KR101635590B1 - 트랜스-레스베라트톨(trans-Resveratrol)의 함량이 증대된 발효 블루베리 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 블루베리 원료를 이용한 발효 블루베리의 제조방법 및 발효 블루베리 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 블루베리 원료를 선별하는 단계; 상기 선별된 블루베리 원료를 세척하여 계근한 후 파쇄하는 전처리 단계; 상기 전처리 단계를 거친 블루베리를 분쇄한 후에 착즙하여 블루베리 추출액을 제조하는 단계; 및 상기 분쇄한 후에 착즙된 블루베리 추출액에 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.)을 접종하여 발효시키는 단계를 포함하여 최적의 발효능을 나타내는 발효 블루베리의 제조 방법 및 트랜스-레스베라트롤(trans-resveratrol, trans-3,5,4'-trihydroxystilbene)을 포함한 총 총 폴리페놀(total polyphenol) 함량 및 항산화 활성(antioxidant activity)이 증대된 발효 블루베리 조성물을 제공한다.

Description

트랜스-레스베라트톨(trans-Resveratrol)의 함량이 증대된 발효 블루베리 조성물 및 이의 제조 방법{FERMENTED BLUEBERRY COMPOSITION WITH INCREASED CONTAINED QUANTITY OF TRANS-RESVERATROL, AND METHOD FOR PRODUCING THE FERMENTED BLUEBERRY}

본 발명은 블루베리 원료를 이용한 발효 블루베리 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

블루베리(Vaccinium spp.)는 북아메리카 원산으로 20여 종이 알려져 있고, 한국에도 정금나무·산앵두나무 등이 있으며 모두 열매를 먹을 수 있다.

원예학적인 면에서 블루베리는 높이가 5m 내외로 자라는 하이부시베리(high bush berry: V. corymbosum)와 높이가 30cm 내외로 자라는 로우부시베리(low bush berry: V. angustifolium var. laevifolium)로 나누어 진다.

블루베리의 수확시기는 품종별로 구분이 되기는 하지만 지역적인 풍토와 기후 등을 감안하여 통상 6월 하순부터 8월 중순까지이며, 이러한 수확시기의 편중으로 원료 수급 및 저장에 있어서 다소의 어려움이 있으므로 블루베리 원료의 전처리를 통한 가공공정을 거친 후 저장하여야 한다.

더구나 블루베리를 가공하여 과제의 시료 및 추후 제품화 단계에서 사용하기 위하여는, 원료의 불순물 제거하고 원료의 순도 등을 조절할 수 있는 적절한 전처리 공정이 요구된다.

특히, 블루베리는 수확시기에 따라 열매의 완숙정도가 상이할 수 있는바, 열매 완숙도의 차이는 결국 최종제품의 수율에 지대한 영향을 미치게 된다.

또한 이와 같이 선별된 블루베리는 농장의 작업자나 기타 여러 상황적인 요인들로 말미암아 이물질이 산입되었거나 오염되었을 가능성을 배제할 수 없기 때문에 세척을 실시하여야 한다.

전처리작업을 거친 블루베리 원료를 이용한 추출액을 제조하기 위한 공정 중 가장 중요한 사항은 농가의 수익증대를 고려하여 생산 현장에서의 수율 극대화를 통해 생산성을 증진시켜야 한다는 것이며, 여러 가지 추출 방법 중 이러한 요건들을 충족할 수 있는 공정이 필요하다.

블루베리 발효를 위한 미생물균주로서는 대량생산 작업을 감안하여 핸들링하기 용이하고 가격 및 공급의 측면에서 유리한 미생물균주의 선별이 요구된다.

비피더스균의 일종인 비피도박테리움 속(Bifidobacterium genus)의 경우 기존 문헌에 발효능이 우수한 것으로 보고되어 있으나, 혐기성 미생물에 해당하여 핸들링이 까다로우며 대량생산 설비 및 공정에 사용하기에는 어려움이 많을 수 있다.

유산균(젖산균: lactic acid bacteria)의 일종인 락토바실러스 속(Lactobacillus genus)은 호기성 미생물로서 당류를 발효하여 에너지를 획득하고 다량의 유산을 생성하는 세균이다.

락토바실러스 속은 형태적으로는 그람 양성(gram positive) 무포자 간균으로 다형성을 나타내고, 크기는 05 ~ 0.9 * 1 ~ 11㎛로 단간균에서 장간균의 여러 형태를 나타내며, 코리네형(coryne form)을 나타내는 균종도 있다.

락토바실러스 속 균의 배열은 단재, 이연쇄, 단연쇄, 단붕상이 있으며, 대부분은 운동성이 없고, 보통은 catalase 음성에 해당한다.

락토바실러스 속은 산도(pH 3 ~ 4 정도)에서 내성을 보이는 것이 많고, 영양요구성이 매우 복잡하여 당류 외 많은 아미노산이나 비타민류를 요구하며, 균종 또는 균주에 따라 미량 영양소를 가하지 않으면 발육할 수 없는 것도 알려져 있다.

락토바실러스 속에는 생육온도역, 당류발효 양상, 생성유산의 광학이성체 등의 성질에 따라 60종 이상의 종(species)이 있다(출처: 식품과학기술대사전, 한국식품과학회, 2008).

락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum)은 막대기 모양의 간균이며 크기는 0.7 ~ 1.0 * 3.0 ~ 8.0㎛로, 아라비노스(arabinose), 글루코스(glucose), 프럭토스(fructose), 갈락토스(galactose), 말토스(maltose), 수크로스(sucrose), 덱스트란(dextran), 트레할로스(trehalose), 라피노스(raffinose) 등을 발효하여 젖산을 생성한다.

락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)는 프락토올리고당 (FOS: Fructooligosaccharides)를 대사에 이용하여 발효하는 유산균종이다.

페놀성 화합물은 식품계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로서 다양한 구조와 분자량을 가지며, 항산화, 항균활성 등의 생리활성 기능을 가지는 것으로 알려져 있어 천연항 산화제로서 많이 이용되고 있다.

폴리페놀 화합물이 항산화 효능을 지니는 기작은 체내 생체막에 존재하는 지질이 활성산소에 의해 유리기와 연쇄반응을 일으켜 산화됨으로써 인체의 노화의 원인이 되는데 이때 폴리페놀 물질들이 이러한 유리기를 제거시키기 때문인 것으로 알려져 있다.

전자공여능은 시료의 플라보노이드(flavonoids) 및 페놀(phenol)성 물질 등에 대한 항산화 작용을 판단하는 지표로 쓰이며 이러한 물질들은 체내 활성산소에 의해 생성된 유리 라디칼(free radical)을 환원시키거나 상쇄시키는 능력이 매우 크다.

유리 라디칼은 인체 내에서 세포의 노화를 촉진하는 인자이므로, 따라서 이러한 유리 라디칼을 환원시키거나 제거할 수 있는 물질들은 항산화 효과가 있음을 의미한다.

폴리페놀 성분 중 레스베라트롤(Resveratrol)은 스틸벤(Stilbene) 계열로서 coumaroyl-Co A와 malony-CoA로부터 stilbene synthase라는 효소에 의해 합성되는 물질이다.

레스베라트롤은 자외선 조사, 금속이온 등의 비생물학적 스트레스 또는 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)나 포도나무 노균병(Plasmopara viticola) 등에 의한 생물학적 스트레스에 의해 식물체가 생성하는 방어 물질인 파이토알렉신(phytoalexin)으로 알려져 있다.

