CN107075544A - 与聚合酶联用的缓冲液 - Google Patents
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Abstract
提供了包含阳离子表面活性剂和阴离子表面活性剂的扩增反应混合物。本文提供了用于储存聚合酶的溶液。在一些实施方式中,溶液包含聚合酶;阴离子表面活性剂;和阳离子表面活性剂。在一些实施方式中,阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂的浓度为0.0001%至0.1%。在一些实施方式中,阴离子去污剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。在一些实施方式中,阳离子去污剂是十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。在一些实施方式中,阴离子去污剂是SDS并且阳离子去污剂是CTAB。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年7月22日提交的美国临时专利申请号62/027,668的优先权,该文通过引用纳入本文。
发明背景
聚合酶用于大量不同的分子反应,包括但不限于聚合酶链反应(PCR)。
发明内容
本文提供了用于储存聚合酶的溶液。在一些实施方式中,溶液包含聚合酶;阴离子表面活性剂;和阳离子表面活性剂。在一些实施方式中,阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂的浓度为0.0001%至0.1%。在一些实施方式中,阴离子去污剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。在一些实施方式中,阳离子去污剂是十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。在一些实施方式中,阴离子去污剂是SDS并且阳离子去污剂是CTAB。
在一些实施方式中,溶液还包含两性离子表面活性剂。在一些实施方式中,两性离子表面活性剂是3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)。在一些实施方式中,两性离子表面活性剂的浓度为0.01-1.0%。
在一些实施方式中,其中,聚合酶是热稳定的。
还提供了包含聚合酶、阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂的反应混合物。在一些实施方式中,反应混合物还包含核酸样品。在一些实施方式中,反应混合物还包含以下中的至少一种:核苷酸或寡核苷酸引物,适于聚合酶链反应(PCR)的缓冲剂,和镁。
在一些实施方式中,阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂的浓度为0.0001%至0.1%。在一些实施方式中,阴离子去污剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。在一些实施方式中,阳离子去污剂是十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。在一些实施方式中,阴离子去污剂是SDS并且阳离子去污剂是CTAB。
在一些实施方式中,反应混合物还包含两性离子表面活性剂。在一些实施方式中,两性离子表面活性剂是3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)。在一些实施方式中,两性离子表面活性剂的浓度为0.01-1.0%。
在一些实施方式中,聚合酶是热稳定的。
还提供了进行引物延伸反应的方法。在一些实施方式中,该方法包括:
形成包含以下组分的反应混合物:可能包含靶序列的核酸样品;与靶序列退火的引物;聚合酶;阴离子表面活性剂;和阳离子表面活性剂。
将引物与可能存在的靶序列退火;并且
用聚合酶将引物延伸至少一个核苷酸。
在一些实施方式中,延伸包括热循环条件。在一些实施方式中,延伸包括聚合酶链反应(PCR)。
在一些实施方式中,阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂的浓度为0.0001%至0.1%。在一些实施方式中,阴离子去污剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。在一些实施方式中,阳离子去污剂是十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。在一些实施方式中,阴离子去污剂是SDS并且阳离子去污剂是CTAB。
在一些实施方式中,反应混合物还包含两性离子表面活性剂。在一些实施方式中,两性离子表面活性剂是3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)。在一些实施方式中,两性离子表面活性剂的浓度为0.01-1.0%。
在一些实施方式中,聚合酶是热稳定的。
还提供了包含聚合酶、阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂的试剂盒。在一些实施方式中,第一容器含有聚合酶且第二容器包含阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂。在一些实施方式中,容器包含聚合酶,阴离子表面活性剂,和阳离子表面活性剂。在一些实施方式中,阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂处于母液浓度。在一些实施方式中,阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂的浓度为0.0001%至0.1%。在一些实施方式中,阴离子去污剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。在一些实施方式中,阳离子去污剂是十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。在一些实施方式中,阴离子去污剂是SDS并且阳离子去污剂是CTAB。在一些实施方式中,试剂盒还包含两性离子表面活性剂。在一些实施方式中,两性离子表面活性剂是3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)。在一些实施方式中,两性离子表面活性剂的浓度为0.01-1.0%。在一些实施方式中,聚合酶是热稳定的。
定义
除非另有说明,本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义。通常,本文所用的命名和下述细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学以及杂交中的实验室步骤均为本领域熟知和常用的。使用标准技术进行核酸和肽合成。按照本领域和各种通用参考文献所述的常规方法进行这些技术和步骤(通常参见,Sambrook等,《分子克隆:实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL),第2版(1989)冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),纽约冷泉港(Cold SpringHarbor,N.Y.),其通过引用纳入本文),将它们引入本文全文中。本文所用的命名以及下述分析化学和有机合成中的实验室步骤均为本领域熟知且常用。
“表面活性剂”是降低两种液体之间或液体和固体之间的表面张力(或界面张力)的化合物。表面活性剂可用作去污剂、润湿剂、乳化剂、泡沫剂和分散剂。表面活性剂通常是两性的有机化合物。
术语“Sso7”或“Sso7DNA结合结构域”或“Sso7样DNA结合结构域”或“Sso7结构域”指核酸和多肽多态性变体、等位基因、突变体和种间同源物,其:(1)氨基酸序列与WO2012/177695的SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有大于约60%(65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高)的序列相同性;或(2)在严谨杂交条件下特异性杂交至WO2012/177695的SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:10的Sso7d编码核酸序列;及其保守修饰变体。该术语包括全长Sso7d多肽和具有序列非特异性双链结合活性的多肽片段。Sso7样蛋白包括但不限于Sso7d、Sac7d和Sac7e。比野生型Sso7d的特异性增加的各种Sso7d突变结构域描述于,例如,WO2012/138417和WO2012/138416。
