CN111205994B - 一株具核梭杆菌动物亚种菌株及其应用 - Google Patents

一株具核梭杆菌动物亚种菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株分离自人类直肠癌肿瘤组织的具核梭杆菌动物亚种菌株THCT5A4，分类命名为Fusobacterium nucleatum subsp.animalis THCT5A4，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019366，保藏日期为2019年05月17日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，其16SrRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供了该具核梭杆菌动物亚种菌株的分离方法。结直肠癌细胞系与THCT5A4共培养的结果说明THCT5A4可显著促进结直肠癌细胞增殖，因此THCT5A4可为结直肠癌的研究提供多样性的体外或体内模拟肠道环境的实验条件，还可以构建结直肠癌疾病模型来筛选治疗结直肠癌的药物。

Description

一株具核梭杆菌动物亚种菌株及其应用
技术领域
本发明涉及具核梭杆菌动物亚种领域，具体涉及一株具核梭杆菌动物亚种菌株及其应用。
背景技术
结直肠癌是临床常见恶性肿瘤。世界卫生组织据2012年全球癌症病例数据指出，全部恶性肿瘤中，结直肠癌发病率在全球女性中高居第二位，男性中居第三位；总体死亡率居癌症死亡原因第四位。
研究发现肠道菌群失调与结直肠癌的发生发展具有相关性。一些细菌，如牛链球菌、幽门螺旋杆菌、脆弱拟杆菌、粪肠球菌、败毒梭菌、具核梭杆菌、大肠杆菌等，都被发现与结直肠癌的发生发展呈现显著的相关性。其中，具核梭杆菌 (Fusobacteriumnucleatum)被认为是一种重要的“促癌菌”。具核梭杆菌是人类共生菌，为革兰阴性专性厌氧菌，通常定植在口腔中；同时也是一种条件致病菌，参与牙周疾病的炎症反应，常在龈下菌斑中分离得到，是在牙周病中起主导作用的微生物。而近期研究发现结直肠癌患者的肿瘤组织及粪便中，具核梭杆菌的丰度显著升高，其可经TLR4上调NF-κB和miR-21，促进结直肠癌细胞增殖和癌症发展，亦有研究发现其通过激活肿瘤细胞自噬而导致结直肠癌化疗耐药。
目前普遍用于结直肠癌研究的具核梭杆菌菌株为ATCC 25586和ATCC 23726，但是它们并非来自人类肿瘤组织，而是分离自口腔(ATCC 25586)或阴道(ATCC 23726)。此外，这两株菌属于具核梭杆菌的具核亚种(F.nucleatum subsp. nucleatum)，但已有研究指出在结直肠癌患者肠道的具核梭杆菌中丰度占优的是动物亚种(F.nucleatumsubsp.animalis)。因此，目前用于结直肠癌研究的菌株可能无法反映肠道中具核梭杆菌的实际生物学特性。而结直肠癌肿瘤中分离培养的具核梭杆菌，尤其是动物亚种，鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一株具核梭杆菌动物亚种菌株及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面是提供一株分离自人类直肠癌肿瘤组织的具核梭杆菌动物亚种菌株THCT5A4，该菌株的16SrRNA基因序列如下所示：
>16S_rRNA_gene THCT5A4[CCTCC M 2019366]
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGACAGAATGCTTAACACATGC AAGTCAACTTGAATTTGGGTTTTTAACTTAGATTTGGGTGGCGGACGGGTG AGTAACGCGTAAAGAACTTGCCTCACAGCTAGGGACAACATTTAGAAATG AATGCTAATACCTGATATTATGATTTTAAGGCATCTTAGAATTATGAAAGCTA TATGCACTGTGAGAGAGCTTTGCGTCCCATTAGCTAGTTGGAGAGGTAACA GCTCACCAAGGCGATGATGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCACA AGGGGACTGAGACACGGCCCTTACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAAT ATTGGACAATGGACCGGGAGTCTGATCCAGCAATTCTGTGTGCACGATGAA GTTTTTCGGAATGTAAAGTGCTTTCAGTTGGGAAGAAAGAAATGACGGTAC CAACAGAAGAAGTGACGGCTAAATACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGT ATGTCACGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGCGTCTAGGTGGTT ATGTAAGTCTGATGTGAAAATGCAGGGCTCAACTCTGTATTGCGTTGGAAA CTGTATAACTAGAGTACTGGAGAGGTAAGCGGAACTACAAGTGTAGAGGTG