CN114292929B - 一种用于定量耐酸乳杆菌的分子标记及一种绝对定量黄酒发酵过程中细菌群落组成的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于定量耐酸乳杆菌的分子标记及一种绝对定量黄酒发酵过程中细菌群落组成的方法，属于生物工程技术领域。能够有效解决黄酒由于其复杂的微生物群系，确定原始内标复杂而一直无法运用的技术问题，本发明提供了一种SEQ ID NO：3所示的分子标记作为鉴定和特异性定量耐酸乳杆菌的标志物的应用，以内标Lactobacillus acetotolerans的特异性引物可以在黄酒发酵系统中检测和定量内标。针对内标的分布范围进行统计，结果显示内标广泛分布在黄酒发酵系统中。通过对内标的绝对定量，能够对不同的菌群含量进行计算，具有操作方便、应用范围广的特点。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种用于定量耐酸乳杆菌的分子标记及一种绝对定量黄酒发酵过程中细菌群落组成的方法。
背景技术
在黄酒生产过程中，微生物生命活动受制于环境条件和营养物质的可利用性。在自然环境或人工控制条件下，发酵菌群可能利用不同的原料生产各种代谢产物。研究表明，不同的黄酒发酵菌群中存在着特定的微生物功能类群，并进行着有序的群落演替和随时间变化的功能转换。大量研究发现，微生物个体在群落中功能的发挥，依赖于与其他个体发生种类多样的相互作用。在黄酒酿造过程中，不同微生物功能类群之间通过互作影响，改变个体生长发酵特征，继而影响群体结构与功能，最终影响黄酒风味与品质。黄酒发酵过程是糖化、产酒精、产乳酸以及其他风味物质生产协同进行的混合发酵并行过程。这些过程由多种功能微生物通过分工协作以及复杂的相互作用共同完成，有效解析黄酒发酵过程中微生物群落结构是有效了解和调控黄酒质量的重要方法。
高通量测序技术是目前解析环境中微生物有效的方法，其具有高通量，测序快且可以得到不可培养微生物信息等优点，解析环境中微生物群落通常需要从三个维度进行，即种类，结构和含量，高通量测序技术很好的解决了微生物种类和结构的问题，但由于技术所限无法对微生物含量进行准确的定量，其他解析微生物的技术如qPCR，流式细胞术等，虽然可以绝对定量环境中微生物的含量，但其无法解析环境中所有微生物的种类和结构，因此如何有效从三个维度对环境中微生物进行解析成为了研究热点，其中qPCR结合高通量测序技术是目前绝对定量微生物群落结构最常用的方法，但是在环境样本中添加人工合成标样的方法在实际的操作中还存在一定的不确定性，如：样本中可能含有类似序列，其于通用引物结合效率的变化等，因此数据存在一定的缺陷；采用样品中原始内标是相对理想的方法，但需要寻找样品中合适所为内标的微生物，设计特异性引物并验证，目前采用该方法已经成功对土壤中，但黄酒由于其复杂的微生物群系，确定原始内标复杂而一直无法运用。
发明内容
本发明提出的采用天然内标方法对菌群定量的方法，能够有效解决黄酒由于其复杂的微生物群系，确定原始内标复杂而一直无法运用的技术问题。同时，本发明通过筛选系统中的天然内标，构建菌群绝对定量方法在黄酒酿造体系具有重要的研究和使用价值，该技术方法为其它发酵食品体系中微生物菌群绝对定量提供借鉴。
有益效果：采用Lactobacillus acetotolerans为内标，设计特异性引物，qPCR对Lactobacillus acetotolerans进行定量，并结合高通量测序技术绝对定量黄酒发酵过程中是微生物群系，从而为进一步本发明首次构建一种基于天然内标计算微生物菌群绝对含量的方法，为发酵食品体系中微生物菌群绝对定量提供借鉴。
本发明所提供的天然内标Lactobacillus acetotolerans中国黄酒体系天然内标，克服了现有外源添加内标的方法所存在的操作不便、会对原始的菌群结构研究产生干扰的缺陷，对于菌群绝对定量方法具有重要意义。
本发明所提供的天然内标Lactobacillus acetotolerans的特异性引物可以在白酒发酵系统中检测和定量内标。进一步地，本发明针对内标的分布范围进行统计，结果显示内标广泛分布在黄酒发酵系统中。通过对内标的绝对定量，能够对不同黄酒的菌群含量进行计算，具有操作方便、应用范围广的特点。解析黄酒中微生物群落提供了技术支持。
附图说明
图1为内标物种的选择，其中，A不同产地黄酒醪液中细菌种类统计，B共有物种在黄酒发酵过程中相对丰度的变化。
图2为是黄酒发酵过程中细菌的群落变化，其中，A基于传统相对定量方法，B基于绝对定量方法；
图3为以Lactobacillus acetotolerans为内标构建的qPCR标准曲线。
具体实施例
实施例1.Lactobacillus acetotolerans特异性引物的设计