“结构域”指蛋白质或蛋白质复合物的单元,包含多肽子序列、完整多肽序列,或多个多肽序列,这些序列中该单元具有限定的功能。该功能理解为广义定义并且可以是配体结合、催化活性或者可对蛋白质结构有稳定化效果。
用于蛋白质部分时,“异源”指该蛋白质包含在天然情况下彼此不存在于同一关系中的两个或更多结构域。这类蛋白质(如融合蛋白)含有来自不相关蛋白质的两个或更多个结构域,其排列为生成新的功能性蛋白质。
“接合”是指本领域已知的用于功能性连接蛋白质结构域的任何方法,包括但不限于用或不用中间结构域的重组融合,内含肽-介导的融合,非共价结合,和共价键合,包括二硫键键合;氢键键合;静电键合;和构象键合,例如,抗体-抗原,和生物素-亲和素结合。
本文使用的“热稳定聚合酶”或“热稳定性聚合酶”指使用DNA或RNA作为模板通过向核苷酸链中加入核苷酸单元以催化多核苷酸合成的酶且该酶在高于45℃的温度下达到最佳活性。
“嗜热酶”是指从任何嗜热物种分离的A家族DNA聚合酶,包括但不限于水生栖热菌(Thermus aquaticus)、布鲁克栖热菌(Thermus brockianus)、和嗜热栖热菌(Thermusthermophilus);衍生自嗜热物种的任意重组聚合酶,及其任意功能性衍生物,无论是衍生自遗传修饰或化学修饰或本领域已知的其他方法。
术语“扩增反应”指用于倍增核酸靶序列拷贝的任何体外方法。这类方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、DNA连接酶链反应(参见美国专利号4,683,195和4,683,202;《PCR方案:方法和应用指南》(Innis等编,1990))、(LCR)、QBeta RNA复制酶、和基于RNA转录(如TAS和3SR)的扩增反应以及本领域技术人员已知的其它反应。
“扩增”指将溶液置于足以扩增多核苷酸的条件下的步骤(如果反应的所有组分是完整的)。扩增反应的组分包括,例如,引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸等。术语“扩增”一般是指靶核酸的“指数型”增长。然而,本文所用的“扩增”也可指核酸的选择靶序列数量的线性增长,如由循环测序所得。
术语“扩增反应混合物”指包含用于扩增靶核酸的各种试剂的水性溶液。这些试剂包括酶、水性缓冲剂、盐、扩增引物、靶核酸和三磷酸核苷。如本发明中进一步讨论的那样,扩增反应混合物还可包含稳定剂和其它添加剂以优化效率和特异性。根据内容,混合物可以是完整或不完整(例如,缺少核酸模板、引物,或同时缺少两者)扩增反应混合物。
“聚合酶链反应”或“PCR”是指靶双链DNA的特定区段或子序列得以几何级数式扩增的一种方法。PCR是本领域技术人员所熟知的;参见例如,美国专利号4,683,195和4,683,202;和《PCR方案:方法和应用指南》,Innis等编,1990。示例性PCR反应条件一般包括两步或三步循环。两步循环具有变性步骤,之后是杂交/延伸步骤。三步循环包括变性步骤,之后是杂交步骤,之后是独立的延伸步骤。
“引物”指与靶核酸上的序列杂交并且用作核酸合成的起始点的多核苷酸序列。引物可以是各种长度的并且通常长度小于50个核苷酸,例如长度为12-30个核苷酸。可基于本领域技术人员已知的原理设计用于PCR的引物的长度和序列,参见例如Innis等(同上)。
“模板”指包含待扩增的多核苷酸、侧接引物杂交位点的多核苷酸序列。因此,“靶模板”包含侧接5′引物和3′引物的杂交位点的靶多核苷酸序列。
本文所用的“核酸”表示DNA、RNA、单链、双链、或更高度聚集的杂交基序及其任意化学修饰。修饰包括但不限于,提供整合入其它电荷、极化性、氢键、静电相互作用、与核酸配体碱基或核酸配体整体的连接点和作用点的化学基团的那些修饰。这类修饰包括但不限于,肽核酸(PNA)、磷酸二酯基团修饰(例如,硫代磷酸酯、甲基膦酸酯)、2′-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、环外胺处的修饰、4-硫尿核苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代、骨架修饰、甲基化、不常见的碱基配对组合如异碱基(isobases)、异胞苷和异胍(isoguanidine)等。核酸也可包含非天然碱基,如硝基吲哚。修饰还可包括3′和5′修饰,例如用荧光团(例如,量子点)或其他部分加帽。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换使用,指氨基酸残基的聚合物。该术语可用于表示其中一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物,以及天然产生的氨基酸聚合物和非天然产生的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”指天然产生的和合成的氨基酸,以及作用方式类似于天然产生氨基酸的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然产生的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸,以及随后经修饰的那些氨基酸,例如,羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然产生的氨基酸具有相同基本化学结构的化合物,即碳原子与氢原子、羧基、氨基和R基结合,如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这种类似物具有修饰的R基(如正亮氨酸)或修饰的肽主链,但保留了与天然产生的氨基酸基本相同的化学结构。氨基酸模拟物指结构不同于氨基酸的普通化学结构,但作用方式类似于天然产生氨基酸的化合物。
本文中氨基酸可按IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的俗称三字母符号或单字母符号表述。同样,核苷酸可指其普遍接受的单字母代码。
“保守修饰变体”可应用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列,保守修饰变体指编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸,或者当核酸不编码氨基酸序列时,指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性,大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如,密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此,在密码子指定丙氨酸的每个位置上,可将所述密码子改变成所述的任何相应密码子而不改变编码的多肽。这类核酸变异是“沉默变异”,这是保守修饰变异的一种。本文编码多肽的每种核酸序列也描述该核酸的每种可能的沉默变异。本领域技术人员应认识到,可修饰核酸中的各个密码子(除了AUG和TGG,AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子,TGG通常是色氨酸的唯一密码子),以产生功能相同的分子。因此,在所述的各序列中隐含了编码多肽的各核酸沉默变异。
至于氨基酸序列,本领域技术人员将认识到,在编码序列中改变、加入或删除一个氨基酸或较少百分数氨基酸的某一核酸、肽、多肽或蛋白质序列单独取代、缺失或添加是“保守修饰变体”,其中所述改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸所取代。提供功能上相似氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。此类保守修饰的变体是本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因的补充且并不排除它们。
术语“编码”指编码一种或多种氨基酸的多核苷酸序列。该术语无需起始或终止密码子。氨基酸序列可编码于多核苷酸序列提供的六种不同的阅读框中任一种中。
术语“启动子”指定位于转录起始上游和/或下游且涉及识别和结合RNA聚合酶和其他蛋白质以起始转录的区域或序列。
