JP4696237B2 - 糖尿病性腎症の治療用医薬組成物 - Google Patents

Description

本発明は、糖尿病性腎症の治療または予防用医薬組成物に関する。具体的には、本発明の医薬組成物は、エンドスタチン、その変異体またはその断片を有効成分として含むことを特徴とする。

２型糖尿病の発症率は世界的に増加しており、３０〜４０％の患者にて糖尿病性腎症を発症する。現在、我が国において維持透析患者の原因疾患では、糖尿病性腎症が最多であり、糖尿病性腎症の進展機序の解明および新たな治療法の開発は重要な課題である。

糖尿病性腎症では、早期に糸球体過剰濾過・糸球体肥大、引き続いて糸球体基底膜の肥厚・メサンギウム基質の増加や尿中アルブミン排泄増加が認められ、最終的には糸球体硬化に到る（非特許文献１）。腎症早期の段階で、糸球体係蹄数の増加・既存の血管の伸長等の血管新生様の現象が認められる。１型及び２型糖尿病の進展にＴＧＦ−β１，ＩＧＦ−１等の種々の増殖因子が関与するが、血管新生促進因子である血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ：ＶＥＧＦ） の関与も報告された。

血管新生の進展過程では、最初に血管基底膜がＭＭＰ−２，９等のプロテアーゼにより分解される。次に血管内皮細胞が血管外に遊走・増殖する。この過程でＶＥＧＦ，塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ），アンギオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）−２等の因子が関与する。次に、血管内皮細胞が管腔を形成し間葉系細胞が付着する。その後、アンギオポエチン−１の作用により間葉系細胞が周皮細胞（ｐｅｒｉｃｙｔｅ）に分化し、新生血管が安定化する。

ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）誘発糖尿病性腎症ラットモデル（１型糖尿病モデル）にてＶＥＧＦ発現が早期（３週）にて糸球体上皮細胞（ｐｏｄｏｃｙｔｅ）で増加し、進展期（８３週）においてＶＥＧＦ受容体のｆｌｋ−１が糸球体内皮細胞にて増加することが報告された（非特許文献２）。一方、２型糖尿病モデルのＯＬＥＴＦラットでは９，２０，６８週にてすなわち早期及び進展期にてＶＥＧＦの糸球体での発現が増加した。そして、ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ変換酵素阻害剤投与にてＶＥＧＦ発現が抑制された（非特許文献３）。また、ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ誘発糖尿病性腎症ラットモデルおよびｄｂ／ｄｂマウス（２型糖尿病モデル）にて中和型抗ＶＥＧＦ抗体投与により、糸球体過剰濾過、糸球体肥大、アルブミン尿ならびに進展期のメサンギウム基質増加が有意に抑制された（非特許文献４、５）。また、抗ＶＥＧＦ抗体を有効成分として含む糖尿病性腎症診断剤も報告されている（特許文献１）。

さらに、糖尿病性腎症において糸球体係蹄（毛細血管）数の増加、糸球体毛細血管の伸長により糸球体濾過表面積の増加がおこることが糖尿病性腎症ラットモデルにて報告された（非特許文献６）。

エンドスタチンはマウス血管内皮細胞種の細胞系の培養上清から分離された１８４アミノ酸（ヒトは１８３アミノ酸）から成る蛋白質である（特許文献２、３）。１９９４年に報告されたＸＶＩＩＩ型コラーゲンは、Ｎ末端領域（３つのスプライス変異体をもつ）、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙシークエンスを繰り返すコラーゲン領域、および３５ｋＤ（キロダルトン、分子量）のＣ末端のｎｏｎｃｏｌｌａｇｅｎｏｕｓドメイン（ＮＣ１）より構成され、エンドスタチンはＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＮＣ１ドメインのＣ末端断片である。エンドスタチン蛋白はウシ毛細血管内皮細胞の増殖を抑制するが、血管平滑筋細胞、線維芽細胞、肺上皮細胞、Ｌｅｗｉｓ肺癌細胞等の非内皮細胞の増殖抑制作用はない（非特許文献７、特許文献４）。エンドスタチンはさらに、血管内皮細胞の遊走を抑制し（非特許文献８）、アポトーシスを促進する（非特許文献９）。エンドスタチンはさらに、腫瘍において内在性の血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ発現を抑制し腫瘍増殖及び血管新生を抑制する（非特許文献１０、７）。

エンドスタチンは内皮細胞上のαｖβ３−インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）、 α５β１インテグリンに結合し、またヘパラン硫酸プロテオグリカンであるグリピカン（ｇｌｙｐｉｃａｎ）に低親和性にて結合する（非特許文献１１）。これらの細胞膜上の受容体との結合はエンドスタチンの血管新生抑制効果において重要な役割を果たす（非特許文献１１、１２）。ヒトエンドスタチンペプチドは、血管内皮細胞増殖・遊走及び血管新生を抑制する（非特許文献１３、特許文献５）。腫瘍以外の作用について、局所でのエンドスタチン過剰発現による網膜血管新生・網膜剥離の抑制効果（非特許文献１４）、関節リウマチモデルにおける治療効果（非特許文献１５）も実験レベルで報告されている。

さらにまた、固形癌患者を対照とした米国での臨床試験では、組換え型ヒトエンドスタチンを１５〜２４０ｍｇ／ｍ^２／日にて連日経静脈投与し、一部患者において治療効果を認めた（非特許文献１６）。また、３０〜３００ｍｇ／ｍ^２／日にて連日経静脈投与した場合にも有意の毒性を認めなかった（非特許文献１７）。

特開平０８−２４５４２４号公報 国際公開ＷＯ ９７／１５６６６ 特表２００２−５０４４９４ 特表２００２−５０３４４９ 特表２００２−５４４１２４ Ｍａｋｉｎｏ Ｈ.ら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４５：４８８−４９５（１９９６） Ｃｏｏｐｅｒ，Ｍ．Ｅ．ら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ,４８：２２２９（１９９９） Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｋ.ら,Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ,４２：５７９（１９９９） Ｄｅ Ｖｒｉｅｓｅ，Ａ．Ｓ．ら，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ，１２：９９３（２００１） Ｆｌｙｖｂｊｅｒｇ，Ａ．ら,Ｄｉａｂｅｔｅｓ,５１：３０９０（２００２） Ｎｙｅｎｇａａｒｄ，Ｊ．Ｒ．ら,Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ,３６：１８９（１９９３） Ｏ'Ｒｅｉｌｌｙ, Ｍ.Ｓ.ら，Ｊ Ｃｅｌｌ，８８：２７７−２８５（１９９７） Ｙａｍａｇｕｃｈｉ, Ｎ.ら，Ｅｍｂｏ Ｊ，１８：４４１４−４４２３（１９９９） Ｄｈａｎａｂａｌ Ｍ.ら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７４：１１７２１−１１７２６（１９９９） Ｈａｊｉｔｏｕ Ａ.ら，Ｆａｓｅｂ Ｊ，１６：１８０２−１８０４ （２００２） Ｋａｒｕｍａｎｃｈｉ Ｓ.Ａ.ら，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，７：８１１−８２２（２００１） Ｓｕｄｈａｋａｒ Ａ.ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１００：４７６６−４７７１（２００３） Ｃａｔｔａｎｅｏ Ｍ.Ｇ.ら，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２８３，２３０−２３６（２００３） Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ.ら， Ｆａｓｅｂ Ｊ，１７：８９６−８９８（２００３） Ｍａｔｓｕｎｏ Ｈ.ら，Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，２９：８９０−８９５（２００２） Ｅｄｅｒ Ｊ.Ｐ.ら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２０：３７７２−３７８４（２００２） Ｔｈｏｍａｓ Ｊ.Ｐ.ら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２１：２２３−２３１（２００３）

