CN112760394A - 一种用于禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型鉴定的多重pcr引物 - Google Patents

一种用于禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型鉴定的多重pcr引物 Download PDF

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黄瑜
程龙飞
傅光华
施少华
万春和
傅秋玲
刘荣昌
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Abstract

本发明提供了一种用于禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型鉴定的多重PCR引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1‑6所示。本发明根据NCBI(National Center for Biotechnology Information）数据库禽源多杀性巴氏杆菌中kmt1基因（Genbank:AF16259）、编码荚膜A型（capA）(Genbank:AF067175)和编码脂多糖（LPS1）基因簇等的保守序列进行引物设计，于国内外率先建立禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型（A型和L1型）鉴定的多重PCR引物，该方法灵敏度高、特异性强，最低可检测116pg的核酸。

Description

一种用于禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型鉴定的多重PCR 引物
技术领域
本发明涉及一种用于禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型鉴定的多重PCR引物，属于兽医传染病学领域。
背景技术
多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，P. multicida ）属于革兰氏阴性杆菌，是一类重要的、能感染多种宿主的病原菌，可导致禽霍乱，猪萎缩性鼻炎，还可以导致牛、羊以及家兔等动物发生出血性败血病。该类细菌流行于全球，给各地的养殖业造成了不可估量的经济损失。禽源多杀性巴氏杆菌可感染各品种水禽，30日龄以上特别是产蛋水禽更易感。急性发作时病程短促，死亡率高，病变特征为心冠脂肪出血、肝脏灰白色点状坏死和肠道出血等。慢性发作时，以慢性呼吸道炎、慢性胃肠炎、肉髯水肿和关节炎等多见。禽霍乱已成为危害水禽养殖业的重要传染病之一。
多杀性巴氏杆菌血清型众多，按照荚膜抗原的不同可以被分为 A、B、D、E、F 五种血清型；按照脂多糖抗原的不同可以被分为 16 种血清型（1-16）。五种荚膜血清型和 16种脂多糖血清型又被分别划分为五种荚膜基因型（A、B、D、E、F）和 8 种脂多糖基因型（L1-L8）。目前，根据我们团队前期的研究结合参考文献确定禽源多杀性巴氏杆菌的优势荚膜型为A型，优势脂多糖型为L1型，然而在实际工作中需要做三个PCR才能分别鉴定出多杀性巴氏杆菌、荚膜血清型和脂多糖血清型，费时费力且浪费耗材，鉴于此，本发明建立快速、简便、敏感、特异的禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型鉴定的多重PCR方法，旨在快速检测临床的疑似病例，还可用于血清型的鉴定，对于禽霍乱的分子流行病学调查具有重要的科学意义和应用价值。该多重PCR鉴定方法的建立对于禽霍乱的有效防控提供技术支撑，具有重大的现实意义。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型鉴定的多重PCR引物。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型鉴定的多重PCR引物，所述引物序列如下：
Figure 665411DEST_PATH_IMAGE001
所述三组引物根据kmt1基因、编码荚膜A型（capA）和脂多糖（LPS1）基因簇的保守序列来设计合适大小的片段，分别用于禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型的鉴定。该引物组合不仅能准确地鉴定禽源多杀性巴氏杆菌，同时还能鉴定出它的血清型。
所述3组引物主要用来鉴定禽源多杀性巴氏杆菌和血清型。第一组引物所扩增的产物为编码脂肪酶的基因，片段大小为230 bp；第二组引物所扩增的产物为编码荚膜A型的基因，片段大小为529 bp；第三组引物所扩增的产物为编码脂多糖LPS1型的基因，片段大小为763bp。
利用本发明的引物对PCR进行反应体系和反应条件的各种优化，建立一套可用于禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型鉴定的多重PCR方法。
具体操作方法如下：
1、引物设计
参考NCBI 数据库中kmt1基因、编码荚膜A型（capA）和脂多糖（LPS1）基因簇的保守序列，利用Lasergene v 7.1 DNAStar软件进行同源性分析比较，利用Oligo 7.0软件，分别在保守区设计引物，并采用BLAST工具进行检索，验证其特异性。
2、反应体系的优化
优化出的25 μL 最佳反应体系为：2×GoTaq Master Green Mix 12.5 μL、第一组和第二组的上、下游引物（20 μM）各 0.25 μL、第三组引物的上、下游引物（20 μM）各1.5 μL、模板0.5μL、灭菌去离子水补足至终体积 25 μL。最佳反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s，35 个循环；72 ℃ 10min。
3、多重PCR的建立
以优化的反应体系进行多重PCR扩增，该方法可用于禽源多杀性巴氏杆菌的流行病学检测，为疾病的早期预防控制奠定技术基础。同时，该方法的建立为研究该病原的复制动力学提供检测平台。
本发明的有益效果：
本发明根据kmt1基因、编码荚膜A型（capA）和脂多糖（LPS1）基因簇的保守序列，设计一种鉴定禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型的多重PCR引物，于国内外率先建立禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型鉴定的多重PCR方法，该方法灵敏度高、特异性强，最低可检测116pg的核酸。
