CN110305979B

CN110305979B - 一种基于多内标系统的微生物群落绝对定量方法

Info

Publication number: CN110305979B
Application number: CN201910095751.9A
Authority: CN
Inventors: 徐岩; 吴群; 王石垒
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2021-01-29
Anticipated expiration: 2039-01-31
Also published as: CN110305979A

Abstract

本发明公开了一种基于多内标系统的微生物群落绝对定量方法，属于生物技术及组学分析领域。本发明提供了一种在扩增子测序过程中能够有效地对微生物进行绝对定量的方法，所述方法是根据样品中微生物总量的拷贝数添加相应梯度的目标质粒，进行DNA分离，质控，测序，获得OTU分类单元，根据目标质添加量与检测量之间的比例关系计算样本中相应微生物的绝对数量。本发明能够实现待测样品的绝对定量，极大提高测定结果的准确性，并具有成本低等优点，对测序技术的进步具有重要的推动作用。

Description

一种基于多内标系统的微生物群落绝对定量方法

技术领域

本发明涉及一种基于多内标系统的微生物群落绝对定量方法，属于生物技术及组学分析领域。

背景技术

扩增子(amplicon)为DNA或RNA扩增后的一段核苷酸序列，是一种高靶向性方法，用于分析特定基因组区域中的基因变异。比如通过PCR扩增得到的某个基因的扩增片段，其超深度测序可以有效地识别变异并对其进行特征分析。扩增子测序主要包括16S rDNA测序、18S rDNA测序、ITS测序及目标区域扩增子测序等。来反应环境样品在细菌、真菌、古菌等分类方面物种之间的差异，对研究海洋、土壤、肠道粪便等环境中的微生物构成有重要的指导作用，同时也是系统发育和分类学研究中一种广泛使用的方法。

但是目前由于扩增子测序技术的限制，在微生物组成方面通常采用相对丰度的方式进行表示，而缺乏对目标环境中微生物绝对含量的表征方法，以至于在不同目标环境样本间或是同一样本在不同时间条件下进行跨样本或时间梯度进行比较时，容易获得错误的结论，无法具体反映出同一微生物在时间梯度下的具体演替规律，这是目前扩增子测序所面临的最重要的问题。其主要原因在于不同环境样品中微生物DNA在提取过程中存在不同量的损失率，以及在扩增过程中存在的偏好性，造成了扩增子测序过程中无法对样品中生物量进行绝对的定量。

发明内容

为解决现有技术存在的缺陷，本发明提出一种对微生物实现绝对定量的方法，通过建立具有一定浓度梯度的标记物DNA，形成内标系统，使操作步骤中待测样品与内标系统所经历的处理条件一致，使两者之间的损失尽可能的接近，从而实现绝对定量。同时，由于目标样本中不同微生物浓度之间可能存在着较大的差异，采用本发明的方法，避免不同浓度的微生物基因组样品在扩增过程中存在的速率差异，从而确保了计算结果更为准确。

本发明的第一个目的是提供一种在扩增子测序过程中有效地对微生物进行绝对定量的方法，所述方法是根据待测样品中微生物总量的拷贝数与相应浓度梯度的标记物DNA混合，进行DNA分离，质控，测序，获得OTU分类单元，单个样本中根据目标质添加量与检测量之间的线性方程关系：

(其中a和b为常数)，计算单一样本中相应微生物的绝对数量(X)。

在本发明的一种实施方式中，所述根据待测样品中微生物总量的拷贝数与相应浓度梯度的标记物DNA混合是：建立至少2个浓度梯度，使建立的浓度梯度与微生物总量的拷贝数所处的数量级尽可能多的，或全面性重合。

在本发明的一种实施方式中，建立2个，或3个，或4个，或5个以上的浓度梯度，

在本发明的一种实施方式中，所述微生物为真菌、细菌或古细菌。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是根据待测样品中细菌总量的拷贝数与相应浓度梯度的标记物DNA混合，进行DNA分离，质控，测序，获得OTU分类单元，根据目标质添加量与检测量之间的线性方程关系：

(其中a和b为常数)，计算样本中细菌的绝对数量(X)；

和/或根据待测样品中真菌总量的拷贝数与相应浓度梯度的标记物DNA混合，进行DNA分离，质控，测序，获得OTU分类单元，根据目标质添加量与检测量之间的线性方程关系：

