CN108359677A - 提高猪圆环病毒2型和3型Cap蛋白串联表达效率的方法 - Google Patents

提高猪圆环病毒2型和3型Cap蛋白串联表达效率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，提供一种提高猪圆环病毒2型和3型Cap蛋白串联表达效率的方法，所述方法采用两对特异性引物进行扩增，利用基因工程技术构建能够同时表达PCV2和PCV3 Cap蛋白中主要抗原位点的串联重组质粒，在串联蛋白的表达过程中发现PCV2‑PCV3Cap蛋白表达效率较低，本发明根据大肠杆菌的偏好性，将PCV2‑PCV3Cap的密码子进行优化，使其更有利于蛋白的表达。

Description

提高猪圆环病毒2型和3型Cap蛋白串联表达效率的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高猪圆环病毒2型和3型Cap蛋白串联表达效率的方法。
背景技术
2000年我国第一次在猪群中检测到猪圆环病毒2型（porcine circovirus type2，PCV2），在此之后开始逐渐在国内蔓延流行。该病毒常表现出与其它病源混合感染或者继发感染。PCV2感染已给我国乃至世界的养猪也带来了巨大的经济损失。一直以来都认为，猪圆环病毒只有两种血清型，其中1型不具有致病性，2型是引起猪圆环病毒病的主要病原。近年来，随着PCV2全病毒灭活苗和亚单位疫苗的广泛使用，我国PCV2感染的发生率得到了一定的控制。然而，2016年，美国首次报道从发生繁殖障碍和呼吸道疾病的病猪分离到了一种新的病毒，经分离鉴定为猪圆环病毒3型(PCV3)，其基因组与PCV2的基因组同源性极低，只有37%左右。研究发现，我国多省份均有PCV3阳性病例。鉴于PCV2和PCV3 基因组同源性之间约30％的同源性，交叉保护似乎不太可能，同时，我国已经发现了PCV3，那么如何有效的预防该病已经成为目前研究的重点。
因此，本发明针对PCV2和PCV3对我国养猪业影响巨大，治疗仍然存在无特效药的困境，利用基因工程技术构建能够同时表达PCV2和PCV3 Cap蛋白中主要抗原位点的串联重组质粒，在串联蛋白的表达过程中发现PCV2-PCV3Cap蛋白表达效率较低，本发明根据大肠杆菌的偏好性，将PCV2-PCV3Cap的密码子进行优化，使其更有利于蛋白的表达。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高猪圆环病毒2型和3型Cap蛋白串联表达效率的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种提高猪圆环病毒2型和3型Cap蛋白串联表达效率的技术，所述方法包括如下：
（1）病毒DNA的提取
将确诊为PCV2和PCV3阳性病料充分磨碎，12000r/min离心5分钟，弃上清，按病毒DNA提取试剂盒说明书操作来提取DNA，于-80℃保存；
（2）引物设计与合成
根据NCBI库中的PCV2 ORF2基因序列( KU041859.1)和PCV3 ORF2基因序列（KX966193.1），为使基因在大肠杆菌中更好的表达，在不影响基因主要抗原位点的情况下对基因序列进行截短优化，利用Primer 5.0 软件设计两对特异性引物如下（带有下划线的为酶切位点）：
PCV2CAP-F：CGGGTACCAGCCATCTTGGCCAGATCCT （Kpn I）；
PCV2CAP -R：CTGGATCCAAGTGGGGGGTCTTTAAGATT （BamH I）；
该引物扩增片段大小661bp；
PCV3CAP-F：5´- CGGGATCCAGGCGCTATGTCAGAAGAAAA -3´（BamH I）；
PCV3CAP -R：5´- GCGTCGACCATTCCAGTTTTTTCCGGGA -3´（Sal I）；
该引物扩增片段大小为547bp。
（3） PCR扩增及测序
分别以PCV2核酸、PCV3核酸为模版，各自设计的特异性引物为模版，进行PCR扩增的目的基因产物，将PCR扩增产物测序。
（4）密码子的优化
将测序所得的密码子根据大肠杆菌的偏好性，利用密码子的简并性，对所测的序列进行优化，改变基因的密码子，但不改变其氨基酸，将优化后的序列在5端添加KpnI酶切位点，在3端添加SalI酶切位点，并按PCV2-PCV3连接顺序人工合成序列。
（5）PCR扩增
