KR102308360B1 - groESL 오페론 내 유전자 간 스페이서 영역 서열을 이용한 락토바실러스 속의 동정방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 groESL 오페론 내 유전자 간 스페이서 영역(intergenic sequence region) 서열을 이용한 락토바실러스 속의 동정방법에 관한 것으로, 본 발명의 락토바실러스 종 분류 방법은 기존 락토바실러스 종 판별법에 비해 특히 식약처 고시형 균주 및 그렇지 않는 락토바실러스 종에 대해 신속 정확하게 판별해 낼 수 있어, 16S rRNA 대체 종 판별 방법으로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

groESL 오페론 내 유전자 간 스페이서 영역 서열을 이용한 락토바실러스 속의 동정방법{Identification method of Lactobacillus sp. using intergenic spacer region sequence in groESL operon}

본 발명은 groESL 오페론 내 유전자 간 스페이서 영역 서열을 이용한 락토바실러스 속의 동정방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 groES와 groEL간 유전자 간 스페이서 영역(intergenic spacer region, ISR)의 서열을 결정하여 락토바실러스 속 균종을 동정하는 방법에 관한 것이다.

생명체의 종을 동정하는 방법 중 하나로, 염기서열 정보를 이용하는 방법이 널리 이용되고 있으며, small subunit ribosome을 구성하는 rRNA를 염기서열 분석에 많이 사용하고 있다. 칼 우즈 박사가 16S rRNA를 코딩하는 유전자를 통해 분자분류를 시작하여 지금까지 널리 통용되고 있다(Woese CR et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1990. 87(12):4576-9). rRNA는 모든 생물종에 존재하고, 가장 많은 데이터베이스를 확보하고 있으며(예컨대, NCBI), 종 수준으로 구분할 수 있는 정보를 가지고 있다. 원핵생물에서는 97% 이하의 상동성을 가지고 있으면 다른 종 (species)으로 분류된다(Stackebrandt, E., and B. M. Gobel. 1994. Int. J. Syst. Bacteriol. 44: 846-849.). 또한, 97% 이상의 상동성을 가진 경우 DNA-DNA hybridization 실험을 통해 같은 종인지 다른 종인지 구분하며, 이 때 70% 이상의 DNA-DNA 상동성을 가지는 경우 같은 종으로 구분한다. 미지의 원핵생물을 분리하여 확보한 경우, 분리된 균주의 16S rRNA를 중합효소연쇄반응으로 증폭하여 염기서열을 확인한 후 데이터베이스에 존재하는 기존 서열들과 비교함으로써 어떠한 종에 속하는지 손쉽게 동정할 수 있다.

그러나, 하나의 세균 유전체 안에서도 여러 개의 16S rRNA 유전자가 존재하고 완전히 동일하지 않은 경우도 많으며(Case RJ et al., Appl Environ Microbiol. 2007 73(1):278-88), 원핵생물의 유전자들 중에서 가장 잘 보존되어 있어 분류학적으로 거리가 먼 생물간에도 염기서열의 차이가 가장 적은 특성으로 인해, 일부 생물종 사이에서는 16S rRNA 염기서열에 기반한 종 구분이 쉽지 않은 경우가 있다.

락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 식품에 사용가능한 GRAS(generally recognized as safe) 종인 반면, 락토바실러스 펜토서스(L. pentosus)는 non-GRAS 종이다. 그러나, 상기 두 종의 락토바실러스 미생물은 16S rRNA 염기서열이 100% 동일하여 16S rRNA 서열에 기반한 종 판별 방법으로는 정확한 종간 구별이 되지 않는 문제점이 있다.