糖尿病患者の著しい増加に伴い、糖尿病性腎症の進展機序の解明および有効な治療法の開発が緊急の課題である。腎症へのＶＥＧＦの関与が報告されているが、複雑な生体系でこの特定の因子のみが疾患に関わるとは考え難い。一方、エンドスタチンはこれまで抗癌剤として使用されてきたが、糖尿病性腎症に有効であるかどうかは不明であった。これまでに、糖尿病性腎症の治療を目的とした、エンドスタチンの糸球体内皮細胞への作用や腎における血管新生誘導因子もしくは制御因子発現への作用に関する検討はなされていなかった。

本発明は、糖尿病性腎症の治療に有効な薬剤を提供することを目的とする。

本発明は、以下の特徴を有する。
すなわち、本発明は、エンドスタチン、その変異体またはその断片を有効成分として含む糖尿病性腎症の治療または予防用医薬組成物を提供する。
第１の実施形態において、本発明の変異体または断片は、腎臓において血管新生抑制活性を有するものである。
第２の実施形態において、本発明のエンドスタチン、その変異体またはその断片はヒト由来のものである。
第３の実施形態において、本発明の断片は、エンドスタチンのＮ末端ドメインを含むものである。
第４の実施形態において、上記Ｎ末端ドメインは、ヒトエンドスタチンのアミノ酸配列の少なくとも１位〜２７位または６位〜４９位の配列、あるいはそれらに対応する非ヒト哺乳類エンドスタチン由来の配列、を含むものである。
第５の実施形態において、本発明の断片は、エンドスタチンのＣ末端ドメインを含むものである。
第６の実施形態において、上記Ｃ末端ドメインは、ヒトエンドスタチンのアミノ酸配列の少なくとも１３４位〜１７８位の配列、あるいはそれに対応する非ヒト哺乳類エンドスタチン由来の配列、を含むものである。
第７の実施形態において、本発明の断片は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むものである。
第８の実施形態において、本発明の変異体は、エンドスタチンのアミノ酸配列中に１もしくは数個の置換、欠失および／または付加を含み、かつ腎臓において血管新生抑制活性を有するものである。
第９の実施形態において、本発明は糖尿病性腎症の早期病変に有効である。

本発明により、糖尿病性腎症の予防または治療、特にその早期病変の進行の抑制に有効である。

本発明は、上記のとおり、糖尿病性腎症の治療または予防に有効な医薬組成物を提供する。その治療または予防に有効な成分は、エンドスタチン、その変異体またはその断片である。

糖尿病性腎症は、早期に糸球体過剰濾過、糸球体肥大、それに続いて糸球体基底膜の肥厚、メサンギウム基質の増加、尿中アルブミン排泄増加が認められ、最終的には糸球体硬化に到る疾患である。本発明の有効成分は、特に早期の糖尿病性腎症に有効であり、腎症を早期の段階で改善または緩和する作用効果を有する。具体的には、次のような作用効果が示される。

（ａ）腎重量／体重比が減少する（図１Ａ）。
（ｂ）尿中アルブミン・クレアチニン比（ＵＡＣＲ）が減少する（図２）。
（ｃ）クレアチニンクリアランスが低下する（図１Ｂ）。
（ｄ）糸球体容積が減少する（図３）。
（ｅ）メサンギウム基質の蓄積及びＩＶ型コラーゲンの蓄積が減少する（図３Ｆ、図４）。
（ｆ）糸球体単球／マクロファージ浸潤が抑制される（図６）。
（ｇ）糸球体におけるＣＤ３１（＋）内皮細胞領域が減少する（図５）。
（ｈ）腎皮質における血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）およびアンギオポエチン−２蛋白質発現が抑制される（図７）。
（ｉ）Ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦ受容体）発現が抑制される（図８）。

本発明において、糖尿病とは、インスリン不足により引き起こされるグルコース代謝異常の疾患であり、インスリン依存型糖尿病（１型）およびインスリン非依存型糖尿病（２型）の両方が含まれる。１型糖尿病は、すい臓ランゲルハンス氏島のβ細胞の破壊のためにインスリン分泌が欠乏し、インスリンの絶対的不足によって発症する疾患である。一方、２型糖尿病は、インスリン分泌異常かあるいはインスリン抵抗性のために発症する疾患である。糖尿病患者の約８５〜９０％が２型糖尿病に罹患しているといわれている。

糖尿病患者の約３０％以上の患者は合併症の１つとして糖尿病性腎症を発症する。上記のとおり、本発明の医薬組成物は、糖尿病自体を改善するものではないが、この１型、２型糖尿病性腎症の予防または治療に有効である。

本明細書で使用する「予防」または「予防する」とは、目的の疾患の発症を抑制または阻止することを意味する。
本明細書で使用する「治療」または「治療する」とは、目的の疾患を治癒、軽減または抑制することを意味する。

本発明の医薬組成物の有効成分は、エンドスタチン、その変異体またはその断片である。この中には、エンドスタチン、その変異体またはその断片と酸または塩基との付加塩も含まれるものとする。変異体および断片は、腎臓において血管新生抑制活性を有し、かつ糖尿病性腎症の治療または予防効果を有するものである。

本明細書で使用する「血管新生抑制活性」とは、アンギオポエチン−２／ＶＥＧＦ発現の抑制作用を指す。

本発明で使用可能なエンドスタチンは、血管基底膜を形成するＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＮＣドメインに由来するタンパク質であり、ヒト、マウス、ネコなどの哺乳動物由来のエンドスタチンである。特にヒト、マウスおよびネコ由来のエンドスタチンはそれぞれ１８３アミノ酸、１８４アミノ酸、１８５アミノ酸からなり、これらのエンドスタチン間の相同率は約８５％である（米国特許公開２００５／００３２１６３）。好ましいエンドスタチンはヒトエンドスタチンである。ヒトエンドスタチンのヌクレオチド、アミノ酸配列は、特表２００２−５０４４９４、特表２００２−５０３４４９などに記載されている。マウスエンドスタチンのヌクレオチド、アミノ酸配列は、国際公開ＷＯ９７／１５６６６にも記載されている。ネコエンドスタチンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、米国特許公開２００５／００３２１６３に記載されている。