AAATTCGTAGATATTTGTAGGAATGCCGATGGGGAAGCCAGCTTACTGGAC AGATACTGACGCTAAAGCGCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATA CCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGATTACTAGGTGTTGGGGGTCGAACCTCAGCGCCCAAGCAAACGCGATAAGTAATCCGCCTGGGGAGTACGTACG CAAGTATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGC ATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGAGGAACCTTACCAGCGTTTGACATCTTAGGAATGAGATAGAGATATTTCAGTGTCCCTTCGGGGAAACCTAAAGACA GGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCC CGCAACGAGCGCAACCCCTTTCGTATGTTACCATCATTAAGTTGGGGACTCA TGCGATACTGCCTACGATGAGTAGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCA TCATGCCCCTTATACGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGTAGAACAGA GAGTTGCAAAGCCGTGAGGTGAAGCTAATCTCAGAAAACTATTCTTAGTTC GGATTGTACTCTGCAACTCGAGTACATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGC GAATCAGCAATGTCGCGGTGAATACGTTCTCGGGTCTTGTACACACCGCCC GTCACACCACGAGAGTTGGTTGCACCTGAAGTAGCAGGCCTAACCGTAAG GAGGGATGCTCCGAGGGTGTGATTAGCGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAG GTATCCGTACGGGAACGTGCGGATGGATCACCT(SEQ ID NO:1)。
进一步地，该菌株分类命名为Fusobacterium nucleatum subsp.animalisTHCT5A4，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019366，保藏日期为2019年05月 17日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉市武汉大学。
进一步地，该菌株在哥伦比亚培养基上培养7天后，形成相对较小、圆形、边缘不规则、半透明白色菌落。
进一步地，该菌株经革兰染色后镜下呈红色、梭杆状，多呈线性排布。
本发明的第二方面是提供一种上述菌株的分离方法，具体步骤如下：
步骤一，从直肠癌手术切除标本上取1-2mm3肿瘤组织块，置于无菌管中，在厌氧条件下，4℃转运、保存；
步骤二，4小时内进行细菌分离操作，将组织块置于500μL培养基中，迅速机械打碎，使用同一培养基梯度稀释100倍，取100μL稀释液涂布于哥伦比亚血平板上，37℃厌氧培养48小时；
步骤三，从平板上挑取单菌落在哥伦比亚血平板上划线稀释，37℃厌氧培养48小时，从中挑取单菌落重复以上步骤，分离纯化菌株；
步骤四，将再次获得的单菌落在哥伦比亚血平板上涂布扩培，37℃厌氧培养48小时，刮下菌苔重悬浮于中含10％-20％甘油的脑心浸液肉汤培养基中，-80℃冻存保种，同时，收集菌体进行16SrRNA基因扩增测序，鉴定菌种。
进一步地，步骤二所述的培养基为含0.05％半胱氨酸的胰酶大豆汤培养基。
本发明的第三方面是提供一种该具核梭杆菌动物亚种菌株在构建体外或体内模拟肠道环境的实验条件中的应用。
本发明的第四方面是提供一种该具核梭杆菌动物亚种菌株在筛选治疗结直肠癌药物中的应用。
进一步地，结直肠癌细胞系为HCT116细胞系或LoVo细胞系。
本发明提供的具核梭杆菌动物亚种菌株THCT5A4显著促进结直肠癌肿瘤细胞系的增殖，因此THCT5A4可为结直肠癌的研究提供多样性的体外或体内模拟肠道环境的实验条件，从而建立结直肠癌的疾病模型来筛选药物或者制备药物。
附图说明
本发明的公开的一株具核梭杆菌动物亚种菌株THCT5A4，其已进行保藏，分类命名为Fusobacterium nucleatum subsp.animalis THCT5A4，其保藏编号为 CCTCC NO：M2019366，保藏日期为2019年05月17日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉市武汉大学。
图1为本发明一实施例中HCT116细胞系与THCT5A4共培养后的增殖情况表示图(其中，左图为HCT116细胞生长曲线；中图为共培养24小时增殖情况比较(双尾t检验p<0.01)；右图为共培养72小时增殖情况比较(双尾t检验 p<0.01))；