1.合成引物：根据Lactobacillus acetotolerans(耐酸乳杆菌)基因组为基础数据，筛选特异的核酸序列，随后经过手动寻找和比对在Lactobacillus acetotolerans的基因组上发现了一段特异的核酸序列如SEQ ID NO：3所示)，该序列在Lactobacillusacetotolerans基因组上只有一个拷贝，以该序列为基础在其上下游设计引物LA-F (5’-GTGCGTTACGGAGGAGTA-3’，SEQ ID NO:1)；LA-R (5’-CGATCATTGAATCGTCAGG-3’，SEQ ID NO:2)，引物自身结构符合要求。
2.特异性验证：
(1)选择购买18种黄酒中的微生物进行引物特异性检验[Lactobacillusplantarum (CGMCC 1.568)；Lactobacillus brevis(CGMCC 1.214)；Lactobacillusacetotolerans(ATCC 27745)；Lactobacillus casei(CGMCC 1.29)；Saccharopolysporaerythraea(CGMCC 4.751)； Bacillus amyloliquefaciens(CGMCC 1.857)；Bacillussubtilis(CGMCC 1.821)；Acetobacter ghanensis(CCTCC AB 2016191)；Pediococcuspentosaceus(CGMCC 1.300)；Leuconostoc mesenteroides(CGMCC 1.639)；Enterobacteraerogenes(CGMCC 1.10716)；Lactococcus lactis(CGMCC 1.62)；Saccharomycescerevisiae(CGMCC 2.1357)；Aspergillus oryzae(CGMCC 3.13905)；Aspergillus niger(CGMCC 3.15663)；Mucor racemosus(CGMCC 3.7075)；Rhizopus oryzae(CGMCC 3.12102)；Rhizopus chinensis(IFFI 3107)]；
(2)提取上述纯培养微生物的基因组，同时提取黄酒醪液的总DNA，待检测样本中微生物的总DNA的浓度为32μg/g酒醅，以基因组和总DNA为模板使用引物LA-F，LA-R进行PCR扩增以检验引物特异性，
(3)PCR反应体系50μL，含25μL Taq Mix，上下引物各8μL(10μmol/L)，模板8 μL，补充无菌水至50μL。反应条件为：95℃5min；95℃1min；55℃30s；72℃25s； 30个循环。
(4)qPCR的反应体系为20μL：10μL AceQ Universal SYBR Green qPCR MasterMix；上下游引物各0.4μL，模板2μL，补充ddH2O至20μL；反应程序：98℃1min；98℃10s， 61℃10s，61℃1min，40个循环。
结果表明以黄酒醪液总DNA和Lactobacillus acetotolerans基因组为模板获得了预期条带，而其余微生物基因组均未扩增出条带，证明引物特异性良好，可以满足后续qPCR的条件。
实施例2.一种定量耐酸乳杆菌的试剂盒
成分有：LA-F(5’-GTGCGTTACGGAGGAGTA-3’，SEQ ID NO:1)、LA-R (5’-CGATCATTGAATCGTCAGG-3’，SEQ ID NO:2)、AceQ Universal SYBR Green qPCR MasterMix、标准品DNA和ddH2O。所述标准品DNA是含有SEQ ID NO：3所示的分子标记的质粒。
实施例3.内标Lactobacillus acetotolerans的定量方法
以Lactobacillus acetotolerans基因组为模板，使用特异性引物LA-F，LA-R扩增目的片段得到SEQ ID NO：3的产物，扩增产物克隆到pMD19-T并转化Escherichia coliJM109，菌落PCR验证转化后的阳性克隆；使用质粒抽提试剂盒抽提质粒，并微量紫外分光光度计定量质粒浓度；
完成定量的质粒进行十倍稀释，分别取8个梯度，使用这8个梯度进行qPCR，PCR体系：模板1μL，上下游引物各0.4μL，10μL AceQ Universal SYBR Green qPCR Master Mix，补足双蒸水至终体积为20μL；PCR条件：98℃1min，98℃10s，61℃1min，40循环。
标准曲线如图3所示，以质粒浓度为横坐标，Ct值为纵坐标绘制标准曲线标准曲线R2＝0.996，线性良好可以满足实际生产过程中微生物的定量。
实施例4.利用内标Lactobacillus acetotolerans的定量后绝对定量黄酒发酵过程中细菌群落组成及演替规律