エンドスタチンの変異体は、エンドスタチンのアミノ酸配列中に１以上、好ましくは１もしくは数個の置換、欠失および／または付加からなる変異を含み、かつ腎臓において血管新生抑制活性を有するものである。好ましい変異体は、ヒトエンドスタチンの変異体である。置換は、好ましくは、荷電性アミノ酸類の間、極性アミノ酸類の間、非極性アミノ酸類の間、または芳香族性アミノ酸類の間での保存的アミノ酸置換である。荷電性アミノ酸には、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる酸性アミノ酸、あるいは、リシン、アルギニンおよびヒスチジンからなる塩基性アミノ酸が含まれる。極性アミノ酸にはセリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、グリシンおよびシステインが含まれる。非極性アミノ酸にはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニンなどが含まれる。芳香族アミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが含まれる。欠失、置換または付加は、エンドスタチンのアミノ酸配列において、血管新生抑制活性を損なわない部位または領域のアミノ酸の欠失、置換または付加である。例えばヒトエンドスタチンの場合、例えばそのアミノ酸配列の１〜２７位、６〜４９位、１３４〜１７８位を除く部位または領域での欠失、置換または付加である。

本明細書で使用する「数個」とは、２〜１５、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜５、２〜４または２〜３個を意味する。

エンドスタチンの変異体は、エンドスタチン、好ましくはヒトエンドスタチンのアミノ酸配列と８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の％同一性を有するものである。

２つの配列間の％同一性は、数学的アルゴリズムを用いて判定し得る。アルゴリズムの例は、Ｋａｒｌｉｎ−Ａｌｔｓｃｈｕｌアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４−２２６８，１９９０）、その改良アルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５８７７，１９９３）などである。このようなアルゴリズムは、ＮＢＬＡＳＴやＸＢＬＡＳＴプログラム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０） に取り入れられている。また、２つの配列間でギャップ付き整列比較を行うことによって％同一性を決定することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）。さらにまた、ＢＬＡＳＴ等のプログラムはヌクレオチド配列やタンパク質検索のために使用できる。起源の異なるエンドスタチンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースから検索プログラムを用いて得ることができる。

エンドスタチンまたはその変異体の断片は、エンドスタチンまたはその変異体のアミノ酸配列において少なくともＮ末端ドメインまたはＣ末端ドメイン配列を含む部分配列であり、かつ腎臓において血管新生抑制活性を有するものである。

この部分配列は、エンドスタチンのアミノ酸配列において、連続する少なくとも２０アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも７０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも９０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１１０アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１３０アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１７０アミノ酸、または少なくとも１８０アミノ酸からなる。

好ましい断片は、ヒトエンドスタチンまたはその変異体の断片である。
ヒトエンドスタチンにおいて、Ｎ末端ドメインを含む断片は、例えばヒトエンドスタチンのアミノ酸配列の少なくとも１位〜２７位または６位〜４９位の配列を含むものであり、また、Ｃ末端ドメインを含む断片は、該アミノ酸配列の少なくとも１３４位〜１７８位の配列を含むものである。特に、ヒトエンドスタチン１−２７断片のアミノ酸配列は、ＨＳＨＲＤＦＱＰＶＬＨＬＶＡＬＮＳＰＬＳＧＧＭＲＧＩＲ（配列番号１）である。

１位〜２７位のアミノ酸配列を含む断片には、例えば、ヒトエンドスタチンのアミノ酸配列中の１位〜Ｘ_ｂ位（ここで、Ｘ_ｂ＝２７〜１８２である。）が含まれる。
６位〜４９位のアミノ酸配列を含む断片には、例えば、ヒトエンドスタチンのアミノ酸配列中のＸ_ａ位〜Ｘ_ｂ位（ここで、Ｘ_ａ＝１〜６、Ｘ_ｂ＝４９〜１８２である。）が含まれる。
１３４位〜１７８位のアミノ酸配列を含む断片には、例えば、ヒトエンドスタチンのアミノ酸配列中のＸ_ａ位〜Ｘ_ｂ位（ここで、Ｘ_ａ＝１〜１３４、Ｘ_ｂ＝１７８〜１８２である。）が含まれる。

ヒト以外の哺乳類のエンドスタチンの断片の例は、エンドスタチンのアミノ酸配列において、上記のヒトエンドスタチンの血管新生抑制活性のあるＮ末端ドメインおよびＣ末端ドメインに対応する領域を含む断片である。

さらにまた、エンドスタチンのアミノ酸配列中、１位〜２７位、６位〜４９位または１３４位〜１７８位のヒト配列あるいはこれらに対応する非ヒト哺乳類エンドスタチン由来の配列が保持されかつ血管新生抑制活性を有する限り、それ以外の部分の配列に１以上、好ましくは１もしくは数個、の配列の置換、欠失および／または付加が含まれてもよい。このような断片もまた、本発明に包含されるものとする。

本発明で使用されるエンドスタチン、その変異体およびその断片は、医薬上許容されうる有機または無機の酸あるいは塩基との塩の形態であってもよい。そのような酸および塩基は当業界で周知、慣用のものが好ましい。例えば、そのような塩には、塩酸、酢酸、硫酸、炭酸、シュウ酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸、安息香酸などの酸との付加塩が含まれる。また、ナトリム、カリウムなどのアルカリ金属、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、アンモニア、アミン類との塩が含まれる。

本発明の医薬組成物の有効成分である、エンドスタチン、その変異体またはその断片は、当技術分野で公知の技術を用いて作製することができる。

そのような技術には、例えばＤＮＡ組換え技術、タンパク質またはペプチド合成技術、部位特異的突然変異誘発技術、ＰＣＲ技術などが含まれる。

ＤＮＡ組換え技術は、ヒトエンドスタチンを含む哺乳類エンドスタチンのヌクレオチド配列を適切な発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞に移入したのち、宿主細胞の培養によってエンドスタチンを得ることができる。発現ベクターは、原核および真核生物用のいずれのベクターも使用できる。原核生物ベクターには、例えば大腸菌、枯草菌などの細菌用のベクターが含まれる。また、真核生物ベクターには、例えば酵母、糸状菌、担子菌、昆虫細胞、単子葉もしくは双子葉植物細胞、哺乳類細胞（ヒト細胞、ヒト株化細胞を含む）動物細胞用のベクターが含まれる。

