CN110499379A - 引物、检测Lactobacillus sp.的方法以及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于菌种检测技术领域，涉及一种特异性识别Lactobacillus sp.基因的引物、检测Lactobacillus sp.的方法以及检测Lactobacillus sp.的试剂盒。其中，一种引物，其特征在于，所述引物特异性识别Lactobacillus sp.的基因，所述引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列为5′‑TGCCACAAGGCTATCACCTC‑3′；所述SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列为5′‑AACTCTTGGCTTCGCTGACG‑3′。本发明提供的引物能够特异性地识别Lactobacillus sp.的基因。
Description
技术领域
本发明属于菌种检测技术领域，更具体地，涉及一种特异性识别Lactobacillussp.基因的引物、检测Lactobacillus sp.的方法以及检测Lactobacillus sp.的试剂盒。
背景技术
我国白酒酿造为多菌种混合发酵系统，包括细菌、霉菌、酵母菌等。其中，乳杆菌(Lactobacillus sp.)被认为是白酒酿造系统中的重要微生物，能产生乳酸、乙酸等代谢产物，直接影响白酒的风味。Lactobacillus sp.一种乳杆菌，具有产乳酸等代谢产物的能力。该菌种在酒醅发酵的中后期占有绝对优势，在白酒酿造系统中发挥重要作用。该菌种的16SrRNA基因序列与目前已知的细菌序列的相似度均不超过89％，是一株尚未定种的新乳酸菌种。
目前，白酒酿造系统中微生物检测存在的一个难题是酒醅样本的处理。白酒发酵酒醅为固态颗粒物质，不同于液态发酵，如何使酒醅中的乳杆菌在数量不变的情况下完全释放出来，这是对酒醅中乳杆菌进行检测的难题之一。
白酒酿造系统中微生物检测存在的另一个难题是目的基因的选择。目前微生物检测时大多是以16S rRNA作为目的基因，虽然16S rRNA基因序列高度保守，但是在同一种微生物中含有的16S rRNA基因的拷贝数也可能并不相同，因此以16S rRNA作为目的基因检测时并不能真实反应微生物的数量。因此，选择哪个基因作为检测Lactobacillus sp.的目的基因是一个尚待解决的技术问题。
因此，亟需构建一种Lactobacillus sp.的检测方法，为揭示白酒酿造系统中Lactobacillus sp.的分布特征提供保障。
发明内容
本发明的目的是提供一种引物、检测Lactobacillus sp.的方法以及检测Lactobacillus sp.的试剂盒，以准确检测Lactobacillus sp.。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种引物。该引物特异性识别Lactobacillus sp.的基因，所述引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列为5′-TGCCACAAGGCTATCACCTC-3′；所述SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列为5′-AACTCTTGGCTTCGCTGACG-3′。
具体地，Lactobacillus sp.的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述SEQID NO:3所示的核苷酸序列为5′-TGCCACAAGGCTATCACCTCCTCATTTTGAGATGACAGATATAAGTATATCAAAAGTTTCCTTATAAGTGGTGTACTTTATCTTATAGTGTTTAGGTATACCAAAAGTTATTTTCCAGTAGCGCCTCATCTCACAACTTGCTATAATAGGGGCGAATAGACACGGGAAAGGAACTGATATGATGGTATTAACCAAAAAAGACATCGAAGATCTTTTTAACAAGGAACAGGGTCAATACAAGAAGGACGTCAGCGAAGCCAAGAGTT-3′。
本发明第二方面提供一种检测Lactobacillus sp.的方法，该方法包括以下步骤：
提取酒醅中的微生物，获得含有所述微生物的体系；
对所述含有所述微生物的体系依次进行DNA提取和PCR扩增；
对Lactobacillus sp.菌液进行浓度梯度稀释，并对不同浓度的所述Lactobacillus sp.菌液进行DNA提取，获得所述含有所述微生物的体系对应的DNA；
对所述每个浓度的所述Lactobacillus sp.菌液对应的DNA和所述含有所述微生物的体系对应的DNA分别进行荧光定量PCR检测，所述荧光定量PCR检测所需的引用为上述的引物；
以所述Lactobacillus sp.菌液的浓度的对数为横坐标，以所述Lactobacillussp.菌液的荧光定量PCR的检测结果为纵坐标，绘制标准曲线；