以人工合成的核酸为模版，PCV2CAP-F和PCV3CAP -R为引物，进行PCR扩增的目的基因产物再进行琼脂糖凝胶电泳，最后将含目的基因片段的琼脂糖凝胶按胶回收试剂盒说明书进行纯化得到PCV2-PCV3 Cap。
（6）重组表达质粒的连接
用Kpn I和Sal I 酶对PCV2-PCV3 Cap和PET-32a质粒双酶切后，T4连接酶4℃过夜连接，接着转化到DH-5а感受态细胞，涂于加有氨苄的LB培养基，第二天挑取培养板中的菌落进行PCR鉴定，并提取质粒进行酶切鉴定，将鉴定为阳性的质粒送至生工生物有限公司进行测序。PCV2Cap和PCV3Cap蛋白重组表达质粒命名为pET-32a-PCV2-PCV3 Cap。
（7）重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达
将优化重组串联质粒转化至Transetta(DE3) 感受态细胞中，挑取白色单克隆菌落并进行扩增菌量，同时将实验室保存的未优化的串联质粒感受态细胞进行菌量扩增，当OD600=1.0时，加入终浓度为1mmol.L-1的IPTG蛋白诱导剂进行诱导，同时设置Transetta(DE3) 空白菌转入PET-32a的空载体菌诱导组作为对照，最后进行SDS-PAGE检测。
本发明的优点在于：
1.本发明可以同时诱导表达针对猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型主要中和位点,该发明可用于开发猪圆环病毒2型和3型二联疫苗。
2.本发明针对串联蛋白重组质粒表达效率低的问题，对重组基因进行密码子优化，优化后的重组质粒明显的提高表达效率。
附图说明
图1 特异性PCR扩增电泳图，其中M:2000DNA分子质量标准; 1:PCV2Cap; 2:PCV3Cap。
图2A为密码子优化前编码效率图。
图2B为密码子优化后编码效率图。
图2C为密码子优化前GC含量分布图。
图2D为密码子优化后GC含量分布图。
图3串联表达PCV2-PCV3 Cap蛋白重组质粒的PCR鉴定电泳图，其中M:5000DNA分子质量标准; 1:T7（F、R）; 2:T7（F）、PCV3Cap（R）; 3:PCV2Cap(F)、 PCV3Cap(R); 4: PCV2Cap(F) 、T7（R）。
图4串联重组表达质粒的酶切鉴定电泳图，其中M:5000DNA分子质量标准; 1: 无酶切重组质粒; 2: Kpn I单酶切; 3: Kpn I＋Sal I双酶切; 4: Sal I单酶切。
图5重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达的SDS-PAGE图，其中A: (M: 蛋白质分子质量标准; 1: 优化前重组质粒菌诱导组; 2: 空白质粒诱导组); B:(M: 蛋白质分子质量标准; 1: 空白质粒诱导组; 2: 优化后重组质粒菌诱导组)。
具体实施方式
１材料与方法
1.1 表达载体
表达载体：pET-32a(+)（Promega北京生物技术有限公司）；克隆和表达宿主菌：DH5α和Transetta(DE3) 感受态细胞（北京全式金生物技术有限公司）。
1.2 主要试剂和仪器
主要仪器：伯乐T100梯度PCR仪(美国Bio-Rad公司)、MicroSmart微量高速离心机（北京鼎昊源科技有限公司）、ZHWY-103D恒温培养振荡器（智城分析仪器制造有限公司）、DYY16D电泳仪(北京六一生物技术有限公司)、Tanon 1600 全自动数码凝胶图像分析系统（上海天能科技有限公司）。
主要试剂：2000bpDNALadder、5000bpDNALadder（全式金生物技术有限公司）、病毒DNA提取试剂盒（天根生化科技(北京)有限公司）、琼脂糖凝胶DNA快速回收试剂盒（购自北京康为世纪生物技术公司）、Kpn 1 QuickCut 和Sal 1 QuickCut限制酶（宝生物工程（大连）有限公司）、高纯度质粒小提中量试剂盒（天根生化科技(北京)有限公司）、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（博士德生物技术有限公司）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。
1.3 病毒DNA的提取
将确诊为PCV2和PCV3阳性病料充分磨碎，12000r/min离心5分钟，弃上清，按病毒DNA提取试剂盒说明书操作来提取DNA，于-80℃保存。
1.4 引物设计与合成
