CN108424184A - 一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法和精准应用 - Google Patents

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Yinchuan yieryu Biotechnology Co.,Ltd.
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Abstract

本发明公开了一种微生物肥料菌剂配方的精准制定方法和精准应用，属于微生态肥料个性化定制的领域。本发明通过对土壤样品的原有微生物菌群进行生物信息分析，优化和制定具有针对性的活性复合微生物菌剂配方，利用该菌剂配方对天然植物类进行发酵，在个性化构建的活性复合微生物菌剂的作用下，对植物成分持续发酵升温，杀灭有害病原体的同时，使植物成分充分分解后腐熟，得到优质的生物肥料，解决了传统单一的生产工艺，使资源进一步得到优化和良性循环，在现代农业领域中得到充分地精准应用，填补产业空白，极大地符合我国国情，应用前景广阔。

Description

一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法和精准应用
技术领域
本发明属于微生态有机肥料个性化定制的技术领域，更具体地说，涉及一种微生物肥料动态配方的制定方法。
背景技术
生态肥料是有机固体废弃物(包括有机垃圾、秸秆、人、畜、禽粪便、饼粕、农副产品和食品加工产生的固体废弃物)经微生物发酵、除臭和完全腐熟后制作而成的有机肥料。富含多种功能性微生物和丰富的微量元素，可以改良土壤结构，对作物生长起到营养、调理和保健作用。
但是目前的生态肥料发酵多采用单一菌种或盲目的(针对不同个体，菌群比例一成不变)复合菌种进行发酵，生态肥料的成分相对固定，不能满足不同地区的土质需求。例如，中国专利申请号为201410639199.2，申请公布日为2015年2月18日的专利申请文件公开了一种生态有机肥料，以动物粪便、废弃植物、秸秆粉、树叶粉、玉米面作为原料，添加发酵菌剂进行发酵，同时添加一些石膏粉、氮磷钾肥等进行调整。中国专利申请号为201510147305.X，申请公布日为2015年8月5日的专利申请文件也是公开了类似的技术方案。再例如某一发明专利(CN 201610080592)应用固定不变的几个菌种组成及化学物质作为基质混合发酵农林作物的肥料。中国专利申请号为CN101168491A，申请公布日为2016年10月24日的专利申请文件也是公开了类似的技术方案。
天然活性复合微生物菌种及其衍生物的微生态产品制备过程中，通过微生物发酵，能够提高产品的稳定性，免去添加任何化学试剂等危害。显著提高了农产品的品质/产量和土壤改良的效果(现代农业)，免去化学物质及添加剂等对人体造成的危害和提高精准应用的价值。
在我国，耕地的60％以上存在着营养贫瘠的问题，生态肥料不仅能够提供农作物生长发育所需的各类营养元素，其中的功能性微生物施入土壤后，或能活化土壤中的养分，改善植物的营养环境，或在微生物的生命活动过程中，产生活性物质，刺激植物生长的特定微生物制品。每个区域的土壤性质(原有的微生物种类、含量等)都不相同，固定单一的生态肥料配方无法满足不同地区的土壤需求，目前还缺少如何根据土壤性质的不同，个性化提供生态肥料的菌剂配方，发酵得到性能稳定的肥料的方法。
发明内容
1.要解决的问题
针对现有生物肥料功能单一、没有针对性等问题，本发明提供一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，根据不同区域内的土壤微生物分布情况确定独特的微生物菌剂配方，对天然植物进行发酵得到合适的微生物肥料，微生物菌剂配方依据土壤的性质来制定，具有针对性和独特性。
2.技术方案
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，包括以下步骤：