根据所述含有所述微生物的体系对应的荧光定量PCR的检测结果在所述标准曲线上的投点，计算酒醅中Lactobacillus sp.的含量。
本发明的检测Lactobacillus sp.的方法的检测对象可以为任一种酒发酵所需的酒醅，优选为白酒酒醅。
在本发明中，所述提取所使用的抽提缓冲液包括：终浓度为180-200mmol/L的Tris，终浓度为50-60mmol/L的EDTA，终浓度为180-200mmol/L的NaCl，终浓度为8-12mmol/L的CaCl2。该抽提缓冲液能够将酒醅中的微生物浸提出来。
具体地，所述提取酒醅中的微生物的步骤包括：
将所述酒醅与所述抽提缓冲液混合，在4-10℃条件下，以150-200转/分钟，震荡20-30min，8000-1000转/分钟离心，弃上清液，保留沉淀物，向所述沉淀物中加入所述抽提缓冲液，混匀后，进行至少一次冻融。冻融的次数通常可以为2-5次，例如2次、3次或者4次，使细胞全部充分破裂。冷冻所需的冷冻介质可以为液氮，冷冻后在0-4℃解冻融化，例如可以在冰上或者冰水混合物中解冻融化。
本领域技术人员可以根据操作经验，调整所述酒醅与所述抽提缓冲液的比例，本发明在此不做具体限定。通常所述酒醅与所述抽提缓冲液的比例可以为40-50g:100mL；所述沉淀物与所述抽提缓冲液的比例可以为40-50g:500mL。
由于提取微生物DNA为本领域的常规操作，因此，本发明不对DNA提取的方法和所用的试剂进行限定，本领域常用的提取微生物DNA的方法均能够实现本发明。例如，本领域技术人员采用CTAB提取法、SDS提取法、磁珠提取法等。
具体地，本发明可以采用下述方法提取微生物中的DNA：
向所述含有所述微生物的体系中加入溶菌酶和/或溶壁酶，混匀，之后孵育；向其中加入20％-25％的SDS、4％-6％的CTAB/NaCl和5M的NaCl，60-65℃水浴30-60min，离心，取上清液，向上清液中加入苯酚、氯仿、异戊醇的混合液，混匀后离心，取上层水相；向上层水相中加入pH值为5.2的醋酸钠溶液和无水乙醇，混匀后离心，弃上清液，保留沉淀，该沉淀即为微生物的DNA，用70％-100％乙醇溶液洗涤沉淀，之后室温干燥，用无菌的ddH2O溶解DNA，置于-20℃保存备用。
优选地，将所述酒醅与所述抽提缓冲液混合，在4℃条件下，以180转/分钟，震荡30min，8000转/分钟离心，弃上清液，保留沉淀，向所述沉淀中加入所述抽提缓冲液，混匀后，进行至少一次冻融。
荧光定量PCR为本领域的常规操作，本发明对此亦不作具体限定和阐述。
所述荧光定量PCR的检测结果可以为所述荧光定量PCR的Ct值。
本发明第三方面提供一种检测酒醅中Lactobacillus sp.的试剂盒。该试剂盒包括：
上述的引物；
上述的抽提缓冲液；
Lactobacillus sp.菌液；
DNA提取试剂；以及
荧光定量PCR试剂。
优选地，所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为含有Lactobacillus sp.基因片段的质粒DNA。
具体地，所述试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为ddH2O。
本发明提供的引物，该引物能够特异性地识别Lactobacillus sp.的基因。
本发明提供的检测Lactobacillus sp.的方法，能够检测出微生物中是否含有Lactobacillus sp.，并且对酒醅中的Lactobacillus sp.进行定量检测，以准确地获得酒醅中Lactobacillus sp.的数量，为评价酒的发酵品质提供基础。
本发明提供的检测Lactobacillus sp.的方法所使用的抽提缓冲液中的Tris能够为微生物提供稳定的酸碱环境，EDTA能够去除酒醅中的碱金属、稀土元素和过渡金属等，NaCl作为电解质能够平衡细胞膜内外离子处于平衡状态而不破裂，CaCl2能高效沉淀酒醅中的腐殖酸，因此该抽提缓冲液能够将酒醅中的微生物浸提出来，并且抑制微生物在浸提过程生长繁殖，以准确获得酒醅中的微生物，从而准确定量酒醅中的Lactobacillus sp.。
本发明提供的检测Lactobacillus sp.的方法，通过优化震荡的温度和时间，不但使得菌株不会在震荡的过程中繁殖，而且使得抽提缓冲液能够将将酒醅中的微生物全部浸提出来，从而能够准确检测微生物中的Lactobacillus sp.的数量，为评价酒的发酵品质提供基础。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1示出了实施例1-15的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳照片。其中泳道M:DL2000DNA Marker；1：Lactobacillus buchneri；2：Lactobacillus pontis；3：Lactobacilluscasei；4：Lactobacillus farraginis；5：Lactobacillus plantarum；6：Lactobacillusparafarraginis；7：Lactobacillus panis；8：Bacillus oleronius；9：Bacilluscirculans；10：Acetobacter pasteurianus；11：Pediococcus pentosaceus；12：Saccharomyces cerevisiae；13:阳性对照(含有目的基因的质粒DNA)；14：Lactobacillussp.；15：含有Lactobacillus sp.的酒醅；16：阴性对照(ddH2O)。
