CN114657154A

CN114657154A - 一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法及其应用

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Publication number: CN114657154A
Application number: CN202011528341.8A
Authority: CN
Inventors: 赵魁; 周艳龙; 关继羽; 吕品; 高丰; 贺文琦; 宋德光; 兰云刚; 李姿; 田静
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2040-12-22
Also published as: CN114657154B

Abstract

本发明提供了一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法，通过将目标基因突变的方式制备，所述目标基因为羊传染性脓疱病毒ORF120基因。所述缺失ORF120基因的羊传染性脓疱病毒是采用基因工程手段，利用同源重组的方法从ORFV‑SY17分离株全基因组中敲除ORF120基因，以此达到毒力减弱的目的，并以绿色荧光蛋白EGFP作为标记蛋白代替缺失的基因，命名为ORFV‑SY17Δ120减毒株。在此基础上，拯救出其互补株ORFV‑SY17‑Rv120，并以红色荧光蛋白RFP作为筛选标识。经过本源动物羔羊动物接种实验表明，本发明所述的ORF120单基因缺失羊传染性脓疱病毒减毒株具有良好的使用安全性，为羊传染性脓疱病毒减毒活疫苗的开发以及ORF120基因功能的探究提供技术支持。

Description

一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及兽医领域，具体涉及一种减毒的羊传染性脓疱病毒基因缺失株的制备方法及其应用。

背景技术

羊传染性脓疱病俗称“羊口疮（Orf）”，是由羊传染性脓疱病毒（Orf virus, ORFV）感染引起绵羊、山羊等的一种急性、高度接触性的人兽共患传染病，临床以在感染部位形成丘疹、水疱、脓疱和疣状厚痂为特征。近年来，ORFV 感染的临床病例报道逐年增多，目前已呈世界范围分布。此外，ORFV在体外的生存能力较强，能够在环境中长期稳定地存在，羊群一旦被感染则很难清除，可持续多年对羊群造成危害。通过与病羊的直接/间接接触，人也可发生感染，尤其从事饲养、屠宰、兽医等职业的人员。因此，该病不仅对养羊业的危害较为突出，而且潜在危害人类健康，成为影响我国乃至世界公共卫生安全的一个重要隐患。

作为一种重要的人兽共患传染病病原，ORFV是如何突破天然免疫屏障成功感染宿主的具体机制至今尚不清楚，近年来针对ORFV感染与宿主免疫间关系受到越来越广泛的关注和深入的研究。研究发现，ORFV进化出了一系列拮抗/破坏宿主天然免疫的策略，可利用自身编码的多种免疫调节蛋白，通过抑制干扰素产生、细胞凋亡等多种机制来抑制和逃避宿主的抗病毒反应。然而，由于对ORFV诱导的宿主免疫和致病机制的研究仍不够深入，导致临床上尚缺乏有效的防治策略。

鉴于基因缺失减毒苗的构建依赖于对病毒毒力基因和免疫抑制相关基因的筛选鉴定以及对病毒致病机制的了解，近年来国内外研究人员对 ORFV全基因组序列及免疫逃避机制进行深入解析，分离和鉴定更多的免疫调节及毒力相关基因成为目前该领域研究的热点。

中国专利CN104017776B公开了通过传代培养获得致弱毒株并将其应用于疫苗的制备。通过传代获得的弱毒株由于其本身的基因并未发生改变，其病毒毒力存在复毒的风险。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法，通过将目标基因突变的方式制备，所述目标基因为羊传染性脓疱病毒ORF120基因。

羊传染性脓疱病毒为痘病毒科（Poxviridae）副痘病毒属（Parapoxvirus）的代表种，基因组庞大，由位于两末端的反向末端重复序列（ITRs）（ORFs 001-008和112-134）和中间核心区（ORFs 009-111）构成，其中末端区ITRs集中有毒力免疫调节相关基因，能够编码产生使宿主防御反应的免疫成分失活的相关蛋白，如vIL-10、趋化因子（MCP-1、MIP-1α、RANTES）阻遏蛋白（CBP）、GM-CSF/IL-2抑制因子（GIF）、抗细胞凋亡因子（ORFV125）和锚定蛋白（ANK）重复蛋白等，这些免疫调节因子被认为能够参与宿主免疫和炎症反应，通过与宿主体内一些免疫调节因子结合并降低其活性，抑制宿主的免疫反应从而促进病毒在宿主内的生存和增殖。目前，针对ORFV基因组尤其是末端区部分未知功能的基因研究发现，ORFV002、ORFV024、ORFV073、ORFV121等基因编码蛋白为NF-κB抑制剂，可通过多种途径阻断NF-κB介导的天然免疫炎症信号通路，以拮抗宿主的天然免疫。其中，ORFV073、ORFV121既是免疫抑制基因又是毒力基因，然而ORFV编码的多个免疫抑制基因与病毒毒力并不相关，包括且不限于ORFV002 基因（DIEL D G, LUO S, DELHON G, et al. A Nuclear Inhibitor of NF-κB Encoded by a Poxvirus [J]. Journal of virology, 2011, 85(1): 264-75.）和ORFV024 基因（DIEL D G, DELHON G, LUO S, et al. A novel inhibitor of the NF-{kappa}B signaling pathway encoded by the parapoxvirus orf virus [J]. Journalof virology, 2010, 84(8): 3962-73.）均与病毒毒力无关，缺失ORFV002和ORFV024基因对病毒毒力及本源动物羊的致病性没有显著影响。目前，ORFV末端区仍有多个基因的功能未知，尚有待于挖掘。

