変化が１０より大きくなるまでＢＡＣＴ
ＥＣＲビンを読み取った。サンプルを各ビンから除き、
プレーティングして、生物同定を証明した。生物を有し
ない対照ビンもまた培養しそして試験品とした。
【００２８】二つの異なった生物、大腸菌 ATCC 25922
およびシュードモナス マルトフィラ（Pseudomonas ma
ltophila）ＢＢＬ#7301(アミカシン８μg/ml含有) を用
いて各系を検査した。結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】 表２ 大腸菌 ATCC #25922 ＢＡＣＴＥＣＲ ＢＡＣＴＥＣＲ 微量滴定凹部 ビン ビン w/o S.B. w/S.B. ＃陽性試験 １１ ５ ２ 平均検出時間 ８．２５ １２ １３ (時間) 微量滴定凹部の検出時間 １００％ １４５％ １５８％ （パーセントとして） シュードモナス マルトフィラ BBL #7301 （８μｇ／ｍｌアミカシン） ＢＡＣＴＥＣＲ ＢＡＣＴＥＣＲ 微量滴定凹部 ビン ビン w/o S.B. w/S.B. ＃陽性試験 ２ ４ ４ 平均検出時間 １２ ４１．０ ４０．０ （時間） 微量滴定凹部の 検出時間 １００％ ３４２％ ２０８％ （パーセントとして） 大腸菌 次の実験において、全ての陽性微量滴定凹部（限界値は
平均を越える５０蛍光度と等しい）は大腸菌の純粋培養
物を含むことがわかった。様々な陰性凹部からのサンプ
リングの結果、生物が無かった。陽性ＢＡＣＴＥＣＲビ
ンはまた純粋培養物を有していた。
【００３０】明らかなように、微量滴定凹部に対する検
出時間はＢＡＣＴＥＣＲビンよりも約４５〜５８％早
い。
【００３１】シュードモナス マルトフィラ 次の実験において、全ての陽性微量滴定凹部（限界値は
平均を越える５０蛍光度と等しい）はシュードモナスの
純粋培養物を含むことがわかった。様々な陰性凹部から
のサンプリングの結果、生物が存在しなかった。陽性Ｂ
ＡＣＴＥＣＲビンはまた純粋培養物を有していた。
【００３２】明らかなように、検出のためのＢＡＣＴＥ
ＣＲビン時間は、本発明の時間の２００％を越えた。
【００３３】上記で説明した本発明の多くの修正および
変法がその精神および範囲を逸脱することなくおこなわ
れうることは明らかである。記載された明細書の実施態
様は実施例のためのみに与えられており、本発明は特許
請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ａは、本発明装置の一例を示す一面透視平面図
である。ｂは、ａの装置の側面図である。ｃは、ａの装
置の格子組式区画部を示す拡大斜視図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デヴィッド・ティー・スティット アメリカ合衆国メリーランド州21053，フ リーランド，ゴア・ミル・ロード 20050 (72)発明者 デニス・ハーディー・バロウズ アメリカ合衆国メリーランド州21207，ボ ルティモア，ウッドグリーン・サークル 6555

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 微生物の増殖を助ける条件下で液状サン
    プルを培養し、前記サンプルを微生物増殖についてモニ
    ターすることを含む液状培地における微生物の存在を確
    認する方法において、前記サンプルを複数の別々の領域
    へ分けた後に培養を行い、そして微生物増殖について各
    々の領域を別々にモニターすることからなる液状サンプ
    ル中の微生物の存在を確認する方法。
  2. 【請求項２】 微生物増殖を比色法または蛍光分析法に
    よりモニターする請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 サンプルを物理的境界により複数の別々
    の領域へ分ける請求項１の方法。
  4. 【請求項４】 サンプルを微量滴定板上の複数の別々の
    領域へ分ける請求項１の方法。
  5. 【請求項５】 サンプルを格子組式区画部により複数の
    別々の領域へ分ける請求項４の方法。
  6. 【請求項６】 容器および該容器を複数の別々の領域へ
    分割して、該容器内のサンプルを該容器における複数の
    領域へ分けるための手段とを含む微生物増殖の測定方
    法。
  7. 【請求項７】 前記容器を複数の別々の領域へ分割する
    前記手段が複数の物理的境界である請求項６の装置。
  8. 【請求項８】 前記物理的境界が格子組式区画部である
    請求項７の装置。
  9. 【請求項９】 前記物理的境界が微量滴定板を形成する
    請求項７の装置。
JP05236715A 1992-09-22 1993-09-22 サンプル中の微生物の検出方法 Expired - Fee Related JP3127064B2 (ja)

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EP (1) EP0589634B1 (ja)
JP (1) JP3127064B2 (ja)
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