発現ベクターには、プラスミド、ウイルス、コスミドなどが含まれる。原核生物または真核生物用ベクターには、例えば、ｐＭＡＬ系、ｐＴＹＢ系ベクター（以上、第一化学薬品）、ＰＡＵＲ１２３（宝酒造）、ｐＥＴ系、ｐＢＡＣ系、ｐＴｒｉ−Ｅｘ１ベクター（以上、Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｉｎｃ．）、ｐＣｒｕｚ^ＴＭ系ベクター（コスモバイオ）、ｐＨＢ６、ｐＶＢ６、ｐＢＸ、ｐＨＭ６、ｐＶＭ６、ｐＭＨ、ｐＳＶ４０／ＳＥＡＰ、ｐＣＭＶ／ＳＥＡＰベクター（以上、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ｐｃＤＮＡ−３、ｐＥＦ、ｐＳｅｃ、ｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＤＥＳＴ、ｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）、Ｔ７系ベクター（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら， Ｇｅｎｅ （１９８７）， ５６： １２５）、ｐＥＺＺ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｐＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＣＭＳ−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、アグロバクテリウム系Ｔｉプラスミド、ｐＪＢ８、ｃ２ＲＢ、ＣＤＭ８、ｐＣＥＶ４、ｐＭＥ１８Ｓ、ｐＤＯＬ（例えば日本生化学会編、新生化学実験講座２、核酸ＩＩＩ、組換えＤＮＡ技術、東京化学同人、１９９２年；塚越規弘編著、生物化学実験法４５、組換えタンパク質生産法、学会出版センター）などが含まれる。

ベクターには、エンドスタチンＤＮＡ配列の他に、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、開始コドン、スプライスシグナル、停止コドン、複製開始点、選択マーカー、マルチプルクローニングサイト、リボソーム結合部位などを含むことができる。

プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであり、例えば、バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃなどのプロモーター、Ｔ７プロモーター、ユビキチンプロモーター、ＴＫプロモーター、メタロチオネインプロモーター、レトロウイルス末端反復配列、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ＭＴプロモーター、ＯｐｌＥ２プロモーターなどが例示される。

選択マーカーは、薬剤耐性マーカーおよび栄養要求性相補マーカーを含み、例えばアンピシリン、カナマイシン、ネオマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、メトトレキサート、ＵＲＡ３などを含む。

宿主細胞は、原核細胞、例えば細菌、例えば大腸菌、枯草菌（例えばバチルス・ブレビス）、シュードモナス属細菌、ザイモモナス属細菌など、真核細胞、例えば酵母（例えばサッカロマイセス属、ピチア属など）、昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）、ヒト細胞を含む哺乳類細胞（例えばＨＥＫ２９３細胞などのヒト胎児腎臓細胞、ヒト神経前駆細胞、ＢＨＫ２１細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞）、双子葉もしくは単子葉細胞（例えばタバコ、トウモロコシ）などを含む。

上記の適切なベクターは、公知の形質転換又はトランスフェクション技術、例えばリン酸カルシウム法、塩化カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション（電気窄孔法）、マイクロインジェクションなどを用いて、上記の適切な宿主細胞、好ましくはコンピテント宿主細胞中に導入される。

形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞は、公知の適当な培地にて、エンドスタチンタンパク質が発現産生されるような条件下で培養され、発現産物を宿主細胞又は培養上清から回収し、必要に応じて精製プロセスにかける。

シグナルペプチドコード配列をエンドスタチン遺伝子配列にフランキングするときには、形質転換もしくはトランスフェクションされた宿主細胞を適する培地中で培養することによって、エンドスタチンが成熟形態で培地中に産生されるので、エンドスタチンを容易に回収できる。一方、シグナルペプチドコード配列を含まない場合には、宿主細胞内に蓄積されたエンドスタチンを、低張液、超音波破砕機、ダウノミル、マウントガウリンホモゲナイザー、フレンチプレスなどの手段を用いて破壊し、その上清からエンドスタチンを回収することができる。

さらに、発現に際して、ＨｉｓタグやＧＦＰなどのタグを連結した形態でエンドスタチンを発現するときには、タンパク質の精製が容易になる。そのための発現ベクターとして、例えばｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）、 ｐＥＴ２１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびｐＣＭＳ−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用することができる。

他の哺乳類のエンドスタチンについては、その動物組織から慣用の手法でｃＤＮＡライブラリーを作製するかあるいは市販のライブラリーを入手し、ヒトもしくはマウスエンドスタチンのヌクレオチド配列、特に相同性の高い領域の配列、をプローブとして用いるサザンハイブリダイゼーションによって目的のエンドスタチンＤＮＡをスクリーニングし、上記の適切なベクター・宿主系でクローニングおよび発現することによってエンドスタチンを得ることができる。ハイブリダイゼーション技術は、例えば中山広樹ら著、細胞工学別冊、バイオ実験イラストレイテッド、遺伝子解析の基礎、秀潤社、１９９５年；松村正明ら監修、細胞工学別冊、ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法、秀潤社、２０００年に記載されている。

プローブは、通常、標識されるが、標識の例は、放射性標識、蛍光標識（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン、フルオレサミン、その誘導体）などである。標識化には、ニックトランスレーション、ランダムプライム法、エンドラベルなどの方法が含まれる。

スクリーニングは、低、中又は高ストリンジェント条件で行うことができる。温度、イオン強度、洗浄条件を適度に選択することによってストリンジェンシーが変わる。高ストリンジェント条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４２℃でのハイブリダイゼーションのあと、０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃での洗浄からなる。低ストリンジェント条件は、例えば１０％ホルムアミド、５×デンハート液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４２℃でのハイブリダイゼーションのあと、１×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、５０℃での洗浄からなる。あるいは、高ストリンジェント条件は、例えば、６５℃で１×ＳＳＣまたは４２℃で１×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミド、中ストリンジェント条件は、６５℃で４×ＳＳＣまたは４２℃で４×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミド、低ストリンジェント条件は、５０℃で４×ＳＳＣまたは４０℃で６×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミドである。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９）。

必要に応じて、ＰＣＲによってエンドスタチンＤＮＡを増幅することができる。ＰＣＲは、ＤＮＡの変性、アニーリング、伸長反応からなり、変性は、二本鎖ＤＮＡを通常９４℃で１５秒〜１分で処理して一本鎖ＤＮＡに解離させる段階、アニーリングは、鋳型ＤＮＡにプライマーをアニーリングさせる段階であり、通常５５℃、３０秒〜１分の処理条件からなる段階、伸長は、プラーマーの伸長を通常７２℃、３０秒〜１０分の条件でＴａｑなどの耐熱性ポリメラーゼを使用して行う段階を含み、これを１サイクルとして通常２５〜４０サイクル繰り返してＤＮＡ増幅行う。プライマーは通常１５〜３０塩基長が好ましい。ＰＣＲ技術は、例えば蛋白質核酸酵素増刊、ＰＣＲ法最前線（１９９６），４１巻５号，共立出版に記載されている。