“聚合酶”是指进行模板引导的多核苷酸(例如,DNA和/或RNA)合成的酶。该术语同时包括全长多肽和具有聚合酶活性的结构域。DNA聚合酶是本领域技术人员熟知的,包括但不限于从激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、滨海嗜热球菌(Thermococcus litoralis)和海栖热袍菌(Thermotoga maritime)分离或衍生的DNA聚合酶或其修饰版本。它们包括DNA-依赖聚合酶和RNA-依赖聚合酶,如逆转录酶。已知至少5个DNA-依赖DNA聚合酶家族,虽然大多数落入A、B和C家族。各家族之间很少或没有序列相似性。大多数A家族聚合酶是可含有多重酶促功能(包括聚合酶、3′到5′外切核酸酶活性和5′到3′外切核酸酶活性)的单链蛋白质。野生型B家族聚合酶通常有具有聚合酶和3′到5′外切核酸酶活性的单个催化结构域,以及辅助因子。C家族聚合酶通常是具有聚合和3′到5′外切核酸酶活性的多亚基蛋白质。在大肠杆菌中,已经发现了3种类型的DNA聚合酶,DNA聚合酶I(A家族)、DNA聚合酶II(B家族)和DNA聚合酶III(C家族)。在真核细胞中,核复制中涉及3种不同的B家族聚合酶,DNA聚合酶α、δ和ε,并且A家族聚合酶,聚合酶γ用于线粒体DNA复制。其他类型的DNA聚合酶包括噬菌体聚合酶或者两种或更多种聚合酶之间的融合体。相似地,RNA聚合酶通常包括真核RNA聚合酶I、II和III,和细菌RNA聚合酶以及噬菌体和病毒聚合酶。RNA聚合酶可以是DNA-依赖的和RNA-依赖的。
当如下述比对最大对应性时,如果在两条序列中核苷酸或氨基酸残基的序列分别是相同的,两条核酸序列或多肽被称为“相同的”。在两条或更多条核酸或多肽序列内容中的术语“相同的”或“相同性”百分比指就比较窗的最大对应性进行比较和比对时,相同或有特定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸的两条或更多条序列或子序列,如使用下列序列比较算法之一或通过手工比对和目测测量。序列相同性百分比涉及蛋白和肽使用时,认为不同的残基位置通常由于保守氨基酸取代而不同,其中氨基酸残基被具有相似化学性质(如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代,因此不改变分子的功能性质。当序列由于保守取代而不同时,序列相同性百分比可上调以根据该取代的保守性质校正。进行该调整的方法为本领域技术人员公知。通常其包括将保守取代作为部分评分而不是完全错配,从而增加序列相同性百分比。因此例如,相同氨基酸得分为1,非保守取代得分为0,保守取代得分为0-1。保守取代的评分按照,例如Meyers和Miller的算法,Computer Applic.Biol.Sci.4:11-17(1988),例如,如在程序PC/GENE(美国加利福尼亚州芒廷维尤的智慧遗传公司(Intelligenetics,Mountain View,California,USA))中执行的进行计算。
如果采用以下序列比较算法之一或通过手工比对和目测检查测量时,当就比较窗口或指定区域上的最大对应性而言,这些序列有特定百分数的核苷酸或氨基酸残基相同(例如在特定区域上至少60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同),则序列彼此间“基本相同”。
对于序列比较,一般将一条序列用作与测试序列比较的参比序列。使用序列比较算法时,测试和参比序列均输入计算机,必要时指定子序列坐标,指定序列算法程序参数。可使用默认的程序参数,或者可指定另外的参数。然后,该序列比较算法基于程序参数计算出测试序列相对于参比序列的序列相同性百分数。
本文所用的“比较窗口”包括参考选自20-600,通常约50-200,更常见约100-150的任一数量的毗连位置的区段,其中对两个序列进行最优比对后,可将序列与具有相同数量毗连位置的参比序列作比较。比对序列的比较方法是本领域熟知的。可进行最优序列比对以作比较,例如,通过Smith和Waterman的局部同源性算法,Adv.Appl.Math.2:482(1981);通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法,J.Mol.Biol.48:443(1970);通过Pearson和Lipman的相似性搜索法,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988);通过计算机执行这些算法(阿克赛勒里公司(Accelrys)的威斯康星遗传学软件包(Wisconsin GeneticsSoftware Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA),或通过手工比对和目测。
适合确定序列相同性和序列相似性百分数的算法分别是BLAST和BLAST 2.0算法,分别描述于Altschul等,Nuc.Acids Res.25:3389-402(1977)和Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-10(1990)。进行BLAST分析的软件可从国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得(http://ncbi.nlm.nih.gov/)。此算法包括:首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP),与数据库序列中长度相同的字比对时它们能匹配或满足一些正值的阈值评分T。T称为相邻字评分阈值(Altschul等,同上)。这些初始相邻字命中用作启动搜索的种子,以便找到含有它们的较长HSP。只要可提高累积比对评分,该字命中在两个方向上沿各序列延伸。出现以下情况时中止字命中在各个方向上的延伸:累积比对评分比其最大获得值降低X;由于一个或多个负评分残基比对的累积,累积评分变为零或零以下;或者达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用的默认值为:字长(W)11,BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))比对(B)50,期望值(E)10,M=5,N=-4,以及比较两条链。
BLAST算法也对两条序列间的相似性进行统计学分析(参见例如,Karlin和Altschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小概率和(P(N)),它表明两条核苷酸或氨基酸序列之间偶尔发生匹配的概率。例如,如果测试核酸与参比核酸比较时的最小概率和小于约0.2,更优选小于约0.01,最优选小于约0.001,那么认为该核酸与参比序列相似。
术语“严谨杂交条件”指通常在核酸的复杂混合物中,探针与其目标子序列杂交,但不与其他序列杂交的条件。严谨条件是序列依赖性的,在不同情况下不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。有关核酸杂交的广泛指南参见Tijssen,Techniques inBiochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes(《生物化学和分子生物学技术-与核酸探针杂交》),“Overview of principles of hybridizationand the strategy of nucleic acid assays(核酸测定的杂交原理和方案概览)”(1993)。通常,高严谨条件选择为比特定序列在确定离子强度、pH下的解链温度(Tm)低约5-10℃。通常低严谨条件选择为低于Tm约15-30℃。Tm是50%靶标互补探针与靶序列杂交平衡时的温度(在确定离子强度、pH和核酸浓度下)(由于靶序列过量存在,在Tm时50%探针被平衡地占据)。杂交条件一般是盐浓度小于约1.0M钠离子,一般约0.01至1.0M钠离子浓度(或其它盐),pH 7.0至8.3,对短探针(例如,10-50个核苷酸)而言温度至少约为30℃、对长探针(例如大于50个核苷酸)而言至少约60℃的条件。也可加入去稳定剂如甲酰胺以获得严谨条件。在选择性或特异性杂交中,阳性信号至少是背景杂交的两倍,优选10倍。
如果核酸编码的多肽基本相同,那么在严谨条件下彼此不杂交的核酸仍基本相同。例如,用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时可能发生这种情况。在这种情况下,核酸一般在中等严谨的杂交条件下杂交。示范性“中等严谨杂交条件”包括37℃,在40%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS的缓冲液中杂交,45℃,1X SSC洗涤。示例性“严谨条件”包含在40%甲酰胺、1M NaCI、1%SDS的缓冲液中37℃杂交,和至少一次在0.2X SSC中于至少约50℃的温度下(通常约55℃-约60℃)洗涤20分钟,或等同的条件。阳性杂交至少是背景的两倍。本领域普通技术人员不难认识到,可利用替代的杂交和洗涤条件提供相似严谨性的条件。
附图的简要说明
图1显示了经过琼脂糖凝胶中的电泳的扩增反应的结果。在实施例中在表1中提供了各反应的相同性。
图2显示了经过琼脂糖凝胶中的电泳的扩增反应的结果。在实施例中在表2中提供了各反应的相同性。
发明详述