本发明的研究工作中，优选采用ORFV-SY17进行减毒毒株的制备。ORFV-SY17的基因组序列已经公开于相关数据库。本发明首先从众多末端基因中锁定位于病毒基因组末端区的ORF120，然后通过大量序列信息的比对，确定ORFV-SY17毒株的ORF120基因全长序列为ORFV-SY17株基因组序列的120694至121281碱基的588bp核苷酸序列。进一步的研究，确定了缺失ORF120基因的ORFV-SY17缺失株可在羊体内产生减毒表型，导致病毒毒力的减弱，证实ORF120基因是ORFV的一个重要毒力基因。为本发明进一步构建ORFV减毒株提供重要的理论依据。

本发明进一步的研究中，ORFV-SY17病毒株基因组120779至121169基因位点的ORF120基因序列（如SEQ NO：2所示的核苷酸序列）的缺失导致野生病毒的减毒以及在本源动物羊等中小反刍动物上对亲本ORFV病毒攻击的100%免疫保护。因此，构建ORF120基因缺失病毒作为疫苗候选毒株更具有针对性。本发明优选的病毒野毒株ORFV-SY17株为现有技术中已公开的毒株（Zhong J#, Guan J#, Zhou Y, Cui S, Wang Z, Zhou S, Xu M, WeiX, Gao Y, Zhai S, Song D, He W, Gao F, Zhao K*. Genomic characterization oftwo Orf virus isolates from Jilin province in China. Virus Genes, 2019, 55:490–501.），公众可通过与作者共享的方式获得。

优选的是，所述ORF120基因包含SEQ NO：1所示的核苷酸序列，ORF120基因的突变方式包括SEQ NO：1所示的核苷酸序列中第1～86至476～588位核苷酸序列的缺失或替换。优选的突变方式包括：SEQ NO：1所示的核苷酸序列中第1～476位核苷酸，第1～477位核苷酸，第1～478位核苷酸，……，第1～588位核苷酸；第2～476位核苷酸，第2～477位核苷酸，第2～478位核苷酸，……，第2～588位核苷酸；第3～476位核苷酸，第3～477位核苷酸，第3～478位核苷酸，……，第3～588位核苷酸；第4～476位核苷酸，第4～477位核苷酸，第4～478位核苷酸，……，第4～588位核苷酸；以此类推直至第86～476位核苷酸，第86～477位核苷酸，第86～478位核苷酸，……，第86～588位核苷酸的缺失突变，即将SEQ NO：1 所示的核苷酸序列中的第N1位碱基至第N2位碱基间的核苷酸序列敲除，其中1≤N1≤86，476≤N2≤588；另一优选方案是将SEQ NO：1 所示的核苷酸序列中的第N1位碱基至第N2位碱基间的核苷酸序列替换为其他核苷酸片段，在本发明的优选实施例中，将缺失片段替换为标记基因的核苷酸序列。

上述任一项优选的是，ORF120基因的突变方式还包括SEQ NO：1所示的核苷酸序列中第86至476位核苷酸的一个或多个碱基的缺失或替换。

关于ORF120基因序列的确定及敲除位点的选择，发明人进行了大量的工作，最终选定缺失突变构建方式，即确定的敲除序列（即缺失序列）的起始位点位于SEQ NO：1所示的核苷酸序列第1至86位碱基，终止位点位于第476至588位碱基，其中最为优选的敲除序列为SEQ NO：1所示的核苷酸序列的第86～476位碱基，即敲除序列的起始碱基为第86位碱基，终止碱基为第476位碱基，即将SEQ NO：2所示的核苷酸序列。进一步的优选方案是，将SEQ NO：2所示的核苷酸序列敲除后，插入标记基因的核苷酸序列。

上述任一项优选的是，在ORF120基因缺失位点插入第一标记基因，作为筛选标记基因。所述第一标记基因优选为绿色荧光蛋白基因（eGFP），第一标记基因还包括具有同等作用的荧光素DsRED, RFP, mCherry, tdTomato, YFP均可作为筛选标记。通过同源重组插入所述第一标记基因。

上述任一项优选的是，所述羊传染性脓疱病毒为羊传染性脓疱病毒ORFV-SY17株。

上述任一项优选的是，制备步骤包括：

（1）准备亲本毒株：所述的羊传染性脓疱病毒ORFV-SY17株作为亲本毒株，所述的羊传染性脓疱病毒ORFV-SY17株的全长基因序列如GenBank：MG712417.1所示。本发明所述的毒株，ORFV-SY17株全长序列已于GenBank公开（GenBank序列号：MG712417.1）。

（2）筛选表达盒的构建：将适用于羊传染性脓疱病毒的特异性启动子和第一标记基因插入载体骨架中获得筛选表达盒。本发明所述适用于羊传染性脓疱病毒的特异性启动子是指在羊传染性脓疱病毒中能够启动基因表达的启动子。