(1)土壤样本处理：抽提并纯化样本中的微生物DNA，采用515F/806RPCR(515F-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA，806R-GGACTACHVGGGTWTCTAAT)引物对微生物DNA的16S rRNA基因的V4高变区进行扩增；16S rRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中，16S rRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列具有较完备的参考文库用以细菌分型分析。
(2)测定土壤中微生物总量：提取土壤中微生物的总DNA，然后以16S rRNA作为目标序列，使用515F/806R PCR引物通过定量即时PCR对总的微生物菌群进行绝对定量，以大肠杆菌作为标准品；
(3)鉴定土壤中不同微生物菌群比例：通过高通量基因测序技术对扩增的产物进行测序(测序长度可以到达双端500～600碱基，可以完全包括16S基因片段；可以同时对超过10000个样本的PCR扩增产物进行测定，极大地降低单个样本的测序价格，清除价格瓶颈)，对测序结果进行分析评估，将测序结果与16S rRNA的微生物基因序列数据库进行对比，确定土壤样本中不同活性微生物菌群的相对含量和比例；
(4)确定菌剂配方：将测定的微生物菌群含量与该地区的土壤微生物数据库中该微生物菌群的含量分布进行比较，若相对含量≤25％，则提供的菌剂配方中该微生物菌群的活性含量不低于5×109cfu/g(mL)；若相对含量＞25％，则提供的菌剂配方中该微生物菌群的活性含量不低于1×109cfu/g(mL)；所述微生物菌群的菌种均来自于筛选出的大自然环境的天然菌种；
(5)生物肥料发酵：将步骤(4)中确定的菌剂配方与发酵基质进行混合发酵，当发酵基质的pH值到达或接近5.0，则发酵成熟，将发酵液进行冷却，经过混匀，过滤分离，检测，调配，贮藏在无阳光直射、阴凉通风处。
更进一步地，所述的步骤(1)中采用微珠打碎和/或超声(130W×20KHz)的方法来提取样本中的微生物DNA，使用荧光法测定DNA浓度。
更进一步地，所述的步骤(1)中采用的515F/806R PCR引物为515F：GTGCCAGCMGCCGCGGTAA806R；806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。细菌16S rRNA基因包含从V1，V2到V9共九个高变区。本发明中通过使用双端编码的515F/806R PCR引物，扩增16S rRNA基因的V4高变区。扩增的产物通过Illumina或其他的测序平台进行高通量测序。
更进一步地，土壤中的微生物菌群包括光合菌、硝化细菌、乳酸菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌、酵母菌、芽孢杆菌、木霉菌、黑曲霉菌、放线菌、解钾菌、解磷菌、固氮菌。
更进一步地，16S rRNA的微生物基因序列数据库的构建方法为：通过对公共数据库(RDP、SILVA、GreenGene、UNITE等)中细菌遗传信息筛选选择土壤样本中常见几百种菌株的约1.8kb大小的16S rRNA基因的DNA序列，数据库中包括菌株的详细系统分类名称和DNA序列信息。
更进一步地，土壤微生物数据库的建立方法为通过高通量16S rRNA基因测序获得某一地区的大量土壤样本中微生物组成分布比例信息，如图2所示。
更进一步地，所述的发酵基质包括无毒植物块、茎、果实，包括蔬菜、水果、根茎、菌类植物、子实体及本草类，发酵基质要经过洗净、切块/粉碎(长度<1.5cm)并去除杂质(铁丝、石块、塑料、泥块、肉类、油类等)。
更进一步地，发酵基质中包括70％的水和5～8％的蔗糖，质量分数。
更进一步地，所述的蔗糖是一种没有经过高度精炼的、带蜜成型的、颜色比较深的甘蔗成品糖，主要是指黑糖和红糖。
