KR101280462B1 - Ｃｈｏ 세포 ｄｎａ의 검출 또는 정량용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CHO 세포 DNA 검출 또는 정량용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 CHO 세포 DNA를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 및 이를 함유하는 조성물은 CHO 세포 DNA만을 특이적으로 검출할 수 있어, 상기 세포를 숙주세포로 사용하여 바이오 의약품을 제조하는 과정에서 생산되는 상기 세포의 배양물이나 정제물에 함유된 CHO 세포 DNA를 효과적으로 검출하거나 정량하는데 용이하게 사용될 수 있다.

Description

ＣＨＯ 세포 ＤＮＡ의 검출 또는 정량용 조성물{Composition for detecting or measuring CHO cell DNA}
본 발명은 CHO 세포 DNA의 검출 또는 정량용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 CHO 세포 DNA를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브에 관한 것이다.
중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포는 정제 단백질 의약품을 만들어 내는 숙주세포로 많이 이용되고 있고 많은 관리기관의 승인 사례를 가지고 있다. CHO 세포에서 생산된 정제 단백질 의약품 내의 숙주 세포 DNA의 오염은 큰 위험 요소로 간주되지 않지만 가장 낮은 수준으로 조절되어야 하므로 세계보건기구(WHO)는 의약품에서 1회 복용량 당 숙주세포 DNA를 10 ng 이하로 권고하고 있다.
정제 단백질 의약품에서의 잔류 DNA를 검출하는 방법으로 blot hybridization 방법과 효소 반응을 이용한 THRESHOLD(Molecular Devices Corporation) 방법 그리고 정량 실시간 중합효소 연쇄반응 방법(quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction, PCR)이 있다. 그러나 Blot hybridization 방법은 다른 방법들에 비해 검출 및 정량 한계가 높은 단점이 있으며, THRESHOLD 방법은 실험 재료 가격이 비싸고 시료에 포함된 모든 DNA를 검출하는 단점이 있다. 반면, 정량 실시간 중합효소 연쇄반응(quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction, PCR) 방법은 다른 방법들에 비해 낮은 검출 및 정량 한계와 빠른 시간 안에 정확하게 정량할 수 있으며 현재 박테리아, 곰팡이, 바이러스 DNA를 검출하는데 사용되고 있다.
이에 본 발명자들은 CHO 세포에 특이적인 프라이머 및 프로브를 제작하고, 이를 이용하여 정량 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써 정제 단백질에 잔류하는 숙주세포 DNA를 정확하게 검출 및 정량할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포 DNA의 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브를 포함하는, CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포 DNA의 검출 또는 정량용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 조성물을 포함하는 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포 DNA의 검출 또는 정량용 키트를 제공하는 것이다.또한 본 발명의 목적은 (a) 시료에서 DNA를 추출하는 단계, (b) 상기 (a) 단계에서 추출된 DNA에 대해, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브로 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하는 단계 및 (c) 형광신호를 측정하는 단계를 포함하는 CHO 세포의 DNA를 검출 또는 정량하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포 DNA의 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브를 포함하는, CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포 DNA의 검출 또는 정량용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포 DNA의 검출 또는 정량용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 시료에서 DNA를 추출하는 단계, (b) 상기 (a) 단계에서 추출된 DNA에 대해, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브로 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하는 단계, 및 (c) 형광신호를 측정하는 단계를 포함하는 CHO 세포의 DNA를 검출 또는 정량하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에서 'CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포'는 중국 햄스터의 난소에서 유래된 세포로, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 CHO-DXB11, CHO-DG44 및 CHO-K1로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상을 포함한다.
본 발명에서 '시료'는 바이오 의약품 제조를 위해 CHO 세포를 숙주 세포로 사용하여 배양한 결과 수득한 배양물 또는 상기 배양물의 정제물일 수 있으며, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 재조합 단백질 또는 단클론 항체를 제조하기 위하여 형질전환된 CHO 세포의 배양물, 또는 이의 정제물일 수 있다. 상기 배양물 또는 정제물의 제조방법에 대해서는 당업계에 널리 알려져 있다. 상기 바이오 의약품은 이에 한정되지 않지만 정제 단백질일 수 있으며, 상기 정제 단백질은 약학적, 진단학적 특성 또는 상업적, 실험적 용도 또는 다른 용도에 유용한 특성을 지닌 정제 단백질을 포함한다. 또한, 상기 정제 단백질은 치료용 단백질일 수 있으며, 상기 치료용 단백질은 이에 한정되지 않지만 치료용 항체일 수 있다. 상기 항체는 단일클론항체, 다중클론항체를 포함한다. 또한, 상기 항체에는 비인간 동물 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 인간항체, 다른 분자(예를 들면, PEG 등의 고분자 등)가 결합한 수식 항체, 아미노산 서열이 개변된 항체, 당사슬이 개변된 항체 등 어떠한 항체도 포함된다.