从浙江省绍兴市、浙江省台州市、上海市、江苏省丹阳市、江苏省无锡市、山东省即墨市、福建省南平市、安徽省宣城市八个黄酒主要产区采集黄酒发酵醪液，对采集所得醪液进行高通量扩增子测序寻找八个产区共有的微生物种类，八个样品中共有7种微生物为所有样品共有图1，随后以此作为内标筛选的范围。
随后以绍兴黄酒醪液为材料，分析扩增子数据看出，在7种共有微生物中Lactobacillus acetotolerans相对丰度较高，尤其是在黄酒发酵的中后期其相对丰度得到了显著提高，而同样作为相对丰度较高的Bacillus sp.M26由于其相对丰度随着发酵的进行不断下降，因此Lactobacillus acetotolerans更适宜于作为黄酒发酵过程中的内标。
以绍兴黄酒发酵醪液为原料，使用16S rDNA高通量扩增子技术相对定量黄酒中主要微细菌群落(＞1％)的相对丰度，随后使用引物LA-F，LA-R对黄酒中Lactobacillusacetotolerans 进行绝对定量，随后根据公式即可得到黄酒中主要细菌群落的绝对含量图2。
X：所求微尘物的绝对含量[Lg(Copies/g)]
A：所求微生物的相对丰度(％)
B：Lactobacillus acetotolerans的绝对含量[Lg(Copies/g)]
C：Lactobacillus acetotolerans的相对丰度(％)。
SEQUENCE LISTING
<110> 绍兴文理学院
<120> 一种用于定量耐乳酸杆菌的分子标记及一种绝对定量黄酒发酵过程中细菌群
落组成的方法
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gtgcgttacg gaggagta 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cgatcattga atcgtcagg 19
<210> 3
<211> 488
<212> DNA
<213> Lactobacillus acetotolerans
<400> 3
gtgcgttacg gaggagtagc gaagtggcta aacgcggcgg tctgtaaaac cgctctctct 60
gagttcggcg gttcgaatcc accctcctcc attaattggg ttatagccaa gcggtaaggc 120
actagttttt ggtactagta tgcgctggtt cgaatccagc taacccaatt gttctttaat 180
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atatatttat gtgttgaaag gaaataaggg atacatgaat gatgataaaa atgttggaca 360
agttattcac aataaaagaa aagaattatc tttaactcaa gaggatttag ctgaaaaagt 420
tcacgttaca agacaggccg tttctaattg ggaaaggaat aaaactgttc ctgacgattc 480
aatgatcg 488
Claims (6)
1.SEQ ID NO：3所示的分子标记作为鉴定和特异性定量耐酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans）的标志物的应用。
2.一种绝对定量黄酒中耐酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans）的引物，其特征在于，所述引物为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述引物可以扩增SEQ ID NO：3所示的分子标记。
3.一种定量耐酸乳杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的引物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括AceQ UniversalSYBR Green qPCR Master Mix、标准品DNA和ddH2O 。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品DNA是含有SEQ ID NO：3所示的分子标记的质粒。
6.一种绝对定量黄酒发酵过程中细菌群落组成的方法，其特征在于，所述方法是利用SEQ ID NO：3所示的分子标记鉴定耐酸乳杆菌作为内标来进行绝对定量。
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