CN110857450A - 结直肠癌标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种结直肠癌标志物及其应用。所述标志物包括选自下列中的至少一种：SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5；来源于具核梭杆菌且与所述SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5中的任意一种具有95％以上同源性的核酸序列。同时还提供了引物对、核酸探针、构建体以及试剂盒以及对待测者进行结直肠癌检测的系统。通过本发明提供的标志物可以实现结直肠癌的快速检测。

Description

结直肠癌标志物及其应用

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种结直肠癌生物标志物及其应用，尤其涉及一种结直肠癌标志物、引物对、核酸探针、试剂盒以及结直肠癌的检测方法。

背景技术

据统计，结直肠癌(colorectal cancer，CRC)在各类癌症中发病率排名第三，致死率排名第四，近55％的发病案例发生在较发达国家。在年龄小于40岁的人中发生率较低，但随着年龄增加发生率亦逐渐增高。结直肠癌也是目前最可预防的肿瘤之一，医学界认为如果及早发现，肠癌是最易治愈的癌症。传统的结直肠癌筛选方法主要是结肠镜检查，另外还有活体组织检查和脱落细胞学检查，这几种检查方法都是侵入式的，尤其是脱落细胞学检查取材繁琐，不易获得满意的标本，临床应用少。所以如果没有表现出相关症状，很多人并不愿意去做结直肠癌的早期筛查。

因此，针对结直肠癌的早期诊断和筛查，还需要进一步改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种结直肠癌肿瘤标志物、引物对、试剂盒以及结直肠癌的检测方法。本发明提供的结直肠癌肿瘤标志物能够用于结直肠癌病人的早期筛查和诊断。

本发明是基于发明人的如下发现所获得的：

人体肠道微生物组包含了数量巨大的微生物，它们参与食物药物代谢、人体免疫调节，在保持人体健康中起着极其重要的作用。有大量文献报道具核梭杆菌与结直肠癌有很强的相关性，研究疾病的不同阶段中微生物组成分的改变能够作为一种新的用于癌症诊断及预后效果测试的手段：因此本发明想通过测定肠道中具核梭杆菌的特定基因，来对结直肠癌的发生与发展进行早期检测和及时干预治疗。

本发明在有case-control的人群中对具核梭杆菌的特异性基因进行定量PCR(qPCR)检测，确定基因的量，分析并验证这些基因预测结直肠癌的概率。以开发结直肠癌患者的肠道微生物基因检测试剂盒，为广大人群提供快速简便的结肠癌早期筛查、诊断的有效措施。为实现结直肠癌的早期预警、诊断和干预提供依据。

具体而言，本发明提供了如下技术方案：

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种结直肠癌标志物，所述标志物包括选自下列中的至少一种：SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5，来源于具核梭杆菌且与所述SEQ IDNO:1～SEQ ID NO:5中的任意一种具有95％以上同源性的核酸序列。研究表明，具核梭杆菌与结直肠癌有着很强的相关性，本发明通过利用宏基因组测序研究，筛选了具核梭杆菌中与结直肠癌相关性强的特定核酸序列，作为结直肠癌检测的标志物，能够用于结直肠癌的早期诊断和筛查。所述结直肠癌标志物可以为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5中的任意一种，也可以是来源于具核酸杆菌且与所述SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5中的任意一种具有95％以上同源性的核酸序列，优选为具有99％以上同源性的核酸序列。通过这些标志物可以用来反映结直肠癌的情况。

根据本发明的第二方面，本发明提供了一组引物对，所述引物对能够特异性扩增本发明第一方面所述的标志物中的至少之一，所述引物对选自SEQ ID NO:6～SEQ ID NO:35中的任意一对。其中SEQ ID NO:6～SEQ ID NO:35中每两个相邻编号的核酸序列为一对。通过这些引物对，能够特异性扩增SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5中的任意一种，从而可以用作结直肠癌的早期诊断和检测。

