CN102146457B - 植物乳杆菌pcr检测、鉴定特异引物对 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一对植物乳杆菌的特异引物，这对引物可以快速、准确地检测出植物乳杆菌。同时建立了植物乳杆菌的PCR鉴定方法，可根据扩增产物是否产生特异的植物乳杆菌条带(大小为100bp)，对微生物肥料中的植物乳杆菌进行检测和鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体而言，提供了利用PCR技术快速检测、鉴定植物乳杆菌的引物对，适合于微生物肥料质检机构、菌种鉴定机构应用。
背景技术
植物乳杆菌与人类的生活关系密切，是一种常见于奶油、肉类及许多蔬菜发酵制品中的乳酸菌。在食品、青贮饲料、美容、水产养殖、工农业生产、生物防腐剂、益生菌制剂、以及医疗保健等领域受到越来越多的关注并都有着广泛的应用。在微生物肥料行业，研究发现其在腐解有机物料、净化水体、促生及抑制病原菌等方面均具有良好的使用效果。
鉴于植物乳杆菌的多功能性，已有很多企业将其用于微生物肥料生产，植物乳杆菌作为有效菌的微生物肥料产品日益增多；另一方面，在产品质量检测过程中发现，乳杆菌种类多，表型相似，很难快速准确区分，而传统的检测方法主要是以形态特征和各项生理生化方法为主，存在着检验周期长，操作繁琐，费用高，准确性差等缺点。因此，迫切需要研究建立快速、准确、灵敏的检测新方法，以满足以植物乳杆菌为有效菌的微生物肥料产品检测的准确性和时效性。
PCR方法有着快速、准确和灵敏的特点，使用种特异引物对菌株进行特异PCR扩增用于微生物快速鉴定技术已经广泛用于食品安全、临床医学等领域：如对各种病毒和病源体-乙肝病毒、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等病源菌已建立了PCR检测方法；在微生物肥料领域也得到了应用，关大伟等人曾建立了的特异PCR法用于沼泽红假单胞菌的鉴定和检测，曹凤明等人建立了一种鉴定微生物肥料中侧孢短芽孢杆菌的特异PCR方法，都取得了良好的应用效果。这都表明了随着技术的发展，分子生物学技术将在微生物检测领域发挥着越来越重要的作用。为将PCR技术更广泛应用于微生物肥料检测和菌种鉴定领域，本发明人利用NCBI中Primer-BLAST(引物设计和特异性检验工具)，以Genbank数据库中某个植物乳杆菌的recA基因(重组蛋白基因)为目标模板序列设计出一对植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)种特异性引物。并通过反复摸索实践建立了基于PCR技术的、能够快速、准确、灵敏地检测微生物肥料中植物乳杆菌的方法。该方法适用于植物乳杆菌的检测和鉴定。
发明内容
本发明内容的关键是提供用于检测、鉴定植物乳杆菌的特异引物对。另一内容是提供利用这对引物对待测菌株进行特异PCR扩增鉴定植物乳杆菌的方法。
具体而言，本发明利用已公布的植物乳杆菌recA核酸序列为目标模板序列，利用NCBI中Primer-BLAST(引物设计和特异性检验工具)设计出一对植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)种特异性引物。通过优化PCR反应中的镁离子浓度和退火温度等条件来提高PCR方法的特异性，并根据优化结果建立了植物乳杆菌的特异PCR鉴定方法，用于微生物肥料中植物乳杆菌的检测和鉴定。
本发明用于检测、鉴定植物乳杆菌的引物对序列为：
上游引物(F)：5′-GTTGACTCGGTGGCGGCCTT-3′；
下游引物(R)：5′-GGAGCGCTTGTGACATCAGCCG-3′。
本发明用于鉴定植物乳杆菌的PCR方法为：
PCR反应体系：10×buffer 2.0μL
Mg2+(25mmol/L) 1.6μL
dNTPS(10mmol/L) 1.6μL
上游引物(20μmol/L) 0.5μL
下游引物(20μmol/L) 0.5μL
Taq E(2.5U/μL) 0.2μL
模板DNA 1.0μL
补足ddH2O至 20μL
PCR扩增参数：94℃ 3min
72℃ 10min。
附图说明
图1为应用植物乳杆菌特异引物对植物乳杆菌标准菌株及乳杆菌属其它菌株进行PCR的实验结果。其中，各泳道的具体说明如下：
泳道1：DNA分子量标准：100bp标准分子量
泳道2：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum CGMCC 1.2437T)
泳道3：植物乳杆菌(L.plantarum CGMCC 1.2158)
泳道4：植物乳杆菌(L.plantarum CGMCC 1.555)
泳道5：植物乳杆菌(L.plantarum ACCC 10533)
泳道6：植物乳杆菌(L.plantarum ACCC 10644)
泳道7：鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus ACCC10534T)
泳道8：嗜酸乳杆菌(L.acidophilus CGMCC 1.1878T)
泳道9：德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckii subsp.bulgaricus CGMCC 1.1480)
泳道10：德氏乳杆菌乳亚种(L.delbrueckii subsp.lactis CGMCC 1.2625T)
泳道11：德氏乳杆菌德氏亚种(L.delbrueckiisubsp.delbruekii CGMCC 1.2624T)
泳道12：布氏乳杆菌(L.buchneri CGMCC 1.13)
泳道13：干酪乳杆菌干酪亚种(L.casei subsp.casei CGMCC 1.2435)
泳道14：鼠乳杆菌(L.murinus CGMCC 1.2626T)
泳道15：动物乳杆菌(L.animalis CGMCC 1.2623)
泳道16：清酒乳杆菌(L.sake CGMCC 1.6)
泳道17：瑞士乳杆菌(L.helveticus ACCC10532T)
泳道18：发酵乳杆菌(L.fermentium CGMCC 1.1880T)
泳道19：玉米乳杆菌(L.zeae CICC20290)
泳道20：戊糖乳杆菌(L.pentosus CICC20301)
泳道21：高加索酸奶乳杆菌(L.kefiri CICC6080)
泳道22：类植物乳杆菌(L.paraplantarum CICC 22192)