图2示出了Lactobacillus sp.与对照菌株的实时荧光定量PCR的检测结果。
图3示出了不同浓度的Lactobacillus sp.菌液的实时荧光定量PCR的检测结果的标准曲线示意图。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
制备例1
本制备例提供一种引物。
本实施例对已报道的白酒酿造系统中的重要功能菌株Lactobacillus sp.的全基因序列与Nr数据库进行了系统的比对分析，选择了Lactobacillus sp.特有的单拷贝基因为目的基因，请参见表1该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本实施例设计了能够特异性识别该基因的引物。该引物包括：上游引物和下游引物。请参见表1，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
表1引物和目的基因的核苷酸序列
实施例1
本实施例提供一种检测Lactobacillus sp.的方法。该方法包括以下步骤：
(1)将50g的酒醅样品与100mL的抽提缓冲液混合，在4℃条件下，180r/min，震荡30min。抽提缓冲液包括：终浓度为200mmol/L的Tris，终浓度为50mmol/L的EDTA，终浓度为200mmol/L的NaCl，终浓度为10mmol/L的CaCl2。
(2)将步骤(1)中的震荡后的酒醅样品与抽提缓冲液的混合物，4℃、8000r/min离心5min，弃上清液，保留沉淀，向沉淀中加入500mL抽提缓冲液，混匀后，于液氮中反复冻融3次，获得含有微生物的体系。
(3)DNA提取向含有微生物的体系中加入10μL 100mg/mL溶菌酶和20μL 200mg/mL溶壁酶，混匀，37℃180r/min孵育1h；加入60μL 20％的SDS，30μL 5％的CTAB/NaCl和100μL5M的NaCl，混匀后65℃水浴1h；4℃8000r/min离心5min，将上清液转入新的2mL离心管中；向上清液中加入等体积的苯酚、氯仿、异戊醇的混合液，三者体积比为25:24:1，混匀后12000r/min离心10min，取上层水相；向上层水相中加入1/10体积的3mol/L、pH值为5.2的醋酸钠溶液和1倍体积的无水乙醇，混匀后于-20℃放置1h，12000r/min离心10min，弃上清，保留沉淀，该沉淀即为微生物的DNA，用70％的乙醇溶液洗涤沉淀两次，室温干燥，加入30μLddH2O溶解DNA，置于-20℃保存，作为后续的PCR扩增和实时荧光定量PCR检测的模板备用。
(4)PCR扩增PCR反应体系为(25μL)：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPs(10mmol/L，各2.5mmol)2μL，上、下游引物(10mmol/L)各1μL，DNA模板(50ng/L)1μL，Taq酶(5U/L)0.5μL，用ddH2O补至25μL；其中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
PCR反应条件：94℃预变性4min；95℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸10min。
(5)实时荧光定量PCR检测荧光定量PCR反应体系(20μL)：2×SYBR Green qPCRMaster Mix 10μL，上、下游引物(10mmol/L)各1μL，模板1μL，用ddH2O补至20μL；其中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
实时荧光定量PCR反应条件：95℃预变性4min；95℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环40次；每个样品三次重复。
实施例2-15
实施例2-15与实施例1的区别仅在于检测的对象不同。其中，实施例2的检测对象为Lactobacillus buchneri；实施例3的检测对象为Lactobacillus pontis；实施例4的检测对象为Lactobacillus casei；实施例5的检测对象为Lactobacillus farraginis；实施例6的检测对象为Lactobacillus plantarum；实施例7的检测对象为Lactobacillusparafarraginis；实施例8的检测对象为Lactobacillus panis；实施例9的检测对象为Bacillus oleronius；实施例10的检测对象为Bacillus circulans；实施例11的检测对象为Acetobacter pasteurianus；实施例12的检测对象为Pediococcus pentosaceus；实施例13的检测对象为Saccharomyces cerevisiae；实施例14的检测对象为阳性对照(含有目的基因的质粒)；实施例15的检测对象为含有Lactobacillus sp.的酒醅。