更进一步地，步骤(5)中发酵过程为：在25～30℃的温度下发酵，活性复合微生物进行营养和繁殖，发酵7d后，没有大量气体产生时，密封发酵罐，以便杀灭病原菌、虫卵等，为了提高无害化处理程度，这个阶段至少保持15-20d；在这个阶段由于温度上升，水分有所减少。发酵过程继续，并逐渐转化为比较稳定的微生态产品(即本发明中的生物肥料的主要成分)。当温度稳定后，且pH到达或接近5.0时显示发酵成熟，并冷却；发酵结束，过滤分离得到固态型和液态型两种微生态产品，即为本发明中的微生物肥料。经检测，上述固态型微生态产品呈黄色，松软；液态型微生态产品呈棕黄色；pH 5.0-7.5，12个月内各种配方菌总含量≥109cfu/g(mL)，符合标准。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明通过对土壤样本的微生物菌群进行生物信息分析，优化和制定具有针对性的活性复合微生物菌剂配方，利用该菌剂配方对天然植物类进行发酵，在个性化构建的活性复合微生物菌剂的作用下，对植物成分持续发酵升温，杀灭有害病原体的同时，使植物成分充分分解后腐熟，得到优质的个性化活性复合微生物菌剂及其衍生物；本发明的特点在于通过复合微生物发酵，能够提高产品的稳定性，免去添加任何化学试剂等危害；发酵制备过程中能够促进物质的代谢反应，大量产生和积累初级及次级代谢(衍生)产物，生成低聚糖、糖醇、酶类、低聚肽等多种有益成分；同时，保留自身多样性的共生菌群的功能；这些有益成分可以促进有益菌群的增殖，抑制有害菌群的繁殖及腐败物质形成，起到调节菌群平衡、增强免疫、延缓衰竭等作用，对个体有多种有益功效。
(2)本发明采用来自于大自然环境的天然多种活性复合微生物菌种及多样化组成(根据生物信息分析结果)，对多种类天然植物进行长期稳定的发酵，能够使发酵过程更为充分，使天然植物中包含的丰富营养成分的代谢更为完全，产生更多的营养成分及微生物的衍生物，并能充分地保护有益的天然多种菌种的原有功能。
(3)本发明通过结合当前最前沿的生物信息技术，解决了传统单一的生产工艺，过滤分离后分别得到固态和液态微生物肥料，使资源进一步得到优化和良性循环，在现代农业领域中得到充分地精准应用，填补产业空白，极大地符合我国国情，应用前景广阔。
(4)本发明在发酵制备过程中能够促进物质的代谢反应，大量产生和积累初级及次级代谢(衍生)产物，生成低聚糖、糖醇、酶类、低聚肽等多种有益成分；同时，保留自身多样性的共生菌群的功能；这些有益成分可以促进有益菌群的增殖，抑制有害菌群的繁殖及腐败物质形成，起到调节土壤菌群平衡、增强农作物个体免疫、延缓衰竭等作用，对农作物有多种有益功效。
附图说明
图1为本发明中微生物有机肥料制备方法概要图；
图2为本发明中构建土壤微生物数据库的流程示意图；
图3为本发明中制定微生物肥料动态菌剂配方的流程示意图。
具体实施方式
为了对本发明作进一步的阐述，列举下面的个别实施案例。同时郑重声明：这些所述案例不以任何方式限制本发明的范围，本发明不仅仅局限于所述这些实例，在权利要求的范围内所做出的某些改变和调整也应属于本发明的范围。
实施例1
浙江宁波的某客户提供了土壤样品，需要定制符合其土壤需求的生物肥料。首先，构建宁波地区的土壤微生物数据库，通过高通量16S rRNA基因测序获得该区域内300份土壤样本中微生物组成分布比例信息(流程如图1和2所示)，然后按照下述方法确定生物肥料动态菌剂配方(如图3所示)：
(1)土壤样本处理：采用微珠打碎法抽提并纯化样本中的微生物DNA，采用515F/806RPCR引物对微生物DNA的16S rRNA基因的V4高变区进行扩增；515F/806R PCR引物为515F：GTGCCAGCMGCCGCGGTAA，806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。
(2)测定土壤中微生物总量：提取土壤中微生物的总DNA，然后以16S rRNA作为目标序列，使用515F/806R PCR引物进行绝对定量，以大肠杆菌作为标准品，梯度为106，5×106，107，5×107，108，5×108，109cfu/g；该土壤样本中总微生物含量为2×108cfu/g。