（3）穿梭质粒的构建：扩增ORFV-SY17株的ORF120基因缺失序列两侧的序列作为重组同源臂，克隆入步骤（2）构建的筛选表达盒上，获得标记后的重组穿梭质粒；

（4）利用步骤（3）制备的穿梭质粒转染已感染ORFV-SY17野毒株的宿主细胞，获得表达第一标记基因的缺失病毒；步骤4优选的制备所述表达第一标记基因的缺失病毒的方法为荧光斑法和有限稀释法。

（5）利用步骤（4）制备的表达第一标记基因的缺失病毒感染宿主细胞，将携带ORF120基因的质粒转染所述表达第一标记基因缺失病毒感染的宿主细胞，通过荧光斑法和有限稀释法获得缺失毒株的互补株。步骤5优选的制备所述缺失毒株的互补株的方法为荧光斑法和有限稀释法。

步骤4和5中所述荧光斑法和有限稀释法，均为本领域常规使用的方法，记载在已公开的文献中，在此不进行详述。

上述任一项优选的是，步骤5中携带ORF120基因的质粒还含有第二标记基因。所述第二标记基因与所述第一标记基因的种类不同或检测方式不同，优选的第一标记基因和第二标记基因为不同的荧光蛋白，所述不同的荧光蛋白是指第一标记基因荧光蛋白和第二标记基因荧光蛋白激发产生的荧光在不同的波段进行检测。

上述任一项优选的是，所述第一标记基因包括绿色荧光蛋白eGFP、红色荧光蛋白DsRED、红色荧光蛋白RFP、红色荧光蛋白mCherry、荧光蛋白tdTomato或黄色荧光蛋白YFP中的至少一种；和/或所述载体骨架包括克隆载体pTZ19R、pUC57、pMD18T、pQE30、pUC18、pUC19、pRSET-A、pRSET-B、pVAX1或pBR322等中的一种；和/或所述适用于羊传染性脓疱病毒的特异性启动子包括痘苗病毒（Vaccinia virus, VV）早晚期p7.5启动子（VV p7.5）、VV H6启动子（H6）、VV合成早晚期启动子（E/L）、VV晚期P11启动子（P11）、痘病毒合成晚期441启动子（SL441）、痘病毒合成晚期454启动子（SL454）、pb56双向启动子及人工优化早晚期启动子（LEO）。本申请所述载体骨架如无特殊说明为商业化的载体骨架。

上述任一项优选的是，所述宿主细胞为OFTu细胞（胎羊鼻甲骨细胞）。

上述任一项优选的制备步骤为：

（1）亲本毒株：具体为全长基因序列如GenBank：MG712417.1中所述的羊传染性脓疱病毒（ORFV）SY17株；

（2）筛选表达盒的构建：用绿色荧光蛋白eGFP作为第一标记基因，以pUC57、pUC19等克隆质粒为载体骨架，插入痘苗病毒（Vaccinia virus, VV）早晚期p7.5启动子（VVp7.5）、VV H6启动子（H6）、VV合成早晚期启动子（E/L）、VV晚期P11启动子（P11）、痘病毒合成晚期441启动子（SL441）、痘病毒合成晚期454启动子（SL454）、pb56双向启动子或人工优化早晚期启动子（LEO）中的至少一种和标记基因eGFP，构建pUC57-eGFP筛选表达盒；

（3）穿梭质粒的构建：扩增ORFV-SY17株的ORF120基因两侧的序列作为重组同源臂，克隆入步骤（2）构建的pUC57-eGFP筛选表达盒上，获得标记后的pUC57-LFΔ120-eGFP-RFΔ120重组穿梭质粒；

（4）利用步骤（3）制备的穿梭质粒pUC57-LFΔ120-eGFP-RFΔ120转染已感染ORFV-SY17野毒株的OFTu细胞，通过荧光斑法和有限稀释法获得表达绿色荧光蛋白的缺失病毒OV-SY17/Δ120/GFP+；

（5）利用步骤（4）制备的ORFV-SY17/Δ120/GFP+缺失病毒感染细胞后，将标记红色荧光蛋白RFP（第二标记基因）的pUC19-ORF120质粒（由ORFV ORF120基因克隆入pUC19质粒构建）转染OFTu细胞，通过荧光斑法和有限稀释法获得缺失毒株的互补株ORFV-SY17-Rv120。pUC19-ORF120质粒由ORFV ORF120基因克隆入pUC19质粒构建，包括3×Flag标签、全长ORF120序列（588bp，即SEQ NO：1 所示的核苷酸序列）和RFP荧光蛋白基因。所述Flag标签的氨基酸序列包括但不限于N-DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-C，现有技术中能够实现本发明功能的Flag标签均适应于本发明。进一步的优化方案为：

（1）绿色荧光蛋白（eGFP）筛选表达盒的构建：设计针对VV p7.5启动子序列的特异性引物（VV p7.5 Fw的核苷酸序列如SEQ NO：3所示; VV p7.5 Rv的核苷酸序列如SEQ NO：4所示），以pSPV-EGFP质粒（由南方医科大学生物技术学院实验室提供，公众可自行获取）为模板进行PCR扩增，反应条件为98℃ 30s，55℃ 15s，72℃ 5s，34个循环；设计针对eGFP的特异性引物（eGFP Fw的核苷酸序列如SEQ NO：5所示; eGFP Rv的核苷酸序列如SEQ NO：6所示），以pEGFP-N1载体（Clontech）为模板进行PCR扩增，反应条件为98℃ 30s，55℃ 15s，72℃ 8s，34个循环。将经PCR获得的VV p7.5产物和eGFP产物通过融合PCR方法进行连接，反应条件为98℃ 30s，55℃ 15s，72℃ 60s，34个循环；以pUC57质粒为载体骨架，插入VVp7.5-eGFP筛选表达盒基因片段，测序验证转移载体构建的正确性，获得pUC57-eGFP筛选表达盒。