在本发明的一些实施例中，所述引物对SEQ ID NO:6～SEQ ID NO:11中的任意之一能够特异性扩增SEQ ID NO:1；所述引物对SEQ ID NO:12～SEQ ID NO:19中的任意之一能够特异性扩增SEQ ID NO:2；所述引物对SEQ ID NO:20～SEQ ID NO:23中的任意之一能够特异性扩增SEQ ID NO:3；所述引物对SEQ ID NO:24～SEQ ID NO:31中的任意之一能够特异性扩增SEQ ID NO:4；所述引物对SEQ ID NO:32～SEQ ID NO:35中的任意之一能够特异性扩增SEQ ID NO:5。

根据本发明的第三方面，本发明提供了一种核酸探针，所述核酸探针能够特异性捕获本发明第一方面所述的结直肠癌标志物。设计核酸探针捕获本发明所用到的结直肠癌标志物，能够实现结直肠癌的快速检测。

根据本发明的第四方面，本发明提供了一种构建体，所述构建体包括根据本发明第一方面所述的结直肠癌标志物。通过将结直肠癌标志物构建到载体上，形成一种构建体，可以用作阳性标准品，用来表征结直肠癌的诊断情况。

在本发明的一些实施例中，所述构建体为含有本发明第一方面所述的结直肠癌标志物的重组载体。

在本发明的一些实施例中，所述载体为质粒。例如利用pUC57质粒，将本发明第一方面所述的结直肠癌标志物构建到质粒中，形成重组质粒，从而可以作为阳性标准品，用来表征结直肠癌的诊断情况。

根据本发明的第五方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括用于检测本发明第一方面所述的结直肠癌标志物的试剂。

在本发明的一些实施例中，所述试剂盒可以包括以下至少之一：本发明第二方面所述的引物对，本发明第三方面所述的核酸探针和/或本发明第四方面所述的构建体。

在本发明的第六方面，本发明提供了一种对待测者进行结直肠癌检测的系统，包括：定量装置，所述定量装置用来确定所述待测者的粪便DNA中的所述靶标核酸的含量，所述靶标核酸为本发明第一方面所述的标志物；判断装置，所述判断装置与所述定量装置相连，所述判断装置基于所述靶标核酸的含量，确定所述待测者是否为结直肠癌患者。本发明所述“对待测者进行结直肠癌检测的系统”也可以根据需要表述为“对待测者进行结直肠癌检测的设备”，指的是能够用于结直肠癌检测的一种产品。

在本发明的一些实施例中，以上所述对待测者进行结直肠癌检测的系统，可以进一步附加如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述定量装置能够按照包括如下步骤的方法确定所述待测者的粪便DNA中的所述靶标核酸的含量：对所述靶标核酸进行PCR扩增，确定所述待测者的粪便DNA中的所述靶标核酸的含量。

在本发明的一些实施例中，所述PCR为荧光定量PCR。

在本发明的一些实施例中，所述判断装置基于如下标准来确定所述待测者是否为结直肠癌患者：所述靶标核酸的含量大于等于预定阈值，则所述待测者为结直肠癌患者；所述靶标核酸的含量小于所述预定阈值，则所述待测者为非结直肠癌患者。

在本发明的一些实施例中，所述预定阈值是通过下列方法确定的：以由结直肠癌患者和非结直肠癌患者(正常对照)组成的群体为研究对象，对所述群体中的每个个体的粪便DNA中的所述靶标核酸分别进行荧光定量PCR扩增，以便获得检测结果；基于所述检测结果绘制ROC曲线，并从所述ROC曲线中找出灵敏度和特异性最佳的点；基于所述灵敏度和特异性最佳的点，对应所述荧光定量PCR，得到所述靶标核酸的拷贝数(绝对数值)即为所述预定阈值。根据本发明的实施例，在利用检测结果绘制ROC曲线的时候，依照结直肠癌患者和非结直肠癌患者的分组方式绘制ROC曲线。