(3)鉴定土壤中不同微生物菌群比例：通过高通量基因测序技术对扩增的产物进行测序，对测序结果进行分析评估，将测序结果与16S rRNA的微生物基因序列数据库进行对比(16SrRNA的微生物基因序列数据库的构建方法为：通过对公共数据库(RDP、SILVA、GreenGene、UNITE等)中细菌遗传信息筛选选择土壤样本中常见几百种菌株的约1.8kb大小的16S rRNA基因的DNA序列，数据库中包括菌株的详细系统分类名称和DNA序列信息)，确定土壤样本中不同活性微生物菌群的相对含量和比例；经测序，确定该土壤样本中含芽孢杆菌4×106cfu/g，放线菌4×107cfu/g，绿脓杆菌2×107cfu/g，根瘤菌1×104cfu/g，光合菌1×104cfu/g等，绿脓杆菌是土壤中常见菌，但不是肥料用菌，所以在制定菌剂配方时不考虑。
(4)确定菌剂配方：将测定的微生物菌群含量与数据库中该微生物菌群的含量分布进行比较(土壤微生物数据库的建立方法为通过高通量16S rRNA基因测序获得某一地区的大量土壤样本中微生物组成分布比例信息，如图2所示)，相对含量≤25％，则提供的菌剂配方中该微生物菌群的活性含量不低于5×109cfu/g(mL)；若相对含量＞25％，则提供的菌剂配方中该微生物菌群的活性含量不低于1×109cfu/g(mL)；
该地区不同土壤样本中芽孢杆菌含量≤25％为2.2×106cfu/g(25％的临界值，下同)，根瘤菌含量≤25％为5.6×103cfu/g，光合菌含量≤25％为8×103cfu/g，放线菌≤25％为5×107cfu/g。
根据生物信息分析的结果，按一定比例，组成适合该客户的多种天然微生物活性菌群：光合菌3.0×109cfu/g(mL)，放线菌1.5×1010cfu/g(mL)，芽孢杆菌1.5×109cfu/g(mL)，根瘤菌1×109cfu/g，土壤中乳酸菌含量较少，为了增强本发明中最后得到的微生物肥料的效果，因此在依据土壤中测定的微生物活性菌群种类和含量的基础之上，增加一些非细菌类(如木霉、黑曲、酵母)作为本发明配方中额外的基本成分，乳酸菌：5.0×109cfu/g(mL)，木霉菌1.0×109cfu/g(mL)，黑曲霉菌1.2×109cfu/g(mL)，酵母菌：2.0×109cfu/g(mL)。
根据生物信息分析的结果，取新鲜不同种类的天然植物：圆白菜、芹菜、冬瓜、菠萝、丰水梨、西红柿、甘蔗、西瓜各l0kg，分别洗净、切块/粉碎(长度<1.5cm)并去除杂质(铁丝、石块、塑料、泥块、肉类、油类等)后存放；按比例3：10(植物：水)加入洁净泉水和/或洁净自来水(如有漂白剂气味，需放置一段时间或不用)稀释调浆；然后，在浆液中添加5～8％(优选加入8％)的蔗糖，搅拌均匀；再以1:500稀释以上所述天然微生物活性菌群后加入，搅拌后转移至发酵车间进行主发酵，温度25-30℃，发酵7d后，可以密封发酵罐，以便杀灭病原菌、虫卵等；这个阶段至少要保持15-20d(本实施例中保持20d)。在这个阶段由于温度上升，水分有所减少。发酵过程继续，当温度稳定后，PH到达或接近5.0时显示发酵成熟，冷却；
发酵结束后，将发酵液混匀l0min，然后采用过滤机进行过滤分离，得到固态型和液态型两种微生态产品，即为本发明中的微生物肥料，利用检测平台检测其活性复合微生物菌种的比例及调配至设计标准(光合菌：放线菌：芽孢杆菌：根瘤菌：木霉菌：黑曲霉菌：乳酸菌：酵母菌＝3：15：1.5：1：1：1.2：5：2)。优选，将微生态活性复合微生物菌种及其衍生物产品按生产工艺灌装、封盖，得到个性化微生态生物产品(生物肥料)成品，贮藏在无阳光直射、阴凉通风处。经检测，上述固态型微生态产品呈黄色，松软；液态型微生态产品呈棕黄色；pH 5.0-7.5，12个月内各种配方菌总含量≥109cfu/g(mL)，符合标准。
实施例2
宁夏中宁地区的客户提供了土壤样品，需要定制符合其土壤需求的生物肥料。首先，构建宁夏中宁地区的土壤微生物数据库，通过高通量16S rRNA基因测序获得该区域内200份土壤样本中微生物组成分布比例信息，