测试例1
对实施例1-15的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。
PCR扩增产物电泳检测：使用1.5％含有染色液EB的琼脂糖凝胶，5V/cm电压下进行电泳25-30min，然后使用Bio-Rad凝胶成像分析仪进行紫外拍照。
PCR扩增产物电泳结果请参见图1，图1示出了实施例1-15的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳照片。实施例2-14依次对应泳道1-13，实施例1对应泳道14，实施例15对应泳道15。如图1所示，在泳道13、14和15中出现了预期的分子量为266bp的特异性条带，1-12均没有出现该特异性条带。由此说明，引物仅能扩增含有目的基因的对象(含有目的基因的质粒DNA、Lactobacillus sp.以及含有Lactobacillus sp.的酒醅)，而不能扩增不含有目的基因的对象，也就是说，该引物能够特异性地识别目的基因，能够作为检测是否含有Lactobacillus sp.菌株的引物。
需要说明的是，含有目的基因的质粒DNA是将Lactobacillus sp.的PCR产物与PMD-19T载体连接并热击转化到大肠杆菌DH5α，获得阳性克隆子后提取出的质粒DNA。
测试例2
本测试例用于说明引物对Lactobacillus sp.的实时荧光定量PCR检测的特异性。
利用实施例1提供的检测方法，以非同种菌作为对照菌株，进行Lactobacillussp.定量检测的特异性验证。其中，所用的参照菌株分别为：Lactobacillus buchneri；Lactobacillus pontis；Lactobacillus casei；Lactobacillus farraginis；Lactobacillus plantarum；Lactobacillus parafarraginis；Lactobacilluspanis；Bacillus oleronius；Bacillus circulans；Acetobacter pasteurianus；Pediococcuspentosaceus；Saccharomyces cerevisiae(实施例2-12中的菌株)。
结果判断：循环阈值(Ct值)≤35时，说明实时荧光定量PCR中有目的基因的扩增，可判定为阳性；Ct值在32-40之间时，应重做实时荧光定量PCR实验，再次扩增Ct值仍小于40，且扩增曲线有明显对数期及对照组结果均正常，可判定为阳性；再次扩增Ct值仍大于40，且对照组结果均正常，可判定为阴性。
Lactobacillus sp.与对照菌株的实时荧光定量PCR的检测结果请参见图2，如图2所示，当引物为Lactobacillus sp.特异性引物时，仅在模板为Lactobacillus sp.的DNA时出现具有明显对数期的扩增曲线，说明本发明的方法对Lactobacillus sp.的定量检测具有特异性。
制备例2
本制备例提供定量检测用的标准曲线。
将Lactobacillus sp.使用MRS培养基，37℃条件下培养3天，测定A值，平板计数法计算出真实菌数。然后将Lactobacillus sp.菌液梯度稀释101、102、103、104、105、106、107、108倍，每梯度各取3管提取DNA，作为待检测模板，利用制备例1中的引物以及实施例1提供的检测方法进行实时荧光定量PCR。实时荧光定量PCR的检测结果详见图3。
所述Lactobacillus sp.菌液的浓度的对数为横坐标，以所述Lactobacillus sp.菌液的荧光定量PCR的检测结果的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线。该标准曲线详见图3，图3示出了不同浓度的Lactobacillus sp.菌液的实时荧光定量PCR的检测结果的标准曲线示意图，标准曲线y＝-3.4394x+42.496(R2＝0.9996)。
结果表明：Ct值为32时对应的菌数为Lactobacillus sp.的检测下限，即1.126×103cfu，亦为本发明提供的引物的实时荧光定量PCR的最低检测标准。
将实施例1中Lactobacillus sp.的实时荧光定量PCR的Ct值带入该标准曲线，得到酒醅样品中的Lactobacillus sp.的数量为4.66±0.12×105cfu/g酒醅。
测试例3
本测试例制备待测样品和对待测样品进行实时荧光定量PCR检测。