한편, 한국등록특허 제1790021호에는 '항바이러스 활성 또는 면역증진 활성을 갖는 락토바실러스 균주 판별용 조성물 및 스크리닝 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2020-0004944호에는 LPXTG-motif cell wall anchor domain 단백질 코딩 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 이용한 '락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸 특이 검출 및 선발을 위한 마커 및 이를 이용한 분석 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 'groESL 오페론 내 유전자 간 스페이서 영역 서열을 이용한 락토바실러스 속의 동정방법'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 기존에 보고된 균주 판별 및 동정에 사용된 11종의 하우스키핑 유전자의 서열을 바탕으로 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 파라카제이, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 펜토서스 및 락토바실러스 파라플란타룸의 유전자 유사도를 판별하였을 때 groESL 오페론의 유전자 서열이 universal 프라이머 세트를 디자인할 수 있는 종간 보존 서열이 존재하는 동시에 종간 변이가 높아 락토바실러스 속 균종의 분류에 적합함을 알 수 있었다. 특히, groESL 오페론 내의 groES와 groEL간 ISR(intergenic spacer region)을 표적으로 하는 프라이머 세트를 제작하여 락토바실러스 속 균주들을 판별한 결과, 락토바실러스 속 균종의 분류 및 분화를 16S rRNA 염기서열 기반 방법에 비해 효율적으로 분석할 수 있었으며, 락토바실러스 플란타룸과 락토바실러스 펜토서스를 정확하게 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 락토바실러스 속 균종의 groES와 groEL간 ISR(intergenic spacer region)의 염기서열을 결정하는 단계를 포함하는 락토바실러스 속 균종의 동정방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 속 균종의 groES와 groEL간 ISR(intergenic spacer region)의 염기서열을 유효성분으로 함유하는 락토바실러스 속 균종의 동정을 위한 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 43 및 서열번호 44의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 락토바실러스 속 균종의 동정을 위한 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 락토바실러스 속 균종의 동정을 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 방법은 종래 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)를 이용한 락토바실러스 속 균종 판별법의 약점을 보완할 수 있는 장점이 있다. 더욱이, 본 발명의 groESL 오페론 및 이의 ISR(intergenic sequence region) 서열에 기반한 락토바실러스 종 분류 방법은 whole-genome에 기반한 종 분류와 매우 흡사한 발생학적 계통도를 잘 대변해 주고 있으므로, 기존 락토바실러스 종 판별법에 비해 특히 식약처 고시형 균주(락토바실러스 플란타룸)와 비고시형 락토바실러스 종(락토바실러스 펜토서스)에 대해 신속 정확하게 판별해 낼 수 있어, 16S rRNA 대체 종 판별 방법으로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 락토바실러스 속 균종의 groESL 오페론 내 ISR 염기서열을 보여준다.
도 2는 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 균주와 락토바실러스 펜토서스(L. pentosus) 균주의 16S rRNA(a) 및 groESL 오페론의 ISR(b)의 서열비교 결과이다.
도 3은 전장유전체(whole-genome) 서열에 기반한 락토바실러스 속 균종의 계통수(a), 16S rRNA 염기서열에 기반한 락토바실러스 속 균종의 계통수(b) 및 락토바실러스 속 균종의 groESL 오페론의 ISR 서열 유사성(c)을 나타낸다.
도 4는 ISR을 포함한 groESL 유전자 클러스터(오페론)를 표적으로 하는 프라이머 및 종특이적 프라이머 세트를 이용한 PCR 산물의 전기영동 결과이다. 레인 1: 1-kb DNA ladder; 레인 2: positive control(L. plantarum 핵산 시료를 27F 및 1492R 프라이머 세트를 이용하여 증폭); 레인 3: L. plantarum; 레인 4: L. pentosus; 레인 5: L. paraplantarum; 레인 6:　L. casei; 레인 7: L. paracasei; 레인 8: L. reuteri; 레인 9: L. helveticus; 레인 10: L. d.lactis; 레인 11: L. d.bulgaricus; 레인 12: L. d.delbreukii; 레인 13: L. johnsonii; 레인 14: L. gasseri; 레인 15: L. rhamnosus; 레인 16: L. murinus; 레인 17: L. sakei; 레인 18: L. salivarius; 레인 19: L. brevis; 레인 20: L. acidophilus; 레인 21: L. fermentum; 레인 22: L. crispatus.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락토바실러스 속 균종의 groES와 groEL간 ISR(intergenic spacer region)의 염기서열을 결정하는 단계를 포함하는 락토바실러스 속 균종의 동정방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 락토바실러스 속 균종의 동정방법에 있어서, 상기 락토바실러스 속 균종은 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스(L. brevis), 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 크리스파터스(L. crispatus), 락토바실러스 델브루에키 spp. 불가리쿠스(L. delbrueckii ssp. bulgaricus), 락토바실러스 델브루에키 spp. 델브루에키(L. delbrueckii ssp. delbrueckii), 락토바실러스 델브루에키 spp. 락티스(L. delbrueckii ssp. lactis), 락토바실러스 퍼멘텀(L. fermentum), 락토바실러스 가세리(L. gasseri), 락토바실러스 헬베티커스(L. helveticus), 락토바실러스 존소니(L. johnsonii), 락토바실러스 뮤리너스(L. murinus), 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei), 락토바실러스 파라플란타룸(L. paraplantarum), 락토바실러스 펜토서스(L. pentosus), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 루테리(L. reuteri), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus), 락토바실러스 사케이(L. sakei) 또는 락토바실러스 살리바리우스(L. salivarius)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 락토바실러스 속 균종의 동정방법은 구체적으로,