其中，所述靶标核酸的拷贝数(绝对数值)是采用标准曲线法获得的，用的是已知拷贝数的标准品做的标准曲线。

在本发明的一些实施例中，所述预定阈值为6.302898。

附图说明

图1是根据本发明的一个实施例提供的箱线图(boxplot)结果。

图2是根据本发明的一个实施例提供的接收者操作特征曲线图(receiveroperating characteristic curve，roc曲线)。

图3是根据本发明的一个实施例提供的对待测者进行结直肠癌检测的系统的示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明要解决的技术问题是通过筛选一种新的结直肠癌肿瘤标志物，然后利用这些结直肠癌标志物通过对结直肠癌病人的粪便DNA进行检测，从而实现无创低成本的早期筛查或诊断技术。例如可以通过高通量测序技术对待测者的粪便DNA中的核酸进行测序，来获得有关这些结直肠癌标志物的含量信息，从而表征待测者的患病情况。再例如可以借助于荧光定量PCR技术通过对待测者粪便DNA中的核酸进行表征，来获得关于这些结直肠癌标志物的含量信息，而且借助于荧光定量PCR技术进行检测，可以方便快速获得检测结果，有利于对于结直肠癌检测的推广和产业化。

为此，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种结直肠癌标志物，所述标志物选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5中的至少一种。本发明通过全基因组关联分析(MetabolomeGenome-Wide Association Study，MGWAS)方法对具核酸杆菌的特异性序列进行筛选，所得到的SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5中的任意一种均可以用来表征结直肠癌的患病情况。在本发明的一种优选实施方式中，利用SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5中的两种、三种、四种或者物种来表征结直肠癌的患病情况。在本发明的另一种优选实施方式中，利用SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:2作为结直肠癌标志物，优选利用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2作为结直肠癌标志物。

在本发明的另一个方面，本发明提供了一种对待测者进行结直肠癌检测的方法，包括：(1)基于所述待测者的粪便，确定所述待测者的粪便DNA中的所述靶标核酸的含量，所述靶标核酸为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5中的至少之一；(2)基于所述靶标核酸的含量，确定所述待测者是否为结直肠癌患者。

在本发明的一些实施例中，以上所述对待测者进行结直肠癌检测的方法可以进一步附加如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，步骤(1)中，基于对所述待测者的粪便DNA中的靶标核酸进行PCR扩增，确定所述待测者的粪便DNA中的所述靶标核酸的含量。

在本发明的一些实施例中，所述PCR为荧光定量PCR。

在本发明的一些实施例中，所述靶标核酸的含量大于等于预定阈值，则所述待测者为结直肠癌患者；所述靶标核酸的含量小于预定阈值，则所述待测者不为结直肠癌患者。

在本发明的一些实施例中，所述预定阈值是通过下列方法确定的：以由结直肠癌患者和非结直肠癌患者组成的群体为研究对象，对所述群体中每个个体的粪便DNA中的所述靶标核酸分别进行荧光定量PCR扩增，以便获得检测结果；基于所述检测结果，按照结直肠癌患者和非结直肠癌患者的分组方式绘制ROC曲线，并从所述ROC曲线中找出灵敏度和特异性最佳的点；基于所述灵敏度和特异性最佳的点，对应所述荧光定量PCR，得到所述靶标核酸的拷贝数(绝对数值)即为所述预定阈值。

在本发明的一些实施例中，所述预定阈值为6.302898。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种对待测者进行结直肠癌检测的系统，如图3所示，包括：定量装置和判断装置，所述定量装置和所述判断装置相连，所述定量装置通过对所述待测者的粪便DNA中的靶标核酸进行PCR扩增，确定所述待测者的粪便DNA中的所述靶标核酸的含量，所述靶标核酸为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5中的至少一种；所述判断装置基于所述靶标核酸的含量，确定所述待测者是否为结直肠癌患者。根据本发明的实施例，所述判断装置基于如下标准来确定所述待测者是否为结直肠癌患者：所述靶标核酸的含量大于等于预定阈值，则所述待测者为结直肠癌患者；所述靶标核酸的含量小于预定阈值，则所述待测者为非结直肠癌患者。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