上記のようにして得られたエンドスタチンは、例えば、抽出、濃縮（例えば、限外濾過膜使用）、塩析（硫安沈殿）、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、色素吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよびＨＰＬＣなどのクロマトグラフィーなどの慣用の技術を適宜組み合わせて精製することができる。

エンドスタチンの変異体は、例えば部位特異的突然変異誘発法、好ましくはＰＣＲによる部位特異的突然変異誘発法によって作製することができる。簡単に説明すると、エンドスタチンをコードするヌクレオチド配列を含むクローニングベクターＤＮＡを鋳型にして、目的の変異を導入したプライマーを用いたＰＣＲを行い、該変異を含むエンドスタチン変異体をコードするＤＮＡを作製することができる（ＭＡ Ｉｎｎｉｓ編，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９０；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９）。一旦そのようなＤＮＡを得たならば、上記のように発現ベクター／宿主系に適用して目的のエンドスタチン変異体を得ることができる。

エンドスタチンの断片の作製は、より長い鎖の場合には、エンドスタチンをコードするヌクレオチド配列を含むクローニングベクターＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行うか、あるいはより短い鎖の場合には、自動ＤＮＡ合成装置を用いて化学合成することによって行うことができる。ＰＣＲによって合成されたエンドスタチン断片をコードするＤＮＡは、上記のように発現ベクター／宿主系に適用して目的のエンドスタチン断片を得ることができる。

本発明の医薬組成物は、上で説明したように、ヒトを含む哺乳類のエンドスタチン、その変異体またはその断片を有効成分とし、糖尿病性腎症、好ましくは早期腎症、の治療および予防のために使用される。

本発明の医薬組成物の形態は、特に限定されないが、例えば錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、座剤、カプセル剤などである。好ましい形態は、溶液剤、懸濁剤などの液剤である。これらの製剤は、当業界で一般的に知られる方法によって作製することができる。

さらに、本発明の医薬組成物は、多層被覆構造の遅延放出製剤、胃溶性もしくは腸溶性製剤などの剤型としうる。このような製剤は、例えばアルキルセルロース（例えば、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート、セルロースアセテートフタレート）、アクリルポリマー（例えば、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリアミノアルキルメタクリレート）などのポリマーで、有効成分を含むコアを被覆することによって作製されうる。

本発明の医薬組成物は、上記の有効成分の他に、担体（賦形剤、希釈剤）を含み、必要ならば添加剤を含むことができる。添加剤には、溶解補助剤、保存剤、安定化剤、懸濁化剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、等張化剤、風味剤、着色剤、甘味剤、乳化剤などが含まれるが、これらに限定されない。このような担体および添加剤は、医薬上許容されうるものであり、当業界で慣用されるものを使用することができる。以下に、担体、溶解補助剤、安定化剤、懸濁化剤、懸濁化剤、崩壊剤、滑沢剤、乳化剤、等張化剤の具体例を記載する。

担体には、例えば、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、オリーブ油、ゴマ油、カカオバター、エチレングリコール、水、生理食塩液、エタノール、その他常用されるものが含まれる。

溶解補助剤には、例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、その他常用されるものが含まれる。
結合剤には、例えば、ポリビニルピロリドン、ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム、その他常用されるものが含まれる。
安定化剤には、例えば、メチオニンなどのアミノ酸類、糖類、その他常用されるものが含まれる。
懸濁化剤には、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、アルコール類、ポリソルベート８０（登録商標）、その他常用されるものが含まれる。
崩壊剤には、例えば、繊維素グリコール酸カルシウム、デンプン、アルギン酸、その他常用されるものが含まれる。
滑沢剤には、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、その他常用されるものが含まれる。
乳化剤には、例えば、ショ糖界面活性剤、ラウリル硫酸ナトリウム、その他常用されるものが含まれる。
等張化剤には、例えば、塩化ナトリウム、その他常用されるものが含まれる。

本発明の医薬組成物中に、有効成分が例えば１〜７０重量％、１〜５０重量％、５〜３０重量％などの量で含まれるが、有効成分量は効能の程度や患者の年齢に応じて変えることができる。

有効成分の投与量は、約１〜約８０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重／日などであるが、これらに限定されないものとする。投与量は、患者または被験者の性別、年齢、体重、状態などに応じて変わるので、効能や副作用（毒性）の程度をも考慮しながら決定されるべきである。なお、毒性について、例えばヒトエンドスタチンペプチド（配列番号１）は、これまでに固形腫瘍を対象として米国にて臨床試験が実施されており、重大な副作用発生事例の報告はなく、投与時の安全性も確立されていると考えられる。また、癌治療において、組換え型ヒトエンドスタチンを３０−３００ｍｇ／ｍ^２／日にて連日経静脈投与しても有意の毒性を認めなかったことが報告されている（Ｔｈｏｍａｓ Ｊ.Ｐ.ら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２１：２２３−２３１（２００３））

投与経路は、非経口または経口投与であるが、好ましくは非経口投与、より好ましくは静脈内投与である。非経口投与には、例えば静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、局所、皮内、皮下、経粘膜、経直腸などの投与が含まれる。

本発明はさらに、糖尿病を患っている、あるいは糖尿病の兆候を示しつつある患者または被験者において、本発明のエンドスタチン、その変異体またはその断片を投与することを含む、患者または被験者の糖尿病性腎症を予防または治療する方法も提供する。

患者または被験者には、ヒト、ネコ、イヌ、ブタなどの哺乳類が含まれ、好ましくはヒトである。
有効成分の投与量、投与形態、投与経路は、上記と同様である。好ましい投与経路は、静脈内投与である。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって制限されないものとする。

方法１：雄性Ｃ５７／ＢＬ６Ｊマウス（Ｃｌｅａ Ｊａｐａｎ， Ｉｎｃ．）を用いた。ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）を腹腔内に１日おきに計３回投与し（１２５ｍｇ／ｋｇ体重／回）血糖が２５０〜４００ ｍｇ／ｄｌに至ったマウスを実験に用いた。グループ１：正常コントロール、グループ２：糖尿病群にビヒクルバファ（ｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ＰＢＳ）を４週間投与、グループ３：糖尿病群にエンドスタチンペプチド（配列番号１；純度９７％以上；分子量２９９５．５Ｄａ；Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ））を１ｍｇ／ｋｇ体重／日にて４週間投与、グループ４： 糖尿病群にエンドスタチンペプチドを５ｍｇ／ｋｇ体重／日にて４週間投与（ｎ＝５）。エンドスタチンペプチドはＰＢＳに溶解し、皮下に埋め込んだ浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ社）にて投与した。