본 발명에서 '프로브'는 CHO 세포 DNA, 바람직하게는 CHO 세포 게노믹 DNA, 더 바람직하게는 CHO 세포 게노믹 DNA의 표적 서열(도 2의 파란색 부분)에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 분자로, 방사성 동위원소, 리간드, 형광물질, 화학발광제 및 효소로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상이 부착될 수 있으며, 보다 바람직하게는 한쪽 말단에 형광 표지인자가 삽입되고 반대쪽 말단에 형광 억제물질이 삽입된 것일 수 있다. 구체적으로, 한쪽 말단(바람직하게는 5' 말단)에 6-FAM(6-carboxyfluorescein), TET(5'-Tetrachloro-Fluorescein), VIC, 6-JOE(6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein), NED, ROX(6-carboxy-X-rhodamine), Texas Red, Cy3, Cy5 및 HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나가 표지될 수 있고, 반대쪽 말단(바람직하게는 3' 말단)에 6-TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine), BHQ-1,2,3(Black Hole Quencher) 및 DABCYL 다크 형광억제물질(DABCYL Dark Quencher)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나가 표지될 수 있다.
상기 프로브는 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열로 표시될 수 있으나, 상기 표적 서열과 혼성체를 형성할 수 있다면 상기 서열의 일부 변경(결실, 치환 또는 부가)이 있는 경우에도 본 발명의 프로브에 포함된다. 예를 들어, 상기 서열번호 3의 염기서열과 80%, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%, 보다 더 바람직하게는 99% 상동성이 있는 경우에도 본 발명의 프라이머 세트에 포함된다.
본 발명의 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되며 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포 DNA를 특이적으로 검출할 수 있는 특징이 있으며, 구체적으로 본 발명의 프라이머 세트는 상기 시료에서 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포 DNA를 특이적으로 검출할 수 있으며, 특히 상기 시료는 박테리아, 바람직하게는 Sphingomonas Paucimobilis, Bacillus cereus 또는 Staphylococcus epidermidis로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상의 박테리아에 쉽게 오염될 수 있으나, 본 발명의 프라이머 세트는 상기 박테리아와 구별하여 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포의 DNA만을 특이적으로 검출할 수 있는 특징이 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 CHO 세포 DNA, 바람직하게는 CHO 세포 게노믹 DNA, 더 바람직하게는 CHO 세포 게노믹 DNA의 표적 서열(도 2의 붉은색, 초록색 부분)에 특이적으로 어닐링(annealing)하여 혼성체(hybrid)를 형성할 수 있는 특징이 있다. 상기 프라이머 세트는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4 가지 디옥시 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 것이 바람직하나, 상기 CHO 세포 DNA, 바람직하게는 CHO 세포 게노믹 DNA, 더 바람직하게는 CHO 세포 게노믹 DNA의 표적 서열(도 2의 붉은색, 초록색 부분)에 특이적으로 어닐링(annealing)하여 혼성체를 형성할 수 있다면 상기 서열의 일부 변경(결실, 치환 또는 부가)이 있는 경우에도 본 발명의 프라이머 세트에 포함된다. 예를 들어, 상기 서열번호 1 및 2의 염기서열과 80%, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%, 보다 더 바람직하게는 99% 상동성이 있는 경우에도 본 발명의 프라이머 세트에 포함된다.
한편, 본 발명의 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포 DNA의 검출 또는 정량용 조성물은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브를 포함하고 있어 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포 DNA를 특이적으로 검출하여 정량할 수 있다.
상기 CHO 세포 DNA는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 시료에 잔류하는 CHO 세포의 게노믹 DNA일 수 있으며, 상기 시료는 앞서 기재한 바와 같이 박테리아에 쉽게 감염될 수 있는CHO 세포의 배양물 또는 이의 정제물일 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 상기 박테리아와 구별하여 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포의 DNA만을 특이적으로 검출하고 정량화할 수 있는 특징이 있다.
본 발명의 조성물에는 상기 프라이머 세트 및 프로브가 혼성화 반응을 하기 위해 필요한 시약, DNA 폴리머라아제, dNTP를 추가적으로 포함할 수 있으며, 또한 상기 프라이머 세트 및 프로브를 안정화시키고, 반응의 매질이 되는 버퍼, 용매 등을 더 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포 DNA의 검출 또는 정량용 키트는 상기 본 발명의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 키트는 본 발명의 프라이머 및 프로브가 함유된 조성물을 포함하고 있어CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포 DNA를 특이적으로 검출하여 정량할 수 있다.