通过MGWAS的方法寻找结直肠癌肠道菌群标志物(该方法是本领域公知的，文献中有详细描述)，找到具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)特异性序列，如下表1所示。其中MGWAS(全基因组关联分析)方法即利用自然群体、人工群体作为研究材料，基于重测序的信息，结合代谢组结果进行代谢组的全基因组关联分析。实验过程参考文献：Jun Yu,QiangFeng eal.,.Metagenomic analysis of faecal microbiome as a tool towardstargeted non-invasive biomarkers for colorectal cancer.Gut 2015；0:1–9.doi:10.1136/gutjnl-2015-309800，根据需要全部或者部分引入本申请中。

表1特异基因序列

其中，序列SEQ ID NO:3中碱基N代表随机碱基，即可以为A，T，C，G中的任意一种。

实施例2

采用oligo7软件对筛选得到的特异菌群的特异序列进行引物设计，尽可能满足重要原则的基础上，要求上下引物扩增产物在70bp～200bp，预计每个基因设计各3～5套引物。

针对实施例1筛选获得的特异性序列，设计了如下所示的引物序列，用于各特异性序列的特异扩增，所设计的引物序列如下表所示：

表2引物序列

对于所设计得到的引物，进行引物测试：即利用普通PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带，经过检测发现：目的条带大小与预期一致且条带单一，说明利用本发明实施例2提供的引物，扩增的特异性好。具体而言，在对标志物SEQ ID NO:1进行扩增的时候，用到的引物序列为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7表现出最佳的扩增效果；在对标志物SEQ ID NO:2进行扩增的时候，用到的引物序列为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13表现出最佳的扩增效果；在对标志物SEQ ID NO:3进行扩增的时候，用到的引物序列为SEQ ID NO:20和SEQ IDNO:21表现出最佳的扩增效果；在对标志物SEQ ID NO:4进行扩增的时候，用到的引物序列为SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25表现出最佳的扩增效果；在对标志物SEQ ID NO:5进行扩增的时候，用到的引物序列为SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33表现出最佳的扩增效果。

实施例3

本发明实施例主要基于Qpcr技术对结直肠癌患者和正常人粪便DNA进行测试，所示出的结果仅仅是按照实施例2提供的最佳引物所提供的结果。使用16例结直肠癌病人粪便DNA和16例正常人粪便DNA进行Qpcr检测(所使用的试剂为：SYBR Premix Ex Taq(TM)II(Perfect Real Time)，货号:DRR081A)。其中，SYBR Premix Ex Taq(TM)II为采用SYBRGreen I嵌合法进行Real Time PCR(实时荧光定量PCR)的专用试剂。通过PCR反应生成双链DNA，SYBR Green I能够与双链DNA结合后发出荧光，通过检测PCR反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量。具体而言，在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入双链DNA后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而能够保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

本方法使用的是标准曲线法，本发明采用的标准品为分别含有SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5对应序列，阳性标准品即为将这些序列克隆到载体上的质粒；该部分标准品为商业公司帮忙合成(南京金斯瑞公司，标准载体pUC57)。商业公司寄过来的质粒标准品为干粉，将干粉离心后稀释，测定其浓度后换算为对应的拷贝数，然后进行梯度稀释，稀释5个梯度作为标准曲线(标准曲线的横坐标为拷贝数，纵坐标为CT值)。通过利用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因所测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量，从而实现目的基因拷贝数的绝对定量。

实验具体操作步骤如下：

1)配制反应液：将引物、DNA模板、ROX Reference Dye、SYBR Premix Ex Taq II配制成10μl反应液，加入到96孔反应板上，具体如下：

