CN114703306A - 一种生殖支原体parC基因突变类型的检测方法与试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生殖支原体parC基因突变类型的检测方法与试剂盒，所述检测方法用于检测生殖支原体parC基因的8个突变类型，其中8个突变类型的检测靶标为(1)ParC S83I，(2)ParC S83C，(3)ParC S83N，(4)ParC S83R，(5)ParC D87G，(6)ParC D87N，(7)ParC D87H，(8)ParC D87Y，本发明进一步提供分别针对8个突变类型检测的反应引物序列SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9，本发明利用高分辨率熔解曲线分析技术(High Resolution Melting，HRM)结合未标记探针检测所述8个突变类型。

Description

一种生殖支原体parC基因突变类型的检测方法与试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，涉及一种生殖支原体parC基因的8个突变类型的检测方法，特别涉及一种生殖支原体parC基因的8个突变类型的方法及其试剂盒。

背景技术

生殖支原体于1980年首次从两名男性非淋菌性尿道炎患者的样本中分离出来。生殖支原体感染在男性非衣原体非淋菌性尿道炎中占10-35％。在女性患者中，生殖支原体与宫颈炎和盆腔炎(PID)有关。然而，由于缺乏可靠的检测方法，在该病原体被发现的后续10年间，生殖支原体在细菌的临床重要性确定的方面几乎没有什么进展。生殖支原体一种生长极其缓慢且挑剔的细菌，而新的分离株是在经过一系列技术培养后才获得的，在Vero细胞中的临床样本共培养技术已经建立。生殖支原体培养周期长(长达六个月)，并且培养的灵敏度差。因此，生殖支原体相关培养技术的开发对生殖支原体的耐药流行病学监测和以及了解其背后的遗传机制至关重要。实际上，有研究表明，核酸检测法(NAATs)的灵敏度高于培养法。

生殖支原体感染是男性非衣原体非淋菌性尿道炎主要致病病原体，与女性宫颈炎和盆腔炎(PID)有关。目前尚未有针对生殖支原体的有效疫苗，有效的抗菌治疗仍是治疗和控制生殖支原体感染的主要手段。大环内酯类抗生素(阿奇霉素)是生殖支原体感染的指南推荐一线用药。但是由于阿奇霉素的运用场景广泛，且用药剂量高，在很多地区的生殖支原体感染中的耐药率已经高达50％。因此，二线推荐用药氟喹诺酮类抗生素(氟喹诺酮)逐渐在很多地区成为生殖支原体感染的主要用药。不幸的是，近年来不断有氟喹诺酮耐药的生殖支原体临床样本被报导，严重地威胁着当前推荐的治疗方案。

加强生殖支原体氟喹诺酮耐药性的监测是控制和预测耐药趋势的必要手段，以确保当前推荐治疗方案的有效性。常规的耐药检测手段主要是基于细菌的分离培养法，通过纯培养获得分离株，观察分离株在相应的抗生素浓度下的生长情况从而对淋球菌的耐药性进行评价。但是由于生殖支原体极其难培养，该方法在临床及实验室都难以实行，而全基因组测序技术(Whole-genome sequencing，WGS)，通过获得生殖支原体的全基因组序列信息，进而分析携带的耐药情况，已成功应用于生殖支原体的分子流行病学筛查和耐药性监测。全基因组测序技术的优势是显而易见的，它可以提供更全面的耐药信息，追踪不同耐药株亲缘关系与进化关系，分析特定人群、地区的耐药株分布与变异。但是成本高昂、需要专业的人员进行数据分析，并且一次可处理的样本有限。幸运的是在过去几十年年里，在研究生殖支原体的分子耐药机制方面取得了巨大进展，使得建立分子筛查方法以检测特定的耐药基因成为可能。一系列核酸扩增方法(Nucleic acid amplification testing，NAAT)凭借耗时短、操作简便、自动化等优点快速建立起来，取代培养法逐渐成为检测生殖支原体耐药性的首选。氟喹诺酮耐药主要由parC基因的83与87位点的突变介导，常规的NAAT技术均以这两个位点为检测氟喹诺酮耐药的分子靶标。然而，由于上述两个位点突变十分复杂(ParCS83I，S83C，S83N，S83R，D87G，D87N，D87H，D87Y)，常规的NAAT技术均无法覆盖所有突变型。现有的荧光定量PCR方法为覆盖所有突变型需要设计多孔和多条探针，大大地增加了这些方法在应用中的成本。