方法２：腎重量／体重比、血糖を測定した。２４時間蓄尿にて尿中アルブミン・クレアチニン比（ＵＡＣＲ）（治療開始２，３，４週後）、クレアチニンクリアランス（Ｃｃｒ）（治療開始４週後）を測定した。ＰＡＳ染色像にて糸球体容積、糸球体細胞数、メサンギウム基質インデックスを測定した。また、血管内皮細胞マーカーであるＣＤ３１免疫蛍光染色にて糸球体係蹄（毛細血管）領域を検出し、ＮＩＨ ｉｍａｇｅを用いて画像解析を行った。蛍光抗体法にてＩＶ型コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）の免疫染色を行い、糸球体内の陽性領域を画像解析にて評価した。Ｆ４／８０免疫染色にて糸球体単核球／マクロファージ浸潤を評価した。

方法３：腎皮質部からＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒを用いて蛋白を抽出しウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を行い、ＶＥＧＦ，アンギオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）−１，Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ −２，Ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦの受容体）， Ｔｉｅ−２（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１の受容体），アクチン（ａｃｔｉｎ）の発現を検討した。統計解析にはＳｃｈｅｆｆｅ’ｓ ｔｅｓｔを用いた。

その結果、治療開始後４週の時点で、糖尿病マウスにて血糖値上昇，体重減少を認めたが、エンドスタチンペプチド投与による影響は認められなかった。腎重量／体重比は糖尿病マウス群にて非糖尿病マウス群に比して有意に増加し、エンドスタチンペプチド投与群にて抑制効果を認めた（図１Ａ）。ＵＡＣＲ（図２）及びＣｃｒ（図１Ｂ）は糖尿病マウス群にて非糖尿病マウス群に比して有意に高値を呈したが、エンドスタチンペプチド投与により濃度依存性に有意な抑制効果を認めた（糸球体過剰濾過の是正効果）。糸球体容積は、糖尿病マウス群にて非糖尿病マウス群に比して増加し、エンドスタチンペプチド投与により濃度依存性に有意な抑制効果を認めた（糸球体肥大の抑制効果；図３）。糖尿病群の糸球体における、メサンギウム基質の蓄積、ＩＶ型コラーゲンの蓄積がエンドスタチンペプチド投与により濃度依存性に有意に抑制された（図３Ｆ,図４）。さらに、糸球体単球マクロファージ浸潤もエンドスタチンペプチド投与により抑制された（図６）。糖尿病群の糸球体におけるＣＤ３１（＋）内皮細胞領域は糖尿病群にて増加したが、エンドスタチンペプチド投与により抑制された（図５）。腎皮質におけるＶＥＧＦ（図７Ａ，７Ｂ），ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２（図７Ｅ，Ｆ）蛋白発現は糖尿病マウス群にて非糖尿病マウス群に比して有意に増加し、エンドスタチンペプチド投与群にて有意な抑制効果を認めた。Ｆｌｋ−１（図８Ａ，８Ｂ）およびＴｉｅ−２（図８Ｃ，８Ｄ）発現は、エンドスタチンペプチド投与群にて有意な抑制効果を認めた。ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１（図７Ｃ，６Ｄ）発現はグループ間での差を認めなかった。

体重は糖尿群において正常群に比して低値であったがエンドスタチンペプチド投与による影響は認めなかった。血糖値は、ＳＴＺ投与糖尿病群で正常群に比して高値を示したが、エンドスタチンペプチド投与群、およびｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ対照群にて差を認めなかった。（表１）。

以下に各図から得られる結果についてさらに説明する。

図１から、Ａ：腎重量／体重比は、糖尿病群で正常群に比して増加したが、エンドスタチンペプチド投与群ではビヒクルバッファ（ｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ）対照群に比して増加が濃度依存性に抑制され、５ｍｇ／ｋｇ投与群にて有意に抑制された。Ｂ：糖尿病群にて認められた２４時間クレアチニンクリアランスの増加は、エンドスタチンペプチド投与群ではｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ対照群に比して濃度依存性に抑制され、５ｍｇ／ｋｇ投与群にて有意に抑制された。以上の結果より、糖尿病マウスにおける糸球体過剰濾過がエンドスタチンペプチドにより有意に抑制されたものと考えられた。

図２から、一日尿中アルブミン量／クレアチニン比（ＵＡＣＲ）は、糖尿病群で正常群に比して増加したが、エンドスタチンペプチド投与群ではｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ対照群に比して増加が濃度依存性に抑制され、５ｍｇ／ｋｇ投与群にて２，３，４週の各時点で有意に抑制された。糖尿病マウスにおける糸球体過剰濾過がエンドスタチンペプチドにより有意に抑制されたものと考えられた。

図３は、糸球体のＰＡＳ染色像（４週投与後、４００倍）を示す（Ａ−Ｄ）。Ａ：正常対照、Ｂ：ｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ投与糖尿病群、Ｃ：エンドスタチンペプチド（１ｍｇ／ｋｇ）投与糖尿病群、Ｄ：エンドスタチンペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）投与糖尿病群である。糖尿病対照群（Ｂ）にて糸球体肥大・メサンギウム領域の拡大を認めたが、エンドスタチンペプチド投与群にて上記の組織学的変化が抑制された。糖尿病群における糸球体容積の増加は、エンドスタチンペプチド投与群にて（１及び５ｍｇ／ｋｇにて）有意に抑制された（Ｅ）。

図４は、間接蛍光抗体法にてＩＶ型コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）の免疫染色を行い、糸球体内の陽性領域を画像解析にて評価した結果を示す（Ａ〜Ｄ）。１型糖尿病性腎症モデルマウスに、ｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（Ｖ）（陽性対照、図Ｂ）、エンドスタチンペプチド（１ ｍｇ／ｋｇ）（Ｅ１）（図Ｃ）、エンドスタチンペプチド（５ ｍｇ／ｋｇ）（Ｅ５）（図Ｄ）をそれぞれ投与した。陰性対照は 正常マウス（Ｎ）（図Ａ）を用いた。各実験群の４週投与後のマウスから糸球体を取り出し、凍結切片を調製し、蛍光標識抗ＩＶ型ｃｏｌｌａｇｅｎ抗体を用いて糸球体におけるＩＶ型ｃｏｌｌａｇｅｎの発現を蛍光顕微鏡にて観察した。その結果、糖尿病対照群（図Ｂ）にて糸球体ＩＶ型ｃｏｌｌａｇｅｎ蓄積が増加していたが、エンドスタチンペプチド投与群（５ｍｇ／ｋｇ投与）にて糸球体ＩＶ型ｃｏｌｌａｇｅｎ蓄積が有意に抑制された（図Ｅ）。