发明人已经惊讶地发现,在扩增反应中包含阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂导致与缺少两种表面活性剂之一或同时缺少两者相比改善的扩增产率。事实上,如图1所示,仅包含阴离子表面活性剂(例如,SDS)或仅包含阳离子表面活性剂(例如,CTAB)并没有在扩增反应中提供任何明显益处。相反,同时包含阴离子和阳离子表面活性剂导致高扩增产率。另外,已经发现在两性离子表面活性剂(例如,CHAP)存在下,可以高浓度将阴离子和阳离子表面活性剂储存在一起以维持阴离子和阳离子表面活性剂的溶解性,同时允许它们从更高浓度母液用于扩增反应。因此,在一些实施方式中,提供了包含阴离子和阳离子表面活性剂,并且任选地也包含两性离子表面活性剂的反应混合物和扩增反应母液及其使用方法。
阴离子表面活性剂是例如在pH 7下带负电的表面活性剂。示例性的阴离子表面活性剂包括,但不限于,十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、全氟辛酸、月桂基硫酸钾、月桂基硫酸锂、全氟丁磺酸、全氟壬酸、全氟辛烷磺酸、二辛基磺基琥珀酸钠、月桂基硫酸铵、月桂酰肌氨酸钠、肉豆蔻醇聚醚硫酸钠、链烷醇聚醚硫酸钠、硬脂酸钠。
阳离子表面活性剂是例如在pH 7下带正电的表面活性剂。示例性的阳离子表面活性剂包括,但不限于,十六烷基三甲基溴化铵(CTAB),具有pH-决定伯胺、仲胺或叔胺的表面活性剂,如奥替尼啶二盐酸盐,或烷基三甲基铵盐(例如,CTAB或十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)),或十六烷基氯化吡啶鎓(CPC)、三甲基(十四烷基)溴化铵(TTAB),苯扎氯铵(BAC),氯化苄乙铵(BZT),5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷,二甲基双十八烷基氯化铵,十六烷基三甲基溴化铵,或双十八烷二甲基基溴化铵(DODAB)。
可按照需要调节反应混合物中的阴离子表面活性剂以优化扩增产率。在一些实施方式中,以相同浓度在反应混合物中提供阴离子和阳离子表面活性剂,或者其中表面活性剂之一的浓度与另一种表面活性剂的差异不超过5%、10%或20%。例如,阴离子和阳离子表面活性剂之一或两者的浓度可以是0.0001%-0.1%,例如,0.001-0.1%,例如,0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、或0.09%或者如本文他处所述。
在一些实施方式中,反应混合物或母液还包含两性离子表面活性剂。示例性的两性离子表面活性剂包括,但不限于,3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-([3-胆酰胺丙基)二甲基铵基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CHAPSO)。在一些实施方式中,两性离子表面活性剂的浓度为0.001-1%,例如,0.001-0.01%或0.01-0.1%。
一般而言,认为基本上任何聚合酶可包含在包含阴离子和阳离子表面活性剂的反应混合物中以改善扩增产率。在一个示例性的实施方式中,聚合酶包含衍生自2种亲本聚合酶Pfu和DeepVent的聚合酶结构域。这类聚合酶描述于,例如,美国申请公开号20040219558,20040214194,20040191825,20030162173,其各自通过引用纳入本文。
多种聚合酶可用于反应混合物中,或者作为反应混合物中杂交聚合酶的聚合酶结构域的至少一部分。已知至少5个DNA-依赖DNA聚合酶家族,虽然大多数落入A、B和C家族。各家族之间很少或没有结构或序列相似性。大多数A家族聚合酶是可含有多重酶促功能(包括聚合酶、3′到5′外切核酸酶活性和5′到3′外切核酸酶活性)的单链蛋白质。野生型B家族聚合酶通常有具有聚合酶和3′到5′外切核酸酶活性的单个催化结构域,以及辅助因子。C家族聚合酶通常是具有聚合和3′到5′外切核酸酶活性的多亚基蛋白质。在大肠杆菌中,已经发现了3种类型的DNA聚合酶,DNA聚合酶I(A家族)、DNA聚合酶II(B家族)和DNA聚合酶III(C家族)。在真核细胞中,核复制中涉及3种不同的B家族聚合酶,DNA聚合酶α、δ和ε,并且A家族聚合酶,聚合酶γ用于线粒体DNA复制。其它类型的DNA聚合酶包括噬菌体聚合酶。任意这些聚合酶,这些聚合酶的全部或部分的组合,以及这些聚合酶中的2种或更多种之间的嵌合物或杂交体或其等价物可用于形成聚合酶结构域的部分或全部用于本文所述的混合物中。
在一些实施方式中,聚合酶包含赋予聚合酶外切核酸酶缺陷的一个或多个突变。本文所用的“外切核酸酶缺失”表示聚合酶具有明显降低的(即,少于10%、5%或1%的来自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的Pfu DNA聚合酶的3’-5’外切核酸酶活性)或者没有外切核酸酶活性。例如,在D141和E143位置处丙氨酸取代的聚合酶结构域中的两点突变可去除或消除3’-5’外切核酸酶活性。参见例如,Derbyshire等,Methods in Enzymology,卷262(1995),第363-385页。包含这种两点突变的杂交体(例如,融合至序列非特异性双链DNA结合结构域)聚合酶将一般在核酸扩增反应中显示出增加的特异性,导致较少的扩增副产物(如引物二聚体的扩增)和增加的所需靶核酸扩增效率。
在一些实施方式中,聚合酶融合至DNA结合结构域。这种融合肽有时在本文中称为“杂交聚合酶”。DNA结合结构域是以序列不依赖的方式结合(例如结合不显示对特定序列的总体偏好)核酸的蛋白质或蛋白质的限定区域。DNA结合结构域可结合单链或双链核酸。
本发明使用的DNA结合蛋白质通常是热稳定的。这类蛋白质的示例包括但不限于古细菌小基础DNA结合蛋白Sso7d和Sso7d样蛋白(参见例如,Choli等,Biochimica etBiophysica Acta 950:193-203,1988;Baumann等,Structural Biol.1:808-819,1994;以及Gao等,Nature Struc.Biol.5:782-786,1998),古细菌HMf样蛋白(参见例如,Starich等,J.Molec.Biol.255:187-203,1996;Sandman等,Gene 150:207-208,1994),以及PCNA同源物(参见例如,Cann等,J.Bacteriology 181:6591-6599,1999;Shamoo和Steitz,Cell:99,155-166,1999;De Felice等,J.Molec.Biol.291,47-57,1999;以及Zhang等,Biochemistry34:10703-10712.1995)。
HMf样蛋白是古细菌组蛋白,其在氨基酸序列和结构上都与被认为和与DNA直接相互作用的真核细胞H4组蛋白具有同源性。这些HMf家族蛋白在溶液中形成稳定的二聚体,且已从热稳定的物种(例如炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)和火球菌菌株GB-3a)中鉴定到若干HMf同源物。HMf家族蛋白质,一旦连接至具有低固有持续合成能力的DNA聚合酶或任何DNA修饰酶,可增强酶沿着DNA底物滑动的能力并由此增加其持续合成能力。例如,二聚体HMf-样蛋白质可共价连接至Taq DNA聚合酶的N端,例如,通过化学修饰,并由此改善聚合酶的持续性。
某些螺旋-发夹-螺旋基序已被证明非特异性结合DNA并增强其融合的DNA聚合酶的持续合成能力(Pavlov等,Proc Natl Acad Sci USA.99:13510-5,2002)。
Sso7d和Sso7d样蛋白、Sac7d和Sac7d样蛋白(例如Sac7a、Sac7b、Sac7d和Sac7e)是分别来自极端嗜热性古细菌硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)和酸热脂环酸硫化叶菌(S.acidocaldarius)的小(约7,000kd MW)、基础染色体蛋白。这些蛋白质是富赖氨酸的且具有高度的热、酸和化学稳定性。其以不依赖序列的方式结合DNA,在一些情况下,一旦结合,使得DNA的Tm升高最多达40℃(McAfee,Biochemistry 34:10063-10077,1995;Gao等,Nat.Struct.Biol.5(9):782-786,1998)。这些蛋白质及其同源物通常被认为参与在升高的温度下稳定基因组DNA。用于本发明的合适的Sso7d样DNA结合结构域可基于其与Sso7d的序列同源性进行修饰。通常,在约25个氨基酸的比较窗口上(任选约50-100个氨基酸或整个蛋白质的长度)与已知的DNA结合蛋白相同或基本相同的DNA结合结构域可用于本发明。该序列可针对比较窗口或指定区域上的最大对应性进行比较和比对,所述最大对应性的测量方法为使用描述的比较算法之一或通过手动比对和视觉观察。在一些实施方式中,DNA结合结构域包含WO2012/177695的SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10或与其基本相同的序列(例如,至少60%、70%、80%、90%、或95%相同)。Sso7结合结构域中的多种突变已描述于例如美国专利申请号2005/0048530和2007/0141591。