高分辨率熔解曲线分析技术(High Resolution Melting，HRM)是近年来兴起的一种新型的结合饱和荧光染料、未标记探针和实时荧光定量PCR的检测基因突变与基因分型的分子诊断技术。HRM在实时荧光定量PCR的基础之上，在体系中加入饱和荧光染料，利用高精密度的仪器，通过PCR产物的高分辨率熔解实时监控DNA解链过程，根据熔解曲线的特征变化来分析DNA序列的微小差异。由于HRM具有快速、准确、高通量、特异性强、灵敏度高、成本低廉和实现真正的闭管操作等优点，因此广泛应用于序列分析、基因分型、突变位点扫描、单核苷酸多态性分析以及临床检测等领域。此外，基于HRM技术，我们创新性地加入未标记的探针，因为探针的序列较短，会放大不同位点的相同碱基突变产生的轻微的温度差，进一步提高了方法的分型能力。由于加入的探针无需荧光标记，大大降低检测成本，反应结束后直接通过高分辨率熔解曲线即可快速灵敏地分析实验结果，获得多种突变信息。

发明内容

一种用于检测生殖支原体parC基因的8个突变类型的专用引物，所述parC基因的8个突变类型的检测靶标为：(1)ParC S83I，(2)ParC S83C，(3)ParC S83N，(4)ParC S83R，(5)ParC D87G，(6)ParC D87N，(7)ParC D87H，(8)ParC D87Y；所述引物序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9。

本发明所述的引物，共有4套引物组，第一套引物组由三条引物组成，一条为正向引物，一条为反向引物，最后一条为3’端磷酸化的引物；其余三套引物组由两条引物组成，一条为正向引物，一条为反向引物，分别针对parC基因的8个突变类型，其对应关系见表1

本发明进一步提供一种用于检测生殖支原体parC基因的8个突变类型的检测试剂盒，其中包括本发明所述的引物。

本发明所述的试剂盒，还包括检测过程中必要的其他试剂或物品。如包括采样管、粗提试剂Lysis buffer、反应组分EvaGreen Master Mix(扩增酶、扩增buffer、dNTP和EvaGreen荧光染料)、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为为各检测靶点的野生型阳性样本，所述阴性对照为ddH2O。本发明所包括的检测试剂或物品的量为1人份，或多人份，所述多人份可以是2-1000人份。

本发明进一步提供一种生殖支原体parC基因的8个突变类型的检测方法，包括使用本发明所述的试剂盒的步骤。如

1)使用试剂盒方法或裂解法完成样本基因组DNA的提取；

2)以待测样本的基因组DNA为模板，在上述专用引物组的引导下配制HRM扩增反应体系，进行特异性扩增；

3)在PCR过程中，由于目标序列的序列特异性，会造成不同PCR产物的碱基含量差异，根据DNA本身的性质，在饱和染料的作用下，对PCR扩增子进行加热，通过实时监测升温过程中荧光强度的变化，将检测结果进行数据整合及图像绘制，生成PCR产物熔解曲线，根据熔解曲线的不同来判断PCR产物中DNA序列的差异。

优选的，本发明所述的检测方法，包括以下步骤：

1)使用试剂盒提供的样本采集管收集病人生殖道分泌物或者尿液样本；

2)对于尿液样本，8,000rpm离心10min后，弃上清，向样本采集管中加入适量粗提试剂Lysis buffer；对于分泌物的拭子样本，向样本采集管中加入适量粗提试剂Lysisbuffer，搅拌，将拭子浸泡在Lysis buffer中5min；