레스베라트롤의 효과가 알려지면서 인위적으로 식물체내 레스베라트롤 함량을 높이려는 연구와 재조합 미생물을 이용해 함량을 높이려는 연구들이 보고되고 있다.

이에 따르면, 레스베라트롤은 포도, 오디, 뽕잎 등에 함유되어 있는 천연 물질로서, 심혈관 질환 예방, 항암 작용 등의 효과를 갖는다.

또한, 당뇨병 환자를 대상으로 한 임상실험 결과 레스베라트롤은 인슐린 저항성과 당뇨병을 예방 및 개선할 수 있다는 가능성을 보여주었고, 이는 세포 모델과 동물 모델을 이용한 연구 결과들에 의해서도 뒷받침되었다.

이와 같은 레스베라트롤의 긍정적 효과는 항산화 효과, 항염증 효과 등의 세부기전에 의한 것으로 제안되고 있다.

레스베라트롤은 트랜스-레스베라트롤(trans-resveratrol: trans-3,5,4'-trihydroxystilbene), 시스-레스베라트롤(cis-resveratrol) 및 레스베라트롤 피세이드(resveratrol piceid)의 3가지 형태로 존재하는데, 이 중에서 트랜스 레스베라트롤만이 약효가 있는 것으로 추측되고 있으며, 열과 자외선에 의해 트랜스-레스베라트롤이 시스-레스베라트롤로 바뀔 수 있다.

따라서, 트랜스-레스베라트롤이 시스-레스베라트롤로 변이되지 않는 조건의 블루베리 가공 방법이 요구된다.

본 발명은 상기한 바와 같은 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 발효능 및 트랜스-레스베라트롤(trans-Resveratrol: trans-3,5,4'-trihydroxystilbene)의 함량이 증대된 발효 블루베리 및 이의 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 블루베리 원료를 선별하는 단계; 상기 선별된 블루베리 원료를 세척하여 계근한 후 파쇄하는 전처리 단계; 상기 전처리 단계를 거친 블루베리를 분쇄한 후에 착즙하여 블루베리 추출액을 제조하는 단계; 및 상기 분쇄한 후에 착즙된 블루베리 추출액에 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.)을 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 발효 블루베리의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 선별하는 단계는 블루베리 원료의 85% 이상이 숙성과가 되도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 분쇄는 상기 전처리 단계를 거친 블루베리 및 상기 전처리 단계를 거친 블루베리 질량의 90 ~ 110% 범위의 질량의 멸균수를 섞어 마쇄기로 분쇄하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 접종되는 락토바실러스 종은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum)을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 접종되는 락토바실러스 종은 락토바실러스 파라카제이 서브스피시스 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 발효시키는 것은 상기 균주의 접종 농도를 2 ~ 4%로 하여 32 ~ 38℃에서 2 ~ 4일 이내에 발효시키는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은, 블루베리 원료를 선별하는 단계; 상기 선별된 블루베리 원료를 세척하여 계근한 후 파쇄하는 전처리 단계; 상기 전처리 단계를 거친 블루베리를 분쇄한 후에 착즙하여 블루베리 추출액을 제조하는 단계; 및 상기 분쇄한 후에 착즙된 블루베리 추출액에 락토바실러스 종을 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 발효 블루베리의 제조 방법에 의해 제조되어 트랜스-레스베라트롤(trans-resveratrol: trans-3,5,4'-trihydroxystilbene)의 함량이 증대된 발효 블루베리 조성물을 제공한다.

본 발명의 발효 블루베리 제조방법은 블루베리 추출 수율을 향상시키고, 발효능 및 트랜스-레스베라트롤(trans-resveratrol: trans-3,5,4'-trihydroxystilbene) 함량이 증대된 발효 블루베리를 제조하도록 하는 효과가 있다.

나아가 본 발명은 트랜스-레스베라트롤을 포함한 총 총 폴리페놀 함량 및 항산화 활성이 증대된 발효 블루베리 조성물을 제공한다.

본 발명에서 구체적으로 언급되지 않은 다양한 효과는 본 발명의 실시예를 통하여 폭넓게 이해될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 전처리 공정 단계를 나타낸 것이다.
도 2는 효소추출법에 의한 블루베리 추출액의 제조공정을 나타낸 것이다.
도 3은 열수추출법에 의한 블루베리 추출액의 제조공정을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 블루베리 추출액의 3가지 제조방법을 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 블루베리 추출액 제조방법에 따른 시료별 발효 블루베리의 색도변화를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 블루베리 추출액 제조방법에 따른 발효균 생장률을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 블루베리 추출액 제조방법에 따른 항산화 활성을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 블루베리 추출액 제조방법에 따른 총 폴리페놀 함량을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 블루베리 추출액 제조방법에 따른 트랜스-레스베라트롤 함량을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 여과 후 멸균 여부에 따른 발효 블루베리의 색도변화
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 여과 후 멸균 여부에 따른 발효균 생장률을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 여과 후 멸균 여부에 따른 항산화 활성을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 여과 후 멸균 여부에 따른 총 폴리페놀 함량을 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따른 여과 후 멸균 여부에 따른 트랜스-레스베라트롤 함량을 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일실시예에 따른 예비발효 실험의 흐름을 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일실시예에 따른 예비발효 실험 결과 전자공여능(EDA)을 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 일실시예에 따른 예비발효 실험 결과 총 폴리페놀 함량을 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 일실시예에 따른 유산균의 단독접종 결과 발효균 생장률을 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 일실시예에 따른 유산균의 단독접종 결과 총 폴리페놀 함량을 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 일실시예에 따른 유산균의 혼합접종 결과 발효균 생장률을 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 일실시예에 따른 유산균의 혼합접종 결과 트랜스-레스베라트롤 함량을 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명의 일실시예에 따른 유산균의 단독접종 결과 발효 온도별 트랜스-레스베라트롤 함량을 나타낸 것이다.
도 23은 본 발명의 일실시예에 따른 유산균의 혼합접종 결과 발효 온도별 트랜스-레스베라트롤 함량을 나타낸 것이다.
도 24는 블루베리의 지방산 구성을 나타낸 가스 크로마토그램(Gas chromatogram)이다.
도 25는 본 발명의 일실시예에 따른 발효 블루베리의 트랜스-레스베라트롤 함량을 나타낸 HPLC 크로마토그램(HPLC chromatogram)이다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다.

단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.

본 출원에서, '포함하다' 또는 '가지다' 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미가 있다.

일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미가 있는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은, 블루베리 원료를 선별하는 단계; 상기 선별된 블루베리 원료를 세척하여 계근한 후 파쇄하는 전처리 단계; 상기 전처리 단계를 거친 블루베리를 분쇄한 후에 착즙하여 블루베리 추출액을 제조하는 단계; 및 상기 분쇄한 후에 착즙된 블루베리 추출액에 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.)을 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 발효 블루베리의 제조 방법을 제공한다.

블루베리 원료를 선별하는 단계는, 주원료인 블루베리를 농장에서 수확시에 숙성과와 잎사귀, 줄기 등의 오염 물질을 분리하여 골라내는 단계이다.

블루베리 원료의 선별은 열매 완숙도의 차이가 결국 최종제품의 수율에 지대한 영향을 미친다는 점을 고려하여, 상기 블루베리 원료의 85% 이상이 숙성과가 되도록 하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

선별된 블루베리 원료를 세척하는 단계는 선별된 블루베리를 먼지나 여타 오염물질을 제거하는 단계이다.