图2为本发明一实施例中LoVo细胞系与THCT5A4共培养后的增殖情况表示图(其中，左图为LoVo细胞生长曲线；右图为共培养72小时增殖情况比较 (双尾t检验p<0.01))。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
一株分离自人类直肠癌肿瘤组织的具核梭杆菌动物亚种菌株THCT5A4，现已被保藏，分类命名为Fusobacterium nucleatum subsp.animalis THCT5A4，其保藏编号为CCTCCNO：M 2019366，保藏日期为2019年05月17日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
该菌株的16SrRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示，其与F.nucleatum subsp.animalis菌株JCM 11025的16SrRNA基因序列(NCBI登录号NR_113378.1)有 99.80％一致性，与F.nucleatum subsp.nucleatum菌株ATCC 25586的16SrRNA 基因序列(NCBI登录号NR_114702.1)有98.38％一致性。
测定该菌株完整基因组，发现该菌株基因组包含一条环状染色体，大小为2490990bp，GC含量为27.07％，含有2356个蛋白编码基因、64个非编码基因 (46个tRNA基因、5套5S-16S-23SrRNA基因和3个sRNA基因)。经Jspecies 软件分析其相对F.nucleatumsubsp.nucleatum菌株ATCC 25586(NCBI基因组登录号：GCA_003019295.1)的全基因组ANIb值为91.06，相对F.nucleatum subsp. animalis菌株7_1(NCBI基因组登录号：GCA_000158275.2)的全基因组ANIb 值为96.9，说明其属于动物(animalis)亚种。ANIb，即average nucleotide identity using BLAST(基于BLAST的平均核苷酸序列一致性)，是一种评价菌株亲缘性的指标，一般认为≥95即同属一种(species)。
实施例一
分离具核梭杆菌动物亚种菌株THCT5A4，具体步骤如下：
步骤一，从直肠癌手术切除标本上取1-2mm3肿瘤组织块，置于无菌管中，在厌氧条件下，4℃转运、保存；
步骤二，4小时内进行细菌分离操作，将组织块置于500μL含0.05％半胱氨酸的胰酶大豆肉汤培养基中，迅速机械打碎，使用同一培养基梯度稀释100倍，取100μL稀释液涂布于哥伦比亚血平板上，37℃厌氧培养48小时；
步骤三，从平板上挑取单菌落在哥伦比亚血平板上划线稀释，37℃厌氧培养48小时，从中挑取单菌落重复以上步骤，分离纯化菌株；
步骤四，将再次获得的单菌落在哥伦比亚血平板上涂布扩培，37℃厌氧培养48小时，刮下菌苔重悬浮于中含10％-20％甘油的脑心浸液肉汤培养基中，-80℃冻存保种，同时，收集菌体进行16SrRNA基因扩增测序，鉴定菌种。
实施例二
THCT5A4与结直肠癌HCT116细胞系共培养，具体的操作步骤如下：
取已培养的HCT116细胞，用胰酶消化制备细胞悬液，进行细胞计数接种至 24孔板(1×105个细胞/孔)，接种后培养12-24小时至细胞贴壁。贴壁后用PBS 洗涤并更换无抗培养基。实验组加入新鲜制备的THCT5A4细菌悬浮液，1×108 CFU/孔(使用PBS悬浮细菌)；对照组加入等体积PBS。每组分别做3个重复孔，放于正常条件下培养。分别在培养至6小时、24小时、48小时采用CCK8法，按说明书给定步骤进行检测细胞增殖活性。其中每隔24小时，更换一次细菌悬浮液。
结果(图1)表明，THCT5A4可显著促进HCT116细胞增殖，在24小时和 48小时的增殖活性显著高于对照组(均p<0.01)。
实施例三
THCT5A4与结直肠癌LoVo细胞系共培养，具体的操作步骤如下：
胰酶消化制备已培养的LoVo细胞悬液，计数后接种至24孔板(1×105个细胞/孔)，培养12-24小时直至细胞贴壁。贴壁后用PBS洗涤并更换无抗培养基。新鲜制备的THCT5A4细菌，并用PBS悬浮，细菌悬浮液加入实验组(1×108CFU/ 孔)；对照组加入等体积PBS。每组分别做3个重复孔。放于常规条件下培养。分别在培养至6小时、24小时、48小时、72小时采用CCK8法检测细胞增殖活性。其中每隔24小时，更换一次细菌悬浮液。
由图2可知LoVo细胞在72小时的增殖活性显著高于对照组(p<0.01)，说明THCT5A4可显著促进LoVo细胞增殖。
综上所述，本发明提供的具核梭杆菌动物亚种菌株THCT5A4显著促进结直肠癌肿瘤细胞系的增殖，因此THCT5A4可为结直肠癌的研究提供多样性的体外或体内模拟肠道环境的实验条件，从而建立结直肠癌的疾病模型来筛选药物或者制备药物。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海市第十人民医院
<120> 一株具核梭杆菌动物亚种菌株及其在结直肠癌研究中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1507
<212> DNA