在不含Lactobacillus sp.的酒醅中，添加终浓度为3.67±0.26×108cfu/g酒醅的Lactobacillus sp.(平板计数法测得菌数分别为3.52×108cfu/g酒醅、3.60×108cfu/g酒醅、3.72×108cfu/g酒醅)，利用实施例1提供的检测Lactobacillus sp.的方法处理待测样品。荧光定量PCR的反应体系和反应条件请参见测试例2。该待测样品的实时荧光定量PCR的Ct值为13.08±0.13(Ct值分别为13.21、12.95、13.11)，根据制备例2所得标准曲线计算得到酒醅中的Lactobacillus sp.的浓度为3.56±0.39×108cfu/g酒醅(理论菌数计算值分别为3.28×108cfu/g酒醅、3.89×108cfu/g酒醅、3.51×108cfu/g酒醅)，通过SPSS统计软件分析，平板计数法与本发明提供的方法所得的结果无显著性差异(P＝0.65)，说明本发明提供的样品预处理方法与特异性引物的检测结果具有准确性。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
序列表
<110> 武汉轻工大学
<120> 引物、检测Lactobacillus sp.的方法以及试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tgccacaagg ctatcacctc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
aactcttggc ttcgctgacg 20
<210> 3
<211> 266
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tgccacaagg ctatcacctc ctcattttga gatgacagat ataagtatat caaaagtttc 60
cttataagtg gtgtacttta tcttatagtg tttaggtata ccaaaagtta ttttccagta 120
gcgcctcatc tcacaacttg ctataatagg ggcgaataga cacgggaaag gaactgatat 180
gatggtatta accaaaaaag acatcgaaga tctttttaac aaggaacagg gtcaatacaa 240
gaaggacgtc agcgaagcca agagtt 266
Claims (9)
1.一种引物，其特征在于，所述引物特异性识别Lactobacillus sp.的基因，所述引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列为5′-TGCCACAAGGCTATCACCTC-3′；所述SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列为5′-AACTCTTGGCTTCGCTGACG-3′。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列为5′-TGCCACAAGGCTATCACCTCCTCATTTTGAGATGACAGATATAAGTATATCAAAAGTTTCCTTATAAGTGGTGTACTTTATCTTATAGTGTTTAGGTATACCAAAAGTTATTTTCCAGTAGCGCCTCATCTCACAACTTGCTATAATAGGGGCGAATAGACACGGGAAAGGAACTGATATGATGGTATTAACCAAAAAAGACATCGAAGATCTTTTTAACAAGGAACAGGGTCAATACAAGAAGGACGTCAGCGAAGCCAAGAGTT-3′。
3.一种检测Lactobacillus sp.的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
提取酒醅中的微生物，获得含有所述微生物的体系；
对所述含有所述微生物的体系依次进行DNA提取，获得所述含有所述微生物的体系对应的DNA；
对Lactobacillus sp.菌液进行浓度梯度稀释，并对不同浓度的所述Lactobacillussp.菌液进行DNA提取，获得每个浓度的所述Lactobacillus sp.菌液对应的DNA；
对所述每个浓度的所述Lactobacillus sp.菌液对应的DNA和所述含有所述微生物的体系对应的DNA分别进行荧光定量PCR检测，所述荧光定量PCR检测所需的引用为权利要求1所述的引物；
以所述Lactobacillus sp.菌液的浓度的对数为横坐标，以所述Lactobacillus sp.菌液的荧光定量PCR的检测结果为纵坐标，绘制标准曲线；
根据所述含有所述微生物的体系的荧光定量PCR的检测结果在所述标准曲线上的投点，计算酒醅中Lactobacillus sp.的含量。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酒醅为白酒酒醅。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述提取所使用的抽提缓冲液包括：终浓度为180-200mmol/L的Tris，终浓度为50-60mmol/L的EDTA，终浓度为180-200mmol/L的NaCl，终浓度为8-12mmol/L的CaCl2。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述提取酒醅中的微生物的步骤包括：