농장의 작업자나 기타 여러 상황적인 요인들로 말미암아 이물질이 산입되었거나 오염되었을 가능성을 배제할 수 없기 때문에 세척을 실시하는 것이 바람직하나 세척의 방법에는 제한이 없다.

세척된 원료의 중량을 계근함으로써 추후 제품 생산의 수율 파악할 수 있다.

계근된 블루베리를 민서기를 이용하여 파쇄함으로써 다음 단계인 블루베리 추출액을 제조하는 단계에서 원료의 표면적을 극대화하여 추출 수율을 더욱 향상시킬 수 있다.

분쇄하는 단계는 전처리 단계를 거친 블루베리 및 전처리 단계를 거친 블루베리 질량의 90 ~ 110% 범위의 질량의 멸균수를 섞어 마쇄기로 분쇄하는 것이 바람직하다.

더욱 바람직하게는, 분쇄하는 단계는 전처리 단계를 거친 블루베리 및 전처리 단계를 거친 블루베리 질량의 95 ~ 105% 범위의 질량의 멸균수를 섞어 마쇄기로 분쇄하는 것이나, 이에 한정되지 않는다.

블루베리 추출액을 제조하는 단계에서 '분쇄한 후에 착즙하는 방법'은 열수추출법 내지 효소처리법 등에 비하여 우수한 발효능을 나타낸다.

접종되는 락토바실러스 종은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum)을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

접종되는 락토바실러스 종은 락토바실러스 파라카제이 서브스피시스 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

바람직하게는 발효시키는 단계는 상기 균주의 접종 농도를 1 ~ 5%로 하여 30 ~ 45℃에서 5일 이내에 발효시키는 것이다.

더욱 바람직하게는, 발효시키는 것은 상기 균주의 접종 농도를 2 ~ 4%로 하여 32 ~ 38℃에서 2 ~ 4일 이내에 발효시키는 것이다.

또한 본 발명은, 블루베리 원료를 선별하는 단계; 상기 선별된 블루베리 원료를 세척하여 계근한 후 파쇄하는 전처리 단계; 상기 전처리 단계를 거친 블루베리를 분쇄한 후에 착즙하여 블루베리 추출액을 제조하는 단계; 및 상기 분쇄한 후에 착즙된 블루베리 추출액에 락토바실러스 종을 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 발효 블루베리의 제조 방법에 의해 제조되어 트랜스-레스베라트롤(trans-resveratrol: trans-3,5,4'-trihydroxystilbene)의 함량이 증대된 발효 블루베리 조성물을 제공한다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 이를 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예를 참조하면 명확해질 것이다.

그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다.

오히려 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.

이하 첨부된 도 1 내지 도 25를 참조하여 본 발명에 따른 발효 블루베리의 제조방법 및 발효 블루베리를 포함하는 조성물에 대한 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다.

그러나 이들 실시예는 본 발명의 기술적 사상을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

블루베리 원료의 확보 및 선별

1. 블루베리 원료의 확보

블루베리는 전국적으로 재배가 되고 있으나 원료의 원활한 공급 및 수입묘목의 국내 토양의 적응성 등을 감안하여 묘목의 입식 시기가 오래되고 근거리 교차의 가능성을 배제하기 위해 블루베리 원료의공급지역을 2곳(평택, 김천)으로 선정하였다.

2. 블루베리 원료의 선별

주원료인 블루베리를 농장에서 수확시에 85% 숙성과와 잎사귀, 줄기 등의 오염 물질은 골라내었다.

농장에서 포집되는 원과의 약 85%이상은 숙성과의 비율로 채우도록 하였다.

상기 선별된 블루베리 원료의 전처리 공정 ([표 1] 및 [도 1] 참조)

1. 상기 선별된 블루베리 원료의 세척

상기 선별된 블루베리 원료는 정제수를 이용하여 먼지나 여타 오염물질을 제거하였다.

2. 상기 세척된 블루베리 원료의 계근

상기 세척된 블루베리 원료의 중량을 500㎏ 중량계를 이용하여 계근하여 추후 제품 생산 수율 파악할 수 있도록 하였다.

3. 상기 계근된 블루베리 원료의 파쇄

상기 계근된 블루베리 원료를 민서기를 이용하여 파쇄하였다.

전처리 공정 기기 사양

공 정 명	세 부 설 비	규 격
전처리 공정	자동과일 세척기	800 * 3200 * 1700 (sus304)
	대용량저울(플로어 스케일)	1000W * 1000D * 90H
	민서기	1000W * 900D * 1300H

블루베리 추출액의 제조 공정

1. 분쇄 후 착즙법 ([표 2] 및 [도 4] 참조)

가. 상기 전처리 단계를 거친 블루베리의 분쇄 후 착즙

블루베리 100g에 100㎖의 멸균수를 섞어 마쇄기로 분쇄 후 착즙하여 4000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취하였다.

나. 여과

상기 상등액은 다시 0.45㎕ 멤브레인 필터(membrane filter)를 사용하여 여과하였다.

다. 멸균

상기 여과 후에, 121℃에서 15분간 멸균하였다.

추출물 제조 공정 기기 사양

공 정 명	세 부 설 비	규 격
추출물 제조 공정	2.5ton 추출탱크	2000 * 2500 * 3000 (sus304)
	5ton 교반탱크	3000W * 4000D * 5000H
	5ton 살균탱크	3000W * 4000D * 5000H
	여과장치(진동채)	1000W * 1000D * 900H

2. 효소추출법

[도 2]에 도시된 바에 따라 블루베리 추출액을 제조하였다.

3. 열수추출법

[도 3]에 도시된 바에 따라 블루베리 추출액을 제조하였다.

4. 블루베리 추출액 제조방법에 따른 발효능 비교 결과

가. 실험 방법

한국생명공학연구원(KCTC)에서 분양 받은 락토바실러스 플란타룸 서브스페시스 플란타룸(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum, KCTC 13093)을 MRS 플레이트 미듐(MRS plate medium)을 사용하여 37℃에서 48시간 동안 배양한 후에, 단일 콜로니(colony)를 다시 100㎖의 MRS 배지(MRS broth)에 접종하여 37℃에서 48시간 동안 배양(109cfu/㎖ 이상)하였다.

상기 배양된 균주를 4000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액은 버리고, 침전된 균주를 동량의 멸균수로 1 - 2회 세척하여 준비하였다.

상기 1. 가. 단계의 분쇄 후 착즙법(비여과), 2. 효소추출법 및 3. 열수추출법에 따른 각 블루베리(김천산) 추출액에 상기 준비된 균주의 접종 농도를 각 0%(대조군), 1%, 3% 및 5%로 하여 37℃에서 각 1, 3 및 5일간 발효시켰다.

나. 결과

1) 시료별 발효 블루베리의 색도변화 ([도 5] 참조)

상기 1. 가. 분쇄 후 착즙법(비여과), 2. 효소추출법 및 3. 열수추출법에 따른 각 블루베리 추출액의 색도를 비교한 결과, 1. 분쇄 후 착즙법(비여과)에 따른 블루베리 추출액은 2. 효소추출법 내지 3. 열수추출법에 따른 블루베리 추출액보다 은 색도를 나타내었다.