<213> 16S_rRNA_gene THCT5A4[CCTCC M 2019366]
<400> 1
agagtttgat cctggctcag gatgaacgct gacagaatgc ttaacacatg caagtcaact 60
tgaatttggg tttttaactt agatttgggt ggcggacggg tgagtaacgc gtaaagaact 120
tgcctcacag ctagggacaa catttagaaa tgaatgctaa tacctgatat tatgatttta 180
aggcatctta gaattatgaa agctatatgc actgtgagag agctttgcgt cccattagct 240
agttggagag gtaacagctc accaaggcga tgatgggtag ccggcctgag agggtgaacg 300
gccacaaggg gactgagaca cggcccttac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg 360
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taatccgcct ggggagtacg tacgcaagta tgaaactcaa aggaattgac ggggacccgc 900
acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga cgcaacgcga ggaaccttac cagcgtttga 960
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acccctttcg tatgttacca tcattaagtt ggggactcat gcgatactgc ctacgatgag 1140
taggaggaag gtggggatga cgtcaagtca tcatgcccct tatacgctgg gctacacacg 1200
tgctacaatg ggtagaacag agagttgcaa agccgtgagg tgaagctaat ctcagaaaac 1260
tattcttagt tcggattgta ctctgcaact cgagtacatg aagttggaat cgctagtaat 1320
cgcgaatcag caatgtcgcg gtgaatacgt tctcgggtct tgtacacacc gcccgtcaca 1380
ccacgagagt tggttgcacc tgaagtagca ggcctaaccg taaggaggga tgctccgagg 1440
gtgtgattag cgattggggt gaagtcgtaa caaggtatcc gtacgggaac gtgcggatgg 1500
atcacct 1507

Claims (3)

1.一株分离自人类直肠癌肿瘤组织的具核梭杆菌动物亚种（Fusobacteriumnucleatumsubsp.animalis）菌株THCT5A4，其特征在于，所述具核梭杆菌动物亚种菌株THCT5A4的16SrRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示；所述具核梭杆菌动物亚种菌株THCT5A4的保藏编号为CCTCC NO：M 2019366，保藏日期为2019年05月17日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
2.一种如权利要求1所述的具核梭杆菌动物亚种菌株THCT5A4在构建体外或体内模拟肠道环境的实验条件中的应用。
3.一种如权利要求1所述的具核梭杆菌动物亚种菌株THCT5A4在筛选治疗结直肠癌药物中的应用。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110903997B (zh) * 2019-10-23 2021-11-23 上海市第十人民医院 一株从大肠癌肿瘤组织中获取的具核梭杆菌及其应用
CN111004738B (zh) * 2019-10-23 2021-09-21 上海市第十人民医院 一株具核梭杆菌多形亚种分离株及其应用
CN110903999B (zh) * 2019-10-23 2021-11-23 上海市第十人民医院 一株人类肠道分离的具核梭杆菌动物亚种菌株及其应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105473738A (zh) * 2013-08-06 2016-04-06 深圳华大基因科技有限公司 结直肠癌生物标志物
CN106573044A (zh) * 2014-08-05 2017-04-19 深圳华大基因科技有限公司 真杆菌属在预防和治疗结直肠癌相关疾病中的用途
JP2017140005A (ja) * 2016-02-12 2017-08-17 国立大学法人山口大学 大腸腫瘍の有無の予測を補助する方法
CN108660182A (zh) * 2018-05-22 2018-10-16 江南大学 一种分离筛选人体肠道中发酵乳杆菌的培养基及其应用