2)QPCR扩增：将96孔板放在Qpcr仪上，进行扩增检测；

3)分析数据：使用Qpcr软件导出结果，根据qpcr的定量结果使用R语言对数据进行分析作图，按照病人，正常人画箱线图(box plot)和接收者操作特征曲线图(Roc曲线)；箱线图是利用数据中的几个统计量，包括：最小值、下四分位数，中位数，上四分位数以及最大值等来描述数据的一种方法，利用箱线图可以看出数据是否有对称性、分布的离散程度等信息。

以SEQ ID NO:1作为标志物，以SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7作为引物序列为例，所得到的结果如图1和图2所示，其中图1是一种箱形图，显示结肠癌病人和正常人两组数据的分散情况；图中横坐标代表结肠癌和正常人两类人群，纵坐标代表富集度。其中每个箱的最下面一条线代表下四分位数；中间那条线代表中位数；最上面那条线代表上四分位数；两个人群的中位数差距越大，代表两个人群区分的越开，该肿瘤标志物的检测效率越高。图中示出的每个点代表QPCR检测结果经过进一步计算对应的值。

图2是接收者操作特征曲线(Roc曲线)，图中横坐标代表特异性，纵坐标代表敏感性；中间那条对角线代表AUC＝0.5的情况，图中得到的AUC为0.924，说明该肿瘤标志物检测效果较好。图中左上角圆圈圈起来的那个点即为灵敏度和特异性最佳的点，其对应的灵敏度和特异性分别为93.3％和92.8％，对应的qpcr的阈值(cut off值)为6.302898，利用该阈值可以对结直肠癌的患病情况进行判断，qpcr得到的质量值(quantity值)大于等于该阈值即可判断为结直肠癌病人，小于该值可判断为正常，此处Qpcr所得的quantity值，即为标准曲线得出的待测样本中靶标基因的拷贝数绝对值)。

具体数据见下表3和表4，其中表3为利用引物Fn1-F和Fn1-R对SEQ ID NO:1进行荧光定量PCR检测的结果，表4为利用引物Fn2-F1和Fn2-R1对SEQ ID NO:2进行荧光定量PCR检测的结果。

表3 16例正常人和16例病人的QPCR检测结果

注：表中“-”代表检测结果低于cut off值，判断结果为正常；“+”代表检测结果高于cut off值，判断结果为结直肠癌肿瘤患者。

从表3可以看出，利用本发明提供的引物和序列进行荧光定量PCR检测，在对正常样本进行测定的过程中，在16例样本中仅有1例样本测定的质量值大于阈值，在对结直肠癌患者样本进行测定的过程中，在16例样本中仅有2例样本测定的质量值小于阈值；说明利用本发明的结直肠癌标志物可以准确高效的用于结直肠癌的检测。

同样地，以SEQ ID NO:2作为标志物对这16例正常人和16例结直肠癌病人进行检测，检测结果表明：在16例正常样本中检测到12例表现为正常，在16例患病样本中检测到11例表现为患病。

同样地，以SEQ ID NO:3作为标志物对这16例正常人和16例结直肠癌病人进行检测，检测结果表明：在16例正常样本中检测到10例表现为正常，在16例患病样本中检测到11例表现为患病。

同样地，以SEQ ID NO:4作为标志物对这16例正常人和16例结直肠癌病人进行检测，检测结果表明：在16例正常样本中检测到11例表现为正常，在16例患病样本中检测到9例表现为患病。

同样地，以SEQ ID NO:5作为标志物对这16例正常人和16例结直肠癌病人进行检测，检测结果表明：在16例正常样本中检测到9例表现为正常，在16例患病样本中检测到10例表现为患病。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接或彼此可通讯；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可以是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大生命科学研究院