본 발명의 키트는 미생물 검출 키트에 통상적으로 사용되는 구성성분을 추가적으로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 PCR(Polymerase chain reaction), 보다 바람직하게는 RT-PCR(Real Time-Polymerase chain reaction)을 수행하는데 통상적으로 사용되는 성분 및 지지체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 지지체는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 니트로셀룰로오즈막, 폴리비닐수지로 합성된 96웰 플레이트(96 well plate), 폴리스티렌수지로 합성된 96 웰 플레이트, 또는 유리로 된 슬라이드글라스로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
한편, 본 발명의 CHO 세포의 DNA를 검출 또는 정량하는 방법은 (a) 시료에서 DNA를 추출하는 단계, (b) 상기 (a) 단계에서 추출된 DNA에 대해, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브로 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하는 단계, 및 (c) 형광신호를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 (a) 단계에서 시료에서 DNA를 추출하는 것은 당업계에 통상적으로 알려진 방법을 이용하면 가능하나, 바람직하게는 상용되는 DNA 추출 키트를 사용하여 용이하게 시료로부터 DNA를 추출할 수 있다.
앞서 기술한 바와 같이 상기 시료는 CHO 세포를 숙주 세포의 배양물 또는 상기 배양물의 정제물일 수 있으며 이들은 박테리아에 쉽게 오염될 수 있지만, 본 발명의 정량 또는 검출 방법을 이용하면 상기 박테리아를 제외하고 CHO 세포의 DNA만을 특이적으로 검출하거나 정량할 수 있다.
상기 (b) 단계에서 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행함으로써 CHO 세포의 DNA가 존재하는 경우에만 형광신호가 발생할 수 있다. 구체적으로 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트가 CHO 세포의 DNA에 특이적으로 혼성화하고, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브도 CHO 세포의 DNA에 혼성화되어 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하면서, 이에 한정되지 않지만 상기 프로브에 부착된 형광 표지인자와 형광 억제인자가 분리되어 형광신호가 발생할 수 있다.
상기 (b) 단계에서 PCR은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 정량 실시간 중합효소반응(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)일 수 있다. 상기 qRT-PCR 방법 및 장치에 대해서는 당업계에 공지된 방법 및 장치를 이용할 수 있으며, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 SLAN real time PCR detection system (LG 생명과학, 한국), LightCyclerTM (Roche, Germany), ABI PRISMTM 7000/7700, 7500 (Applied Biosystems, USA), iCyclerTM (Bio-Rad, USA), Rotor-GeneTM(Corbett, Australia) 또는 OpticonTM (PharmaTech, USA)일 수 있다.
상기 (b) 단계에서 PCR은, 상기 프라이머 세트 및 프로브가 혼성화 반응을 하기 위해 필요한 시약, DNA 폴리머라아제, dNTP를 추가적으로 포함하여 수행할 수 있으며, 또한 상기 프라이머 세트 및 프로브를 안정화시키고, 반응의 매질이 되는 버퍼, 용매 등을 더 포함하여 수행할 수 있다.
상기 (c) 단계에서 형광신호를 측정하는 것은 상기 (b) 단계에서 기재된 장치를 이용하여 당업자가 용이하게 측정할 수 있으며, 구체적으로 상기 프로브에 부착된 형광 표지인자와 형광 억제인자가 PCR 반응하는 과정에서 분리되어 발생하는 형광신호를 측정할 수 있다.
상기 (c) 단계를 통해 측정된 형광신호 세기를 표준시료(CHO 세포 DNA의 함량이 특정된 시료)를 통해 측정한 표준 곡선에 대입하여 실제 미지의 시료에 함유된 CHO 세포 DNA을 정량할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용하여 CHO-DXB11, CHO-DG44 및 CHO-K1에 대해 각각 표준곡선을 확보하여 각각 도 4a, 4b 및 4c에 기재하였으며, 상기 표준곡선이 직선성을 가짐을 확인하였으며, 이를 통하여 미지의 시료에 함유된 CHO 세포 DNA를 정량할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 프라이머 및 이를 함유하는 조성물은 CHO 세포 DNA만을 특이적으로 검출할 수 있어, 상기 세포를 숙주세포로 사용하여 바이오 의약품을 제조하는 과정에서 생산되는 상기 세포의 배양물이나 정제물에 함유된 CHO 세포 DNA를 효과적으로 검출하거나 정량하는데 용이하게 사용될 수 있다.
도 1은 CHO세포에서 배양한 재조합 단백질을 정제한 후 정제 단백질에 잔류하는 DNA를 추출하여 실시간 PCR를 통해 잔류 DNA를 검출 및 정량하는 과정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 CHO(Cricetulus griseus) 세포로부터 추출된 Genomic DNA 단편의 서열을 나타낸 것이다.