（2）ORF120缺失用重组穿梭质粒的构建：设计ORF120基因上下游序列作为左、右同源臂（ LF; 819 bp（基因组第119960至120778位核苷酸序列），RF; 852 bp（基因组第121170至122021位核苷酸序列）），分别克隆入pUC57-eGFP筛选表达盒上，测序验证重组穿梭质粒构建的正确性，获得pUC57-LFΔ120-eGFP-RFΔ120重组转移质粒。

（3）细胞转染和重组病毒的筛选：将pUC57-LFΔ120-eGFP-RFΔ120重组转移质粒转染至已感染羊传染性脓疱病毒原始野毒株的OFTu细胞，经倒置荧光显微镜观察重组病毒的感染情况。挑选单个荧光细胞经反复冻融释放病毒，随后再次接种OFTu细胞，观察出现荧光的细胞孔。

（4）重组病毒的筛选纯化和鉴定：通过荧光斑法、有限稀释、蚀斑纯化、扩大培养、纯净性检验（目的基因PCR鉴定），以确定获得纯化的ORFV ORF120基因缺失病毒ORFV/Δ120/GFP+。

在本发明优选的实施例中，目的基因PCR测定结果显示，所述羊传染性脓疱病毒减毒株相对于ORFV-SY17原始毒株全长序列缺失了第120779至121169位核苷酸。

本发明还提供了羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法在制备羊传染性脓疱病减毒活疫苗中的应用。

优选的是，在ORF120基因缺失的部位插入绿色荧光蛋白基因（eGFP）作为标记物，表达eGFP的ORF120基因缺失病毒作为候选毒株，敲除GFP后作为疫苗生产毒株用于制备羊传染性脓疱病减毒活疫苗。

本发明首次提供了ORF120基因的功能及其缺失突变在羊传染性脓疱减毒病毒制备中的应用，本发明提供了一种基因修饰的制备减毒毒株的方法，进一步的提供了制备减毒活疫苗的应用方案，本发明所提供的方法和方案，能够克服病毒经体外致弱的缺陷，消除暴发隐患，且具有能有效激活机体免疫系统等优点，因此成为当前新型疫苗研发过程中一个极具吸引力的选择。随着人们对 ORFV生物学基本特征及免疫逃逸机制的深入了解，越来越多的毒力及免疫抑制基因被成功挖掘，有针对性地删除毒力相关基因获得相应的缺失突变体，为合理开发新型、高效的羊传染性脓疱病疫苗开辟了新的可能性。

本发明的研究成果益处在于：

（1）本发明研究发现，缺失ORFV-SY17毒株ORF120基因后，其对羔羊致病性大幅度降低，具有显著的减毒表型，证实了ORF120基因是ORFV的一个重要毒力基因。

（2）本发明通过敲除ORFV-SY17毒株ORF120基因获得了ORF120单基因缺失减毒株，该毒株具有良好的安全性，适合作为制备羊传染性脓疱病疫苗的毒株，对于羊传染性脓疱病疫苗的制备和防控具有重要的实际意义。

附图说明

图1为本发明优选实施例1 ORFV ORF120基因敲除策略示意图。

图2为本发明优选实施例1转染重组穿梭质粒至已感染ORFV-SY17毒株（MOI=1）3h的OFTu细胞，继续培养48h后疑似重组病毒感染的情况以及单个GFP阳性细胞筛选纯化后绿色荧光情况。

图3为本发明优选实施例1重组病毒rORFV/Δ120/GFP+的纯度鉴定结果。

图4为本发明优选实施例1缺失毒株的互补株ORFV-SY17-Rv120的筛选纯化情况。

图5为本发明优选实施例1缺失毒株的互补株ORFV-SY17-Rv120的纯度鉴定结果。

图6为本发明优选实施例1亲本毒株、缺失毒株及其互补毒株的生长曲线对比。

图7为本发明优选实施例1ORF120基因缺失对病毒毒力及本源动物致病性的影响。

具体实施方式

本发明通过以下实施例进行更加清晰、完整的描述，但所描述的实例仅是本发明一部分实施例，并非全部。所述实施例为帮助理解本发明，不应依此来局限本发明的保护范围。本发明所使用的试剂方法如无特殊说明均为现有技术的常规试剂和方法，可由商业化购买或者记载于教科书、工具书及相关已公开文献中。

实施例1

实施例材料来源：

细胞和病毒：本发明所用原代胎羊鼻甲骨细胞（OFTu）分离自妊娠3～5月龄健康孕羊，麻醉孕羊，无菌取出胎羊，采集鼻甲骨组织剪碎，使用D-Hanks液体冲洗2～3次，加入0.25%胰蛋白酶消化处理30min，之后重复消化1～2次。收集细胞悬液，低速离心，弃去上清，将细胞重悬于含10% FBS的MEM培养基中，置37℃、5% CO₂培养箱中进行培养。OFTu细胞用于质粒转染和病毒重组实验。ORFV-SY17病毒株为吉林大学兽医病理学实验室保存病毒株，已公开于Zhong J#, Guan J#, Zhou Y, Cui S, Wang Z, Zhou S, Xu M, Wei X, Gao Y,Zhai S, Song D, He W, Gao F, Zhao K*. Genomic characterization of two Orfvirus isolates from Jilin province in China. Virus Genes, 2019, 55: 490–501.，为公众可获得的病毒来源，病毒效价为10^7.37 TCID₅₀，分装保存于－80℃备用。