2) 발효균 생장률 ([도 6] 참조)

십진희석법에 따른 결과, 효소처리 내지 열수추출액에서는 발효시간이 증가함에 따라 젖산균의 생장율이 감소하는 경향을 나타내었다.

그러나, 분쇄착즙액에서는 젖산균이 발효시간에 따라 조금씩 증가하는 경향을 나타내었다.

3) 항산화 활성 ([도 7] 참조)

비색법에 따른 결과, 효소추출 및 열수추출액의 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능으로 측정한 항산화활성은 발효시간이 증가함에 따라 거의 변화가 없었다.

그러나, 분쇄착즙액에서는 발효시간이 증가함에 따라 모두 증가하는 경향을 나타내었다.

4) 총 폴리페놀 함량 ([도 8] 참조)

비색법에 따른 결과, 분쇄착즙액은 접종농도 및 발효시간이 증가함에 따라 총 폴리페놀 함량이 증가하는 경향을 나타냈으며, 접종 농도를 3%로 한 경우와 5%로 한 경우는 발효 3일째부터 거의 변화가 없었다.

분쇄착즙액은 효소처리 내지 열수추출액보다 대조군에서는 총 폴리페놀 함량이 낮았으나, 발효가 진행됨에 따라 오히려 총폴리페놀 함량이 증가하여 분쇄 후 착즙액에 대한 발효공정이 폴리페놀 함량 증가에 효과적인 것으로 보인다.

효소처리 내지 열수추출액은 발효시간이 증가하여도 총 폴리페놀의 함량이 거의 변화가 없었고 이는 젖산균의 생장률 저하와 관련이 있는 것으로 사료된다.

5) 트랜스-레스베라트롤 함량 ([도 9] 참조)

HPLC-RI(High Performance Liquid Chromatography-Refractive Index, Jasco RI-2031 plus, Jasco Inc.)에 의한 분석 결과, 분쇄착즙액이 효소처리 내지 열수추출액을 발효한 결과보다 더 높은 트랜스-레스베라트롤 함량을 나타내었다.

이는 트랜스-레스베라트롤이 열과 효소에 민감한 성질을 가지고 있기 때문에, 열수 및 효소를 사용하여 블루베리를 추출시 시스-레스베라트롤(cis-resveratrol)로 변환되거나, 파괴가 되었기 때문으로 파악된다.

또한 발효시간이 증가함에 따라 그 함량의 증가는 뚜렷하였고, 접종농도에 의한 차이는 크지 않으나 꾸준히 증가하는 것으로 나타났다.

6) 소결

블루베리는 가열이나 효소처리 등이 배제된 분쇄 후 착즙된 상태인 경우에 가장 발효능이 우수하였다.

5. 여과 후 멸균 여부에 따른 비교

가. 실험 방법

한국생명공학연구원(KCTC)에서 분양 받은 락토바실러스 플란타룸 서브스페시스 플란타룸(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum, KCTC 13093)을 MRS 플레이트 미듐(MRS plate medium)을 사용하여 37℃에서 48시간 동안 배양한 후에, 단일 콜로니(colony)를 다시 100㎖의 MRS 배지(MRS broth)에 접종하여 37℃에서 48시간 동안 배양(109cfu/㎖ 이상)하였다.

상기 배양된 균주를 4000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액은 버리고, 침전된 균주를 동량의 멸균수로 1 - 2회 세척하여 준비하였다.

상기 1. 나. 단계의 분쇄착즙여과액 및 1. 다. 단계의 분쇄착즙여과멸균액에 상기 준비된 균주의 접종 농도를 각 0%(대조군), 1%, 3% 및 5%로 하여 37℃에서 각 1, 3 및 5일간 발효시켰다.

나. 결과

1) 시료 멸균에 따른 발효 블루베리의 색도변화 ([도 10] 참조)

분쇄착즙 후 여과하고 멸균하지 않은 시료는 발효 후 색의 변화가 없는 반면에, 분쇄착즙 후 여과하고 멸균한 시료는 갈변현상을 나타내었다.

2) 발효균 생장률 ([도 11] 참조)

십진희석법에 따른 결과, 멸균하지 않고 발효한 시료에서는 1, 3 및 5%의 접종농도 모두에서 발효기간에 따라 생장률의 변화가 크지 않았으나 3일째 가장 높은 생장율을 나타내었다.

그러나 멸균한 후 발효한 시료에서는 발효기간이 증가함에 따라 모든 접종농도에서 젖산균의 생장율이 감소하여 멸균하지 않은 시료와 큰 차이를 보였다.

3) 항산화 활성 ([도 12] 참조)

비색법에 따른 결과, 멸균하지 않고 발효한 시료에서 DPPH 라디칼 소거능으로 측정한 항산화활성은 접종농도에 따라 증가하였고, 특히 발효 3일째 5% 접종한 경우 99.41%의 전자공여능을 나타내었으며, 이는 젖산균 생장율과 거의 일치한 것이었다.

그러나, 멸균한 후 발효한 시료에서는 발효기간이 증가하여도 대조군과 거의 차이가 없었다.

이는 상기의 젖산균 생장률이 감소하는 결과로 미루어 보아 발효기간이 증가함에도 불구하고 오히려 젖산균이 감소하여 효율적인 전자공여가 이루어지지 않기 때문인 것으로 사료된다.

4) 총 폴리페놀 함량 ([도 13] 참조)

비색법에 따른 결과, 총 폴리페놀함량은 상기 멸균하지 않은 시료의 경우나 멸균한 시료의 경우 모두 발효기간이 증가함에 따라 대조군에 비해 크게 증가하였으며 멸균하지 않은 시료에서 높은 값을 나타내었다.

균의 접종 농도가 증가할수록 총풀리페놀 함량이 증가하는 경향을 보였으나 유의적 차이는 없는 것으로 판단되었다.

5) 트랜스-레스베라트롤 함량 ([도 14] 참조)

HPLC-RI에 의한 분석 결과, 멸균하지 않은 시료의 발효액에서 확연하게 높은 트랜스-레스베라트롤 함량을 나타내었다.

또한 발효시간이 증가함에 따라 그 함량의 증가는 뚜렷하였고, 접종농도에 의한 차이는 크지 않았으나 1%보다는 3%가 높았고, 3%와 5%는 유의적 차이가 없는 것으로 판단되었다.

6) 소결 ([도 15] 참조)

트랜스-레스베라트롤이 열과 압력에 민감한 특성이 있어 블루베리 시료의 멸균시 약효가 없는 시스-형태(cis-form)으로 전환되거나 파괴되는 것으로 추측할 수 있으므로, 향후 블루베리 시료의 고온가압 처리공정은 피해야 할 것으로 판단되었다.

한편, 최적 발효 조건과 관련하여, 최적 발효일수는 3일이고 최적 접종농도는 3%라는 결론을 도출할 수 있었다.

발효미생물 균주의 스크리닝 및 선발

1. 모든 공시균주는 생명공학연구원 미생물자원센터에서 분양받았다.

발효 미생물 균주

수탁기관: 한국생명공학연구원
KCTC No.	Strain	생장 환경
3171	락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus)	호기성
3600	락토바실러스 살리바리어스 서브스페시스 살리시니어스(Lactobacillus salivarius subsp. salicinius)
13093	락토바실러스 플란타룸 서브스페시스 플란타룸(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum)
13088	락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)
13097	락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)
13090	락토바실러스 파라카제이 버스스페시스 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)
13094	락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)
13372	루코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)
3658	스트렙토코커스더모필러스(Streptococcus thermophilus)
3357	비피도박테리엄 비피덤(Bifidobacterium bifidum)	혐기성

2. 우수균주 선발을 위한 예비발효 및 스크리닝

한국생명공학연구원(KCTC)에서 분양받은 상기 미생물 균주 중에서 호기성 균주 9종에 대해 블루베리의 발효 활성을 살펴보았다.