图2为应用植物乳杆菌特异引物对植物乳杆菌标准菌株及微生物肥料常见非乳杆菌属菌株进行PCR的实验结果。其中，各泳道的具体说明如下：
泳道1：DNA分子量标准：100bp标准分子量
泳道2：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum CGMCC 1.2437T)
泳道3：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CCTCCAB92068T)
泳道4：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis CCTCCAB92069T)
泳道5：胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus VKPM B-7519T)
泳道6：巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium CCTCCAB92075T)
泳道7：多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa CCTCCAB92076T)
泳道8：恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida CGMCC 1.1839)
泳道9：侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus CGMCC 1.2012T)
泳道10：戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus 1.2695)
泳道11：乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis1.2829)
具体实施方式
下面结合附图对本发明具体实施方案进一步说明。
实施例
用植物乳杆菌特异性引物对标准菌株进行PCR检测。
(1)材料
测试菌：下面表1所列标准菌株为测试菌。
表1
(2)引物的设计和合成
根据植物乳杆菌的recA核酸序列设计植物乳杆菌特异性引物。所述引物如表2所示。所述引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
表2
| 种类 | 引物 | 核苷酸序列 |
| 植物乳杆菌 | 上游引物(F) | 5′-GTTGACTCGGTGGCGGCCTT-3′ |
| 植物乳杆菌 | 下游引物(R) | 5′-GGAGCGCTTGTGACATCAGCCG-3′ |
(3)DNA提取：取1.5mL菌液于Eppendorf管中，13000r/min离心2min收集菌体。将收集到的菌体用1×TE缓冲液洗涤菌体2次，再加入于上述2mL离心管中，加入约0.7-1.0g珠子(beater)，加磷酸缓冲液700μL，加酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)至管口。轻轻摇匀，于mini-beadbeater(研磨珠均质器)上振1min-1min30s，而后13000r/min离心5min；吸上清至另一1.5mL离心管，加等量氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻轻混匀，13000r/min离心5min；吸上清至另一1.5mL离心管，加等量异丙醇，-20℃保存30min-3h后13000r/min离心10min，去上清，沉淀用70％乙醇500μL离心洗涤2次；去上清，干燥，而后加适量1×TE缓冲液(30-150μL)，65℃保温30min溶解DNA，该溶液即为从菌株中提取的DNA样品。经电泳检测后稀释至适宜浓度用于PCR扩增。DNA样品贮藏于-20℃。
(4)PCR反应体系和PCR反应程序
按表3所示配方，在200uLPCR管中加入试剂和DNA溶液，制备成PCR混合液。
表3
| 成分 | 体积(μL) |
| dd H2O | 12.6 |
| 10×Buffer | 2.0 |
| Mg2+(25mM) | 1.6 |
| dNTP(2.5mM/each) | 1.6 |
| 引物I(20μM) | 0.5 |
| 引物II(20μM) | 0.5 |
| TaqE(5U/μL) | 0.2 |
| DNA(50ng/μL) | 1.0 |
PCR混合液在94℃进行热变性3min后，完成如下30个循环：94℃热变性60s，67℃退火/复性45s，72℃延长反应60s。最后72℃延长反应10min。
(5)结果
该实验结果如图1和图2所示，植物乳杆菌标准菌株(图1的泳道2-6，图2的泳道2)均能扩增出一条长度为100bp的特异条带，而其他测试菌(图1的泳道7-22，图2的泳道3-11)则无目标条带产生，这说明本发明的特异性引物能够准确地检测和鉴定植物乳杆菌。
Claims (1)
1.一种用于检测、鉴定植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的特异性扩增引物对，其特征在于，序列为：
上游引物(F)：5′-GTTGACTCGGTGGCGGCCTT-3′；
下游引物(R)：5′-GGAGCGCTTGTGACATCAGCCG-3′。
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| Sandra Torriani et al..Differentiation of Lactobacillus plantarum, L. pentosus, and L. paraplantarum by recA Gene Sequence Analysis and Multiplex PCR Assay with recA Gene-Derived Primers.《Applied and Environmental Microbiology》.2001,第67卷(第8期),第3451页右栏"Multiplex PCR assay"部分. |
| 干酪乳杆菌群和植物乳杆菌群的分子鉴定技术和分类方法的研究进展;王芳等;《乳业科学与技术》;20101031(第144期);第243页第2.3节 * |
| 王芳等.干酪乳杆菌群和植物乳杆菌群的分子鉴定技术和分类方法的研究进展.《乳业科学与技术》.2010,(第144期),第243页第2.3节. |
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