适于使用的其他DNA结合结构域可通过与已知DNA结合蛋白的同源性和/或通过抗体交叉反应性来鉴定,或可通过生物化学试验方法发现。可使用本发明所述和本领域已知的技术合成或分离DNA结合结构域。
本发明所使用的序列非特异性双链核酸结合结构域还可使用抗体通过交叉反应性进行鉴定,所述抗体包括但不限于结合已知核酸结合结构域的多克隆抗体。多克隆抗体使用本领域普通技术人员已知的方法生成(参见例如Coligan,Current Protocols inImmunology(《新编免疫学方法》)(1991);Harlow和Lane,Antibodies,A LaboratoryManual(《抗体,实验室手册》)(1988))。这些属于免疫交叉反应性结合蛋白的蛋白质可随后通过多种试验方法检测。对于可使用的多种形式和条件的描述,参见例如,Methods inCell Biology:Antibodies in CellBiology(《细胞生物学中的方法:细胞生物学中的抗体》),卷37(Asai编,1993),Coligan(同上)和Harlow和Lane(同上)。
可使用本领域普通技术人员已知的多种试验来测试对双链核酸的结合特异性。这些试验包括诸如过滤结合试验或凝胶迁移试验的试验。例如,在过滤结合试验中,在适当的缓冲液中将待评估与双链DNA结合活性的多肽与放射性标记的DNA(双链或单链)预混合。通过保留蛋白质和蛋白质-DNA复合物的膜(如硝酸纤维素)过滤混合物。保留在过滤器上的DNA的量表示与蛋白质结合的量。可通过竞争分析来定量结合,其中通过加入含量递增的未标记的DNA来竞争标记的DNA的结合。以比单链DNA高10倍或更高的亲和性结合双链DNA的多肽在本发明中被定义为双链DNA结合蛋白。或者,可通过凝胶迁移试验评估结合活性,其中放射性标记的DNA与测试多肽孵育。与未结合的DNA相比,蛋白质-DNA复合物将较慢地通过凝胶移动,导致迁移的条带。通过将样品与含量递增的双链或单链未标记DNA孵育并定量迁移的条带中的放射性的量来评估结合量。
适用于本发明的结合结构域以序列不依赖的方式结合双链核酸,即本发明的结合结构域以显著的亲和性结合双链核酸,但是没有已知核酸以相比具有相同核苷酸组成但不同核酸序列的另一核酸高超过100倍的亲和力结合该结构域。可使用类似于确定双链对比单链核酸结合的方法来测试非特异性结合。可如上文所述使用相同核苷酸组成但不同核酸序列的竞争物DNA来进行过滤结合试验或凝胶迁移试验以确定结合特异性。
也可评价本发明使用的序列非特异性双链核酸结合结构域,例如,通过测试双链结合结构域增加修饰酶的持续合成能力或效率或提高核酸双链的稳定性至少1℃的能力。
本发明的结合结构域还可通过直接评估这类结构域稳定双链核酸构象的能力来鉴定。例如,可通过监测260nm处的DNA的UV吸收在蛋白质存在或不存在的情况下获得引物-模板构建体的解链曲线。可由解链曲线的中点确定双链底物的Tm。可随后通过比较经修饰的酶存在的情况下获得的Tm与未修饰的酶存在的情况下获得的Tm来确定序列非特异性双链核酸结合蛋白对于Tm的影响。(该蛋白质不显著导致UV吸收,因为其在260nm处的消光系数远低于DNA)。可选择将Tm提高1℃(通常提高5℃、10℃或更多)的结构域用于本发明。
新型序列非特异性双链核酸结合蛋白还可通过利用其DNA结合活性来分离,例如通过在DNA-纤维素柱上纯化。分离的蛋白质随后可通过常规手段进一步纯化,测序,并使用PCR通过常规方法克隆基因。随后可通过上文所述的任意方法测试由这些克隆过表达的蛋白质。
DNA聚合酶可通过本领域技术人员熟知的方法接合至序列非特异性DNA结合结构域。这些方法包括化学和重组手段。
例如,可如Bioconjugate Techniques(《生物偶联技术》),Hermanson编,学术出版公司(Academic Press)(1996)所述进行DNA聚合酶对非特异性DNA结合结构域的化学连接。接合可包括,例如,出于将2种蛋白质互相连接的目的的衍生化,所述衍生化通过蛋白质化学领域所熟知的方法以直接或通过连接化合物的方式进行。例如,在一个化学偶联实施方式中,连接催化结构域和核酸结合结构域的手段包括杂双官能-偶联剂,其最终导致在2个基团之间形成分子间二硫键。可用于本发明的这种能力的其他类型的偶联剂描述于,例如,美国专利号4,545,985。或者,分子间二硫键可在各基团中的半胱氨酸之间方便地形成,其是天然产生的或者通过遗传工程改造插入的。连接基团的手段也可使用双官能交联剂或特定低pH可切割交联剂之间的硫醚连接或特定蛋白酶可切割接头或其他可切割或不可切割化学连接。
将DNA聚合酶连接至非特异性DNA结合结构域也可包括在基团之间形成肽基键,其通过标准肽合成化学或重组手段分开合成。也可使用化学方法来产生偶联蛋白质本身以整体或部分合成氨基酸序列。例如,可通过固相技术来合成肽,例如,Merrifield固相合成方法,其中,向氨基酸的生长链连续加入氨基酸(参见,Merrifield(1963)J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2146)。用于自动化合成多肽的设备可购自供应商如PE公司(加利福尼亚州福斯特城(Foster City,CA))并且一般可按照生产商的说明操作。然后合成的肽可从树脂上切下,并且纯化,例如,通过制备型高效液相色谱(参见Creighton,Proteins Structures andMolecular Principles(《蛋白质、结构和分子原理》),50-60(1983))。可通过氨基酸合成或测序来确认合成多肽或多肽亚片段的组成(例如,埃得曼降解步骤;参见,Creighton,Proteins,Structures and Molecular Principles(《蛋白质、结构和分子原理》),第34-49页(1983))。
另外,可以取代或添加向序列中导入非经典氨基酸或化学氨基酸类似物。非经典氨基酸一般包括但不限于:普通氨基酸的D-异构体、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代-氨基酸、设计氨基酸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和氨基酸类似物。此外,氨基酸可以是D(右旋)或L(左旋)。
在另一个实施方式中,DNA聚合酶和非特异性DNA结合结构域通过连接基团接合。连接基团可以是化学交联剂,包括,例如琥珀酰亚胺基-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC)。连接基团也可以是其他氨基酸序列,包括,例如,聚丙氨酸、聚甘氨酸或类似的连接基团。
或者,在一些实施方式中,杂交聚合酶中各多肽的编码序列在其氨基或羧基端通过任意顺序的肽键接合。或者,氨基酸接头序列可用于将第一和第二多肽组件隔开足够距离以确保各多肽折叠成其二级和三级结构。这类氨基酸接头序列整合至融合蛋白中。合适的肽接头序列可基于以下因素选择:(1)其采取挠性延伸构象的能力;(2)其采取可与第一和第二多肽上功能性表位相互作用的二级结构的能力;以及(3)缺少可与多肽功能性表位反应的疏水性或带电残基。典型的肽接头序列含有Gly、Ser、Val和Thr残基。其他的近中性氨基酸(如Ala)也可用于接头序列。可用作接头的氨基酸序列包括下述中公开的那些:Maratea等,(1985)Gene 40:39-46;Murphy等,(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8258-8262;美国专利号4,935,233和4,751,180。该接头序列的长度通常可以是1至约50个氨基酸,例如长度为3、4、6或10个氨基酸,但长度也可以是100或200个氨基酸。当第一和第二多肽具有可用于分隔功能性结构域且阻止位阻干扰的非必需N端氨基酸区域时,可以不需要接头序列。
其他化学接头包括碳水化合物接头、脂质接头、脂肪酸接头、聚醚接头,如PEG,等。例如,聚(乙二醇)接头可获自阿拉巴马州汉茨维尔的谢氏聚合物有限公司(ShearwaterPolymers,Inc.)。这些接头任选具有酰胺键、巯基键或杂双官能键。
连接DNA聚合酶和非特异性DNA接合结构域的其他方法包括通过表达负电荷和正电荷尾部进行离子结合和通过抗体和链霉亲和素-生物素相互作用进行间接结合。(参见,例如《生物偶联技术》,同上)。结构域也可通过中间相互作用序列接合在一起。例如,Sso7d-相互作用序列,即结合Sso7d的序列可接合至聚合酶。然后,所得的融合蛋白可被允许与Sso7d非共价结合以生成Sso7d-聚合酶偶联物。
在一些实施方式中,本发明的杂交聚合酶通过编码蛋白质的核酸的重组表达产生。可通过由本领域已知的方法,在合适的编码框架中将编码所需氨基酸序列的合适核酸序列互相连接,并且通过本领域已知的方法表达产物来制备这种杂交聚合酶。