然后按照下述方法确定生物肥料动态菌剂配方：
(1)土壤样本处理：采用微珠打碎法抽提并纯化样本中的微生物DNA，采用515F/806RPCR引物对微生物DNA的16S rRNA基因的V4高变区进行扩增；515F/806R PCR引物为515F：GTGCCAGCMGCCGCGGTAA，806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。
(2)测定土壤中微生物总量：提取土壤中微生物的总DNA，然后以16S rRNA作为目标序列，使用515F/806R PCR引物进行绝对定量，以大肠杆菌作为标准品，梯度为106，5×106，107，5×107，108，5×108，109cfu/g；该土壤样本中总微生物含量为1.2×108cfu/g。
(3)鉴定土壤中不同微生物菌群比例：通过高通量基因测序技术对扩增的产物进行测序，对测序结果进行分析评估，将测序结果与16S rRNA的微生物基因序列数据库进行对比，确定土壤样本中不同活性微生物菌群的相对含量和比例；经测序，确定该土壤样本中含芽孢杆菌1×106cfu/g，放线菌5×107cfu/g，绿脓杆菌2.5×107cfu/g，硝化细菌1.2×104cfu/g，光合菌1×104cfu/g等。该地区不同土壤样本中芽孢杆菌含量≤25％为2×106cfu/g(25％的临界值，下同)，放线菌含量≤25％为4×107cfu/g，硝化细菌含量≤25％为6×104cfu/g，光合菌含量≤25％为5×103cfu/g。
根据生物信息分析的结果，按一定比例，组成适合该客户的多种天然微生物活性菌群(光合菌3.0×109cfu/g(mL)，放线菌1.0×109cfu/g(mL)，芽孢杆菌为1.0×1010cfu/g(mL)，硝化细菌1.8×1010cfu/g和乳酸菌：5.0×109cfu/g(mL)。再加入木霉菌1.1×109cfu/g(mL)，黑曲霉菌1.0×109cfu/g(mL)和酵母菌：1.0×109cfu/g(mL)。
根据生物信息分析的结果，取新鲜不同种类的无毒植物：哈木瓜、圆白菜、秸秆、冬瓜、菠萝、甘蔗、西瓜各l0kg，分别洗净、切块/粉碎(长度<1.5cm)并去除杂质(铁丝、石块、塑料、泥块、肉类、油类等)后存放；按比例3：10(植物：水)加入洁净泉水或自来水(如有漂白剂气味，需放置一段时间或不用)稀释调浆；然后，在浆液中添加5～8％(优选加入5％)的蔗糖，搅拌均匀；再以1:500稀释以上所述天然微生物活性菌群后加入，搅拌后转移至发酵车间进行主发酵，温度25-30℃，发酵7d后，可以密封发酵罐，以便杀灭病原菌、虫卵等；这个阶段至少要保持15-20d(本实施例中保持18d)。在这个阶段由于温度上升，水分有所减少。发酵过程继续，当温度稳定后，PH到达或接近5.0时显示发酵成熟，冷却；
发酵结束后，将发酵液混匀12min，然后采用过滤机进行过滤分离，得到固态型和液态型两种微生态产品，即为本发明中的微生物肥料；利用检测平台检测其活性复合微生物菌种的比例及调配至设计标准(光合菌：放线菌：芽孢杆菌：硝化细菌：木霉菌：黑曲霉菌：乳酸菌：酵母菌＝3：1：10：18：1.1：1：5：1)，优选，将微生态活性复合微生物菌种及其衍生物产品按生产工艺灌装、封盖，得到个性化微生态生物产品(土壤改良)成品，贮藏在无阳光直射、阴凉通风处。经检测，上述固态型微生态产品呈黄色，松软；液态型微生态产品呈棕黄色；pH 5.0-7.5，12个月内各种配方菌总含量≥109cfu/g(mL)，符合标准。
实施例3
江苏某地区的客户提供种植葡萄生长的土壤样品，定制符合其土壤需求的有机肥料微生态。1，建立该地区的土壤微生物数据库，通过高通量16S rRNA基因测序获得该区域内260份土壤样本中微生物组成分布比例信息。2，按照下述方法确定微生物肥料个性化菌剂配方：