a) 락토바실러스 속 의심 균주로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 락토바실러스 속 균종의 groES와 groEL간 ISR 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;

c) 상기 증폭된 표적 서열의 염기서열을 분석하는 단계; 및

d) 상기 분석된 염기서열과 락토바실러스 속 표준 균주의 염기서열을 비교하여 락토바실러스 속 의심 균주의 종(species)을 결정하는 단계;를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 d) 단계에서 락토바실러스 속 의심 균주의 분석된 염기서열을 락토바실러스 속 표준 균주의 groESL 오페론 유전자의 염기서열에 대입하여 다중정렬한 후 계통도를 완성하여 락토바실러스 속 의심 균주의 종을 결정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 상기 표준 균주는 공인기관에 기탁된 균주로 전장유전체(whole genome) 서열이 밝혀져 있거나, 기탁된 균주가 아니더라도 종별 완전한 게놈 서열이 밝혀져 있는 균주를 의미한다. 상기 표준 균주의 groESL 오페론 유전자의 염기서열은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 Nucleotide Database, EzBioCloud (http://www.ezbiocloud.net/), Greengenes(http://greengenes.lbl.gov/), SILVA (https://www.arb-silva.de/) 또는 RDP Database(https://rdp.cme.msu.edu/) 등의 공지된 데이터베이스에서 검색하여 획득할 수 있다.

또한, 상기 계통도는 당업계의 공지된 소프트웨어를 이용하여 수행될 수 있고, 예컨대 ClustalW 1.8 (http://www.clustal.org/download/1.X/ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/) 및 MEGA 6.0 소프트웨어 (https://www.megasoftware.net/) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 락토바실러스 속 균종의 동정방법에 있어서, 상기 b) 단계의 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 서열번호 17 및 18; 서열번호 19 및 20; 서열번호 21 및 22; 서열번호 23 및 24; 서열번호 25 및 26; 서열번호 27 및 28; 서열번호 29 및 30; 서열번호 31 및 32; 서열번호 33 및 34; 서열번호 35 및 36; 서열번호 37 및 38; 서열번호 39 및 40; 및 서열번호 43 및 44;의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)의 groES와 groEL간 ISR 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트이고, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 락토바실러스 펜토서스(L. pentosus)의 groES와 groEL간 ISR 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트이며, 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 락토바실러스 파라플란타룸(L. paraplantarum)의 groES와 groEL간 ISR 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트이며, 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus)의 groES와 groEL간 ISR 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트이며, 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 락토바실러스 브레비스(L. brevis)의 groES와 groEL간 ISR 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트이며, 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 락토바실러스 카제이(L. casei)의 groES와 groEL간 ISR 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트이며, 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei)의 groES와 groEL간 ISR 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트이며, 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 락토바실러스 크리스파터스(L. crispatus)의 groES와 groEL간 ISR 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트이며, 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 락토바실러스 델브루에키 spp. 불가리쿠스(L. delbrueckii ssp. bulgaricus)의 groES와 groEL간 ISR 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트이며, 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 락토바실러스 델브루에키 spp. 델브루에키(L. delbrueckii ssp. delbrueckii)의 groES와 groEL간 ISR 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트이며, 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 락토바실러스 델브루에키 spp. 락티스(L. delbrueckii ssp. lactis)의 groES와 groEL간 ISR 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트이며, 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 락토바실러스 퍼멘텀(L. fermentum)의 groES와 groEL간 ISR 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트이며, 서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 락토바실러스 가세리(L. gasseri)의 groES와 groEL간 ISR 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트이며, 서열번호 27 및 28의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 락토바실러스 헬베티커스(L. helveticus)의 groES와 groEL간 ISR 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트이며, 서열번호 29 및 30의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 락토바실러스 존소니(L. johnsonii)의 groES와 groEL간 ISR 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트이며, 서열번호 31 및 32의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 락토바실러스 뮤리너스(L. murinus)의 groES와 groEL간 ISR 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트이며, 서열번호 33 및 34의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 락토바실러스 루테리(L. reuteri)의 groES와 groEL간 ISR 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트이며, 서열번호 35 및 36의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus)의 groES와 groEL간 ISR 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트이며, 서열번호 37 및 38의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 락토바실러스 사케이(L. sakei)의 groES와 groEL간 ISR 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트이며, 서열번호 39 및 40의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 락토바실러스 살리바리우스(L. salivarius)의 groES와 groEL간 ISR 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트이고, 서열번호 43 및 44의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 락토바실러스 종의 groES와 groEL간 ISR 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 범용 프라이머 세트이다. 상기 각 프라이머 세트들의 표적 서열은 Genbank 데이터베이스를 사용하였다(표 1 참고).