상기 분양 받은 각 균주를 MRS 플레이트 미듐(MRS plate medium)을 사용하여 37℃에서 48시간 동안 배양한 후에, 상기 각 배양된 균주 1%를 100㎖의 블루베리 시료액에 접종하고, 30℃에서 5일간 100rpm의 진탕배양기(shaking incubator)에서 발효시켰다.

각 시료의 발효 활성은 발 효전후의 발효균 생장률, DPPH 라디칼 소거능으로 측정한 항산화활성, 총 폴리페놀 함량 및 트랜스-레스베라트롤 함량을 지표로 비교 및 검토하여 선발의 근거로 삼았다.

3. 각 지표별 실험 방법

가. 발효균 생장률 분석 방법

상기 배양액을 취하여 분광광도계(spectrophotometer)로 탁도(OD 660)를 측정하여 균체의 성장을 측정하였다.

나. 항산화 활성 분석 방법

1) 전자공여능(EDA; Antioxidant ability by electron donating ability)

전자공여능에 의한 항산화 활성은 DPPH(1.1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 유리라디칼 소거법으로 분석하였다.

즉, 시료의 메탄올 추출물 0.2㎖에 0.8㎖의 0.2 mM DPPH 용액을 가하여 와류 믹서(vortex mixer)로 10초간 혼합한 후 실온에서 30분간 방치한 후에 525㎚에서 흡광도를 측정하였고, 다음과 같은 식에 의해 전자공여능(Electron Donating Ability, EDA)을 계산하였으며, 초기 DPPH 농도가 50% 감소될 때까지 필요한 시료의 농도를 EC₅₀(Efficient Concentration)으로 산출하였다.

EDA(%) = (1 -Sample absorbance/Control absorbance) × 100

2) ABTS 라디칼 소거능(2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid radical scavenging activity)

ABTS 라디칼을 이용한 항산화능의 측정은 과황산칼륨(potassium persulfate)과의 반응에 의해 생성된 ABTS 유리 라디칼이 추출물 내의 항산화 물질에 의해 제거되어 라디칼 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한 방법이다.

7mM의 ABTS 용액에 과황산칼륨을 2.4mM이 되도록 용해시킨 다음 암실에서 12 ~ 16시간 동안 반응시켰다.

이를 414㎚에서 흡광도가 1.5가 되도록 증류수로 조정한 후 3.0㎖를 취하여 추출물 1.0㎖를 가한 다음 실온에서 10분간 반응시켜 414㎚에서 흡광도를 측정하였다.

항산화능은 증류수를 대조군으로 다음의 식에 의하여 백분율로 나타내었다.

ABTS radical scavenging activity(%) = (A - B) / A × 100

3) SOD 유사 활성(Superoxide dismutase like activity)

200㎕의 블루베리 시료에 pH 8.5로 조정한 3㎖의 트리스-염산 버퍼(tris-HCl buffer) 용액과 200㎕의 7.2mM 파이로갈롤(pyrogallol)을 가하고 25℃에서 10분간 반응시킨 후 1㎖의 1N 염산을 가하여 반응을 정지시키고 420㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 다음의 계산식에 의하여 활성을 측정하였다.

SOD-like activity(%) = 100－[(OD of sample / OD of control)×100]

다. 총 폴리페놀 함량 분석 방법

폴리페놀성 물질에 의해 폴린-시오칼트 시약(Folin-Ciocalteu reagent)이 환원되면 몰리브덴 청색으로 발색하는 원리를 이용하여 다음과 같이 분석하였다.

즉, 시료 메탄올 추출물을 50㎎/mL의 농도로 각각의 용매에 녹인 후 이 중 20㎕를 취해 2㎖ 튜브에서 1.4㎖의 증류수로 희석하고, 0.1㎖의 폴린-데니스 시약(Folin-Denis reagent)을 가하여 진탕하였다.

3분 후에 0.2㎖의 탄산나트륨(sodium carbonate) 포화용액을 가하고, 전체를 2㎖로 정용하여 잘 혼합한 후에 실온에서 1시간 동안 방치한 후에 분광광도계(spectrophotometer, DU 650, Beckman Coulter Inc., Miami, FL, USA)로 725㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 이 때의 표준곡선은 탄닌산(tannic acid)을 이용하여 작성하였다.

라. 트랜스-레스베라트롤 함량 분석 방법

메탄올에 추출물을 용해하여 HPLC로 측정하였으며, 분석을 위한 모든 시약은 HPLC 등급(HPLC grade) 시약을 사용하였다.

4. 결과

가. 예비발효 결과 발효균 생장률 ([표 4] 참조)

예비발효 결과 생장률은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) > 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) > 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 순서로 높게 나타났다.

[표 4]

예비발효 결과 발효균 생장률

나. 예비발효 결과 블루베리 발효물의 pH ([표 5] 참조)

pH는 시료 10g을 증류수로 10배 희석한 후 pH 미터(pH meter, Accument excel XL15, USA)로 측정하였다.

상기와 같이 블루베리 발효물에 대한 pH를 측정한 결과 발효 전의 블루베리는 pH 3.75 였으나 발효 후 모두 감소하였다.

가장 낮은 pH는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)에 의한 발효물에서 pH 3.05로 나타났고, 높은 생장률을 보였던 나머지 2종의 균주인 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 각각 pH 3.19와 3.39로 나타났다.

[표 5]

예비발효 결과 pH

다. 예비발효 결과 항산화 활성 ([도 16] 참조)

락토바실러스 아시도필러스(L. acidophilus) > 락토바실러스 살리바리어스(L. salivarius) > 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei) > 스트렙토코커스 더모필러스(Streptococcus thermophillus) > 루코노스톡 메센트로이데스(Leuconostoc mesentroides) 등의 순서로 항산화 활성이 높은 것으로 나타났다.

라. 예비발효 결과 총 폴리페놀 함량 ([도 17] 참조)

락토바실러스 살리바리어스(L. salivarius) > 락토바실러스 아시도필러스(L. acidophilus) > 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei) > 락토바실러스 퍼멘텀(L. fementum) > 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)의 순서로 함량이 많은 것으로 나타났다.

마. 예비발효 결과 트랜스-레스베라트롤 함량 ([표 6] 및 [도 25] 참조)

예비발효 블루베리에 함유된 트랜스-레스베라트롤의 함량은 HPLC 분석결과중 피크 면적(peak area)으로 비교하였다.

그 결과 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)과 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei)가 가장 높은 것으로 나타났다.

[표 6]

예비발효 결과 트랜스-레스베라트롤 함량

바. 소결

예비발효 블루베리의 유산균 생장률, 폴리페놀함량, 항산화활성 및 트랜스-레스베라트롤 의 함량을 비교한 결과 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)과 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei)가 가장 높은 것으로 나타나 최종적으로 이 두 균주를 블루베리의 발효균으로 결정하였다.