도 3a, 3b 및 3c는 각각 CHO-DXB11, CHO-DG44 및 CHO-K1 세포로부터 추출된 Genomic DNA를 주형으로 사용하여 농도별로 실시간 PCR을 수행한 결과이다.
도 4a, 4b 및 4c는 각각 CHO-DXB11, CHO-DG44 및 CHO-K1 Genomic DNA의 표준곡선의 직선성을 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예에 따라 상세히 설명한다. 하기의 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명이 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 프라이머 및 프로브의 제작
본 발명자들은 Peter Morin Nissom의 논문(Biologicals 35 (2007) 211-215)에 개시된 Cricetulus griseus (중국 햄스터) 세포로부터 추출된 Genomic DNA 단편의 서열(도 2)로부터 아래 표 1과 같은 정방향, 역방향의 프라이머 세트 및 프로브를 고안해 냈다.
프라이머와 프로브 서열
프라이머와 프로브 서열 서열번호
정방향 프라이머 5'- CCCTAGACTTGCTGTGGATGTG -3' 1
역방향 프라이머 5'- TTAGCAGACACTGTTGCAGAGACA -3' 2
프로브 서열 FAM 5'- ACCAGTCAGCTGATGTGGACACCCC -3' TAMRA 3
프로브와 프라이머의 제조 및 사용 방법은, 예를 들어 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992; 및 Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990에 자세히 설명되어 있다.
실시예 2: 정량 실시간 중합효소반응 전 준비과정
2-1. CHO Genomic DNA 표준 용액의 준비 및 DNA 추출
표준곡선을 그리기 위한 표준물질로 사용하기 위해 QIAGEN (카탈로그 번호. 13343) 키트를 이용하여 CHO-K1 세포 Genomic DNA를 추출하고 1 ㎍/㎖로 희석하였다. 상기 CHO-K1 세포(ATCC로부터 입수, 카탈로그 번호: CCL-61, 로트 번호: 3442943) Genomic DNA 표준 저장용액(1 ㎍/㎖)으로부터 표준 용액을 준비하였다. 먼저, 표준 용액(100,000 pg/㎖)은 1 ㎍/㎖ 용액으로부터 10배 희석하여 준비하였다. 표준용액(No.1)을 만들기 위해 100,000 pg/㎖를 DNA 추출 키트(Wako Pure Chemical Industries, 카탈로그 번호: 295-50201)로 추출한 후 각각의 표준용액(No.2-6)를 10배씩 순차적으로 희석하여 준비하였다. 10배 희석은 아래 표 2와 같이 뉴클레이즈 프리워터(nuclease-free water) (Ambion, 카탈로그 번호: 9937)를 이용하여 준비하였고 최고 속도에서 간단하게 볼텍싱(vortexing)하였다. 최종적으로, CHO-K1 Genomic DNA 표준 용액들을 100,000 pg/㎖, 10,000 pg/㎖, 1,000 pg/㎖, 100 pg/㎖, 10 pg/㎖, 및 1 pg/㎖로 준비하였다.
CHO Genomic DNA 표준 용액의 희석
표준용액
번호		 CHO gDNA 농도
(pg/㎖)		 희석 방법
1 100,000 DNA 키트를 이용한 100,000 pg/㎖ CHO Genomic DNA 추출
2 10,000 1번 표준용액 100 ㎕ + 뉴클레이즈 프리 워터 900 ㎕
3 1,000 2번 표준용액 100 ㎕ + 뉴클레이즈 프리 워터 900 ㎕
4 100 3번 표준용액 100 ㎕ + 뉴클레이즈 프리 워터 900 ㎕
5 10 4번 표준용액 100 ㎕ + 뉴클레이즈 프리 워터 900 ㎕
6 1 5번 표준용액 100 ㎕ + 뉴클레이즈 프리 워터 900 ㎕
7 0 DNA 키트를 이용한 뉴클레이즈 프리 워터 추출
CHO-K1, CHO-DXB11 및 CHO-DG44의 Genomic DNA의 표준용액은 상기와 동일한 방법으로 준비하였다. 또한, CHO Genomic DNA의 품질관리용 대조군 용액 및 스파이크 시료에 대한 하기 실시예에서도 CHO-DXB11 및 CHO-DG44 세포는 CHO-K1 세포와 동일한 방법으로 준비하였으므로, 이하 CHO-K1 세포를 중심으로 기술하고 CHO-DXB11 및 CHO-DG44 세포에 대한 기술은 생략하기로 한다.
표준용액의 DNA은 DNA 추출 키트(Wako Pure Chemical Industries, 카탈로그 번호: 295-50201)를 이용하여 다음과 같이 추출하였다.