CN110903998A (zh) * 2019-10-23 2020-03-24 上海市第十人民医院 一株肠道分离的具核梭杆菌文氏亚种菌株及其应用
CN110903999A (zh) * 2019-10-23 2020-03-24 上海市第十人民医院 一株人类肠道分离的具核梭杆菌动物亚种菌株及其应用
CN110903997A (zh) * 2019-10-23 2020-03-24 上海市第十人民医院 一株从大肠癌肿瘤组织中获取的具核梭杆菌及其应用
CN111004738A (zh) * 2019-10-23 2020-04-14 上海市第十人民医院 一株具核梭杆菌多形亚种分离株及其应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2440183T3 (pl) * 2009-06-10 2019-01-31 Arbutus Biopharma Corporation Ulepszona formulacja lipidowa
US20140024036A1 (en) * 2012-07-22 2014-01-23 Glc Biotechnology, Inc. Methods and materials for quantification of fusobacterium nucleatum dna in stool to diagnose colorectal neoplasm
CN108690864A (zh) * 2017-10-31 2018-10-23 中山大学 一种粪便样本中菌群稳态评价方法及在结直肠癌筛查中的应用
WO2019117212A1 (ja) * 2017-12-12 2019-06-20 森永乳業株式会社 ビフィドバクテリウム属細菌を有効成分とする組成物
CN109908342B (zh) * 2019-03-08 2022-12-16 上海市第十人民医院 具核梭杆菌作为结直肠癌pd-l1抗体治疗疗效预测的标记物及其应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105473738A (zh) * 2013-08-06 2016-04-06 深圳华大基因科技有限公司 结直肠癌生物标志物
CN106573044A (zh) * 2014-08-05 2017-04-19 深圳华大基因科技有限公司 真杆菌属在预防和治疗结直肠癌相关疾病中的用途
JP2017140005A (ja) * 2016-02-12 2017-08-17 国立大学法人山口大学 大腸腫瘍の有無の予測を補助する方法
CN108660182A (zh) * 2018-05-22 2018-10-16 江南大学 一种分离筛选人体肠道中发酵乳杆菌的培养基及其应用
CN110903998A (zh) * 2019-10-23 2020-03-24 上海市第十人民医院 一株肠道分离的具核梭杆菌文氏亚种菌株及其应用
CN110903999A (zh) * 2019-10-23 2020-03-24 上海市第十人民医院 一株人类肠道分离的具核梭杆菌动物亚种菌株及其应用
CN110903997A (zh) * 2019-10-23 2020-03-24 上海市第十人民医院 一株从大肠癌肿瘤组织中获取的具核梭杆菌及其应用
CN111004738A (zh) * 2019-10-23 2020-04-14 上海市第十人民医院 一株具核梭杆菌多形亚种分离株及其应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Fusobacterium nucleatum subsp. animalis strain JCM 11025 16S ribosomal RNA, partial sequence";Sakamoto,M.等;《GenBank Database》;20190312;Accession No. NR_113378.1 *
Fusobacterium nucleatum Promotes Chemoresistance to Colorectal Cancer by Modulating Autophagy;TaChung Yu等;《Cell》;20170727;第170卷(第3期);第548-563页 *
具核梭杆菌促进大肠癌发生的相关性研究;郭伯敏;《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）医药卫生科技辑》;20170215(第2期);摘要，第2.2.1节, 第2.3节,图3，第4.2.2.1节，第4.4节 *
具核梭杆菌通过下调LCN2促进结直肠癌细胞增殖和迁移;朱畅等;《岭南现代临床外科》;20200821;第20卷(第4期);第411-415页 *
大肠癌和癌旁组织中具核梭杆菌丰度差异的研究;杨垒等;《同济大学学报（医学版）》;20151209;第36卷(第5期);第34-38页 *
肠道菌群结构异常与大肠癌发病风险及预后的相关性研究;高志光;《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）医药卫生科技辑》;20170201(第2期);E072-272页 *

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