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라 서열번호 1 내지 서열번호 40, 서열번호 43 및 서열번호 44의 서열 내의 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상의 연속 뉴클레오드티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(21개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 40, 서열번호 43 및 서열번호 44의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. 상기 서열번호 중 홀수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향 프라이머이며, 짝수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향 프라이머이다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 락토바실러스 속 균종의 groES와 groEL간 ISR(intergenic spacer region)의 염기서열을 유효성분으로 함유하는 락토바실러스 속 균종의 동정을 위한 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 락토바실러스 속 균종의 groES와 groEL간 ISR 염기서열을 포함하고 있어, 락토바실러스 속의 균주로 의심되는 미생물의 시료로부터 분리된 게놈 DNA의 염기서열과 비교하여 락토바실러스 속 균종을 동정할 수 있게 되는 것이다.

본 발명은 또한, 서열번호 43 및 서열번호 44의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 락토바실러스 속 균종의 동정을 위한 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에 따른 락토바실러스 속 균종의 동정을 위한 프라이머 세트에 있어서, 서열번호 43 및 서열번호 44의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트는 락토바실러스 속 균종들의 groES와 groEL간 ISR(intergenic spacer region)을 표적으로 하며, 상기 락토바실러스 속 균종은 이에 한정되지는 않으나, 바람직하게는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 파라플란타룸(L. paraplantarum) 및 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 서열번호 43 및 서열번호 44의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 락토바실러스 속 균종의 동정을 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 균주 배양 및 배양 배지

본 발명에서 사용된 균주는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) ATCC 53544, 락토바실러스 브레비스(L. brevis) ZLB004, 락토바실러스 카제이(L. casei) W56, 락토바실러스 크리스파터스(L. crispatus) ST1, 락토바실러스 델브루에키 spp. 불가리쿠스(L. delbrueckii ssp. bulgaricus) ATCC BAA-365, 락토바실러스 델브루에키 spp. 델브루에키(L. delbrueckii ssp. delbrueckii) KCTC 13731, 락토바실러스 델브루에키 spp. 락티스(L. delbrueckii ssp. lactis) KCTC 3035, 락토바실러스 퍼멘텀(L. fermentum) IFO 3956, 락토바실러스 가세리(L. gasseri) ATCC 33323, 락토바실러스 헬베티커스(L. helveticus) D75, 락토바실러스 존소니(L. johnsonii) IDCC9130, 락토바실러스 뮤리너스(L. murinus) CR141, 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei) ATCC 334, 락토바실러스 파라플란타룸(L. paraplantarum) DSM 10667, 락토바실러스 펜토서스(L. pentosus) DSM 20314, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) WCFS1, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) JCM 1112, 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) ATCC 53103, 락토바실러스 사케이(L. sakei) DS4, 및 락토바실러스 살리바리우스(L. salivarius) JCM1046로써 락토바실러스 속 20종이다. 모든 락토바실러스 균주를 De Man, Rogosa and Sharpe (MRS) 한천 플레이트에서 5% CO₂ 배양기, 37℃에서 16시간 동안 배양 하였다.