ORF120基因缺失羊传染性脓疱病毒的构建、纯化和鉴定

1.1 eGFP筛选表达盒的构建

设计针对VV p7.5启动子序列的特异性引物（VV p7.5 Fw的核苷酸序列如SEQ NO：3所示; VV p7.5 Rv的核苷酸序列如SEQ NO：4所示），以pSPV-EGFP质粒（由南方医科大学生物技术学院实验室提供）为模板进行PCR扩增，反应条件为98℃ 30s，55℃ 15s，72℃ 5s，34个循环；设计针对eGFP的特异性引物（eGFP Fw的核苷酸序列如SEQ NO：5所示; eGFP Rv的核苷酸序列如SEQ NO：6所示），以pEGFP-N1载体（Clontech）为模板进行PCR扩增，反应条件为98℃ 30s，55℃ 15s，72℃ 8s，34个循环。将经PCR获得的VV p7.5产物和eGFP产物通过融合PCR方法进行连接，上游引物为VV p7.5 Fw的核苷酸序列如SEQ NO：3所示，下游引物为eGFP Rv的核苷酸序列如SEQ NO：6所示，反应条件为98℃ 30s，55℃ 15s，72℃ 60s，34个循环；以pUC57质粒为载体骨架，插入VV p7.5-eGFP筛选表达盒基因片段，测序验证转移载体构建的正确性，获得pUC57-eGFP筛选表达盒。

1.2 ORF120缺失用同源重组穿梭质粒的构建

根据同源臂基因片段最适原则，设计ORF120基因上下游序列作为同源重组臂，分别用针对左同源臂（LF; 819 bp）（引物序列：ORF120-LF-Fw的核苷酸序列如SEQ NO：7所示；ORF120-LF-Rv的核苷酸序列如SEQ NO：8所示）和右同源臂（RF; 852bp）（引物序列：ORF120-RF-Fw的核苷酸序列如SEQ NO：9所示；ORF120-RF-Rv的核苷酸序列如SEQ NO：10所示）的引物进行PCR扩增，PCR反应条件为98℃ 30s，55℃ 15s，72℃ 10s，34个循环。将左、右同源臂的扩增产物分别克隆入pUC57-eGFP筛选表达盒上，测序验证重组穿梭质粒构建的正确性，获得pUC57-LFΔ120-eGFP-RFΔ120重组转移质粒。使用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒DNA，测定浓度后－20℃保存备用。重组策略如图1所示，缺失的ORF120基因是羊传染性脓疱病毒全基因位于120779至121169的核苷酸序列，该DNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

1.3 细胞转染和重组病毒的筛选纯化

将ORFV-SY17原始毒株（MOI=1）接种至预先铺好OFTu细胞的30mm细胞培养皿中（细胞数约为5×10⁵个），37℃培养箱孵育1h后，加入含2%胎牛血清的DMEM高糖培养基继续培养2h后，弃去培养液，使用D-Hanks液冲洗细胞2～3次后，将1.5μg去内毒素质粒pUC57-LFΔ120-eGFP-RFΔ120经3.75µl脂质体Lipofectamine^TM 3000转染试剂转染至上述已感染ORFV-SY17毒株的OFTu细胞，转染6h后，弃去培养液，加入含2%胎牛血清的DMEM培养基。在继续培养48h后，使用荧光显微镜观察细胞是否出现绿色荧光，镜下观察可见有出现绿色荧光的细胞，表明获得疑似重组病毒，如图2所示，实施例1转染重组穿梭质粒至已感染ORFV-SY17毒株（MOI=1）3h的OFTu细胞，继续培养48h后疑似重组病毒感染的情况以及单个GFP阳性细胞筛选纯化后绿色荧光情况；Bar, 400 μm。其中，(a)是经首次筛选所观察的GFP荧光图片，(b) 是与(a)相同区域明场下细胞图片，(c)是(a)和(b)的合成图。(d) 是经第四轮筛选后培养48h所观察的GFP荧光图片，(e)是与(d)相同区域明场下细胞图片，(f)是(d)和(e)的合成图。(g)是经第六轮筛选后培养48h所观察的GFP荧光图片，(h)是与(g)相同区域明场下细胞图片，(i)是(g)和(h)的合成图。收集上述细胞病变液反复冻融3次，经4℃、1000r/min离心10min后，利用有限稀释法将其接种至预先铺设好OFTu细胞的96孔板进行首轮筛选，观察出现绿色荧光的细胞孔，并再次进行稀释筛选，刮取收集稀释度10^-4以上感染孔中的病毒，之后利用有限稀释法进行4-6轮筛选，刮取单个荧光细胞进行扩大培养，获得重组病毒，命名为ORFV/Δ120/GFP+。相对于羊传染性脓疱病毒ORFV-SY17毒株全长序列，缺失了第120779至121169位核苷酸。