3)将样本采集管置于金属浴或水浴锅中，95℃加热10min，室温静置，完成样本基因组DNA的提取；

4)以上述步骤获得样本基因组DNA为模板，在2个Assay的引物组中实现生殖支原体parC基因的8个突变类型的检测。其中20μl的反应体系包括：10μl的EvaGreen MasterMix，Assay中各引物的最佳扩增浓度见表1，样本基因组DNA 2μl，ddH2O补足至20μl，每次检测反应均同时引物阳性对照和阴性对照反应管；

5)在QuantStudio 6Flex Real-Time PCR System进行扩增反应和HRM分析。扩增反应的条件为：95℃孵育10分，接着95℃退火15秒，60℃延伸1分钟，共进行30个循环扩增反应结束后，40℃孵育1分钟，随后以0.025℃/s到95℃的速率缓慢升温，连续收集荧光信号；

6)反应结束后使用QuantStudio 6and 7Flex Real-Time PCR software v1.0进行分析，软件会自动生成扩增子对应的熔解曲线和Tm值，通过与不同突变型别的阳性对照进行对比，判断结果，若待测样本的parC突变位点突变型别与对照样本相同则熔解曲线形状无变化，若待测样本与对照样本不同会形成突变，熔解曲线形状也会相应发生改变。

本发明的专用引物组，能准确区分野生型和突变型的最佳引物对。

本发明所提供的用于多重检测生殖支原体parC基因的8个突变类型的专用引物组，是选取与二线用药(氟喹诺酮)耐药相关的parC基因作为检测的靶基因。首先从GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中下载各生殖支原体经过完整注释作为参考序列的代表株基因序列，将参考序列与NCBI的nr数据库进行核酸序列BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，下载比对得到的结果，获取更多检测靶基因序列。将所有下载序列进行多重比对分析，使用Beacon Designer 8.0软件在针对mgpa、HBB基因以及parC基因的83和87位点两侧设计特异性的扩增引物，使用NCBI在线的引物工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer blast/)验证引物的特异性。用oligocalc(http://biotools.nubic.norwestern.edu/oligocalc.html)和UMELT在线软件(https://www.dna.utah.edu/umelt/umelt.html)预测扩增产物的熔解温度(Meltingtemperature，Tm)。特异性引物可扩增parC基因的83到87位点，形成Tm值较高的主产物峰，初步对这段序列进行分型。此外针对parC基因的83到87位点设计一条探针，探针应该完美匹配ParC S83I突变型的序列，探针3’端磷酸化阻止探针延伸。针对mgpa、HBB基因以及parC基因的83和87位点两侧设计6组引物对，并筛选出能准确区分野生型和突变型的最佳引物对。设计四条不同长短的探针进行测试，选择不同突变型Tm差异最大的探针。最后，选择能准确区分野生型和多种突变型的最佳引物对和探针，形成最终多重的HRM分析体系。选取mgpa靶标作为生殖支原体种属的鉴定和确认,HBB为核酸提取质控。检测位点如下：

表1引物序列信息

注：*3’端磷酸化

本发明的方法，能够快速地检测生殖支原体parC基因的8个突变类型。与现有检测生殖支原体parC基因突变型的其它技术和同类技术相比，本发明技术方案有如下优点：

本发明与传统的PCR或其他分子检测技术相比，HRM技术是通过实时监控熔解曲线变化而进行PCR产物分析的高通量基因筛查技术，不受检测靶标突变位置及突变种类的限制，无需合成昂贵的序列特异性探针，大大降低检测成本，反应结束后直接通过高分辨率熔解曲线即可快速灵敏地分析实验结果，获得耐药相关位点的突变信息。