(其中a和b为常数)，计算样本中真菌的绝对数量(X)。

在本发明的一种实施方式中，所述根据待测样品中微生物总量的拷贝数与相应浓度梯度的标记物DNA混合可以是：

(a)当待测样品中微生物总量的拷贝数为10³～10⁷时，标记物DNA的浓度梯度为10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷；

(b)当待测样品中微生物总量的拷贝数为10³～10⁶时，标记物DNA的浓度梯度为10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷，或10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶；

(c)当待测样品中微生物总量的拷贝数为10³～10⁸时，标记物DNA的浓度梯度为10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸，或10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷，或10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸。

在本发明的一种实施方式中，所述标记物DNA为任意DNA片段。

在本发明的一种实施方式中，所述标记物DNA可以以任何形式添加，包括但不限于以DNA片段的形式添加，或与载体连接并以质粒的形式添加。

在本发明的一种实施方式中，所述标记物DNA与质粒连接。

在本发明的一种实施方式中，所述质粒为T载体。

在本发明的一种实施方式中，所述标记物DNA的两端分别连接有通用引物，再与质粒连接。

在本发明的一种实施方式中，所述通用引物包括336F/806R，ITS1F/ITS2。

在本发明的一种实施方式中，所述标记物DNA是在5’端连接通用引物336F，并在3’端连接通用引物806R。

在本发明的一种实施方式中，所述标记物DNA是在5’端连接通用引物ITS1F，并在3’端连接通用引物ITS2。

在本发明的一种实施方式中，所述标记物DNA按如下方式设计：选择系统中细菌、真菌中含量最多的前10个OTU单元(含量最多的前10个OTU单元通常涵盖了待测样品中95％的微生物总量)进行DNA序列的设计，按照其平均序列长度和GC％含量进行随机序列设计(以避免扩增的偏好性)，选择与原位系统中OTU数目排行前10的序列的平均相似度均低于50％的序列为标记物DNA。

在本发明的一种实施方式中，所述质粒为T载体。

在本发明的一种实施方式中，根据质粒质量计算每微克质粒的实际拷贝数，具体参照如下方程：(6.02×10²³)×(g/ml)/(DNA length×660)＝copies/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述建立标记物DNA添加量与检测量之间的比例关系是：建立质粒OTU数目与实际添加量的标准曲线，基于所建立标准曲线对样品中其它OTU进行绝对定量。

本发明还要求保护所述方法在食品、医学、环境领域中微生物定量方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述食品领域包括对白酒、酱油、食醋、泡菜等酿造体系下的微生物进行检测。

在本发明的一种实施方式中，所述医学领域包括：对消化系统胃、肠道或脏器组织微生物的检测。

在本发明的一种实施方式中，所述环境领域包括雾霾、污水、矿石能源、土壤环境、海洋环境、冰川或火山环境微生物的检测。

有益效果：(1)本发明针对细菌、真菌微生物在扩增上的效率不同，针对细菌和真菌微生物扩增片段不同的GC％含量和长度设计不同的标记物DNA，在标记物DNA两端添加相应的通用引物对，估算样品中相应生物量的拷贝数添加相应梯度的标记物DNA于样品中进行分离提取，根据对不同梯度标记物DNA的实际添加值和实际检测值构建标准曲线，根据此标记物DNA标准曲线对样品中其它生物量进行绝对定量换算，在所建立的标准曲线梯度内(细菌：10⁴，10⁵，10⁶，10⁷，10⁸copies/g，真菌：10³，10⁴，10⁵，10⁶，10⁷copies/g)能够有效地(R²≥99.9％)定量样品中微生物的绝对含量(细菌10¹⁰～10⁵CFU/g，真菌10⁹～10CFU/g)。

(2)本发明与传统方法相比，误差减少9.7倍。

(3)本发明与传统方法相比，测定单个样品的成本降低80％，检测时间/样品处理时间缩短80％。

附图说明

图1样品中不同质粒拷贝数所对应其OTU数量；A为细菌，B为真菌。

图2样品中细菌和真菌的相对定量与绝对定量比较。A：细菌-相对定量；B：细菌-绝对定量；C：真菌-相对定量；D：真菌-绝对定量。

具体实施方式

实施例1：

以某白酒酿造过程中微生物变化为例：

1、对酿造系统中细菌、真菌中含量最多的前10个OTU单元进行序列的设计(表1，2)，按照其平均序列长度和GC％含量进行随机序列设计，以避免扩增的偏好性，从近300条随机序列中选择与原位系统中OTU数目排行前10的序列的平均相似度均低于50％，能够与原位系统中微生物做到很好的区分(表1和2)的10条序列(表3)为所设计序列。