65 ㎕ 글리코겐 용액을 26 ㎖ 요오드화 나트륨 용액에 넣었다. 2 ㎕ 글리코겐 용액을 40 ㎖ 세척 용액에 넣고 즉시 혼합하였다. 100,000 pg/㎖ CHO-K1 Genomic DNA 표준용액과 블랭크로서 뉴클레이즈 프리 워터의 각각 500 ㎕를 2 ㎖ 무균 튜브에 분배하였다. 튜브에 20 ㎕ sodium N-lauoyl sarcosinate를 넣고 혼합하였다. (하얀 침전물이 생기는 경우, 가열 블록과 디지털 온도계를 이용하여 60±5℃에서 10분간 배양하였다) 10 ㎕ 단백질 분해 효소 K (20 mg/㎖) (New England Biolabs, 카탈로그 번호: P8102S)를 넣은 뒤 섞어주었다. 그리고 이것을 가열 블록에서 60±5℃에서 20분간 배양하였다. 글리코겐이 들어있는 NaI 용액 500 ㎕를 넣고 볼텍싱한 후 가열 블록에서 50±5℃에서 15분간 배양하였다. 900 ㎕ 이소프로판올 (Sigma-Aldrich, 카탈로그 번호: I9782)을 넣은 후 상온에서 30±5분간 상온에서 방치하였다. 간단하게 원심분리(13,000RPM X 15분)한 후 흰색 침전물을 확인하였다. 상층액과 튜브 벽에 남은 용액을 파이펫을 이용하여 제거하였다. 800 ㎕ 세척용액을 튜브에 넣고 튜브 벽에서 침전물이 떨어지도록 볼텍싱하였다. 원심분리 후 (13,000RPM X 10분) 마이크로 파이펫을 이용하여 상층액을 제거하였다. 글리코겐이 들어 있는 세척용액 1,500 ㎕를 튜브에 넣고 볼텍싱하였다. 원심분리 후 (13,000RPM X 10 분) 상층액을 제거하였다. 남은 침전물에는 DNA와 운반체 글리코겐이 들어 있다. 침전물을 상온에서 약 30분간 공기 건조 후, 침전물을 500 ㎕ 뉴클레이즈 프리 워터에 녹였다.
2-2. CHO Genomic DNA 품질관리용 대조군 용액의 준비 및 DNA 추출
CHO Genomic DNA의 품질관리용 대조군 용액들은 상기 실시예 2-1에서 준비한 CHO Genomic DNA 저장 용액(1 ㎍/㎖)으로부터 준비하였다. 100,000 pg/㎖, 1,000 pg/㎖ 및 100 pg/㎖의 CHO Genomic DNA 용액은 1,000,000 pg/㎖ CHO Genomic DNA 용액으로부터 10배씩 희석하여 준비하였다. 10배 희석은 100 ㎕ CHO Genomic DNA 용액과 900 ㎕ 물을 섞어서 준비하였다. 각 3개의 품질 대조군 용액들은 ㎖ 당 100,000 pg, 1,000 pg, 및 100 pg의 표준 용액을 20배씩 희석하는 방법을 이용하여 준비하였다. 20배 희석하는 것은 50 ㎕의 DNA를 950 ㎕의 물에 넣고 최고 속도에서 간단하게 볼텍싱하여 준비하였다. 최종적으로, CHO Genomic DNA 품질관리용 대조군 용액들을 ㎖ 당 5,000 pg, 50 pg, 및 5 pg이 되게 준비하였다.
CHO Genomic DNA 품질관리용 대조군 용액의 희석
시료 번호 CHO gDNA 농도
(pg/㎖)		 희석 방법
1 5,000 표 2의 1번 표준용액 50 ㎕ + 뉴클레이즈 프리 워터 900 ㎕
2 50 표 2의 3번 표준용액 50 ㎕ + 뉴클레이즈 프리 워터 900 ㎕
3 5 표 2의 4번 표준용액 50 ㎕ + 뉴클레이즈 프리 워터 900 ㎕
품질관리용 대조군 용액의 DNA은 DNA 추출 키트(Wako Pure Chemical Industries, 카탈로그 번호: 295-50201)를 이용하여 추출하였다. 각각의 CHO Genomic DNA 품질관리용 대조군 용액의 500 ㎕씩을 뚜껑이 달린 2 ㎖ 무균 튜브에 분배하였고, 그 이하의 DNA 추출 과정은 상기 실시예 2-1에 기재된 표준용액의 DNA 추출 방법과 동일하게 수행하였다.
2-3. 재조합 단백질 시료의 준비 및 DNA 추출
본 실시예에서 사용된 재조합 단백질 시료의 조성은 다음 표와 같다.