将所述酒醅与所述抽提缓冲液混合，在4-10℃条件下，以150-200转/分钟，震荡20-30min，8000-1000转/分钟离心，弃上清液，保留沉淀物，向所述沉淀物中加入所述抽提缓冲液，混匀后，进行至少依次冻融。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酒醅与所述抽提缓冲液的比例为40-50g:100mL；所述沉淀物与所述抽提缓冲液的比例为40-50g:500mL。
8.一种检测酒醅中Lactobacillus sp.的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
权利要求1所述的引物；
权利要求5所述的抽提缓冲液；
Lactobacillus sp.菌液；
DNA提取试剂；以及
荧光定量PCR试剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为含有Lactobacillus sp.基因片段的质粒DNA。
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|---|---|
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102206630A (zh) * | 2011-04-12 | 2011-10-05 | 中国海洋大学 | 一种土壤和沉积物总dna提取方法及提取试剂盒 |
| CN103834745A (zh) * | 2014-03-27 | 2014-06-04 | 泸州品创科技有限公司 | 大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢杆菌的定量分析方法 |
| CN103993071A (zh) * | 2014-03-27 | 2014-08-20 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 酒醅微生物群落中乳酸菌、梭菌、芽孢杆菌的定量分析方法 |
| CN105349670A (zh) * | 2015-11-30 | 2016-02-24 | 武汉轻工大学 | 用于饲料中添加的干酪乳杆菌的快速定性、定量检测试剂盒及检测方法和应用 |
| CN106399297A (zh) * | 2016-09-07 | 2017-02-15 | 贵州茅台酒股份有限公司 | 一种经济快速提取酒醅中微生物基因组dna的方法 |
| CN107699610A (zh) * | 2017-10-13 | 2018-02-16 | 哈尔滨工业大学（威海） | 用于检测白酒发酵过程中耐酸乳酸杆菌含量的两对特异性引物及其应用 |
-
2019
- 2019-09-18 CN CN201910881873.0A patent/CN110499379A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102206630A (zh) * | 2011-04-12 | 2011-10-05 | 中国海洋大学 | 一种土壤和沉积物总dna提取方法及提取试剂盒 |
| CN103834745A (zh) * | 2014-03-27 | 2014-06-04 | 泸州品创科技有限公司 | 大曲微生物群落中乳酸菌和芽孢杆菌的定量分析方法 |
| CN103993071A (zh) * | 2014-03-27 | 2014-08-20 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 酒醅微生物群落中乳酸菌、梭菌、芽孢杆菌的定量分析方法 |
| CN105349670A (zh) * | 2015-11-30 | 2016-02-24 | 武汉轻工大学 | 用于饲料中添加的干酪乳杆菌的快速定性、定量检测试剂盒及检测方法和应用 |
| CN106399297A (zh) * | 2016-09-07 | 2017-02-15 | 贵州茅台酒股份有限公司 | 一种经济快速提取酒醅中微生物基因组dna的方法 |
| CN107699610A (zh) * | 2017-10-13 | 2018-02-16 | 哈尔滨工业大学（威海） | 用于检测白酒发酵过程中耐酸乳酸杆菌含量的两对特异性引物及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JIAN,Y. ET AL.: "Lactobacillus jinshani strain HSLZ-75 chromosome, complete genome", 《GENBANK: CP034726.1》 * |
| 刘倩倩 等: "耐酸乳酸杆菌物种特异性引物设计及其在古井贡酒窖泥酒醅质量评价中的初步应用", 《食品与发酵工业》 * |
| 李德林: "浓香型白酒酒醅微生物分子生物学研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库(电子期刊)工程科技Ⅰ辑》 * |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20191126 |