<120> 结直肠癌标志物及其应用

<130> PIDC3183805

<160> 35

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 957

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgttacaaa caagaaaagt tggaattgtt ggagttggtc atgttggaag tcattgtgca 60

ttgtctatgt tattacaagg tgtatgtgat gaaatggttt taatggatat tattccagaa 120

aaagcaaaag ctcatgcaat agattgtatg gacactataa gttttcttcc tcatagagct 180

attattcgtg atggaggaat acaagagctt tctaaaatgg atgtaattgt aatcagtgtt 240

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gcttgtgctg taatgaaaaa atatattgag gttggaaaat cttataaaat agtataa 957

<210> 2

<211> 1917

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggcaatag ttaaaatgaa aaagtttaaa ttatttgctc ttgaaaaaga tagaaaagct 60

ttattaaaag agttacaaaa atttgattat gtccatttca tcaaaacctc aaatgaagaa 120

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caaaaagtta agtggatgaa aagtttttta ttaaaacttt ttcctaaaga agttaaggaa 240

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agtggaggaa tacttggaat tatacttgga gtaattgtat ttgcatttgg acaatcattt 1800

aatatatttt taagtttctt atctgcttat gtacatactt caagacttat gtatgtagaa 1860

tttttctcta aattctatga aggtggagga aaggcattta aaaaattcag aatatag 1917

<210> 3

<211> 258

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(37)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

ttgatttcta aaccaacagc aatttcgcnn nnnnnnnaat ttaaagaaaa agttaattcc 60

gttcaaggag taaaaaaaat aatagtaaat tgtgaaaatc tttcatatat tgattcaaca 120

ggactcggtg cttttataag tatctacaaa aacataaaag aaaagggaga gaaacttgtt 180

attacaggct taaaaccaca tatcaaaaaa atcttcctta taaccgactt agataaagtt 240

tttgaaatcg aggggtaa 258

<210> 4

<211> 627

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgattttga atatgaaatt tattttaata tttaggagta taataatgag tatattattt 60

gataaattaa tgaatacaat aggagaagac gaaattataa aaaggcttgg aaaaccttat 120

ttcaatagat taaaaagaaa tagtaatgta tggatatatc atatatacac aaaaataaat 180

cttgagaaag aagtaggata tacctatgaa gattgtctac aagattttga atatgaaatt 240

gataaatata aagaaaaaaa agcagtttat aaaatatgga aaacaggctc ttcaatttat 300

gaatatggta taaaattagg tttaaaaaga aattatttat accgaatgtt aagaaatggt 360

tttgatactg ttattaatga aaatataaaa tacctattac ttgatacctt tgatatagaa 420

tataacttag atgatattaa aaattttaaa atagaagttc ataaaaaatt ttgtaaatta 480

attggttcta aagaagagtt agaaaaagta attagtaaat atgaaattga ttatcctatt 540

ctatgtcata atgagcaata tagtgtagct tttaatggac cattatttag aaagattaaa 600

gaaaactata aagatattat aaaatga 627

<210> 5

<211> 160

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgaattatt caatgcctaa atattttcaa aatatgccac aagtaggaaa ttcattagtt 60

aatattgatg aagctaatga aaatgcagta agagaaattg aagatgctat tgctcaaagt 120

attcaagcaa tgcaagattc aggaactcct gatgaaaaaa 160

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aacaggttta gatagtgcaa 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tatatgcttg aataacttgg ct 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tttagtgaaa gcgatattcc a 21

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttcattacag cacaagca 18

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cttgaagaat taaagggctc 20

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cttgcactat ctaaacctg 19

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tctatcactc aaatgtatgc ac 22

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgccaaacac aatattaagc c 21

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cttaatattg tgtttggcat cg 22

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tattaaatca ccaaaggcac t 21

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gattactata tggtagtgcc tt 22

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

caaatgaact gctccgaa 18

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tgccgaaact attgtaggaa 20

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tataaaacct ccagctaagc c 21

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

aaagttaatt ccgttcaagg 20

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

acttataaaa gcaccgagt 19

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ggtgctttta taagtatcta caaa 24