可使用重组遗传领域中的常规技术来获得编码待整合到本发明的杂交聚合酶的结构域的核酸。公开本发明所用一般方法的基础文本包括Sambrook和Russell,MolecularCloning,A Laboratory Manual(《分子克隆,实验室手册》)(第3版,2001);Kriegler,GeneTransfer and Expression:A Laboratory Manual(《基因转移和表达:实验室手册》)(1990);以及Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)(Ausubel等编,1994-1999))。
可使用多种方法中的任一种来获得编码DNA聚合酶和非特异性DNA结合结构域多肽的核酸序列。在一些实施方式中,通过与探针杂交从cDNA和基因组DNA文库中克隆编码多肽的核酸序列,或者使用寡核苷酸引物的扩增技术分离。更常见的,使用扩增技术采用DNA或RNA模板来扩增并分离Sso7和聚合酶序列(参见,例如,Dieffenfach和Dveksler,PCRPrimers:A Laboratory Manual(《PCR引物:实验室手册》)(1995))。或者,可在合成上产生重叠寡核苷酸并且接合以产生结构域中的一个或多个。也可使用抗体作为探针从表达文库中分离编码催化或双链核酸结合结构域的核酸。
在使用PCR获得编码DNA聚合酶或非特异性DNA结合结构域的核酸的实施例中,使用含有一个限制性位点的正义引物和含有另一个限制性位点的反义引物来PCR扩增核酸序列或子序列。这将产生编码所需结构域序列或子序列并且具有末端限制性位点的核酸。该核酸然后可连接到含有编码第二结构域并具有合适的相应限制性位点的核酸的载体中。结构域可直接接合或可被接头,或蛋白质序列分隔。使用GenBank或其他来源中提供的序列信息,本领域技术人员可确定合适的PCR引物。也可通过定点诱变向编码蛋白质或蛋白质子序列的核酸中添加合适的限制性位点。含有结构域编码核苷酸序列或子序列的质粒被合适的限制性内切酶切割,并且然后连接至合适的载体用于按照标准方法扩增和/或表达。
可使用本领域已知的技术产生聚合酶。可使用重组遗传学领域中的常规技术来获得编码聚合酶并且任选地连接至DNA接合结构域的核酸。根据待表达聚合酶的宿主细胞,可采用密码子优化来优化聚合酶在特定宿主细胞中的表达。公开本发明所用一般方法的基础文本包括Sambrook和Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(《分子克隆,实验室手册》)(第3版,2001);Kriegler,Gene Transfer and Expression:A LaboratoryManual(《基因转移和表达:实验室手册》)(1990);以及Current Protocols in MolecularBiology(《新编分子生物学实验指南》)(Ausubel等编,1994-1999))。这类核酸还可通过体外扩增方法获得,例如描述于以下文献中的那些:Berger,Sambrook,和Ausubel,以及Mullis等(1987)美国专利号4,683,202;PCR Protocols A Guide to Methods andApplications(《PCR实验方法:方法和应用指南》)(Innis等编)学术出版社公司,加利福尼亚州圣地亚哥(1990)(Innis);Arnheim和Levinson(1990年10月1日)C&EN 36-47;TheJournal Of NIH Research(1991)3:81-94;Kwoh等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173;Guatelli等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,1874;Lomell等(1989)J.Clin.Chem.,35:1826;Landegren等(1988)Science 241:1077-1080;Van Brunt(1990)Biotechnology 8:291-294;Wu和Wallace(1989)Gene 4:560;以及Barringer等(1990)Gene89:117,其各自通过引用全文纳入本文用于所有目的且尤其是所有涉及扩增方法的教导。
还可向聚合酶进行修饰而不降低其生物活性。可进行一些修饰以促进克隆、表达或将结构域整合至融合蛋白中。这类修饰为本领域技术人员所熟知并且包括,例如,在编码结合结构域的多核苷酸的一端添加密码子(例如在氨基端添加甲硫氨酸)以提供起始位点,或将额外的氨基酸(如聚His)置于一端以建立方便地设置的限制性酶切位点或终止密码子或纯化序列。
在另一个方面中,本发明提供了使用聚合酶在包含阳离子表面活性剂和阴离子表面活性剂,任选的两性离子表面活性剂的反应缓冲液中扩增靶核酸的方法。这类扩增反应包括但不限于聚合酶链反应(PCR)。可使用本发明所述组合物进行的聚合酶链反应包括但不限于逆转录PCR(rt-PCR)和定量PCR(qPCR)。
在一些实施方式中,本发明的方法可用于扩增0.1-2kb、1-5kb、至少5kb、至少7kb、至少10kb、至少12kb或更大的扩增子。
可使用反应混合物来进行扩增方法,该反应混合物足够扩增核酸分子(包含聚合酶)以及阳离子表面活性剂和阴离子表面活性剂。另外,在一些实施方式中,扩增反应混合物包含以下组分中的至少一种或多种:核苷酸三磷酸酯、一种或多种寡核苷酸引物、盐、缓冲剂、水、稳定剂和DNA-结合染料。
在一些实施方式中,本发明的扩增方法包括使用聚合酶和改善扩增特异性的试剂,例如,选自精氨酸、亚精胺和精胺的试剂。在一些实施方式中,除DNA聚合酶或杂交聚合酶以外,扩增反应混合物包含以下组分中的一种或多种:核苷酸三磷酸酯、一种或多种寡核苷酸引物、盐、缓冲剂、水、稳定剂和DNA-结合染料;以及选自精氨酸、亚精胺或精胺的试剂。
在一些实施方式中,本发明的扩增反应混合物包含:例如本文所述的浓度的阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂,例如本文所述的浓度的任选的两性离子表面活性剂,约1U/ml至约75U/ml浓度的聚合酶(例如,约1U/ml、5U/ml、10U/ml、15U/ml、20U/ml、25U/ml、30U/ml、35U/ml、40U/ml、45U/ml、50U/ml、55U/ml、60U/ml、65U/ml、70U/ml、或75U/ml);约0.1mM至约10mM浓度的dNTP(例如,约0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、或10mM);约1mM至约20mM的镁,例如MgCl2(例如,约1mM、1.5mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、或20mM);约10mM至约100mM浓度的(NH4)28O4(例如,约10mM、15mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、或100mM);约50mM至约200mM浓度的钾,例如KCl(例如,约50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、或200mM);约20mM至约200mM浓度的缓冲剂,例如TrispH 8.5-9.5(例如,约50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、或200mM)。任选地,反应混合物还可包含下列的一种或多种:约100mM至约500mM浓度的二糖,例如,海藻糖(例如,约100mM、125mM、150mM、175mM、200mM、225mM、250mM、275mM、300mM、325mM、350mM、375mM、400mM、425mM、450mM、475mM、或500mM);约50mM至约200mM浓度的一种或多种渗透物,例如,肌氨酸、三甲基胺N-氧化物(TMAO)、二甲基磺丙酸酯、和三甲基甘氨酸(例如,约50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、或200mM);约1%至约10%浓度的DMSO(例如,约1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%);约0.001%至约0.01%浓度的荧光素(例如,约0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%、0.006%、0.007%、0.008%、0.009%、或0.01%);约0.5倍至约5倍浓度的DNA结合染料(例如,花青染料)(例如,约0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、或5倍);和任选的约1mM至约100mM浓度的精氨酸、亚精胺、或精胺或其盐(例如,约1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、或100mM)。