1.4 重组病毒ORFV/Δ120/GFP+的PCR鉴定

利用病毒基因组提取试剂盒（德国耶拿）提取野生ORFV和ORFV/Δ120/GFP+基因组DNA，使用针对ORFV ORF120基因的特异性引物（ORFV ORF120-Fw的核苷酸序列如SEQ NO：11所示；ORFV ORF120-Rv的核苷酸序列如SEQ NO：12所示）和GFP的特异性引物（GFP-Fw的核苷酸序列如SEQ NO：13所示；GFP-Rv的核苷酸序列如SEQ NO：14所示）对其纯净度进行PCR鉴定，以验证是否成功缺失ORF120基因。结果如图3（A，B）显示，重组病毒的ORF120基因的扩增结果为阴性，而GFP基因的扩增结果为阳性，表明该重组病毒成功缺失且获得纯化，其中，M为DL2000 Marker；1~4为挑选的3个不同荧光蚀斑的重组毒株；4为ORFV-SY17野毒株。

1.5缺失毒株的互补株ORFV-SY17-Rv120筛选纯化

构建包含Flag标签和RFP红色荧光蛋白的pUC19-Rv120质粒，并将其转染至感染ORFV-SY17Δ120缺失毒株的OFTu细胞，观察出现红色荧光的细胞孔（图4），利用蚀斑纯化挑选单个克隆，之后利用有限稀释法进行多轮筛选，获得缺失毒株的互补株，命名为ORFV-SY17-Rv120。同时，具有同等作用的FLAG，myc，HA, his标签也适用此类方法。图4为缺失毒株的互补株ORFV-SY17-Rv120的筛选纯化情况，将pUC19-ORF120-RFP载体转染至已感染rORFV/Δ120的OFTu细胞，继续培养挑选RFP阳性细胞经六轮、七轮、八轮筛选纯化后所观察的红色荧光情况；Bar, 400 μm；(a) 是经第六轮筛选所观察的RFP荧光图片，(b) 是与(a)相同区域明场下细胞图片，(c) 是(a)和(b)的合成图；(d) 是经第七轮筛选后培养48h所观察的RFP荧光图片，(e) 是与(d)相同区域明场下细胞图片，(f) 是(d)和(e)的合成图；(g)是经第八轮筛选后培养48h所观察的RFP荧光图片，(h) 是与(g)相同区域明场下细胞图片，(i) 是(g)和(h)的合成图。

1.6 缺失毒株互补株ORFV-SY17-Rv120的PCR鉴定

利用病毒基因组提取试剂盒（德国耶拿）提取缺失毒株互补株ORFV-SY17-Rv120和ORFV-SY17Δ120缺失毒株的基因组DNA，使用针对ORFV ORF120基因的特异性引物（ORFVORF120-Fw的核苷酸序列如SEQ NO：15所示；ORFV ORF120-Rv的核苷酸序列如SEQ NO：16所示）和RFP的特异性引物（RFP-Fw的核苷酸序列如SEQ NO：17所示；RFP-Rv的核苷酸序列如SEQ NO：18所示）对其纯净度进行PCR鉴定，以验证是否成功获得ORFV-SY17-Rv120。结果显示，缺失毒株互补株ORFV-SY17-Rv120的ORF120基因扩增结果为阳性，同时RFP基因的扩增结果也为阳性，表明成功获得ORFV-SY17-Rv120互补毒株（图5）。图5为缺失毒株的互补株ORFV-SY17-Rv120的纯度鉴定结果。（A，B）M为DL2000 Marker；1~4为挑选的3个不同荧光蚀斑的重组毒株；4为ORFV/Δ120缺失毒株。

1.7 病毒生长曲线

利用一步法和多步法对缺失毒株ORFV/Δ120/GFP+的增殖特性进行评价，亲本毒株、缺失毒株及其互补毒株的生长曲线对比结果见图6，重组病毒ORFV/Δ120/GFP+与亲本毒株ORFV-SY17及缺失毒株互补株ORFV-SY17-Rv120的生长规律基本一致，病毒滴度无明显变化，表明ORF120基因的缺失不影响病毒在OFTu细胞上的复制，也证明该基因为病毒复制非必需基因。图6为亲本毒株、缺失毒株及其互补毒株的生长曲线对比，其中（A）多步生长曲线；（B）一步生长曲线。

1.8 ORF120基因缺失对病毒毒力及本源动物致病性的影响

本发明实施过程中利用本源动物羔羊进行接种试验，将9只1-3月龄羔羊随机分为三组，分别接种ORFV-SY17（n = 3），ORFV-SY17Δ120（n = 3）和ORFV-SY17-Rv120（n = 3）。采用下唇划痕接种的方式进行接种，接种剂量为10^7.37 TCID₅₀/0.1ml，接种后逐日观察并记录接种羔羊唇部是否出现特征性的口疮病变及死亡情况。结果显示，ORFV-SY17野毒株和ORFV-SY17-Rv120互补株接种羔羊出现相类似的口疮病变，且早在感染后第3d即可观察到，随着时间延长发展为脓疱及结痂，而ORFV-SY17Δ120缺失毒株接种羔羊的口疮病变较为轻微，该结果表明ORF120基因为病毒的毒力基因；结合病毒生长曲线的测定结果，进一步证实ORF120基因为复制非必需毒力基因。图7为本发明优选实施例1为ORF120基因缺失对病毒毒力及本源动物致病性的影响。SY17：为野毒株；SY17Δ120：为缺失ORF120基因的缺失毒株；SY17-Rv120：为ORF120基因回复互补毒株。