유산균의 단독접종 및 혼합접종에 따른 시너지 효과 비교

1. 실험 방법

가. 시료 제조

김천산 및 평택산 블루베리에 대하여 각 상기 실시예 3. 1. 나. 단계의 분쇄 후 착즙 및 여과를 거친 시료, 김천산 블루베리에 대하여 상기 실시예 3. 2. 효소추출법으로 추출한 시료 및 김천산 블루베리에 대하여 상기 실시예 3. 3. 열수추출법으로 추출한 시료를 사용하였다.

나. 발효 공시균주의 선정 ([표 3] 참조)

한국생명공학연구원(KCTC)에서 분양받은 상기 미생물 균주 중에서 9개의 호기적 젖산균 중 예비발효 실험에서 가장 효과가 좋은 것으로 선발한 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)과 두 번째로 효과가 좋았던 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei)를 단독균주 발효실험에 이용하였고, 추가적으로 1종의 혐기적 젖산균인 비피도박테리엄 비피덤(Bifidobacterium bifidum)을 혼합균주 발효실험에 사용하였다.

다. 균주 활성화 및 보관

호기성 젖산균인 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)과 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei)는 락토바실러스용 MRS 배지(Lactobacilli MRS broth)에 접종하여 37℃에서 48시간 동안 호기성 조건으로 배양한 후, 15%의 글라이세롤(glycerol)이 함유된 증류수에 넣어 -80℃ 초저온 냉동고(deep freezer)에 액상 스톡(liquid stock)으로 냉동 보관하였으며, 필요시마다 해동하여 사용하였다.

혐기성 젖산균인 비피도박테리엄 비피덤(Bifidobacterium bifidum)은 비피도박테리엄용 배지(Bifidobacterium broth)에 접종하여 37℃에서 48시간동안 이산화탄소 배양기(CO₂ incubator)를 이용하여 혐기성으로 배양한 후, 15%의 글라이세롤이 함유된 증류수에 넣어 -80℃ 초저온 냉동고에 액상 스톡으로 냉동 보관하였으며, 필요시마다 해동하여 사용하였다.

라. 스타터 균주 및 배양 균주 준비

호기성 젖산균인 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)과 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei)는 MRS 배지 10㎖당 락토바실러스용 MRS 한천(Lactobacilli MRS Agar)에 도말된 균주 1 콜로니(colony)를 접종하여 100rpm, 37℃의 조건으로 48시간 동안 배양하여 스타터 균주로 사용하였다.

혐기성 젖산균인 비피도박테리엄 비피덤(Bifidobacterium bifidum)은 비피도박테리엄용 배지 10㎖당 비피도박테리엄용 한천에 도말된 균주 1 콜로니를 접종하여 이산화탄소 배양기에서 100rpm, 37℃의 조건으로 48시간 동안 배양하여 스타터 균주로 사용하였다.

상기 배양된 각 스타터 균주는 다시 MRS 한천 플레이트 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후, 상기 플레이트 배지 위에 형성된 콜로니가 10⁸ cfu/㎖ 이상 되는지 확인한 후에 블루베리 발효 실험에 사용하였다.

상기 배양된 균주는 4000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액은 버리고, 침전된 균주에 동량의 멸균생리식염수를 이용하여 세포를 세척 한 후에 다시 원심분리(4000rpm, 10분)를 하였다. 이 과정을 1 - 2회 더 반복한 후에 상등액은 버리고 분리된 세포를 50㎖의 멸균 생리식염수에 현탁하여 블루베리 발효 실험에 사용하였다.

마. 발효조건

상기 가.의 시료에 상기 마.의 배양된 균주의 접종 농도를 각 0%(대조군), 1%, 3% 및 5%로 하여 37℃에서 각 1, 3 및 5일간 발효시켰다.

2. 단독접종 결과

가. 발효균 생장률 ([표 7] 및 [도 18] 참조)

락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei) 및 비피도박테리엄 비피덤(Bifidobacterium bifidum)을 각 블루베리 시료에 단독으로 접종하여 발효기간 동안 생육된 젖산균수를 측정한 결과, 분쇄 후 착즙액(김천산, 평택산)에서는 발효일이 증가함에 따라 젖산균수가 증가하였으나, 열수추출물과 효소추출물에서는 발효일이 증가함에 따라 감소하는 경향을 나타내었다.

[표 7]

단독접종 결과 발효균 생장률

나. 항산화 활성 ([표 8] 참조)

락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)을 각 블루베리 시료에 단독으로 접종하여 발효 기간 동안 항산화능을 측정한 결과, 접종 농도가 증가함에 따라 항산화능이 증가함을 나타내었다.

접종농도를 3%로 접종한 경우와 5%로 한 경우는 발효 3일째부터 거의 변화가 없었다.

[표 8]

단독접종 결과 항산화능

다. 총 폴리페놀 함량 ([도 19] 참조)

3종의 균주를 각 블루베리 시료에 각각 단독으로 접종하여 발효 기간 동안 총폴리페놀 함량을 측정한 결과, 접종 농도가 증가함에 따라 항산화능이 증가함을 나타내었다.

접종농도를 3%로 접종한 경우와 5%로 한 경우는 발효 3일째부터 거의 변화가 없었다.

라. 트랜스-레스베라트롤 함량 ([표 9] 참조)

3종의 유산균을 단독접종하여 발효한 결과, 분쇄 후 착즙액의 레스베라트롤 함량이 열수추출액이나 효소처리액에 비하여 월등히 증가했다.

발효가 시작되기 전인 0일자에서는 거의 비슷한 함량을 나타냈던 점으로 미루어 이는 유산균들이 그만큼 분쇄 후 착즙액에서 더욱 왕성하게 활동했음을 의미하며 반대로 열수추출이나 효소처리의 경우 폴리페놀이나 항산화 활성등이 감소하는 것과 일치하는 결과였다.

[표 9]

단독접종 결과 트랜스-레스베라트롤 함량

3. 혼합접종 결과

가. 발효균 생장률

혼합접종 및 발효 후 각 균의 생장률은 선택배지를 달리하여 측정하였다.

1) 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) + 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei) ([표 10] 참조)

분쇄 후 착즙액(김천산, 평택산)에서는 발효일이 증가함에 따라 젖산균수가 증가하였으나, 열수추출물과 효소추출물에서는 발효일이 증가함에 따라 감소하는 경향을 나타내었다.

[표 10]

혼합접종 결과 발효균 생장률

(락토바실러스 플란타룸 + 락토바실러스 파라카제이)

2) 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) + 비피도박테리엄 비피덤(Bifidobacterium bifidum) ([표 1] 참조)

분쇄 후 착즙액(김천산, 평택산)에서는 발효일이 증가함에 따라 젖산균수가 증가하였으나, 열수추출물과 효소추출물에서는 발효일이 증가함에 따라 감소하는 경향을 나타내었다.

[표 11]

혼합접종 결과 발효균 생장률

(락토바실러스 플란타룸 + 비피도박테리엄 비피덤)

3) 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei) + 비피도박테리엄 비피덤(Bifidobacterium bifidum) ([표 12] 참조)

분쇄 후 착즙액(김천산, 평택산)에서는 발효일이 증가함에 따라 젖산균수가 증가하였으나, 열수추출물과 효소추출물에서는 발효일이 증가함에 따라 감소하는 경향을 나타내었다.

[표 12]

혼합접종 결과 발효균 생장률

(락토바실러스 파라카제이 + 비피도박테리엄 비피덤)

나. 항산화 활성 ([표 13] 참조)

3종의 유산균을 각 블루베리 시료에 혼합 접종하여 발효기간 동안 항산화 활성을 측정한 결과, 접종 농도가 증가함에 따라 항산화능이 증가함을 나타내었다.