除了包含上述浓度成分的反应混合物以外,还提供了包含上述成分中的全部或一些的母液,其中母液中的所有成分是上述浓度的2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、100倍、或其他倍数,使得可以最终反应混合物的总体积的部分添加小量的母液。例如,在一些实施方式中,在母液中可包括如上所所列的阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、核苷酸(例如,dNTP)、缓冲剂、镁和钾源、以及任选的硫酸铵源和/或两性离子表面活性剂的母液。在一些实施方式中,母液中也包括聚合酶,或者,包括在第二容器中,使得可在待进行反应时添加聚合酶。
在一些实施方式中,扩增反应还包括添加剂以改善效率。已显示渗透物家族的成员能够改善蛋白质的热稳定性(Santoro,Biochemistry,1992)并降低DNA双螺旋稳定性(Chadalavada,FEBS Letters,1997)。在一些实施方式中,渗透物是由活的生物体响应环境应激如极端温度、脱水或盐度而产生的小分子或化合物,保护其细胞组分并帮助维持最佳细胞溶质条件。本发明中使用的渗透物可包括但不限于:肌氨酸、三甲胺N-氧化物(TMAO)、二甲基磺丙酸酯(dimethylsulfoniopropionate)和三甲基甘氨酸。肌氨酸在化学上类似于甜菜碱,一种已被证明改善常规PCR的化学品(Henke,Nucleic Acids Research,1997)。
在渗透剂的常规应用中,这类混合物的稳定化作用通常在较高的浓度(>1M)下观察到。然而,在本发明的方法中,发现毫摩尔浓度的渗透剂能够有效地改善扩增反应(如qPCR)的反应效率。不受作用机制的限制,对于含有低浓度的输入DNA样品的反应而言,效率上的改善可能是由于改善DNA聚合酶对DNA模板的靶向区域的可及性。在一些实施方式中,本发明的方法和试剂盒中使用浓度为约100至约1000mM的渗透剂。在其他实施方式中,本发明的方法和试剂盒中使用浓度为约50至约700、约100至约600、约150至约500、约200至约400mM,和约300至约350mM的渗透剂。在一些实施方式中,使用的渗透物是。
可用本文所述的反应混合物来进行多种扩增方法。这类扩增反应方法可包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、DNA连接酶链反应(LCR)、QBeta RNA复制酶和基于RNA转录(如TAS和3SR)的扩增反应以及本领域技术人员已知的其他反应。可使用本发明所述反应混合物进行的聚合酶链反应包括但不限于逆转录PCR(rt-PCR)和定量PCR(qPCR)。
在一些实施方式中,该PCR是定量PCR,其中实时监测扩增子的累积(即连续地,例如每个循环一次,而非仅在完成扩增后)。定量扩增方法(例如,定量PCR或定量线性扩增)可涉及扩增核酸模板,直接或间接确定(例如,确定Ct值)扩增的DNA的量,然后基于扩增循环数计算初始模板的量。使用反应扩增DNA基因座是熟知的(参见美国专利号4,683,195和4,683,202;《PCR方案:方法和应用指南》(PCR PROTOCOLS:A GUIDE TO METHODS ANDAPPLICATIONS)(Innis等编,1990))。通常,使用PCR来扩增DNA模板。然而,替代性扩增方法已有描述且也可使用,前提是与扩增切割的DNA的方法相比,这些替代性方法以较高的程度扩增完整的DNA。定量扩增的方法公开于,例如,美国专利号6,180,349;6,033,854;和5,972,602,以及例如,Gibson等,Genome Research 6:995-1001(1996);DeGraves等,Biotechniques 34(1):106-10,112-5(2003);Deiman B等,Mol Biotechnol.20(2):163-79(2002)。
在一些实施方式中,定量扩增是基于监测代表扩增(例如PCR)反应循环中模板拷贝的信号(例如探针的荧光)。在PCR的初始循环中,由于形成的扩增子的量不能支持来自试验的可测量的信号输出,观察到非常低的信号。在初始循环之后,随着形成的扩增子的量增加,信号强度增加至可测量的水平并在后续循环中达到平台(此时PCR进入非对数期)。通过信号强度对循环次数作图,从PCR反应获得可测量的信号的特定循环可以推导和用于倒推计算PCR开始之前靶标的量。该方法确定的特定循环的次数通常称为循环阈值(Ct)。示例性的方法描述于例如Heid等,Genome Methods 6:986-94(1996),参照水解探针。
一种检测扩增产物的方法是5′-3′外切核酸酶“水解”PCR试验(有时也称为TaqManTM试验)(美国专利号5,210,015和5,487,972;Holland等,PNAS USA 88:7276-7280(1991);Lee等,Nucleic Acids Res.21:3761-3766(1993))。该试验通过扩增反应期间双重标记的荧光探针(如″TaqManTM探针)的杂交和切割检测产生的特定PCR产物的累积。荧光探针由用荧光报告染料和淬灭染料双重标记的寡核苷酸组成。PCR期间,当且仅当该探针与正在扩增的片段杂交,则该探针被DNA聚合酶的5′-3’外切核酸酶活性切割。探针的切割导致报告染料的荧光强度增加。
依赖于使用能量转移的检测扩增产物的另一种方法是“信标探针”方法,描述于Tyagi和Kramer,Nature Biotech.14:303-309(1996),其也是美国专利号5,119,801和5,312,728的主题。该方法使用能够形成发夹结构的寡核苷酸杂交探针。在杂交探针的一端上(5′或3′端)存在供体荧光团,且在另一端上存在受体部分。在Tyagi和Kramer方法中,该受体部分是淬灭剂,即该受体吸收由供体释放的能量,但随后其本身不产生荧光。因此,当信标处于开放构象时,供体荧光团的荧光是可检测的,而当信标处于发夹(闭合)构象时,供体荧光团的荧光被淬灭。应用于PCR时,与PCR产物的一条链杂交的分子信标探针处于开发构象并检测到荧光,而保持未杂交的那些不会产生荧光(Tyagi和Kramer,NatureBiotechnol.14:303-306(1996))。结果,荧光的量将随着PCR产物的量的增加而增加,因而可用作PCR进程的测量。本领域技术人员将理解定量扩增的其他方法也是可得的。
用于进行核酸定量扩增的多种其他技术也是已知的。例如,一些方法采用一种或多种结构化后使得寡核苷酸杂交至靶核酸时产生荧光变化的探针寡核苷酸。例如,一种这样的方法包括利用荧光能量共振转移(FRET)的二元荧光团方法,例如LightCyclerTM杂交探针,其中两个寡探针与扩增子退火。寡核苷酸设计成在离开与高效的能量转移相容的距离处以头-尾取向与荧光团杂交。结构化形成当与核酸结合或者掺入延伸产物中时发射信号的标记的寡核苷酸的其他例子包括:ScorpionsTM探针(例如,Whitcombe等,NatureBiotechnology 17:804-807,1999,和美国专利号6,326,145),SunriseTM(或AmplifiuorTM)探针(例如,Nazarenko等,Nuc.Acids Res.25:2516-2521,1997,和美国专利号6,117,635),以及形成次级结构导致信号降低而没有淬灭剂并且与靶标杂交时发射信号增强的探针(例如Lux probesTM)。
在一些实施方式中,该PCR反应混合物不包含经标记的探针寡核苷酸。例如,该反应混合物缺少用于监测扩增子的实时或末端累积的Taqman或其他标记的寡核苷酸探针。在这些实施方式的一些中,包含嵌入荧光染料。在一些实施方式中,与单链核酸相比,在与双链核酸结合时,该嵌入染料改变信号(提高或降低)。示例性的试剂包括SYBR GREENTM、SYBRGOLDTM和EVAGREENTM。由于这些试剂不是模板特异性的,推定基于模板特异性扩增产生信号。这可以通过监测温度导致的信号变化得到证实,因为模板序列的熔点通常比例如引物-二聚体、非特异性扩增序列等高很多或与之不同。
在另一个方面中,本发明提供可用于进行核酸扩增反应的试剂盒。该试剂盒包含阳离子表面活性剂和阴离子表面活性剂,一般在相同溶液中。该溶液还可包含缓冲剂(例如,Tris)、镁和钾以及核苷酸(dNTP)。该溶液还可任选地包含本文所述的两性离子表面活性剂。在一些实施方式中,试剂盒还包含在相同溶液或分开溶液或分开容器中的本文所述的DNA聚合酶。如上所述,在一些实施方式中,包含阳离子表面活性剂和阴离子表面活性剂的溶液是母液,并且因此成分浓度是反应混合物最终所需浓度的多倍(例如,2倍、5倍、10倍等)。