2. 서열 분석 및 프라이머 디자인

선택된 20개의 락토바실러스 종의 모든 이용가능한 완전한 게놈 서열은 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/), EzTaxon (https://www.ezbiocloud.net/) 및 LPSN (List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature; http://www.bacterio.net) 서버에서 조사되었다.

16S rRNA 유전자, ISR(intergenic spacer region) 및 whole-genome에 기초한 뉴클레오티드 서열 및 계통발생학적 분석은 ClustalW 1.8 (http://www.clustal.org/download/1.X/ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/) 및 MEGA 6.0 소프트웨어 (https://www.megasoftware.net/)를 사용하여 수행되었다. 계통 발생 거리는 Kimura two-parameter model (Kimura M. 1980 J Mol Evol. 1980;16(2):111-120), Maximum likelihood estimation (Felsenstein J. 1981 Evolution. 35(6):1229-1242), Maximum-parsimony (Fitch WM. 1971 Systematic Zoology. 20(4):406-416) 방법을 사용하여 neighbour-joining 방법에 따라 계산되었다. 각 결과 트리는 1,000 replications를 기준으로 부트스트랩 분석으로 평가되었다. 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 펜토서스를 포함한 총 20종의 락토바실러스 종(Lactobacillus spp.)을 식별하기 위해 ISR을 증폭시키기 위한 종별 프라이머는 각각의 락토바실러스 종의 groESL 유전자상의 보존된 영역에 기초하여 설계되었다. 디자인된 프라이머 세트는 표 1에 나타냈다.

3. 중합효소연쇄반응(PCR)

MRS 고체 배지에서 배양된 대략 1 mm 직경의 콜로니를 멸균된 이쑤시개로 채취하여 PCR 튜브로 옮겼다. 콜로니 PCR 반응 혼합물은 2 ㎕ 10x 반응 완충액(20 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 0.5 mM EDTA, 0.1 mM DTT, 0.5% tween 20, 0.5% Nonidet P-40 및 50% 글리세롤)과 1 ㎕ 10 mM dNTP 혼합물(각 dNTP의 2.5 mM), 각 프라이머 1 ㎕(1 pmoles), 0.1 ㎕ Prime Taq DNA 폴리머라제(5 unit)을 혼합하고 최종 20 ㎕까지 멸균된 증류수로 채웠다. PCR 조건은 94℃에서 10분 동안 초기 변성에 이어 94℃에서 30초 동안 변성, 58℃에서 30초 동안 결합(annealing), 72℃에서 30초 동안 신장(extension), 및 72℃에서 5분 동안의 최종 신장 단계로 25회 진행되었다. 이후 PCR 산물을 1% 아가로스 겔 전기영동을 통해 분석하였다. 뉴클레오티드 서열은 BigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems)를 사용하여 결정하였다.

실시예 1. 락토바실러스 속 균주 동정을 위한 하우스키핑 유전자의 서열 유사성 분석

기존에 보고된 균주 판별 및 동정에 사용된 특정 유전자를 락토바실러스에 적용하여 락토바실러스 종 판별 및 분류에 적합한지 판별하였다. 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei: LC), 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei: LPC), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum: LP), 락토바실러스 펜토수스(L. pentosus: LPEN), 락토바실러스 파라플란타룸(L. paraplantarum: LPP)의 16S rRNA, groEL, groES, dnaK, dnaJ, grpE, recA, pheS, rpoD, rpoA, dnaK/dnaJ 오페론 및 groESL 오페론 유전자 서열을 바탕으로 유전자 유사도를 판별하였을 때, 하기 표 2에서와 같이 16S rRNA 및 groES, dnaJ, rpoD, rpoA, grpE dnaK/dnaJ 오페론의 서열 유사성 분석 결과에서 일부 락토바실러스 종간 해당 서열이 100% 일치하거나 99.9%의 상동성을 보임을 확인하였다. 즉, 상기 유전자를 이용하여 락토바실러스 속 균종들을 동정할 시, 종 판별이 용이하지 않은 부분이 있음을 알 수 있었다. 그러나, groESL 오페론 유전자 서열이 universal 프라이머를 디자인할 수 있는 종간 보전 서열이 존재하는 동시에 종간 변이(interspecies variation)가 높아 16S rRNA에 비해 종 분류에 더 적합함을 알 수 있었다.