此外，该方法创新性的结合了未标记探针HRM技术，仅凭一条探针和一对扩增引物可实现同时检测生殖支原体parC基因的8个突变类型，覆盖生殖支原体氟喹诺酮耐药相关的所有重要突变。且由于探针序列完全匹配ParC S83I突变型的序列，因此ParC S83I的探针峰显示最高的Tm值，可通过探针快速判断ParC S83I突变型，该突变型别为氟喹诺酮耐药生殖支原体中最常见的型别。该方法灵敏度高(20拷贝/反应)，特异性强，可直接应用于临床样本，是无法进行纯培养的生殖支原体parC基因突变检测的重要的技术补充。且由于探针无需荧光标记，成本远远低于常规的荧光定量PCR。

本发明进行HRM分析实验采用饱和染料EvaGreen，由于饱和染料EvaGreen不会抑制PCR反应，可以在反应开始前直接加入PCR反应体系中参与PCR过程，反应结束后也无需转入其他分析装置或开盖加入染料而直接进行HRM分析，真正实现了闭管操作，避免了开盖可能引入的污染，造成假阳性结果，提高了实验结果的准确率和可信度；最后，分析过程中的升降温不会对DNA结构造成破坏性损伤，后续的降温可使DNA复性，复性后的DNA可以直接用于后续研究(如测序验证结果)，大大节省了时间及人力物力，避免了不必要的浪费。

附图说明

图1，对应Assay1的结果示意图

图2，对应Assay2的结果示意图

图3，对应Assay1的结果判断流程

图4，对应Assay2的结果判断流程

具体实施方式

实施例是基于本发明的前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。此处所描述的具体实施方式和操作过程仅用于解释本发明，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下面就医院临床检测检测生殖支原体parC基因的8个突变类型实施例的实施方式和具体操作过程阐述如下。

实施例1

1)使用试剂盒提供的样本采集管收集病人分泌物或者尿液样本。

2)对于尿液样本，8,000rpm离心10min后，弃上清，向样本采集管中加入适量粗提试剂Lysis buffer；对于分泌物的拭子样本，向样本采集管中加入适量粗提试剂Lysisbuffer，搅拌，将拭子浸泡在Lysis buffer中5min。

3)将样本采集管置于金属浴或水浴锅中，95℃加热10min，室温静置，完成样本基因组DNA的提取。(以上步骤可用其他核酸提取试剂盒或方法完成基因组DNA的提取)

4)以上述步骤获得样本基因组DNA为模板，在2个Assay的引物组中实现检测生殖支原体parC基因的8个突变类型。其中20μl的反应体系包括：10μl的EvaGreen Master Mix，Assay中各引物的最佳扩增浓度(表1)，样本基因组DNA 2μl，ddH2O补足至20μl。每次检测反应均同时引物阳性对照和阴性对照反应管。

5)在QuantStudio 6Flex Real-Time PCR System进行扩增反应和HRM分析。扩增反应的条件为：95℃孵育10分，接着95℃退火15秒，60℃延伸1分钟，共进行40个循环扩增反应结束后，40℃孵育1分钟，随后以0.025℃/s到95℃的速率缓慢升温，并连续收集荧光信号。

6)反应结束后使用QuantStudio 6and 7Flex Real-Time PCR software v1.0进行分析，软件会自动生成扩增子对应的熔解曲线和Tm值。结果判读分为三步：第一步，我们需要确保所有样本均为生殖支原体阳性(mgpa阳性)，并确定核酸提取成功(HBB阳性)；第2步，然后我们通过Assay 2中的主产物熔解曲线初步确定主要产物类型。主要产物类型分为三类：Type1，Type2，Type3；第三步。通过未标记的探针扩增的探针峰进行parC基因进一步分型。Assay1中的ParC D87引物组用于在样本不纯的情况下辅助判断结果。值得注意的是，由于探针完美地匹配了S83I序列，S83I突变体显示出独特的峰值形状和最高的探针Tm，这使我们能够快速直接地判读S83I。通过与不同突变型的阳性对照进行对比，判断结果。(图4)。