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ttatctaagt cggttataag ga 22

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

agcagtttat aaaatatgga a 21

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

catttcttaa cattcggta 19

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

acgaaattat aaaaaggctt g 21

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gtagacaatc ttcataggta 20

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

aaagaaatta tttataccga a 21

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

agttatattc tatatcaaag g 21

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

gattatccta ttctatgtca 20

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

taatctttct aaataatggt c 21

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

attttcaaaa tatgccaca 19

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

tactttgagc aatagcatc 19

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

attttcaaaa tatgccaca 19

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

ttcaatttct cttactgcat t 21

Claims (10)

1.一种结直肠癌标志物，其特征在于，所述标志物包括选自下列中的至少一种：

SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5；

来源于具核梭杆菌且与所述SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5中的任意一种具有95％以上同源性的核酸序列。

2.一组引物对，其特征在于，所述引物对能够特异性扩增权利要求1所述的标志物中的至少之一，所述引物对选自SEQ ID NO:6～SEQ ID NO:35中的任意一对，其中SEQ ID NO:6～SEQ ID NO:35中每两个相邻编号的核酸序列为一对。

3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述引物对SEQ ID NO:6～SEQ ID NO:11中的任意之一能够特异性扩增SEQ ID NO:1；

所述引物对SEQ ID NO:12～SEQ ID NO:19中的任意之一能够特异性扩增SEQ ID NO:2；

所述引物对SEQ ID NO:20～SEQ ID NO:23中的任意之一能够特异性扩增SEQ ID NO:3；

所述引物对SEQ ID NO:24～SEQ ID NO:31中的任意之一能够特异性扩增SEQ ID NO:4；

所述引物对SEQ ID NO:32～SEQ ID NO:35中的任意之一能够特异性扩增SEQ ID NO:5。

4.一种核酸探针，其特征在于，所述核酸探针能特异性捕获包括权利要求1所述的结直肠癌标志物。

5.一种构建体，其特征在于，所述构建体包括权利要求1所述的结直肠癌标志物。

6.根据权利要求5所述的构建体，其特征在于，所述构建体为含有权利要求1所述的结直肠癌标志物的重组载体；

任选地，所述载体为质粒。

7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测权利要求1所述的结直肠癌标志物的试剂；

任选地，所述试剂盒包括以下至少之一：

权利要求2或3所述的引物对；

权利要求4所述的核酸探针；

权利要求5或6所述的构建体。

8.一种对待测者进行结直肠癌检测的系统，其特征在于，包括：

定量装置，所述定量装置用来确定所述待测者的粪便DNA中的所述靶标核酸的含量，所述靶标核酸为权利要求1中所述的标志物；

判断装置，所述判断装置与所述定量装置相连，所述判断装置基于所述靶标核酸的含量，确定所述待测者是否为结直肠癌患者。

9.根据权利要求8所述的系统，其特征在于，所述定量装置能够按照包括如下步骤的方法确定所述待测者的粪便DNA中的所述靶标核酸的含量：

对所述靶标核酸进行PCR扩增，确定所述待测者的粪便DNA中的所述靶标核酸的含量；

任选地，所述PCR为荧光定量PCR。

10.根据权利要求8或9所述的系统，其特征在于，所述判断装置基于如下标准来确定所述待测者是否为结直肠癌患者：

所述靶标核酸的含量大于等于预定阈值，则所述待测者为结直肠癌患者；所述靶标核酸的含量小于预定阈值，则所述待测者为非结直肠癌患者；

任选地，所述预定阈值是通过下列方法确定的：

以由结直肠癌患者和非结直肠癌患者组成的群体为研究对象，对所述群体中每个个体的粪便DNA中的所述靶标核酸分别进行荧光定量PCR扩增，以便获得检测结果；

基于所述检测结果绘制ROC曲线，并从所述ROC曲线中找出灵敏度和特异性最佳的点；

基于所述灵敏度和特异性最佳的点，对应所述荧光定量PCR，得到所述靶标核酸的拷贝数即为所述预定阈值；

任选地，所述预定阈值为6.302898。

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