表1细菌参考序列信息

表2真菌参考序列信息

表3随机序列设计信息。

2、为了避免扩增的偏好性，扩增时选取细菌V3-V4区，真菌ITS2区通用引物对(表4)，标记物DNA设计时将通用引物对设计在随机序列两端，构成标记物DNA。将标记物DNA连接在T载体上进行转化，挑选阳性克隆，测序，提取质粒，获得连接有标记物DNA的质粒，根据质粒质量计算每微克质粒的实际拷贝数。

表4引物信息

3、添加浓度的选取：由于样品中中微生物变化范围细菌10⁸～10⁴CFU/g，真菌10⁷～10³CFU/g。由于加入标记物DNA的浓度与环境中生物量总量浓度越相近，实际检测效果偏差越小，因此选择能够涵盖待测样品浓度的5个细菌质粒添加梯度10⁴，10⁵，10⁶，10⁷，10⁸copies/g，5个真菌质粒添加梯度10³，10⁴，10⁵，10⁶，10⁷copies/g。

4、将所合成的5组质粒按照不同的浓度梯度添加在目标样品中，然后进行DNA分离，质控，测序，获得OTU分类单元，获取样品中10种质粒的OTU数目，与实际添加量构建标准曲线(图1)，基于所建立标准曲线对样品中其它OTU进行绝对定量

本实施例的方法能够实现微生物的绝对定量，具有快速、低价的优点。

对比例1

采用传统的测定方法，具体步骤为：按照实施例1的步骤设计标记物DNA，并将标记物DNA与T载连接，构建目标质粒。将不同浓度梯度的5个目标质粒加入到5个样品中，按照实施例1相同的方法进行DNA分离，质控，测序，获得OTU分类单元，获得目标质粒添加量与检测量之间的线性方程关系，根据线性方程换算样品中微生物的绝对含量。

在DNA分离过程中不同样品之间DNA浓度存在50％左右的误差，且该方法为获取线性方程需要进行5个平行样本的测定，5个平行样本之间DNA浓度的差异，会造成线性方程的结果出现误差的成倍叠加。

将实施例1的方法与对比例1的测定结果进行比较，结果显示(图2)，实施例1的方法更能够反映出环境中微生物真实的组成情况，例如，相对定量中乳酸菌在第20天时含量明显高于第10天，但在绝对定量中则表现出实际情况为第10天和第20天无显著差异，真菌中的酿酒酵母表现出相同的情况。因此，绝对定量更能准确地展示样品中微生物的真实组成情况。

实施例1的方法中，由于不同浓度的目标质粒添加在同一样本中，在DNA分离过程中不同质粒之间存在相同的损失率，因此不会影响线性方程的准确性。为验证实施例1和对比例1在测定结果准确性方面的差异，我们假设在同一样本、PCR过程扩增效率为100％、扩增循环为20个，其余测定步骤的误差相同的情况下，比较DNA分离过程中DNA浓度的误差对线性方程计算结果带来的误差。在对比例1中将DNA浓度存在50％的误差带入Y＝a×(1+x)^b进行计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，x表示平均每次的扩增效率，a代表模板数，b代表循环次数。获得如表5所示，在假设Y(检测浓度)相同的条件下，实施例1中方法较对比例1中方法准确度提高9.7倍。

表5实施例1与对比例之间线性模型的差异。

在时间和成本方面，实施例1的方法中将5种不同浓度目标质粒添加在同一样本中，对比例1方法需要将5种不同浓度目标质粒添加在5个样本中，因此在测序时间和费用上，实施例1所花费的时间和费用只是对比例1的1/5。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，比如在质粒的设计和浓度梯度的选择上，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种基于多内标系统的微生物群落绝对定量方法

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 472

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtactcctac gggaggcagc agccttgcta gcaaccgcgg gctgggagcc tgaggcatca 60

ctcaagaaac aggctcggta acgtacgctc tagccatctg actatcccct gcgtcatata 120

ggggcctacg ttatctgcgt gtccaacctt aggattcgcc tcagcgcgca ggcttgggtc 180

gagatgaaat ctccggcgcc caagaccacg ggcgcccggc gccttggcta acccccgtac 240

atgttgttat aaacaatcag tggaaagcct gtgctagagg gtggagtgac cataaatcag 300

ggacgatatt aatcggaagg agtattcaac gcgatgaagt cgcagggttg gcgtgggaat 360

ggtgcttctg tcctaacagg ttagggtatg acgccggaac cgtcccccaa gcgttcaggg 420

tgggctttgc tacgacttcc gagtccaaag attagawacc cbdgtagtcc ac 472

<210> 2

<211> 472

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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ggacctggct tacgccctag tacgtagcaa ggtgacacaa gcacagtaga tcctgcccgc 120