접종농도를 3%로 접종한 경우와 5%로 한 경우는 발효 3일째부터 거의 변화가 없었다.

[표 13]

혼합접종 결과 항산화능

다. 총 폴리페놀 함량 ([도 20] 참조)

3종의 균주를 각 블루베리 시료에 각각 혼합으로 접종하여 발효 기간 동안 총폴리페놀 함량을 측정한 결과, 접종 농도가 증가함에 따라 항산화능이 증가함을 나타내었다.

접종농도를 3%로 접종한 경우와 5%로 한 경우는 발효 3일째부터 거의 변화가 없었다.

라. 트랜스-레스베라트롤 함량 ([도 21] 참조)

3종의 유산균을 2종씩 혼합접종하여 발효한 결과 단독접종 발효와 마찬가지로 분쇄 후 착즙액의 레스베라트롤 함량이 열수추출액이나 효소처리액에 비해 월등히 증가한 것으로 나타났다.

우수한 발효효과를 기대했던 혐기성균인 비피도박테리엄 비피덤(Bifidobacterium bifidum)의 혼합접종도 크게 향상된 결과를 나타내지 못한 것으로 나타났다.

따라서, 발효능의 시너지 효과를 살펴보기 위하여 선발한 균주들을 혼합접종하여 발효능을 분석하였으나 단독접종한 경우와 큰 차이가 없어 향후 산업현장에서의 비용부분을 감안하면 단독균주 발효로도 충분히 원하는 성과를 얻을 수 있을 것으로 판단되었다.

즉, 향후 산업화를 위한 적용시 생산비 등을 감안하면 2종의 유산균을 사용하는 것보다는 단일균주를 선택하여 발효하는 것이 더욱 효율적일 것으로 판단되었다.

최적 발효온도 확립

1. 단독접종시 발효온도별 트랜스-레스베라트롤 함량 비교 ([도 22] 참조)

3종의 유산균을 단독접종하여 25, 30, 35, 40 및 45℃와 같이 온도별로 발효한 결과 모두 공통적으로 35℃에서 트랜스-레스베라트롤의 함량이 가장 많이 증가한 것으로 나타났다.

다음으로 40℃와 30℃가 높은 증가율을 보였다.

따라서 유산균의 최적발효 온도는 35℃인 것으로 판단되었다.

2. 혼합접종시 발효온도별 트랜스-레스베라트롤 함량 비교 ([도 23] 참조)

3종의 유산균을 혼합접종하여 25, 30, 35, 40 및 45℃와 같이 온도별로 발효한 결과 모두 공통적으로 35℃에서 트랜스-레스베라트롤의 함량이 가장 많이 증가한 것으로 나타났다.

다음으로 40℃와 30℃가 높은 증가율을 보였다.

따라서 유산균의 최적발효 온도는 35℃인 것으로 판단되었다.

3. 결과

트랜스-레스베라트롤의 함량의 증가로 비교한 결과 유산균 발효의 최적 온도는 35℃인 것으로 나타났다.

블루베리의 성분 분석

1. 블루베리의 일반성분 분석

가. 실험 재료 및 방법

1) 재료

산지가 다른 2종의 블루베리(김천산과 평택산)를 냉동상태로 운반 및 보

관하였으며, 분석직전에 해동하여 실험하였다.

분석을 위한 모든 시약은 시판특급 시약을 사용하였다.

2) 수분 함량

수분함량은 식품공전상의 건조 감량법 중 상압가열건조법에 따라 다음과 같이 수분을 분석하고 백분율로 표시하였다.

미리 가열하여 항량으로 한 칭량접시에 시료 3 ~ 5g을 정밀히 달아 뚜껑을 약간 열어 놓고 105℃ 온도의 건조기에 넣어 3 ~ 5 시간 건조한 후 데시케이터 중에서 약 30분간 방냉한후 무게를 달았다.

다시 칭량접시를 1-2시간 건조하여 항량이 될 때까지 같은 조작을 반복하였다.

3) 조지방 함량

조지방함량은 속슬레 추출법(Soxhlet extraction method)에 의하여 다이에틸에테르(diethylether)를 용매로 하여 시료의 지질성분을 추출하여 정량하였다.

4) 회분 함량

회분함량은 건식회화법을 이용하여 도가니에 각 시료 2-3g을 정밀히 달아 200 ~ 220℃에서 탄화시킨 후 550℃ 회화로에서 회화하여 회백색이 된 재의 함량을 정량하였다.

5) 조단백질 함량

조단백 함량은 모두 식품공전상의 방법에 준하여 세미마이크로 킬달(Semimicro-Kjeldahl) 정량법으로 측정하였다.

6) 식이성섬유 및 탄수화물

식이섬유 함량은 효소중량법으로 분석하였고, 탄수화물의 함량은 수분, 조단백, 조지방, 회분, 식이섬유섬유의 함량을 100%에서 차감한 값으로 계산하였다.

나. 결과 ([표 14] 참조)

경북 김천산과 경기 평택산 2종의 블루베리의 일반성분은 수분이 90% 이상이었고, 조지방, 조단백, 조회분 등에는 큰 차이가 없었으며, 식이섬유 함량에 있어서 평택산 블루베리가 다소 높았다.

따라서 두 지역의 거리가 상당히 떨어져 있음에도 불구하고 국내에서 재배되는 블루베리의 지역적 차이는 크게 영향이 없는 것으로 사료된다.

[표 14]

블루베리 일반성분

2. 블루베리의 영양성분 분석

가. 실험 재료 및 방법

1) 재료

산지가 다른 2종의 블루베리(김천산과 평택산)를 냉동상태로 운반 및 보

관하였으며, 분석직전에 해동하여 실험하였다.

분석을 위한 모든 시약은 시판특급 시약을 사용하였다.

2) 미네랄 함량 분석 방법

블루베리 시료 중의 무기질 함량은 식품공전중의 ICP-AES법에 의거하여 측정하였다.

즉, 시료 약 3g을 항량이 된 도가니에 정확히 취해 시료가 든 자기 도가니를 전열기 위에서 예열한 뒤, 550℃ 회화로에서 백색 또는 회백색이 될 때까지 회화시켰다.

실온으로 냉각한 후 재에 증류수 10방울 정도를 떨어뜨려 재를 적셔 날리지 않도록 한 다음 묽은 질산(질산:증류수 = 1:1, v/v) 3㎖를 넣고 열판에서 가열하여 질산을 완전하게 건고시켰다.

이를 550℃전기회화로에서 1시간 동안 회화시킨 다음 방냉하고 다시 도가니에 묽은염산(염산:증류수 = 1:1, v/v) 10㎖를 천천히 가하여 재를 녹인 후 고속 액체크로마토그래피용 증류수를 이용하여 50㎖로 정용한 다음, 무회분 여과지로 여과하여 시험용액으로 하였다.

분석은 ICP-AES(Activa, HORIBA Jobin-Yvon, Longjumeau, France)를 사용하였다.

3) 아미노산의 구성 분석 방법

아미노산은 식품 속의 단백질을 강산으로 가수분해하여 발생하는 아미노산 또는 식품이 함유하는 유리 아미노산을 이온 교환(ion exchange)을 통해 분리하고 닌하이드린 로스트 컬럼(ninhydrin post column) 유도체화를 형성 및 발색시켜 가시 검출기(visible detector)로 분석하는 원리를 이용하여 아미노산 자동분석기 (Hitachi AAA L-8900)로 분석하였다.

