CN102260740B - 沙门氏菌/志贺氏菌双重荧光pcr检测试剂盒 - Google Patents

沙门氏菌/志贺氏菌双重荧光pcr检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种沙门氏菌/志贺氏菌双重荧光PCR检测试剂盒，该检测试剂盒包括以下各组分：PCR反应液、沙门氏菌/志贺氏菌双重反应液和灭菌水。本发明沙门氏菌/志贺氏菌双重荧光PCR检测试剂盒解决了传统的生化与免疫学方法检测这两种细菌所存在的操作繁琐、周期较长以及无法在一个反应中同时检测等问题，能够在同一反应管中同时检测出沙门氏菌和志贺氏菌，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、可重复性强、检测结果快速客观等优点。

Description

沙门氏菌/志贺氏菌双重荧光PCR检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种肠道细菌的体外诊断试剂盒，尤其涉及一种能够同时检测沙门氏菌和志贺氏菌的双重荧光PCR检测试剂盒，属于沙门氏菌和/或志贺氏菌的体外诊断领域。
背景技术
沙门氏菌是一类广泛分布于自然界，可使人和动物发病的具有极大危害的革兰氏阴性肠道致病菌，能引起人胃肠炎、伤寒、败血症等症状。沙门氏菌是肠杆菌科的一个属，本属细菌为革兰氏阴性短杆菌，无芽孢，除鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外，其余畜禽病原菌均有周鞭毛，其中多数长有菌毛，能吸附于红细胞表面，能凝集红细胞。由于沙门氏菌属是一群形态、培养、生化反应和抗原结构相类似的革兰氏阴性菌，其种类繁多，有5个亚属组成。血清型更为复杂，至今已发现2200多个，在中国已发现200多个。常见的有鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等。
目前，全世界已经分离出2000多个血清型，中国已发现216个。沙门氏菌常污染各种肉、鱼、蛋、乳类食品而引起食物中毒，其中以肉类占多数。沙门氏菌污染食品的主要原因有：(1)病畜或病禽的肉制品；(2)病畜或病禽的粪便污染食品；(3)带菌人在制作食品过程中污染食品；(4)生熟食品未分开造成的交叉污染。
沙门氏菌中鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和肠炎沙门氏菌等污染了动物性食品，如肉、禽及未经巴氏消毒的蛋品，可以引起人沙门氏菌食物中毒，表现为发热、头痛、全身酸痛或胃肠炎，个别病人会死亡。因此，食品卫生标准中规定各种食品中不得检出沙门氏菌。食品沙门氏菌检测技术十分关键，出于对食品安全的关切。人类迫切需要发展快速、简便、特异、敏感、适用、低耗的沙门氏菌检测技术。
志贺氏菌是人类细菌性痢疾最常见的病原菌，是一类具有高度传染性的肠道致病菌，通常称为痢疾杆菌。它是一类兼性厌氧、不产生芽孢的革兰氏阴性杆菌。长约2～3μm、宽0.5～0.7μm、杆状或短杆状，不形成荚膜，无鞭毛，多数有菌毛；营养要求不高，能在普通培养基上生长；最适生长温度为37℃，最适pH值为6.4～7.8。
志贺氏菌属细菌的抗原由菌体抗原(O)及表面抗原(K)组成。O抗原可分为群特异性抗原和型特异性抗原，型特异性抗原可用于区别菌型。K抗原可以阻止O抗原与相应抗血清的凝集反应。根据生化反应和O抗原结构的不同，志贺氏菌可以分为痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)、福氏志贺氏菌(S.flexneri)、鲍氏志贺氏菌(S.boydii)和宋内氏志贺氏菌(S.sonnei)。在发展中国家，由福氏志贺氏菌引起的感染性腹泻疾病高居首位。
志贺氏菌常为食物爆发型或经水传播，志贺氏菌在拥挤和不卫生条件下能迅速传播，经常发现于人员大量集中的地方如餐厅和食堂等。食源性致贺菌流行的主要原因是从事食品加工行业人员患菌痢或带菌者污染食品、接触食品人员个人卫生差、已污染的食品存放于不适当的温度下等原因。
志贺氏菌主要通过消化道途径传播，侵袭肠上皮细胞，引起以发热、腹痛、腹泻为特征的典型的痢疾症状，严重危害人类健康。根据WHO统计，每年有1.647亿人感染痢疾，1.1万人死亡，其中多数为5岁以下的儿童。在成年患者中，10～100CFU志贺氏菌就可通过感染肠道致病，引发严重的炎症反应。发展中国家由于缺乏清洁的水源、缺少必要的卫生医疗设备、营养不良等诸多原因，成为痢疾的高发地。因此，建立快速、有效地检测和鉴定志贺氏菌的方法显得尤为重要。
目前，以荧光标记探针为基础的实时荧光PCR技术在中国国内的临床诊断中应用最为广泛。在探针法的实时荧光PCR反应体系中，根据所检测病原体的多少，还可以分为单重或多重实时荧光PCR技术，反应体系中往往包括一对或多对特异性PCR引物及探针，通过研发过程中的条件摸索，探针及引物只与相对应的模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter，R)，如FAM、VIC、ROX等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher，Q)，如BHQ1、BHQ2、TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号(图1)。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。
现有的沙门氏菌和/或志贺氏菌的体外诊断试剂盒大多存在特异性差、灵敏性较低等缺陷，有待改进。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是克服现有的沙门氏菌和/或志贺氏菌的体外诊断试剂盒存在的灵敏度低、特异性差等缺陷，提供一种新的沙门氏菌和/或志贺氏菌的双重荧光PCR检测试剂盒，该双重荧光PCR检测试剂盒具有特异性强、灵敏度高等优点。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种沙门氏菌和志贺氏菌的双重荧光PCR检测试剂盒，包括以下各组分：PCR反应液、沙门氏菌/志贺氏菌双重反应液和灭菌水。
其中，所述的沙门氏菌/志贺氏菌双重反应液包括以下2组组分：