根据NCBI库中的PCV2 ORF2基因序列( KU041859.1)和PCV3 ORF2基因序列（KX966193.1），为使基因在大肠杆菌中更好的表达，在不影响基因主要抗原位点的情况下对基因序列进行截短优化，利用Primer 5.0 软件设计两对特异性引物如下（带有下划线的为酶切位点），由福州擎科生物技术有限公司合成。
PCV2CAP-F：CGGGTACCAGCCATCTTGGCCAGATCCT （Kpn I）；
PCV2CAP -R：CTGGATCCAAGTGGGGGGTCTTTAAGATT （BamH I）；
该引物扩增片段大小661bp；
PCV3CAP-F：5´- CGGGATCCAGGCGCTATGTCAGAAGAAAA -3´（BamH I）；
PCV3CAP -R：5´- GCGTCGACCATTCCAGTTTTTTCCGGGA -3´（Sal I）；
该引物扩增片段大小为547bp。
1.5 PCR扩增及测序
分别以PCV2核酸、PCV3核酸为模版，各自设计的特异性引物为模版，进行PCR扩增的目的基因产物，将PCR扩增产物送上海生物工程技术服务有限公司测序。
1.6密码子的优化
将测序所得的密码子根据大肠杆菌的偏好性，利用密码子的简并性，对所测的序列进行优化，改变基因的密码子，但不改变其氨基酸，将优化后的序列在5端添加KpnI酶切位点，在3端添加SalI酶切位点，并按PCV2-PCV3连接顺序送上海生物工程技术服务有限公司人工合成序列。
1.5 PCR扩增
以人工合成的核酸为模版，PCV2CAP-F和PCV3CAP -R为引物为，进行PCR扩增的目的基因产物再进行琼脂糖凝胶电泳，最后将含目的基因片段的琼脂糖凝胶按胶回收试剂盒说明书进行纯化，得到PCV2-PCV3 Cap。
1.7 重组表达质粒的连接
用Kpn I和Sal I 酶对PCV2-PCV3 Cap和PET-32a质粒双酶切后，T4连接酶4℃过夜连接，接着转化到DH-5а感受态细胞，涂于加有氨苄的LB培养基，第二天挑取培养板中的菌落进行PCR鉴定，并提取质粒进行酶切鉴定，将鉴定为阳性的质粒送至生工生物有限公司进行测序。PCV2Cap和PCV3Cap蛋白重组表达质粒命名为pET-32a-PCV2-PCV3 Cap。
1.8.重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达
将优化重组串联质粒转化至Transetta(DE3) 感受态细胞中，挑取白色单克隆菌落并进行扩增菌量，同时将实验室保存的未优化的串联质粒感受态细胞进行菌量扩增，当OD600=1.0时，加入终浓度为1mmol.L-1的IPTG蛋白诱导剂进行诱导，同时设置Transetta(DE3) 空白菌转入PET-32a的空载体菌诱导组作为对照，最后进行SDS-PAGE检测，
2 结果与分析
2.1 PCR扩增结果
琼脂糖凝胶电泳结果表明， PCV2Cap引物可以特异地扩增到一条大小约为661bp的特异性条带，PCV3Cap引物可以特异地扩增到一条大小约为547bp的特异性条带，与预期的片段大小相符（如图1）。
2.2 PCV2和PCV3的Cap密码子优化及合成
由于串联的序列中存在较多的表达效率低下的密码子，这严重影响着目的蛋白的表达效率，因此，我们对串联的目的序列的密码子进行优化，优化序列送上海生物工程公司合成。合成的优化后的序列如图2A-2D所示。
2.2蛋白重组表达质粒的PCR鉴定结果
优化后的序列与PET-32a构建重组质粒pET-32a-PCV2-PCV3 Cap并转染DH5α，蓝白斑筛选。挑选白色单克隆菌，分别为T7（F、R）、T7（F）+ PCV3Cap（R）、PCV2Cap(F)+ PCV3Cap(R)、PCV2Cap(F) +T7（R）3对引物对阳性克隆菌落进行PCR鉴定，结果显示分别在1839bp、1729bp、1188bp和1308bp处得到相应的目的条带（图3），初步表明重组质粒成构建。
2.3串联重组表达质粒的酶切鉴定
为了进一步验证重组质粒的准确性，我们又进行了酶切鉴定。酶切鉴定结果显示（如图4）用Kpn I 和Sal I对串联重组的质粒进行单酶切的位置明显低于未经酶切的质粒，单酶切后显示的条带位置和预期的一样。用Kpn I＋Sal I、对串联重组的质粒进行双酶切，在1176bp位置上出现了特异条带，和预期的片段大小一样。酶切鉴定结果表明PCV2-PCV3Cap两个基因已成功插入至pET-32a质粒上。
2.4串联重组质粒的测序鉴定
重组质粒的测序结果进一步表明PCV2Cap和PCV3Cap的基因均在被准确的克隆到PET-32a-PCV2-PCV3Cap上，表明重组串联质粒PET-32a-PCV2-PCV3Cap构建成功。