즉, 시료 약 10g을 정확히 칭량하여 앰플에 넣은 후 15㎖의 6N HCl를 가한 다음 와류 믹서(vortex mixer)로 3분간 교반시킨다.

질소가스로 30초간 치환하여 밀봉한 후 질소가스가 충전된 상태에서 105℃의 히팅 블록(heating block)에 장착시킨 후 24시간 동안 가수분해 하였다.

분해가 끝난 시료를 실온에서 방냉하고 50㎖의 정용 플라스크(flask)에 시료용액을 모두 옮겨 담은 후 증류수로 정용하여 1차 중화시켰다.

용액을 여과지(Whatman 5)로 여과하여 테스트 튜브(test tube)에 10㎖ 정도 여액을 모은 후 2㎖을 취해서 25㎖의 정용 플라스크에 3차 증류수로 정용하여 2차 중화하였다.

이를 0.45㎛의 PTFE 필터(Millipore Co., Billerica, MA, U.S.A.)로 여과하고 이를 시험용액으로 하여 아미노산자동분석기로 분석하였다.

아미노산 표준물질은 아미노산 스탠다드 H(amino acid standard H: Pierce Co., Rockford, IL, U.S.A.)를 사용하였다.

4) 지방산의 구성 분석 방법

블루베리 시료 중의 지질성분은 폴츠(Folch) 등의 방법에 의하여 추출 및 정제하였고, AOAC 방법에 따라 14%의 BF3-메탄올(BF3-methanol)로 메틸 에스테르(methyl ester)화 시킨 후 가스 크로마토그래피(Gas Chromatography, HP-6890GCFID, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)로 분석하였다.

GC 분석에는 HP-FFAP 컬럼(30m × 0.32㎛ ID, 0.52㎜ film thickness, Agilent Technologies)을 사용하였고, 검출기는 불꽃이온화검출기(FID), 온도는 주입기 230℃로, 검출기 250℃로, 컬럼 오븐(column oven) 온도는 100℃(2분) ∼ 4℃/분∼ 230℃(20분)으로, 운반 기체(carrier gas)는 헬륨(He)을 1.5㎖/분으로, 분할율(split ratio)은 10: 1로 분석하였다.

5) 유리당 함량 분석 방법

블루베리 시료에 함유된 유리당을 50% 에탄올(ethanol)로 추출한 다음 고속액체 크로마토그래피를 이용하여 분석하였으며 이 방법으로는 단당류와 이당류 및 당알콜을 분석할 수 있다.

블루베리 시료를 믹서(mixer)로 완전히 균질화시켜 5 ~ 10g을 250㎖의 플라스크에 취하고 50㎖의 50% 에탄올 용액을 가하여 65℃ 수욕상에서 1시간 동안 환류냉각 추출하였다.

추출용매를 0.45㎛의 시린지 필터(syringe filter)로 여과하고 HPLC-RI(Jasco RI-2031 plus, Jasco)로 분석하였다.

나. 실험 결과

1) 미네랄 함량 ([표 15] 참조)

경북 김천산과 경기 평택산 블부베리의 무기질 함량은 나트륨, 인, 아연에서는 큰 차이가 없었으나, 칼슘함량은 김천산이 5.33%, 평택산이 8.06%로 차이가 있었으며, 마그네슘 함량도 김천산과 평택산 각 4.70% 및 6.05%로 차이가 있었다.

[표 15]

블루베리 영양성분

2) 아미노산의 구성

경북 김천산과 경기 평택산 블루베리의 아미노산 총량은 483.9㎎/100g 및 509.3㎎/100g으로 평택산에서 다소 높았으며, 이는 기존 연구에서 보고된 한국산 블루베리 324.55㎎/100g과 미국수입산 블루베리 228.24㎎/100g 보다 월등히 높은 수치였다.

필수아미노산의 총함량 또한 본 연구의 재료로 쓰인 평택과 김천산은 각각 147.6㎎/100g 및 153.7㎎/100g으로 기존 보고의 한국산 18.33㎎/100g 과 미국산 3.32㎎/100g과 매우 큰 차이가 있어 영양적으로 우수한 것으로 사료된다.

필수아미노산은 총아미노산 중 28.9 ~ 31.%를 차지하였고, 류신(Leucine)이 가장 많았다.

가장 많이 함유된 아미노산은 감칠맛의 글루타민산(Glutamic acid)이었으며, 함황아미노산 중 시스테인(Cysteine)은 전혀 검출되지 않았고, 또 다른 함황아미노산인 메타이오닌(Methionine)도 4.3~4.8mg/100g 에 그쳤다.

문헌상의 한국산과 미국산 블루베리는 이와 같은 함황아미노산이 전혀 검출되지 않은 것으로 보고되어 있다.

한편, 평택산 블루베리는 김천산보다 알기닌(Arginie) 함량이 매우 높았다.

[표 16]

블루베리의 아미노산 구성

3) 지방산의 구성 ([표 17] 및 [도 24] 참조)

블루베리 시료의 지방산 조성을 분석한 결과 예상보다 불포화 지방산 함량이 79.9 ~ 81.7%로 매우 높게 나타났다.

리놀레산(linoleic acid) 및 리놀렌산(linolenic acid)이 59.7 ~ 63.2%로 주를 이루었으며, 올레산(oleic acid)도 16.9 ~ 18.1%로 상당량을 차지하였다.

두 블루베리 시료의 지역적 차이는 거의 나타나지 않았다.

[표 17]

블루베리의 지방산 구성

4) 유리당 함량 ([표 18] 참조)

블루베리에 함유되어 있는 유리당은 글루코즈(glucose)와 프럭토즈(fructose) 단당류 외에 수크로즈(sucrose)나 말토즈(maltose)와 같은 이당류는 검출되지 않았다.

[표 18]

블루베리의 유리당 함량

Claims (8)

1. 블루베리 원료를 선별하는 단계;
   상기 선별된 블루베리 원료를 세척하여 계근한 후 파쇄하는 전처리 단계;
   상기 전처리 단계를 거친 블루베리를 분쇄한 후에 착즙하여 블루베리 추출액을 제조하는 단계; 및
   상기 분쇄한 후에 착즙된 블루베리 추출액에 락토바실러스 플란타룸 서브스페시스 플란타룸 KCTC 13093(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum KCTC 13093) 또는 락토바실러스 파라카제이 서브스피시스 파라카제이 KCTC 13090(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei KCTC 13090)를 접종하여 발효시키는 단계를 포함하고,
   상기 발효시키는 단계는 위 균주의 접종 농도를 5%로 하여 30 ~ 45℃에서 3 ~ 5일 이내에 발효시키는 것을 특징으로 하는 트랜스-레스베라트롤(trans-resveratrol: trans-3,5,4'-trihydroxystilbene)의 함량이 증대된 발효 블루베리의 제조 방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 선별하는 단계는 블루베리 원료의 85% 이상이 숙성과가 되도록 하는 것인 제조 방법.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 분쇄는 상기 전처리 단계를 거친 블루베리 및 상기 전처리 단계를 거친 블루베리 질량의 90 ~ 110% 범위의 질량의 멸균수를 섞어 마쇄기로 분쇄하는 것인 제조 방법.
   
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