组分(1)：由一对检测沙门氏菌的引物和一条检测沙门氏菌的探针组成，其中，所述引物的碱基序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；所述探针的碱基序列为SEQ ID No.3所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
组分(2)：由一对检测志贺氏菌的引物和一条检测志贺氏菌的探针组成；其中，所述引物的碱基序列分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；所述探针的碱基序列为SEQ ID No.6所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
其中，所述的荧光报告基团包括FAM、HEX、ROX、CY3或CY5等荧光报告基团；所述的荧光淬灭基团包括BHQ1、BHQ2或BHQ3等荧光淬灭基团；
本发明对上述引物和探针的配比比例进行了摸索和优化，试验结果发现，它们之间不同的配比比例对于检测结果的特异性和灵敏性具有显著的差异，本发明通过高通量的筛选试验发现，上述引物和探针在下述配比下，具有最优的检测效果：
检测沙门氏菌的引物及探针的配比分别为：SEQ ID No.1∶SEQ IDNo.2∶SEQ ID No.3＝500nM∶500nM∶200nM。
检测志贺氏菌引物及探针的配比分别为：SEQ ID No.4∶SEQ ID No.5∶SEQ ID No.6＝500nM∶500nM∶800nM。
表1检测沙门氏菌、志贺氏菌的引物和探针序列
Figure BSA00000531205600041
表2沙门氏菌、志贺氏菌双重反应液的组分
  试剂名称   加入体积(μl)/50反应
  沙门氏菌-FP   62.5
  沙门氏菌-RP   62.5
  沙门氏菌-P   25
  志贺氏菌-FP   62.5
  志贺氏菌-RP   62.5
  志贺氏菌-P   100
  灭菌水   125
所述的PCR反应液包括灭菌双蒸水、10×PCR缓冲液、25mM Mg2+、10mM dNTPs和Taq酶(表3)。
表3PCR反应液的组成
  试剂名称   加入体积(μl)/50反应
  灭菌水   210
  10×PCR缓冲液   125
  25mM Mg2+   125
  Taq酶   15
  10mM dNTPs   25
  总计   500
为了达到更好的检测效果，本发明试剂盒中还含有沙门氏菌/志贺氏菌阳性参考品(含沙门氏菌、志贺氏菌的特异性DNA片段的混合液)。
本发明的另一个目的是提供本发明双重荧光PCR检测试剂盒在检测沙门氏菌和/或志贺氏菌的应用方法，包括：
(1)提取样本的DNA；
(2)准备以下组分：PCR反应液10ul，沙门氏菌/志贺氏菌双重反应液10ul，DNA样本5ul；
(3)Real Time-PCR扩增：按照以下程序进行PCR扩增
Figure BSA00000531205600061
(4)结果判定：在FAM通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤36.0，判断为沙门氏菌为阳性；无典型“S”型扩增或CT＞36.0，判断为沙门氏菌为阴性；在HEX通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤36.0，判断为志贺氏菌为阳性；无典型“S”型扩增或CT＞36.0，判断为志贺氏菌为阴性。
所述样本包括：粪便、肛拭子、呕吐物或疑似变质的食物。检测前，建议对肛拭子和食物进行增菌处理，之后按照常规的DNA提取方法对样本提取DNA，将待测标本加入准备好的沙门氏菌/志贺氏菌试剂的PCR反应管中，在荧光定量PCR扩增仪中扩增检测。扩增结束后，根据荧光曲线判断是否感染这两种细菌(图2)。
本发明沙门氏菌/志贺氏菌双重荧光PCR检测能够同时检测出沙门氏菌或/和志贺氏菌，具有操作简便、可重复性强、检测结果快速客观等优点，在肠道细菌体外诊断领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1TaqMan探针的荧光信号产生机制。
图2本发明双重荧光PCR检测检测两组样本的曲线图。
图3本发明双重荧光PCR检测检测沙门氏菌的灵敏度试验结果。
图4本发明双重荧光PCR检测检测志贺氏菌的灵敏度试验结果。
图5本发明双重荧光PCR检测检测沙门氏菌的特异性试验结果。
图6本发明双重荧光PCR检测检测志贺氏菌的特异性试验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
试验例1本发明双重荧光PCR检测试剂盒临床样本的检测试验
1样本处理(DNA提取)
取菌液或样品培养液1mL于离心管中，8000r/min离心4min，沉淀用灭菌水洗涤1次，去上清液，沉淀溶于100μL超纯水中，煮沸10min，10000r/min离心3min，取5μL上清液即可用于PCR反应
2试剂准备
表4
Figure BSA00000531205600071
3PGR扩增程序
Figure BSA00000531205600072
4结果分析：
5个临床样本具体检测结果见表5。
表55个临床样本检测结果
Figure BSA00000531205600081
试验例2本发明双重荧光PCR检测试剂盒的灵敏度试验
对沙门氏菌和志贺氏菌阳性参考品(含沙门氏菌、志贺氏菌的特异性DNA片段的质粒)进行10倍倍比稀释。实验结果表明本发明双重荧光PCR检测试剂盒可检测至10CFU，并CT值随浓度减少呈梯度改变(图3、图4)。试验结果表明，本发明双重荧光PCR检测试剂盒对于沙门氏菌/志贺氏菌的诊断具有高度的灵敏度。
试验例3本发明双重荧光PCR检测试剂盒的特异性试验
为了检测本发明沙门氏菌/志贺氏菌双重荧光PCR检测试剂盒的特异性，用本发明沙门氏菌/志贺氏菌双重荧光PCR检测试剂盒检测弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌、致泻性大肠杆菌等；检测结果表明，FAM通道仅对沙门氏菌进行扩增(图5)；HEX通道仅对志贺氏菌进行扩增(图6)。表明本发明检测试剂盒能特异性扩增沙门氏菌和志贺氏菌，而不与其它致病性细菌发生交叉反应。
Figure ISA00000531205800011