任选地,试剂盒包含双链DNA结合染料。这类试剂盒也可包含稳定剂和其他添加剂(例如,肌氨酸)以提高扩增反应的效率。这类试剂盒还可包含一种或多种引物以及使用试剂盒的组分进行核酸扩增反应的指南。任选地,试剂盒还可包含足量的试剂以提高核酸扩增的特异性。例如,在一些实施方式中,该试剂选自精氨酸(例如,L-精氨酸或D-精氨酸)、亚精胺、和精胺、或其盐。
实施例
提供以下实施例用于说明而非限制本发明所要求的权利。
测试了各种表面活性剂对PCR反应混合物中聚合酶活性和产率的影响。在多种反应混合物中配制衍生自2个亲本聚合酶Pfu和DeepVent并且与Sso7d融合的聚合酶以鉴定改善PCR产率的反应组分。
测试了包含聚合酶,Tris-HCL pH 9.0,KCl,硫酸铵,20ng模板DNA和靶标引物的反应混合物,其中添加下述一种或多种其他组分(结果示于图1):
表1
如图1所示,虽然SDS(一种阴离子表面活性剂)和CTAB(一种阳离子表面活性剂)各自单独并不改善PCR产率,这两种表面活性剂的组合令人惊讶地导致PCR产率增加(参见图1的泳道7-8)。
测试了CTAB和SDS的浓度范围并且也测试了其他组分如辛基b-D-吡喃葡糖苷(OGP)和牛血清白蛋白(BSA)。参见图2。下表2中表述了图2的泳道:
表2
鉴于包含SDS和CTAB的反应混合物令人惊讶的成功,生成了5倍母液。然而,在一些情况中,在母液中形成沉淀。为了解决沉淀,向5倍母液中添加两性离子表面活性剂CHAPS并且这防止沉淀形成。例如,当5倍母液含有1%CHAPS时,在母液中没有观察到沉淀。另外,当在PCR反应中使用包含0.05%SDS和0.05%CTAB的5倍母液时,成功生成2和5kb扩增子,表明CHAPS的存在在该浓度下并不干扰PCR(数据未显示)。
应理解,本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的,本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变,且它们包括在本申请的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有发表物、专利和专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。
Claims (43)
1.一种用于储存聚合酶的溶液,所述溶液包含,
聚合酶;
阴离子表面活性剂;和
阳离子表面活性剂。
2.如权利要求1所述的溶液,其特征在于,所述阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂的浓度为0.0001%至0.1%。
3.如权利要求1所述的溶液,其特征在于,所述阴离子去污剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
4.如权利要求1所述的溶液,其特征在于,所述阳离子去污剂是十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。
5.如权利要求1所述的溶液,其特征在于,所述阴离子去污剂是SDS并且所述阳离子去污剂是CTAB。
6.如权利要求1所述的溶液,所述溶液还包含两性离子表面活性剂。
7.如权利要求6所述的溶液,其特征在于,所述两性离子表面活性剂是3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)。
8.如权利要求6所述的溶液,其特征在于,所述两性离子表面活性剂的浓度为0.01-1.0%。
9.如权利要求1-8中任一项所述的溶液,其特征在于,所述聚合酶是热稳定的。
10.一种反应混合物,其包含
聚合酶;
阴离子表面活性剂;和
阳离子表面活性剂。
11.如权利要求10所述的反应混合物,还包含核酸样品。
12.如权利要求10所述的反应混合物,还包含以下中的至少一种:核苷酸或寡核苷酸引物,适于聚合酶链反应(PCR)的缓冲剂,和镁。
13.如权利要求11-12所述的反应混合物,其特征在于,所述阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂的浓度为0.0001%至0.1%。
14.如权利要求11-12所述的反应混合物,其特征在于,所述阴离子去污剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
15.如权利要求11-12所述的反应混合物,其特征在于,所述阳离子去污剂是十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。
16.如权利要求11-12所述的反应混合物,其特征在于,所述阴离子去污剂是SDS并且所述阳离子去污剂是CTAB。
17.如权利要求11-12所述的反应混合物,还包含两性离子表面活性剂。
18.如权利要求17所述的反应混合物,其特征在于,所述两性离子表面活性剂是3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)。
19.如权利要求17所述的反应混合物,其特征在于,所述两性离子表面活性剂的浓度为0.01-1.0%。
20.如权利要求11-19中任一项所述的反应混合物,其特征在于,所述聚合酶是热稳定的。
21.一种进行引物延伸反应的方法,所述方法包括,
形成包含以下组分的反应混合物:
可包含靶序列的核酸样品;
与所述靶序列退火的引物;
聚合酶;
阴离子表面活性剂;和
阳离子表面活性剂;
若存在靶序列,将引物与所述靶序列退火;并且
用聚合酶将引物延伸至少一个核苷酸。
22.如权利要求21所述的方法,其特征在于,所述延伸包括热循环条件。
23.如权利要求22所述的方法,其特征在于,所述延伸包括聚合酶链反应(PCR)。
24.如权利要求21-23中任一项所述的方法,其特征在于,所述阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂的浓度为0.0001%至0.1%。
25.如权利要求21-23中任一项所述的方法,其特征在于,所述阴离子去污剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
26.如权利要求21-23中任一项所述的方法,其特征在于,所述阳离子去污剂是十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。
27.如权利要求21-23中任一项所述的方法,其特征在于,所述阴离子去污剂是SDS并且所述阳离子去污剂是CTAB。
28.如权利要求21-23中任一项所述的方法,还包括两性离子表面活性剂。
29.如权利要求28所述的方法,其特征在于,所述两性离子表面活性剂是3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)。
30.如权利要求28所述的方法,其特征在于,所述两性离子表面活性剂的浓度为0.01-1.0%。
31.如权利要求21-30中任一项所述的方法,其特征在于,所述聚合酶是热稳定的。
32.一种包含聚合酶、阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂的试剂盒。
33.如权利要求32所述的试剂盒,其特征在于,第一容器含有所述聚合酶且第二容器包含所述阴离子表面活性剂和所述阳离子表面活性剂。
34.如权利要求32所述的试剂盒,其特征在于,容器包含聚合酶,阴离子表面活性剂,和阳离子表面活性剂。
35.如权利要求32-34所述的试剂盒,其特征在于,阴离子表面活性剂,和阳离子表面活性剂为母液浓度。
36.如权利要求32-35中任一项所述的试剂盒,其特征在于,所述阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂的浓度为0.0001%至0.1%。
37.如权利要求32-35中任一项所述的试剂盒,其特征在于,所述阴离子去污剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
38.如权利要求32-35中任一项所述的试剂盒,其特征在于,所述阳离子去污剂是十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。
39.如权利要求32-35中任一项所述的试剂盒,其特征在于,所述阴离子去污剂是SDS并且所述阳离子去污剂是CTAB。
40.如权利要求32-35中任一项所述的试剂盒,还包含两性离子表面活性剂。
41.如权利要求40所述的试剂盒,其特征在于,所述两性离子表面活性剂是3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)。
42.如权利要求40所述的试剂盒,其特征在于,所述两性离子表面活性剂的浓度为0.01-1.0%。
43.如权利要求32-35中任一项所述的方法,其特征在于,所述聚合酶是热稳定的。
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