재조합 단백질 시료의 조성
시료 조성
시료 1 재조합 단백질 (25 mg/㎖), 10 mM 트리스, 4% 마니톨, 1% 슈크로즈
시료 2 단일 클론 항체A (20 mg/㎖), 25 mM 구연산나트륨, 154 mM 염화 나트륨, 0.07% 트윈 80
시료 3 단일 클론 항체B (20 mg/㎖), 5 mM L-히스티딘, 100 mM 트레할로즈, 0.01% 트윈20
재조합 단백질에 존재하는 잔류 DNA는 DNA 추출 키트(Wako Pure Chemical Industries, 카탈로그 번호: 295-50201)를 이용하여 추출하였다. 재조합 단백질 시료의 단백질 농도를 1 mg/㎖ 20 mg/㎖ 의 범위 안의 농도가 되도록 희석하였다. 희석된 재조합 단백질 시료 500 ㎕를 뚜껑이 달린 2 ㎖ 무균 튜브에 분배하였다. 그 이하 DNA 추출 과정은 상기 실시예 2-1에 기재된 표준용액의 DNA 추출 방법과 동일하게 수행하였다.
2-4. 스파이크 시료의 준비 및 DNA 추출
1.7 ㎖ 마이크로퓨즈 튜브에 표 4의 각 재조합 단백질 시료를 495 ㎕씩 첨가하여 스파이크 시료 혼합물을 준비하였다. 각 튜브에 상기 실시예 2-1에서 준비한 1,000,000 pg/㎖ CHO-K1 Genomic DNA 표준 저장용액을 5 ㎕씩 넣고 완전히 섞었다.
스파이크 시료 혼합물의 구성
시료에 스파이크된
DNA의 농도		 CHO Genomic DNA
(1,000,000 pg/㎖)		 재조합 단백질 시료
10,000 pg/㎖ 5 ㎕ 495 ㎕
스파이크 시료의 DNA은 DNA 추출 키트(Wako Pure Chemical Industries, 카탈로그 번호: 295-50201)를 이용하여 추출하였다. 각각의 스파이크 시료의 500 ㎕를 뚜껑이 달린 2 ㎖ 무균 튜브에 분배하였고, 그 이하의 DNA 추출 과정은 상기 실시예 2-1에 기재된 표준용액의 DNA 추출 방법과 동일하게 수행하였다.
2-5. 마스터 혼합물의 준비
표 6과 같이 혼합하여 마스터 혼합물을 준비하였다. (혼합물에서 프라이머와 프로브의 최종 농도는 435 나노몰랄 농도이다). TaqMan 2X Universal PCR Master mix는 Applied Biosystems (카탈로그 번호: 4304437)에서 입수하였다.
마스터 혼합물의 구성성분, 프라이머들, 및 프로브
TagMan Universal PCR Master mix (2X) 1,500 ㎕
정방향 프라이머 (10 μM) 75 ㎕
역방향 프라이머(10 μM) 75 ㎕
프로브(10 μM) 75 ㎕
2-6. 적재할 DNA 표준 용액의 준비
96 well 광학 반응 플레이트로 적재할 DNA 표준 용액을 준비하였다. 7개의 1.7 ㎖ 마이크로퓨즈 튜브에 50 ㎕의 마스터 혼합물을 넣었다. 첫 번째 튜브에 DNA가 추출된 50 ㎕의 100,000 pg/㎖ 표준 용액(상기 실시예 2-1에서 준비)을 첨가하고 위아래로 부드럽게 6번 피펫팅하거나 최고속도로 볼텍싱하여 완전히 섞었다. 튜브를 닫고 모든 용액이 플레이트로 적재되도록 준비될 때까지 옆에 놓았다. 남아있는 5개의 DNA 표준 용액과 블랭크 용액에 대해 이 과정을 반복하였다.
2-7. 적재할 품질관리 대조군 용액의 준비
96 well 광학 반응 플레이트로 적재할 품질관리 대조군 용액을 준비하였다. 1.7 ㎖ 마이크로퓨즈 튜브에 50 ㎕의 DNA 추출된 5,000 pg/㎖의 품질관리 대조군 용액(상기 실시예 2-2에서 준비)을 넣었다. 튜브에 50 ㎕의 마스터 혼합물을 첨가하였다. 용액을 위아래로 부드럽게 6번 피펫팅하거나 최고속도로 볼텍싱하여 완전히 섞었다. DNA 추출된 50 pg/㎖과 5 pg/㎖농도의 품질관리 대조군 용액에 대해 이 과정을 반복하였다. 모든 용액이 플레이트로 적재되도록 준비될 때까지 튜브를 옆에 놓았다.
2-8. 적재할 시료의 준비
96 well 광학 반응 플레이트로 적재할 첫 번째 DNA 시료를 준비하였다. 상기 DNA 시료는 실시예 2-3의 재조합 단백질에서 추출한 잔류 DNA 시료를 말한다. 깨끗한 1.7 ㎖ 마이크로퓨즈 튜브에 50 ㎕의 추출된 DNA 시료를 첨가하였다. 튜브에 50 ㎕의 마스터 혼합물을 넣고 위아래로 부드럽게 6번 피펫팅하거나 최고속도로 볼텍싱하여 완전히 섞었다. 튜브를 닫고 모든 용액이 플레이트로 적재되도록 준비될 때까지 옆에 놓았다. 모든 남아있는 시료들에 대해 이 과정을 반복하였다.