(1)土壤样本处理：采用微珠打碎法抽提并纯化样本中的微生物DNA，采用515F/806RPCR引物对微生物DNA的16S rRNA基因的V4高变区进行扩增；515F/806R PCR引物为515F：GTGCCAGCMGCCGCGGTAA，806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。
(2)测定土壤中微生物总量：提取土壤中微生物的总DNA，然后以16S rRNA作为目标序列，使用515F/806R PCR引物进行绝对定量，以大肠杆菌作为标准品，梯度为106，5×106，107，5×107，108，5×108，109cfu/g；该土壤样本中总微生物含量为1.4×108cfu/g。
(3)鉴定土壤中不同微生物菌群比例：通过高通量基因测序技术对扩增的产物进行测序，对测序结果进行分析评估，将测序结果与16S rRNA的微生物基因序列数据库进行对比，确定土壤样本中不同活性微生物菌群的相对含量和比例；该土壤样本中含芽孢杆菌4.3×106cfu/g，放线菌4.1×107cfu/g，绿脓杆菌3×107cfu/g，根瘤菌2.1×104cfu/g，光合菌7×103cfu/g等。
(4)确定菌剂配方：若测定的微生物菌群含量与数据库中该微生物菌群的含量分布进行比较，相对含量≤25％，则提供的菌剂配方中该微生物菌群的活性含量不低于5×109cfu/g(mL)；若相对含量＞25％，则提供的菌剂配方中该微生物菌群的活性含量不低于1×109cfu/g(mL)；
该地区不同土壤样本中芽孢杆菌含量≤25％为2.2×106cfu/g(25％的临界值，下同)，根瘤菌含量≤25％为5.6×103cfu/g，光合菌含量≤25％为8×103cfu/g，放线菌≤25％为5×107cfu/g。
根据生物信息分析的结果，按一定比例，组成多种天然微生物活性菌群：光合菌1.5×1010cfu/g(mL)，放线菌1.0×1010cfu/g(mL)，芽孢杆菌2.8×109cfu/g(mL)，根瘤菌1.0×109cfu/g(mL)，和乳酸菌：6.0×109cfu/g(mL)。再加入黑曲霉菌2.2×109cfu/g(mL)，酵母菌：3.0×109cfu/g(mL)。
根据生物信息分析的结果，取新鲜不同种类的天然植物：圆白菜、芹菜、冬瓜、秸秆、西红柿、甘蔗、西瓜各l0kg，分别洗净、切块/粉碎(长度<1.5cm)并去除杂质(铁丝、石块、塑料、泥块、肉类、油类等)后存放；按比例3：10(植物：水)加入洁净泉水和/或洁净自来水(如有漂白剂气味，需放置一段时间或不用)稀释调浆；然后，在浆液中添加5～8％(优选加入6％)的蔗糖，搅拌均匀；再以1:500稀释以上所述天然微生物活性菌群后加入，搅拌后转移至发酵车间进行主发酵，温度25-30℃，发酵7d后，可以密封发酵罐，以便杀灭病原菌、虫卵等；这个阶段至少要保持15-20d(本实施例中保持15d)。在这个阶段由于温度上升，水分有所减少。发酵过程继续，当温度稳定后，PH到达或接近5.0时显示发酵成熟，冷却；
发酵结束后，将发酵液混匀l0min，然后采用过滤机进行过滤分离，得到固态型和液态型两种微生态产品，即为本发明中的微生物肥料；利用检测平台检测其活性复合微生物菌种的比例及调配至设计标准(光合菌：放线菌：芽孢杆菌：根瘤菌：乳酸菌：黑曲霉菌：酵母菌＝15：10：2.8：1.0：6.0：2.2：3.0)。优选，将微生态活性复合微生物菌种及其衍生物产品按生产工艺灌装、封盖，得到个性化微生态生物产品(生物肥料)成品，贮藏在无阳光直射、阴凉通风处。经检测，上述固态型微生态产品呈黄色，松软；液态型微生态产品呈棕黄色；pH 5.0-7.5，12个月内各种配方菌总含量≥109cfu/g(mL)，符合标准。

Claims (10)

1.一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，包括以下步骤：
(1)土壤样本处理：抽提并纯化样本中的微生物DNA，采用515F/806R PCR引物对微生物DNA的16S rRNA基因的V4高变区进行扩增；
(2)测定土壤中微生物总量：提取土壤中微生物的总DNA，然后以16S rRNA作为目标序列，使用515F/806R PCR引物进行绝对定量，以大肠杆菌作为标准品；