2.5重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达
SDS-PAGE检测结果显示，未优化的串联质粒感受态细胞诱导后的菌液在约64Ku的位置出现了一条较不明显的条带（如图5A），而优化的串联质粒转染感受态细胞诱导后的在约64Ku的位置出现了一条非常明显的目的条带（如图5B）。表明经过优化的串联质粒其诱导表达目的基因的效率比未优化的串联质粒感高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 提高猪圆环病毒2型和3型Cap蛋白串联表达效率的方法
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgggtaccag ccatcttggc cagatcct 28
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctggatccaa gtggggggtc tttaagatt 29
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgggatccag gcgctatgtc agaagaaaa 29
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcgtcgacca ttccagtttt ttccggga 28

Claims (2)

1.一种提高猪圆环病毒2型和3型Cap蛋白串联表达效率的方法，其特征在于：所述方法采用以下两对特异性引物进行扩增：
PCV2CAP-F：CGGGTACCAGCCATCTTGGCCAGATCCT ，Kpn I；
PCV2CAP -R：CTGGATCCAAGTGGGGGGTCTTTAAGATT ，BamH I；
该引物扩增片段大小661bp；
PCV3CAP-F：5´- CGGGATCCAGGCGCTATGTCAGAAGAAAA -3´，BamH I；
PCV3CAP -R：5´- GCGTCGACCATTCCAGTTTTTTCCGGGA -3´，Sal I；
该引物扩增片段大小为547bp。
2.根据权利要求1所述的一种提高猪圆环病毒2型和3型Cap蛋白串联表达效率的方法，其特征在于：所述方法包括如下：
（1）病毒DNA的提取
将确诊为PCV2和PCV3阳性病料充分磨碎，12000r/min离心5分钟，弃上清，按病毒DNA提取试剂盒说明书操作来提取DNA，于-80℃保存；
（2） PCR扩增及测序
分别以PCV2核酸、PCV3核酸为模版，以权利要求1所述的特异性引物为模版，进行PCR扩增得目的基因产物，将PCR扩增产物测序；
（3）密码子的优化
将测序所得的密码子根据大肠杆菌的偏好性，利用密码子的简并性，对所测的序列进行优化，改变基因的密码子，但不改变其氨基酸，将优化后的序列在5端添加KpnI酶切位点，在3端添加SalI酶切位点，并按PCV2-PCV3连接顺序人工合成序列；
（4）PCR扩增
以人工合成的核酸为模版，权利要求1所述的PCV2CAP-F和PCV3CAP -R为引物，进行PCR扩增得目的基因产物再进行琼脂糖凝胶电泳，最后将含目的基因片段的琼脂糖凝胶按胶回收试剂盒说明书进行纯化得PCV2-PCV3 Cap；
（5）重组表达质粒的连接
用Kpn I和Sal I 酶对PCV2-PCV3 Cap和PET-32a质粒双酶切后，T4连接酶4℃过夜连接，接着转化到DH-5а感受态细胞，涂于加有氨苄的LB培养基，第二天挑取培养板中的菌落进行PCR鉴定，并提取质粒进行酶切鉴定，将鉴定为阳性的质粒进行测序；PCV2Cap和PCV3Cap蛋白重组表达质粒命名为pET-32a-PCV2-PCV3 Cap；
（6）重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达
将优化重组串联质粒转化至Transetta(DE3) 感受态细胞中，挑取白色单克隆菌落并进行扩增菌量，同时将实验室保存的未优化的串联质粒感受态细胞进行菌量扩增，当OD600=1.0时，加入终浓度为1mmol.L-1的IPTG蛋白诱导剂进行诱导，同时设置Transetta(DE3) 空白菌转入PET-32a的空载体菌诱导组作为对照，最后进行SDS-PAGE检测。
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