2-9. 적재할 스파이크 시료의 준비
96 well 광학 반응 플레이트로 적재할 첫 번째 스파이크 시료를 준비하였다. 상기 스파이크 시료는 실시예 2-4의 스파이크 시료 혼합물에서 추출한 DNA 시료를 말한다. 1.7 ㎖ 마이크로퓨즈 튜브에 50 ㎕의 DNA 추출된 스파이크 시료를 첨가하였다. 튜브에 50 ㎕의 마스터 혼합물을 넣고 위아래로 부드럽게 6번 피펫팅하거나 최고속도로 볼텍싱하여 완전히 섞었다. 튜브를 닫고 모든 용액이 플레이트로 적재되도록 준비될 때까지 옆에 놓았다. 남아있는 모든 스파이크 시료 용액에 대해 이 과정을 반복하였다.
2-10. 적재할 블랭크 (No Extraction)의 준비
96 well 광학 반응 플레이트로 적재할 블랭크 (No Extraction) 혼합물을 준비하였다. 1.7 ㎖ 마이크로퓨즈 튜브에 50 ㎕의 뉴클레이즈 프리 워터를 첨가하였다. 튜브에 50 ㎕의 마스터 혼합물을 넣고 위아래로 부드럽게 6번 피펫팅하거나 최고 속도로 볼텍싱하여 완전히 섞었다. 튜브를 닫고 모든 용액이 플레이트로 적재되도록 준비될 때까지 옆에 놓았다.
실시예3: 정량 실시간 중합효소반응
PCR 플레이트에 있는 각각 3개의 well에 준비된 25 ㎕의 각 표준 용액 혼합물 준비된 25 ㎕의 품질관리 대조군 용액 준비된 25 ㎕의 시료와 스파이크 시료 용액 준비된 25 ㎕의 블랭크 (No Extraction) 을 첨가한 다음, 광학 접착 커버로 플레이트를 덮었다.
그 후, 정량 PCR에 대한 7500 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems, 미국)을 설정하였다. 온도 및 시간의 사이클링 매개 변수들은 아래 표와 같다.
온도 사이클링 매개 변수들
온도와 시간
초기 단계
 45 사이클
용해 가열/냉각 확장
고정 고정 15초, 95℃
 60초, 55℃
 60초, 72℃
2분, 50℃ 10분, 95℃
7500 실시간 PCR 시스템에 96 well 플레이트를 적재하고, 정량 실시간 PCR 실행하였다. 실행 완료 후 데이터를 분석하였다.
실시예 4: 반응결과 분석
4-1. 데이터 분석
표준 곡선은 ㎖ 당 pg에 대한 대수 (x 값)에 대한 CT (y 값)의 DNA양을 곡선으로 작성함으로써 만들어진다. CT는 각각의 세 반복 값에 대한 CT의 중간값이 산정되고, 시료의 농도(x 값)는 기울기와, CT 값을 기초로 한 표준 곡선으로부터 결정된 y절편을 이용하여 계산된다. 한계치는 0.1로, 기준선은 사이클 3에서 사이클 15로 설정한다.
4-2. 반응결과
가. 직선성
표1의 프라이머와 프로브 서열은 세가지 CHO 세포들 (CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DXB11)의 Genomic DNA를 검출하는데 있어 1.00에 가까운 직선을 보였다 (도 4a 내지 4c 참조). 상기 CHO-K1 세포는 ATCC (카탈로그 번호: CCL-61, 로트 번호: 3442943)로부터 입수하고, 상기 CHO-DG44 및 CHO-DXB11 세포는 Lawrence Chasin (Department of biological science, 콜럼비아 대학교, 미국)로부터 입수하였다.
나. 회수율
각각의 정제 단백질 시료(시료 1-3, 표 4)에서 잔류하는 숙주세포의 Genomic DNA를 추출하기 위해 DNA 추출 키트를 사용했을 때 100%에 가까운 회수율을 보였다 (표 8 내지 10 참조).