本发明利用DNA同源重组技术，以已鉴定的具有明显减毒表型的ORFV-SY17株ORF120基因作为缺失靶标，构建ORF120毒力基因缺失突变毒株，再通过有限稀释法筛选纯化获得ORFV/Δ120/GFP+缺失株；本源动物羔羊接种试验结果显示，该缺失突变毒株具有良好的使用安全性和免疫保护效果，是理想的基因缺失疫苗候选对象，为研制羊传染性脓疱病新型疫苗奠定重要基础。

实施例2

实施例2与实施例1相似，不同之处在于将SEQ NO：1所示的核苷酸序列中第20至480位核苷酸敲除，并在基因缺失位点插入YFP基因，并以YFP基因为筛选基因对所得细胞进行筛选鉴定。结果表明，利用实施例2所提供的方法获得的病毒减毒株接种羔羊的口疮病变较为轻微。

实施例3

实施例3提供的ORFV减毒株的制备方法、检测方法及应用与实施例1或2相似，不同的是，所述突变方式为将SEQ NO：1所示核苷酸序列的第41位碱基至第500位碱基敲除，即将SEQ NO：19所示核苷酸序列从基因组中敲除。

其左、右同源臂分别为基因组第119960至120733位核苷酸序列和基因组第121194至122021位核苷酸序列。

实施例3中启动子采用痘病毒合成晚期454启动子（SL454），启动子相关序列记载于已发表文献中，在此不进行赘述。

实施例4

实施例4提供的ORFV减毒毒株的制备方法、检测方法及应用与实施例1或2相似，不同的是，所述突变方式为SEQ NO：1所示的核苷酸序列中第86至476位核苷酸（即SEQ NO：2所示的核苷酸序列）一个或多个碱基的缺失或替换。实施例4优选的方式为利用同源重组的方法将SEQ NO：2所示的核苷酸序列第121-320位碱基敲除。或者替换为eGFP基因的核苷酸序列。

实施例5

实施例1或2获得的ORFV减毒毒株感染OFTu细胞，37℃，5%CO₂条件下培养24至48h，细胞病变达到80%左右收毒。收集细胞病变液，反复冻融3次以充分释放病毒，之后经蔗糖密度梯度离心进行浓缩纯化后作为羊传染性脓疱病候选减毒疫苗。选取无特异性抗体的6月龄左右羔羊15头，随机分为三组，分别为实施例1所获毒株免疫组、实施例2所获毒株免疫组和对照组。实施例1和实施例2组羔羊采用下唇部划痕方式进行免疫接种，对照组以相同方式接种无菌PBS。对接种羔羊的血清抗体水平、淋巴细胞增殖以及细胞因子表达等各项免疫学指标的测定结果显示，实施例1和实施例2所获得减毒株主要诱导机体产生Th1型细胞介导的细胞免疫应答反应。攻毒保护性实验结果显示，实施例1毒株和实施例2毒株免疫组羔羊在攻毒后14d仍未见有发病。上述结果表明，本发明所制备的缺失ORF120基因的减毒株具有较好的免疫保护性，可作为临床上用于羊传染性脓疱病防控的候选疫苗毒株。

实施例6

将纯化鉴定后的ORFV-SY17Δ120缺失毒株接种胎羊鼻甲骨细胞，当细胞病变达80%-90%时，收集细胞毒液，反复冻融3次后，然后进行无菌检验、支原体检验、安全检验，经检验合格达到《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》中规定的各项指标，Reed-Muench法测定ORFV-SY17Δ120毒株的TCID₅₀，该缺失毒株的病毒滴度为10^6.2 TCID₅₀，可作为羊传染性脓疱病减毒活疫苗应用。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法及其应用

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 588

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcgtctaa tcttagcgct cgtggcttgc ttgttggcgg cgccgatgcc gttatcgggt 60

cgttcgacaa gcactccaaa cacgtccccc tccgtactcg gctcgacgag ttcggaacca 120

agctcggaag acgctgtggc ttcgagcaca actacaagca cattcacaag cacactcact 180

ctgtccacaa gtgtggacac cactactacc tcgggcgcta caacgtccgc aaacagcact 240

cctgcagcga gtgtgagctc ctccacaccc gcaaccaccg aggcatcgac ggcaccaacg 300

acgccgtcga cgccgacgac agtgaagggc aaggaagacg cgaaggcgtc tgcctacctc 360

gctttactaa tcacgttcat ggtcatgacc acgctagtga tggtcgtggt cgtggtcgtg 420

gtcgtgtaca aacagggact ctgtgactgc tgctgtagga tgtttccctg ctgcagagag 480

ctcaaggact acctcgacga ggaggagagc gccggtctgt acgacgcctt gacgtggagc 540

cactcgaacc ccggcttccg gctcgtcatg cgcgcggacc ccagatga 588

<210> 2

<211> 391

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccccctccgt actcggctcg acgagttcgg aaccaagctc ggaagacgct gtggcttcga 60

gcacaactac aagcacattc acaagcacac tcactctgtc cacaagtgtg gacaccacta 120

ctacctcggg cgctacaacg tccgcaaaca gcactcctgc agcgagtgtg agctcctcca 180

cacccgcaac caccgaggca tcgacggcac caacgacgcc gtcgacgccg acgacagtga 240

agggcaagga agacgcgaag gcgtctgcct acctcgcttt actaatcacg ttcatggtca 300

tgaccacgct agtgatggtc gtggtcgtgg tcgtggtcgt gtacaaacag ggactctgtg 360

actgctgctg taggatgttt ccctgctgca g 391

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtcgacatct atatactata tag 23

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcctcgccc ttgctcacca tggtggcgaa ttcctcgagg cgtc 44