gtttcctatg tatcaagtta gaacttatgg agcatagtaa catgtggacg gccagtggtc 180

ggttgctaca cgcctgccgc aacgttgaag gacccggatt agactggcag gatctatggc 240

gtgagacccg ttatgctcca ttacggtcag tgggtcacgg ctagttgtgg actggattgc 300

cattctccga gtgtattacc gtggcggccg cacgggtccc atataatgca gtcgtagcct 360

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tgcttttaag gaccggacga accacagagc attagawacc cbdgtagtcc ac 472

<210> 3

<211> 472

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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tgtccgatcc catattacga ctccgggagg gggttcgcaa gtcgcacccc aaacgatgct 120

gaaggctcag gatgcacagg cacaagtaca atatatgcgt gttccggctc ttatcctgca 180

ccgaaagctc aatcatgcat cgtaccagtg tgttcgtgtc atctaggagg ggcgcgtagg 240

ataaataatt caattaagat tacgttatgc tactgtacac ctacccgtca ccggccaaca 300

atgtgcggat ggcgccacga cttactgggc ctgatctcac cgcttctgat accgcacact 360

gggcaatacg aggtcaagcc agtcacgcag tgacgttcat cagctaacgt aacggttaga 420

ggctcgctaa atcgcactgt cggcgtccct attagawacc cbdgtagtcc ac 472

<210> 4

<211> 472

<212> DNA

<213> 人工序列

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ctttcctccc aggggtatgc gggtgcgtgg acaagcgagc agcaaacgta aattctcggc 120

gtgcttggtg tctcgtattc ctcctggaga tcgaggaaat gtttcatgac caagcgaaag 180

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<210> 5

<211> 472

<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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Claims

1.一种基于多内标系统的微生物群落绝对定量方法，其特征在于，所述方法是，选择系统中微生物含量最多的前10个OTU单元，按照其平均序列长度和GC％含量进行随机序列设计，选择与原位系统中OTU数目排行前10的序列的平均相似度均低于50％的序列为标记物DNA；根据待测样品中微生物总量的拷贝数与相应浓度梯度的标记物DNA混合，进行DNA分离，质控，测序，获得OTU分类单元，根据标记物DNA添加量与检测量之间的线性方程计算样本中相应微生物的绝对含量；

所述根据待测样品中微生物总量的拷贝数与相应浓度梯度的标记物DNA混合是：建立至少2个浓度梯度，使建立的浓度梯度与微生物总量的拷贝数所处的数量级尽可能多的重合；所述标记物DNA的两端分别连接有微生物的通用引物，再与质粒连接。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物为真菌、细菌或古细菌。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记物DNA的添加形式包括：以DNA片段的形式添加，或将标记物DNA与载体连接并以质粒的形式添加。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，测序完成后，建立质粒OTU数目与实际添加量的标准曲线，基于所建立标准曲线对样品中其它OTU进行绝对定量。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物为真菌、细菌或古细菌；测序完成后，建立质粒OTU数目与实际添加量的标准曲线，基于所建立标准曲线对样品中其它OTU进行绝对定量。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记物DNA的添加形式包括：以DNA片段的形式添加，或将标记物DNA与载体连接并以质粒的形式添加；测序完成后，建立质粒OTU数目与实际添加量的标准曲线，基于所建立标准曲线对样品中其它OTU进行绝对定量。

7.权利要求1～6任一所述的方法在工业领域中微生物定量方面的应用。

8.权利要求1～6任一所述的方法在食品领域中微生物定量方面的应用。

9.权利要求1～6任一所述的方法在环境领域中微生物定量方面的应用。

10.权利要求1～6任一所述的方法在发酵食品中微生物定量中的应用。

11.权利要求1～6任一所述的方法在雾霾微生物检测中的应用。

12.权利要求1～6任一所述的方法在污水微生物检测中的应用。

13.权利要求1～6任一所述的方法在矿石能源微生物检测中的应用。

14.权利要求1～6任一所述的方法在土壤环境微生物检测中的应用。

15.权利要求1～6任一所述的方法在海洋环境微生物检测中的应用。

16.权利要求1～6任一所述的方法在冰川环境微生物检测中的应用。

17.权利要求1～6任一所述的方法在火山环境微生物检测中的应用。