CHO-DXB11 Genomic DNA의 품질관리 대조군 시료와 시료1에서의 회수율
품질관리 대조군 시료의 회수율
품질관리 대조군 시료의 DNA 농도 CT 값 측정된 값
(pg/㎖)		 이론값
(pg/㎖)		 회수율 (%)
5,000 pg/㎖ 25.59 5207.61 5,000 104.15
50 pg/㎖ 33.21 44.60 50 89.21
5 pg/㎖ 37.10 3.94 5 78.76
CHO-DXB11에서 생산된 정제단백질 시료 1의 회수율
시료에 첨가된
DNA의 양		 CT 값 측정된 값
(pg/㎖)		 이론값
(pg/㎖)		 회수율 (%)
N/A 검출 안됨 0 N/A N/A
10,000 pg/㎖ 24.62 9542.33 10,000 95.42
CHO-DG44 Genomic DNA의 품질관리 대조군 시료와 시료2에서의 회수율
품질관리 대조군 시료의 회수율
품질관리 대조군 시료의 DNA 농도 CT 값 측정된 값
(pg/㎖)		 이론값
(pg/㎖)		 회수율 (%)
5,000 pg/㎖ 25.55 4923.84 5,000 98.48
50 pg/㎖ 33.07 43.32 50 86.63
5 pg/㎖ 36.26 5.83 5 116.54
CHO-DG44에서 생산된 정제단백질 시료 1의 회수율
시료에 첨가된
DNA의 양		 CT 값 측정된 값
(pg/㎖)		 이론값
(pg/㎖)		 회수율 (%)
N/A 검출 안됨 0 N/A N/A
10,000 pg/㎖ 24.51 9440.77 10,000 94.41
CHO-K1 Genomic DNA의 품질관리 대조군 시료와 시료3에서의 회수율
품질관리 대조군 시료의 회수율
품질관리 대조군 시료의 DNA 농도 CT 값 측정된 값
(pg/㎖)		 이론값
(pg/㎖)		 회수율 (%)
5,000 pg/㎖ 24.51 5391.34 5,000 107.83
50 pg/㎖ 32.06 50.46 50 100.93
5 pg/㎖ 35.84 4.89 5 97.75
CHO-K1에서 생산된 정제단백질 시료 1의 회수율
시료에 첨가된
DNA의 양		 CT 값 측정된 값
(pg/㎖)		 이론값
(pg/㎖)		 회수율 (%)
N/A 검출 안됨 0 N/A N/A
10,000 pg/㎖ 23.51 9970.87 10,000 99.71
다. 특이성
표1의 프라이머와 프로브 서열은 박테리아(S. Paucimobilis, B. cereus and S. epidermidis) Genomic DNA와는 PCR 반응을 보이지 않았고 오직 CHO 세포들에서만 특이적인 PCR 반응을 보였다 (표 11 참조). 상기 세 가지 박테리아는 재조합 단백질 배양 공정 중 오염될 가능성이 높은 균주이다.
세 가지 박테리아 DNA 혼합물(S. Paucimobilis, B. cereus and S. epidermidis )에서의 CHO-DG44 DNA의 회수율
CHO-DG44
Genomic DNA 양
(pg/㎖)		 세가지 박테리아 Genomic DNA 혼합물 (pg/㎖) 측정된 값
(pg/㎖)		 이론값
(pg/㎖)		 회수율
(%)
5,000 0 4781.58 5,000 95.63
1,000,000 5224.28 5,000 104.49
1,000 5053.09 5,000 101.06
50 0 55.73 50 111.46
1,000,000 57.31 50 114.62
1,0000 51.08 50 102.16
5 0 5.52 5 110.40
1,000,000 4.85 5 97.00
1,000 5.09 5 101.80
지금까지 예시적인 실시 태양을 참조하여 본 발명을 기술하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며, 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시 태양으로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구범위의 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브를 포함하고, 상기 프로브는 한쪽 말단에 형광 표지인자가 삽입되고 반대 쪽 말단에 형광 억제물질이 삽입된 것이며, 상기 프라이머 세트 및 프로브의 검출 또는 정량 한계가 1 pg/mL인, CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포 DNA의 검출 또는 정량용 조성물.
  3. 삭제
  4. 제2항에 있어서, 상기 CHO 세포 DNA는 시료에 잔류하는 CHO 세포의 게노믹 DNA인 조성물.
  5. 제2항 또는 제4항의 조성물을 포함하는 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포 DNA의 검출 또는 정량용 키트.
  6. (a) 시료에서 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 추출된 DNA에 대해, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브로 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
    (c) 형광신호를 측정하는 단계를 포함하고,
    상기 프로브는 한쪽 말단에 형광 표지인자가 삽입되고 반대 쪽 말단에 형광 억제물질이 삽입된 것이며,
    상기 프라이머 세트 및 프로브의 검출 또는 정량 한계가 1 pg/mL인,
    CHO 세포의 DNA를 검출 또는 정량하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 PCR은 정량 실시간 중합효소반응(quantitative real-time polymerase chain reaction)인 검출 또는 정량하는 방법.
  8. 삭제
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Biologicals, Vol. 35, No. 3, pp. 211-215 (2006.10.30.) *
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