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggtgagca agggcgagga gctg 24

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagcttagat ctgcggccgc ttacttgtac agctcg 36

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtgaattcga gctcggtacc aagcttgccg cacccccgca gccccag 47

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atatagtata tagatgtcga cacgtgtttg gagtgcttgt cgaacg 46

<210> 9

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gagctgtaca agtaagcggc cgcagagctc aaggactacc tcgacg 46

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

accatgatta cgccaagctt agatcttcag gcagtcgttc atgga 45

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gctcgacgag ttcggaacc 19

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcagtcacag agtccctg 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggtgagca agggcgag 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttacttgtac agctcgtc 18

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gctcgacgag ttcggaacc 19

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gcagtcacag agtccctg 18

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atggcctcct ccgaggacgt ca 22

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ttaggcgccg gtggagtggc gg 22

<210> 19

<211> 460

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cgccgatgcc gttatcgggt cgttcgacaa gcactccaaa cacgtccccc tccgtactcg 60

gctcgacgag ttcggaacca agctcggaag acgctgtggc ttcgagcaca actacaagca 120

cattcacaag cacactcact ctgtccacaa gtgtggacac cactactacc tcgggcgcta 180

caacgtccgc aaacagcact cctgcagcga gtgtgagctc ctccacaccc gcaaccaccg 240

aggcatcgac ggcaccaacg acgccgtcga cgccgacgac agtgaagggc aaggaagacg 300

cgaaggcgtc tgcctacctc gctttactaa tcacgttcat ggtcatgacc acgctagtga 360

tggtcgtggt cgtggtcgtg gtcgtgtaca aacagggact ctgtgactgc tgctgtagga 420

tgtttccctg ctgcagagag ctcaaggact acctcgacga 460

Claims

1.一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法，通过将目标基因突变的方式制备，其特征在于，所述目标基因为羊传染性脓疱病毒ORF120基因。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述ORF120基因包含SEQ NO：1所示的核苷酸序列，ORF120基因的突变方式包括SEQ NO：1所示的核苷酸序列中第1～86至476～588位核苷酸序列的缺失或替换；和/或SEQ NO：1所示的核苷酸序列中第86至476位核苷酸一个或多个碱基的缺失或替换。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，ORF120基因的突变方式为SEQ NO：1所示的核苷酸序列中第86至476位核苷酸的缺失突变，缺失的核苷酸序列为SEQ NO：2所示的核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在缺失突变位点插入第一标记基因。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述羊传染性脓疱病毒为羊传染性脓疱病毒ORFV-SY17株。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，制备步骤包括：

(1)准备亲本毒株：所述亲本毒株为羊传染性脓疱病毒ORFV-SY17株，所述羊传染性脓疱病毒ORFV-SY17株的全长基因序列如GenBank：MG712417.1所示。

(2)筛选表达盒的构建：将适用于羊传染性脓疱病毒的特异性启动子和第一标记基因插入载体骨架中，获得筛选表达盒。

(3)穿梭质粒的构建：扩增ORFV-SY17株的ORF120基因缺失序列两侧的序列作为重组同源臂，克隆入步骤(2)构建的筛选表达盒上，获得标记后的重组穿梭质粒；

(4)利用步骤(3)制备的穿梭质粒转染已感染ORFV-SY17野毒株的宿主细胞获得表达第一标记基因的缺失病毒；

(5)利用步骤(4)制备的表达第一标记基因的缺失病毒感染宿主细胞，将含有ORF120基因的质粒转染所述表达第一标记基因的缺失病毒感染的宿主细胞获得缺失毒株的互补株。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述第一标记基因包括绿色荧光蛋白eGFP、红色荧光蛋白DsRED、红色荧光蛋白RFP、红色荧光蛋白mCherry、荧光蛋白tdTomato或黄色荧光蛋白YFP中的至少一种；和/或所述载体骨架包括克隆载体pTZ19R、pUC57、pMD18T、pQE30、pUC18、pUC19、pRSET-A、pRSET-B、pVAX1或pBR322中的一种；和/或所述适用于羊传染性脓疱病毒的特异性启动子包括痘苗病毒(Vaccinia virus,VV)早晚期p7.5启动子(VVp7.5)、VV H6启动子(H6)、VV合成早晚期启动子(E/L)、VV晚期P11启动子(P11)、痘病毒合成晚期441启动子(SL441)、痘病毒合成晚期454启动子(SL454)、pb56双向启动子及人工优化早晚期启动子(LEO)。

8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤5所述含有ORF120基因的质粒，还含有第二标记基因。

9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为胎羊鼻甲骨细胞。

10.如权利要求1-8任一项所述羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法在制备羊传染性脓疱病减毒活疫苗中的应用。