실시예 2. groES 와 groEL 간 ISR(intergenic spacer region) 염기서열에 기반한 락토바실러스 계통발생학적 분류

groESL 내 종 특이적 ISR은 whole-genome을 기반으로 한 계통발생학적 분류를 바탕으로 락토바실러스의 종 분화를 비교하였을 때, 16S rRNA를 기반으로 한 계통 발생학적 분화도(도 3b)에 비해 더욱 정확하게 whole-genome기반 계통학적 발생을 잘 대변해 주고 있었다(도 3a). 이는, whole-genome 기반의 계통발생학적 분류가 단편적인 16s rRNA 유전자 서열 기반 계통 분석보다 더 정확하다고 할 수 있으며, 본 발명에서는 whole-genome 기반 계통 분석 결과와 ISR 염기서열 기반 종간 그룹화 결과가 일치하기 때문에 16s rRNA 유전자 기반 계통 분석에 비해 종분화를 더 잘 대변해 주는 것으로 볼 수 있는 것이다.

ISR 서열이 비교적 짧지만 whole-genome 기반 계통학적 발생을 잘 대변해 줄 수 있는 이유는, whole-genome 내 항존유전자(housekeeping gene)의 비율은 상대적으로 전체 유전자 및 정크(junk) DNA에 비해 그 분포 비율이 상대적으로 적으며, ISR은 정크 DNA로 항존유전자와는 상이한 돌연변이에 의해 종 특이적으로 해당 균종의 역사를 서열상에 잘 표현될 가능성이 크기 때문이다. 16s rRNA는 항존유전자로 돌연변이율이 극히 낮아 게놈 시퀀스 기술이 발전하기 이전에 통상적으로 종 판별 마커로 사용된 유전자이나, 시퀀싱 기술의 발전으로 현재 전제 게놈 분석에 의한 종분화 분석으로 페러다임이 바뀌고 있으며, 16s rRNA 서열만으로는 신종 판별이 어렵다고 판단되고 있는 실정이다.