(3)鉴定土壤中不同微生物菌群比例：通过高通量基因测序技术对扩增的产物进行测序，对测序结果进行分析评估，将测序结果与16S rRNA的微生物基因序列数据库进行对比，确定土壤样本中不同活性微生物菌群的相对含量和比例；
(4)确定菌剂配方：将测定的微生物菌群含量与该地区土壤微生物数据库中该微生物菌群的含量分布进行比较，若相对含量≤25％，则提供的菌剂配方中该微生物菌群的活性含量不低于5×109cfu/g(mL)；若相对含量＞25％，则提供的菌剂配方中该微生物菌群的活性含量不低于1×109cfu/g(mL)；
(5)微生物肥料发酵：将步骤(4)中确定的菌剂配方与发酵基质进行混合发酵，当发酵基质的pH值到达或接近5.0时，则发酵成熟。
2.根据权利要求1所述的一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，其特征在于：所述的步骤(1)中采用微珠打碎和/或超声的方法来提取样本中的微生物DNA。
3.根据权利要求1或2所述的一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，其特征在于：所述的步骤(1)中采用的515F/806RPCR引物为515F-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA，806R-GGACTACHVGGGTWTCTAAT。
4.根据权利要求1所述的一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，其特征在于：土壤中的微生物菌群包括光合菌、硝化细菌、乳酸菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌、酵母菌、芽孢杆菌、木霉菌、黑曲霉菌、放线菌、解钾菌、解磷菌、固氮菌。
5.根据权利要求1所述的一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，其特征在于：16SrRNA的微生物基因序列数据库的构建方法为通过公共数据库选择土壤样本中常见几百种菌株的名称和其约1.8kb大小的16SrRNA基因的DNA序列，数据库中包括菌株的详细系统分类名称和DNA序列信息，公共数据库包括RDP、SILVA、GreenGene、UNITE。
6.根据权利要求4所述的一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，其特征在于：土壤微生物数据库的建立方法为：通过高通量测序获得某一地区的大量土壤样本中微生物组成分布比例信息。
7.根据权利要求1或4所述的一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，其特征在于：所述的发酵基质包括无毒植物块、茎、果实，包括蔬菜、水果、根茎、菌类植物、子实体及本草类。
8.根据权利要求7所述的一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，其特征在于：发酵基质中包括70％的水和5～8％的蔗糖，质量分数。
9.根据权利要求8所述的一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，其特征在于：所述的蔗糖是一种没有经过高度精炼的、带蜜成型的、颜色比较深的甘蔗成品糖，主要是指黑糖和红糖。
10.根据权利要求7或8所述的一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，其特征在于：步骤(5)中发酵过程为：在25～30℃的温度下发酵7d后，没有大量气体产生时，密封发酵罐至少保持15-20d；当温度稳定后，且pH到达或接近5.0时显示发酵成熟，并冷却；发酵结束，过滤分离后分别得到固态和液态微生物肥料。
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