図５は、糸球体のＣＤ３１染色像（４週投与後、４００倍）を示す（Ａ〜Ｅ）。凍結切片を用いて、間接免疫蛍光抗体法によりＣＤ３１の糸球体における発現領域を蛍光顕微鏡にて観察した結果である。Ａ：正常対照、Ｂ：ｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ投与糖尿病群、Ｃ：エンドスタチンペプチド（１ｍｇ／ｋｇ）投与糖尿病群、Ｄ：エンドスタチンペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）投与糖尿病群、Ｅ：陰性対照（正常対照を抗ＣＤ３１抗体の代わりに正常ＩｇＧにて反応）である。糖尿病対照群（Ｂ）にて糸球体ＣＤ３１陽性内皮細胞領域が増加していたが、エンドスタチンペプチド投与群にて（５ｍｇ／ｋｇにて）有意に抑制された（Ｆ）。エンドスタチンペプチドによる血管新生抑制作用を介して糖尿病における糸球体ＣＤ３１陽性内皮細胞領域の増加が抑制されたものと考えられた。

図６は、糸球体の単球／マクロプァージ染色像（４週投与後、Ｆ４／８０抗体、４００倍）を示す（Ａ〜Ｄ）。凍結切片を用いて、酵素抗体法により単球／マクロプァージの糸球体における蓄積を観察した結果である。各切片より２０個以上の糸球体を観察し、１糸球体当たりの陽性細胞数を算出した。Ａ：正常対照、Ｂ：ｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ投与糖尿病群、Ｃ：エンドスタチンペプチド（１ｍｇ／ｋｇ）投与糖尿病群、Ｄ：エンドスタチンペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）投与糖尿病群である。矢頭はＦ４／８０陽性細胞を示す。糖尿病対照群にて糸球体における単球／マクロプァージが増加していたが、エンドスタチンペプチド投与群にて（５ｍｇ／ｋｇにて）有意に抑制された（Ｅ）。

図７は、ウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）による蛋白発現レベルの検討結果を示す。治療開始４週後のマウス腎皮質より蛋白を抽出し免疫ブロットを行った。ＡはＶＥＧＦおよびａｃｔｉｎの発現レベルを示す。ＶＥＧＦの免疫ブロットを行った後に、同じ膜を用いてｓｔｒｉｐｐｉｎｇ後ａｃｔｉｎの免疫ブロットを行った。ＢはＶＥＧＦとａｃｔｉｎのバンドをデンシトメトリーにて数値化し、その比を算定した結果を示す。正常コントロール群を１として各群における相対的数値をグラフ化した。ＶＥＧＦ蛋白レベルは糖尿病群において正常コントロール群に比して有意に増加したが、エンドスタチンペプチド投与群（１及び５ ｍｇ／ｋｇ）ではビヒクル投与群に比して有意な抑制効果を認めた。Ｃは 同様にＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１の免疫ブロットの結果を示し、ＤはＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１／ａｃｔｉｎ比を算定した結果である。ＤからＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１蛋白レベルは糖尿病群において正常コントロール群と差がなかった。エンドスタチンペプチド投与群でも特に変化を認めなかった。ＥはＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２ の免疫ブロットの結果を示し、ＦはＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２／ ａｃｔｉｎ比を算定した結果である。Ｆから、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２蛋白レベルは糖尿病群において正常コントロール群に比して有意に増加したが、エンドスタチンペプチド投与群（５ｍｇ／ｋｇ）では有意な抑制効果を認めた。Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２はＶＥＧＦ存在下にて血管新生を誘導することより、エンドスタチンペプチド投与による糖尿病性腎症における過剰の血管新生の抑制効果が示唆された。また、血管透過性因子ＶＥＧＦ， 血管不安定化作用を持つＡｎｇ−２の抑制を介して、エンドスタチンペプチドは糖尿病性腎症における単球・マクロファージ浸潤を抑制し得たものと推察された。

図８は、ウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）による蛋白発現レベルの検討結果を示す。治療開始４週後のマウス腎皮質より蛋白を抽出し免疫ブロットを行った。Ａ：はＦｌｋ−１およびａｃｔｉｎの発現レベルを示す。Ｆｌｋ−１の免疫ブロットを行った後に、同じ膜を用いてｓｔｒｉｐｐｉｎｇ後ａｃｔｉｎの免疫ブロットを行った。Ｂは、Ｆｌｋ−１とａｃｔｉｎのバンドをデンシトメトリーにて数値化し、その比を算定した結果である。正常コントロール群を１として各群における相対的数値をグラフ化した。Ｆｌｋ−１蛋白レベルは糖尿病群において正常コントロール群に比して有意に増加したが、エンドスタチンペプチド投与群（５ ｍｇ／ｋｇ）ではビヒクル投与群に比して有意な抑制効果を認めた。Ｃは、Ｔｉｅ−２の免疫ブロットの結果を示し、ＤはＴｉｅ−２／ａｃｔｉｎ比を算定した結果である。Ｄから、Ｔｉｅ−２蛋白レベルは糖尿病群において正常コントロール群に比して低下傾向を示していた。エンドスタチンペプチド投与群で特に変化を認めなかった。Ｆｌｋ−１増加の抑制作用を介して、エンドスタチンペプチドによる抗血管新生・抗炎症作用が観察された可能性がある。

本発明の有効成分により、糖尿病性腎症モデルにて正常マウスに比してＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２発現が増加し、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１／２比が低下してＴｉｅ−２受容体を介した血管安定化シグナルが減少し、ＶＥＧＦおよびＦｌｋ−１受容体増加も相乗的に作用して血管透過性亢進をきたし、アルブミン尿、単球／マクロファージ浸潤増加に至ったと考えられた。エンドスタチンペプチド投与にてＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２発現増加の抑制、ＶＥＧＦ発現増加の抑制作用を介してアルブミン尿、単球／マクロファージ浸潤が抑制されたと考えられた。エンドスタチンペプチドは血管新生抑制作用を介して糖尿病性腎症における糸球体濾過面積の増加を制御し得たものと考えられた。

以上の結果より、エンドスタチンペプチドは、１型糖尿病性腎症モデルを用いた上記実験の結果、エンドスタチンペプチドは、腎病変の進展を血管新生関連因子制御を介して抑制することが判明した。

今回、実験に使用したエンドスタチンペプチドは、ヒトエンドスタチンの１位〜２７位の断片（配列番号１）であり、血管新生抑制活性を有するものである。それゆえ、この領域を無傷に含むヒトエンドスタチン断片または変異体もまた、糖尿病性腎症の治療または予防に対して有効である。