Claims (8)

1.沙门氏菌/志贺氏菌双重荧光PCR检测试剂盒，包括以下各组分：PCR反应液，沙门氏菌/志贺氏菌双重反应液和灭菌水； 
所述的沙门氏菌/志贺氏菌双重反应液包括以下2组组分： 
组分（1）：由一对检测沙门氏菌的引物和一条检测沙门氏菌的探针组成；其中，所述引物的碱基序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；所述探针的碱基序列为SEQ IDNo.3所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团; 
组分（2）：由一对检测志贺氏菌的引物和一条检测志贺氏菌的探针组成；其中，所述引物的碱基序列分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；所述探针的碱基序列为SEQ ID No.6所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。 
2.按照权利要求1所述的双重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：组分（1）中两条引物和探针之间的配比为：SEQ ID No.1:SEQ ID No.2:SEQ IDNo.3=500nM:500nM:200nM。 
3.按照权利要求1所述的双重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：组分（2）中两条引物和探针之间的配比为：SEQID No.4:SEQID No.5:SEQIDNo.6=500nM:500nM:800nM。 
4.按照权利要求1所述的双重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的荧光报告基团包括FAM、HEX、ROX、CY3或CY5荧光报告基团；所述的荧光淬灭基团包括BHQ1、BHQ2或BHQ3荧光淬灭基团。 
5.按照权利要求1所述的双重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应液包括：灭菌双蒸水、10×PCR缓冲液、25mM Mg2+、10mM dNTPs和DNA聚合酶。 
6.按照权利要求5所述的双重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于:所述DNA聚合酶是热启动酶。 
7.按照权利要求1所述的双重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：还含有沙门氏菌/志贺氏菌阳性参考品。
8.权利要求1-7任何一项所述双重荧光PCR试剂盒在制备检测沙门氏菌和志贺氏菌试剂中的应用。 
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