附图说明
图1多重PCR的建立，1：kmt1；2：capA；3：LPS1；M：Marker(DL2000)；4：多重PCR。
图2敏感性试验，M: Marker(DL2000)；1：116.9 ng /μL；2：11.6 ng /μL；3：1.16ng /μL；4：116pg /μL；5：11.6 pg /μL。
具体实施方式
实施例1 禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型鉴定的多重PCR方法的建立
一、材料
禽源多杀性巴氏杆菌fcf45株（GenBank登录号：CP038875.1 ），其中：
脂多糖L1型为脂多糖外核编码簇上特异的基因位点；
荚膜A型特异基因 (GenBank登录号：AF067175)；
kmt1基因(Genbank登录号：AF16259)。
二、步骤
1、试剂
pMD18-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司，GoTaq Master Green Mix 购自Promega 公司，细菌DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收小量试剂盒、质粒小量抽提试剂盒购自Omega公司；大肠杆菌(Escherichia coli）DH5α感受态细胞自制。
2、引物的特异性
引物的特异性是本实验所建立方法的最重要因素。分别根据NCBI中kmt1基因、编码荚膜A型（capA）和脂多糖（LPS1）基因簇序列，通过比对分析，设计三组引物。
Figure 853816DEST_PATH_IMAGE002
3、单因子PCR方法的建立
按照细菌DNA提取试剂盒说明书方法提取禽源多杀性巴氏杆菌DNA，分别扩增三个基因：
Figure 9640DEST_PATH_IMAGE003
每组引物所扩增的基因片段大小分别为230 bp、529 bp、763bp。
扩增体系为50 μL，其中2×GoTaq Master Green Mix 25 μL、上、下游引物（20 μM）各1μL、模板2 μL、补充灭菌去离子水至终体积50 μL。 反应条件为94℃预变性5 min，随后进行94℃ 30 s、53℃ 30 s、72℃60s循环35次后，72℃延伸10 min。反应结束后，取PCR产物5 μL，在1.0 % 琼脂糖凝胶上电泳。将3个 PCR 产物经胶回收试剂盒纯化后与pMD18-T载体连接，转化 DH5α 感受态细胞，用PCR和双酶切方法鉴定重组质粒。阳性重组质粒进行序列测定。测序结果表明，阳性重组质粒符合预期。
4、多重PCR方法的建立
按照细菌DNA提取试剂盒说明书方法提取禽源多杀性巴氏杆菌DNA，并利用三组引物同时扩增三个基因：
Figure 990103DEST_PATH_IMAGE004
所扩增的目的片段为230 bp、529 bp、763bp（见图1）。
5、反应条件的优化
采用25 μL反应体系2×GoTaq Master Green Mix 12.5μL、第一组和第二组的上、下游引物（20 μM）各 0.25 μL、第三组引物的上、下游引物（20 μM）各1.5 μL、模板1 μL、补充灭菌去离子水至终体积25 μL。对退火温度（53～64 ℃）进行优化。
6、特异性检测
用优化的条件（退火温度55℃）分别检测禽源大肠杆菌、鸭疫里默氏菌、金黄色葡萄球菌和禽源沙门氏菌进行检测，对其特异性进行评价，结果检测均为阴性，PCR产物电泳均未见条带。
7、敏感性检测
基因组DNA 敏感性试验：分别提取禽源多杀性巴氏杆菌的基因组DNA，测定DNA 含量为1169.3 ng /μL，依次稀释至以下浓度：116.9 ng /μL、11.6 ng /μL 、1.16 ng /μL 、116pg /μL、11.6 pg /μL，各取分别取 1 μL已稀释的DNA 为模板进行多重PCR扩增，试验结果表明：多重PCR最低可检测116 pg 的核酸（见图2）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种用于禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型鉴定的多重PCR引物
<130> 6
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgagccaatc tgcttcct 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caaaccgttg aacacgaa 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agccttctat cataaacatc 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ataagtcagg gtcgatgt 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aggaggaatg actaacag 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tctagctttg gcataacc 18

Claims (2)

1.一种用于禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型鉴定的多重PCR引物，其特征在于，所述引物序列如下：
第一组，用于鉴定多杀性巴氏杆菌：
kmt1-F：5'-TGAGCCAATCTGCTTCCT-3'；kmt1-R：5'- CAAACCGTTGAACACGAA -3'；
第二组，用于鉴定荚膜A型：
capA-F：5'- AGCCTTCTATCATAAACATC -3'；capA-R：5'- ATAAGTCAGGGTCGATGT -3'；
第三组，用于鉴定脂多糖L1型：
LPS1-F：5'- AGGAGGAATGACTAACAG -3'；LPS1-R：5'- TCTAGCTTTGGCATAACC -3'。
2.一种包含权利要求1所述用于禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型鉴定的多重PCR引物的试剂。
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