本発明により、これまで有効な治療法がなかった糖尿病性腎症に対して腎症の進展を有意に抑制することが可能となった。したがって、本発明は、糖尿病性腎症の治療または予防のために有用である。

１型糖尿病性腎症モデルマウスにエンドスタチンペプチド（１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ）を投与したときの、Ａ：腎重量／体重比およびＢ：２４時間クレアチニンクリアランスを測定した結果を示す。陰性対照は正常マウス（Ｎｏｎ−ｄｉａｂｅｔｉｃ）、陽性対照はビヒクルバッファ（ｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ）ＰＢＳである。 １型糖尿病性腎症モデルマウスにエンドスタチンペプチド（１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ）を投与したときの、一日尿中アルブミン量／クレアチニン比（ＵＡＣＲ）を示す。陰性対照は正常マウス（Ｎｏｎ−ｄｉａｂｅｔｉｃ）、陽性対照はｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒである。 １型糖尿病性腎症モデルマウスにエンドスタチンペプチド（１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ）を投与したときの、糸球体のＰＡＳ染色像（４週投与後、４００倍）を示す。Ａ： 正常対照（Ｎ）、Ｂ：ｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ投与糖尿病群（Ｖ）、Ｃ：エンドスタチンペプチド（１ｍｇ／ｋｇ）投与糖尿病群（Ｅ１）、Ｄ：エンドスタチンペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）投与糖尿病群（Ｅ５）。また、％糸球体容積を図３Ｅに示す。 １型糖尿病性腎症モデルマウスにエンドスタチンペプチド（１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ）を投与したときの、間接免疫蛍光抗体法による糸球体凍結切片のＩＶ型ｃｏｌｌａｇｅｎ染色像（４週投与後、２００倍）（Ａ〜Ｄ）及びその定量結果（Ｅ）を示す。Ａ：正常対照（Ｎ）、Ｂ：ｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ投与糖尿病群（Ｖ）、Ｃ：エンドスタチンペプチド（１ ｍｇ／ｋｇ）投与糖尿病群（Ｅ１）、Ｄ：エンドスタチンペプチド（５ ｍｇ／ｋｇ）投与糖尿病群（Ｅ５）。 １型糖尿病性腎症モデルマウスにエンドスタチンペプチド（１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ）を投与したときの、間接免疫蛍光抗体法による糸球体凍結切片のＣＤ３１染色像（４週投与後、４００倍）を示す。Ａ：正常対照（Ｎ）、Ｂ：ｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ投与糖尿病群（Ｖ）、Ｃ：エンドスタチンペプチド（１ｍｇ／ｋｇ）投与糖尿病群（Ｅ１）、Ｄ：エンドスタチンペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）投与糖尿病群（Ｅ５）、Ｅ： 陰性対照（正常対照を抗ＣＤ３１抗体の代わりに正常ＩｇＧにて反応）。また、％糸球体ＣＤ３１陽性内皮細胞領域の増減を図４Ｆに示す。 １型糖尿病性腎症モデルマウスにエンドスタチンペプチド（１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ）を投与したときの、酵素抗体法による糸球体凍結切片の単球／マクロプァージ染色像（４週投与後、Ｆ４／８０抗体、４００倍）を示す。Ａ：正常対照（Ｎ）、Ｂ：ｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ投与糖尿病群（Ｖ）、Ｃ：エンドスタチンペプチド（１ ｍｇ／ｋｇ）投与糖尿病群（Ｅ１）、Ｄ：エンドスタチンペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）投与糖尿病群（Ｅ５）。矢頭はＦ４／８０陽性細胞を示す。また、Ｆ４／８０陽性細胞数の変化を図５Ｅに示す。 １型糖尿病性腎症モデルマウスにエンドスタチンペプチド（１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ）を投与したときの、治療開始４週後のマウス腎皮質から抽出した蛋白のウエスタンブロットを示す。Ａ：ＶＥＧＦの発現レベル、Ｂ：ＶＥＧＦ／アクチン（ａｃｔｉｎ）比、Ｃ：アンギオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）−１の発現レベル、Ｄ：Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１／ａｃｔｉｎ比、Ｅ：Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２ の発現レベル、Ｆ：Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２／ａｃｔｉｎ比。Ａ：また図中、Ｎは正常対照、Ｖはｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ投与糖尿病群、Ｅ１はエンドスタチンペプチド （１ ｍｇ／ｋｇ）投与糖尿病群、Ｅ５はエンドスタチンペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）投与糖尿病群を示す。 １型糖尿病性腎症モデルマウスにエンドスタチンペプチド（１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ）を投与したときの、治療開始４週後のマウス腎皮質から抽出した蛋白のウエスタンブロットを示す。Ａ：Ｆｌｋ−１およびａｃｔｉｎの発現レベル、Ｂ：Ｆｌｋ−１／ａｃｔｉｎ比、Ｃ：Ｔｉｅ−２の発現レベル、Ｄ：Ｔｉｅ−２／ａｃｔｉｎ比。また図中、Ｎは正常対照、Ｖはｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ投与糖尿病群、Ｅ１はエンドスタチンペプチド（１ｍｇ／ｋｇ）投与糖尿病群、Ｅ５はエンドスタチンペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）投与糖尿病群を示す。

Claims (7)

1. ヒトエンドスタチン、その変異体またはその断片を有効成分として含み、ただし、該変異体がヒトエンドスタチンのアミノ酸配列中に１もしくは数個の置換、欠失および／または付加を含み、かつ腎臓において血管新生抑制活性を有するものであり、ならびに、該断片がヒトエンドスタチンのアミノ酸配列において連続する少なくとも２０アミノ酸からなる配列を有し、かつ腎臓において血管新生抑制活性を有するものである、糖尿病性腎症の治療または予防用医薬組成物。
2. 前記断片がエンドスタチンのＮ末端ドメインを含むものである請求項１記載の医薬組成物。
3. 前記Ｎ末端ドメインが、ヒトエンドスタチンのアミノ酸配列の少なくとも１位〜２７位または６位〜４９位の配列を含むものである請求項２記載の医薬組成物。
4. 前記断片がエンドスタチンのＣ末端ドメインを含むものである請求項１記載の医薬組成物。
5. 前記Ｃ末端ドメインが、ヒトエンドスタチンのアミノ酸配列の少なくとも１３４位〜１７８位の配列を含むものである請求項４記載の医薬組成物。
6. 前記断片が配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むものである請求項１〜３のいずれか１項記載の医薬組成物。
7. 前記糖尿病性腎症のうち早期腎症に有効である請求項１〜６のいずれか１項記載の医薬組成物。

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