실시예 3. groES 와 groEL 간 ISR(intergenic spacer region) 서열을 이용한 락토바실러스 동정

16S rRNA 시퀀싱을 위한 27F, 1492R 프라이머를 대조구로 사용하여 본 발명에서 디자인된 종-특이적 프라이머 세트 및 범용 프라이머 세트(표 1)를 이용하여 락토바실러스 균종들을 대상으로 콜로니 PCR을 수행하였다. PCR 증폭산물을 전기영동한 결과, 예측된 크기 부근에서 명확한 단일 밴드가 관찰되었다(도 4). 상기 결과를 통해 기존에 16S rRNA로 정확히 분류되지 않던 락토바실러스 동정이 groES와 groEL간 ISR(intergenic spacer region)의 염기서열을 이용할 경우 보다 정확하게 확인할 수 있음을 알 수 있었다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Identification method of Lactobacillus sp. using intergenic spacer region sequence in groESL operon <130> PN19191 <160> 44 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ggacaaaagt tgaccccagc g 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 accgttgcag tagtcgtccc 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cggcaaggtt gttgccgtc 19 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aaaacagtcg cagtggtcgt cc 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 aaggaaaagc cccaaagcgg g 21 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tcgtcgtccc atcaccagc 19 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ccaatggtcg ttaagaaggg cg 22 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cttcagcaac aagcttagca ccc 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 aatggcgaca aggtagcccc 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cgttagtgat ggttgggttg cc 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 caagcgtttg ccaatggccg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ttcggcaacc aacttggcgc 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ttgttgcagt aggtgaaggc gc 22 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ccaacaggat tagcaccggc 20 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gttgtagctg ttggtgaagg tgc 23 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gttagtgatg tcagggttgc cg 22 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 caaggttgtt gccgtaggcg 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gtaccatcac cagcgatgtc g 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 tatgaccgtc caagagggcg 20 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gtcgttggta atcgttgggg c 21 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 aaggttgttg ccgtaggcgg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gtggcctttt caatcccgcg 20 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ataatggcca agtggtggcg g 21 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ggaaaccagc ttagccccc 19 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gttggaggca ttgtcctggc 20 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 cagtrgtagt accgtcacca gc 22 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 cgtaggtgaa ggtgcttacg c 21 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 cgttagtgat gtctgggtta ccg 23 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 gtaggaaatg gtaagcgcaa cgc 23 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 tagtaccgtc accagcaatg tcg 23 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 gggacgtatc cttgatgatg gc 22 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 ctgttgtagt cccatcacca gc 22 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 ctccagctgt taaggaaggc g 21 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 cagttgtagt accatcaccr gc 22 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 tttgacaccg gaaggcaagc g 21 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 ttctgcgact aacttrgcwc cc 22 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 gacggtcagc gaatcccac 19 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 tkgttgtacc gtcaccggcg 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 ccatacctgg tgttgcaggc 20 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 caaggacaag atcgctgaac gtg 23 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 tgttanaacc antnggngat cg 22 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 tcaccaaanc cnggngcctt aac 23

Claims (8)

1. 락토바실러스 속 균종의 groES와 groEL간 ISR(intergenic spacer region)의 염기서열을 결정하는 단계를 포함하는 락토바실러스 속 균종의 동정방법.
2. 제1항에 있어서,
   a) 락토바실러스 속 의심 균주로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 락토바실러스 속 균종의 groES와 groEL간 ISR 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;
   c) 상기 증폭된 표적 서열의 염기서열을 분석하는 단계; 및
   d) 상기 분석된 염기서열과 락토바실러스 속 표준 균주의 염기서열을 비교하여 락토바실러스 속 의심 균주의 종(species)을 결정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 속 균종의 동정방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 d) 단계에서 락토바실러스 속 의심 균주의 분석된 염기서열을 락토바실러스 속 표준 균주의 groESL 오페론 유전자의 염기서열에 대입하여 다중정렬한 후 계통도를 완성하여 락토바실러스 속 의심 균주의 종을 결정하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 속 균종의 동정방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 락토바실러스 속 균종은 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스(L. brevis), 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 크리스파터스(L. crispatus), 락토바실러스 델브루에키 spp. 불가리쿠스(L. delbrueckii ssp. bulgaricus), 락토바실러스 델브루에키 spp. 델브루에키(L. delbrueckii ssp. delbrueckii), 락토바실러스 델브루에키 spp. 락티스(L. delbrueckii ssp. lactis), 락토바실러스 퍼멘텀(L. fermentum), 락토바실러스 가세리(L. gasseri), 락토바실러스 헬베티커스(L. helveticus), 락토바실러스 존소니(L. johnsonii), 락토바실러스 뮤리너스(L. murinus), 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei), 락토바실러스 파라플란타룸(L. paraplantarum), 락토바실러스 펜토서스(L. pentosus), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 루테리(L. reuteri), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus), 락토바실러스 사케이(L. sakei) 또는 락토바실러스 살리바리우스(L. salivarius)인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 속 균종의 동정방법.
5. 락토바실러스 속 균종의 groES와 groEL간 ISR(intergenic spacer region)의 염기서열을 유효성분으로 함유하는 락토바실러스 속 균종의 동정을 위한 조성물.
6. 서열번호 43 및 서열번호 44의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 락토바실러스 속 균종의 동정을 위한 프라이머 세트.
7. 제6항에 있어서, 상기 락토바실러스 속 균종은 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 파라플란타룸(L. paraplantarum) 및 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
8. 제6항 또는 제7항의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 락토바실러스 속 균종의 동정을 위한 키트.

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