序列表

<110>中国医学科学院病原生物学研究所

<120>一种生殖支原体parC基因突变类型的检测方法与试剂盒

<160> 9

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

cttgagcctt tctaaccgct gcact 25

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

caagtccaaggggttaaggtttcat 25

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

agtgctcggtgcctttagtgat 22

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

tggcaaaggtgcccttga 18

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

cccatggtgatagttccatttat 23

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

agctttgggacattctgataattg 24

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

gggagatcatggggaaatacc 21

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

cagctttgggacattctgata 21

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

cccccatggtgatatttccatttatdrtgcaa 32

Claims (9)

1.用于检测生殖支原体parC基因的8个突变类型的专用引物，所述parC基因的8个突变类型的检测靶标为：(1)ParC S83I，(2)ParC S83C，(3)ParC S83N，(4)ParC S83R，(5)ParCD87G，(6)ParC D87N，(7)ParC D87H，(8)ParC D87Y；所述引物序列为SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.9。

2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物共有4套引物组，第一套引物组由三条引物组成，一条为正向引物，一条为反向引物，最后一条为3’端磷酸化的引物；其余三套引物组由两条引物组成，一条为正向引物，一条为反向引物，分别针对parC基因的8个突变类型，其对应关系见表1。

3.一种用于检测生殖支原体parC基因的8个突变类型的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括检测过程中必要的试剂或物品。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，试剂盒中的试剂或物品，包括采样管、粗提试剂Lysis buffer、反应组分EvaGreen Master Mix(扩增酶、扩增buffer、dNTP和EvaGreen荧光染料)、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为为各检测靶点的野生型阳性样本，所述阴性对照为ddH2O。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所包括的检测试剂或物品的量为1人份，或多人份，所述多人份可以是2-1000人份。

7.一种生殖支原体parC基因的8个突变类型的检测方法，其特征在于，包括使用3-6所述的试剂盒的步骤。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)使用试剂盒方法或裂解法完成样本基因组DNA的提取；

2)以待测样本的基因组DNA为模板，在上述专用引物组的引导下配制HRM扩增反应体系，进行特异性扩增；

3)在PCR过程中，由于目标序列的序列特异性，会造成不同PCR产物的碱基含量差异，根据DNA本身的性质，在饱和染料的作用下，对PCR扩增子进行加热，通过实时监测升温过程中荧光强度的变化，将检测结果进行数据整合及图像绘制，生成PCR产物熔解曲线，根据熔解曲线的不同来判断PCR产物中DNA序列的差异。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)使用试剂盒提供的样本采集管收集病人生殖道分泌物或者尿液样本；

2)对于尿液样本，8,000rpm离心10min后，弃上清，向样本采集管中加入适量粗提试剂Lysis buffer；对于分泌物的拭子样本，向样本采集管中加入适量粗提试剂Lysis buffer，搅拌，将拭子浸泡在Lysis buffer中5min；

3)将样本采集管置于金属浴或水浴锅中，95℃加热10min，室温静置，完成样本基因组DNA的提取；

4)以上述步骤获得样本基因组DNA为模板，在2个Assay的引物组中实现生殖支原体parC基因的8个突变类型的检测，其中20μl的反应体系包括：10μl的EvaGreen Master Mix，Assay中各引物的最佳扩增浓度见表1，样本基因组DNA 2μl，ddH2O补足至20μl，每次检测反应均同时引物阳性对照和阴性对照反应管；

5)在QuantStudio 6Flex Real-Time PCR System进行扩增反应和HRM分析，扩增反应的条件为：95℃孵育10分，接着95℃退火15秒，60℃延伸1分钟，共进行30个循环扩增反应结束后，40℃孵育1分钟，随后以0.025℃/s到95℃的速率缓慢升温，连续收集荧光信号；

6)反应结束后使用QuantStudio 6and 7Flex Real-Time PCR software v1.0进行分析，软件会自动生成扩增子对应的熔解曲线和Tm值，通过与不同突变型别的阳性对照进行对比，判断结果，若待测样本的parC突变位点突变型别与对照样本相同则熔解曲线形状无变化，若待测样本与对照样本不同会形成突变，熔解曲线形状也会相应发生改变。

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