CN103705935A - 一种耐热冻干保护剂及其制备方法和应用 - Google Patents
一种耐热冻干保护剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种耐热冻干保护剂及其制备方法和应用。本发明的耐热冻干保护剂由A液和B液按照体积比为1:1混合而成,A液中含有0.01-0.03g/ml的海藻糖、0.01-0.04g/ml的硫代硫酸纳、0.01-0.02g/ml的酶水解酪素、0.01-0.02g/ml的硫脲、0.005-0.02g/ml的199培养基,以及0.001-0.01g/ml的O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖,用质量百分比浓度为2%-6%的聚乙烯吡咯烷酮(PVPK30)水溶液溶解并定容,用0.22um滤器除菌;B液中含有0.01-0.03g/ml的明胶、0.05-0.1g/ml的蛋白胨以及0.05-0.1g/ml蔗糖,用去离子水溶解并定容,高压灭菌后备用。相较于现有产品,本发明的一种改良后的耐热冻干保护剂能够提高产品的保护期限,更大限度的维持病毒滴度,并且缩短了冻干时间,抗体持续时间长,有利于工业化大规模生产的使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种耐热冻干保护剂及其制备方法和应用。属于生物技术领域。
背景技术
我国在耐热冻干保护剂方面的研究起步较晚,但现在在这方面的研究取得了一定的成果,专利公开号为CN1426816A,发明名称为兽医病毒类生物制品耐热冻干保护剂及制备工艺的发明专利申请中公开了一种兽医病毒类持物制品耐热冻干保护剂,保护剂的组份包括常用的蔗糖、脱脂奶粉、明胶、糊精,该申请还进一步公开了一种用于鸡新城疫弱毒冻干疫苗的保护剂的成分配比:明胶1.5-2%、蔗糖5-6%、糊精5-10%、PVP(K90)2-5%、山梨醇2%、谷氨酸钠1-2%。
采用该保护剂制备得到的冻干疫苗在2-8℃条件下,保存24个月以后,病毒滴度无明显下降,37℃放置10天,EID50下降在1个滴度之内,全程冻干不超过48个小时。本发明发明人在该工艺的基础上,改良了保护剂的配方及冻干曲线,新的工艺不但配方简单,耐热后下降约0.4个滴度,冻干时间约为24小时,抗体持续时间长,为大规模的工业生产节约了资源,也增加了经济效益。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种改良后的耐热冻干保护剂。
为了达到上述目的,本发明采用了以下技术手段:
本发明的一种耐热冻干保护剂,其特征在于由A液和B液按照体积比为1:1混合而成,
其中,A液中含有0.01-0.03g/ml的海藻糖、0.01-0.04g/ml的硫代硫酸纳、0.01-0.02g/ml的酶水解酪素、0.01-0.02g/ml的硫脲、0.005-0.02g/ml的199培养基,以及0.001-0.01g/ml的O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖,用质量百分比浓度为2%-6%的聚乙烯吡咯烷酮(PVPK30)水溶液溶解并定容,用0.22um滤器除菌;
其中,按质量体积百分比计,B液中含有0.01-0.03g/ml的明胶、0.05-0.1g/ml的蛋白胨以及0.05-0.1g/ml蔗糖,用去离子水溶解并定容,高压灭菌后备用。
在本发明中,优选的,所述的耐热冻干保护剂,其特征在于由A液和B液按照体积比为1:1混合而成,
其中,A液中含有0.02g/ml的海藻糖、0.03g/ml的硫代硫酸纳、0.015g/ml的酶水解酪素、0.015g/ml的硫脲、0.01g/ml的199培养基以及0.005g/ml的O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖,用质量百分比浓度为4%的聚乙烯吡咯烷酮(PVPK30)水溶液溶解并定容,用0.22um滤器除菌;
其中,按质量体积百分比计,B液中含有0.02g/ml的明胶、0.08g/ml的蛋白胨以及0.08g/ml蔗糖,用去离子水溶解并定容,高压灭菌后备用。
在本发明中,优选的,所述的199培养基为GIBCO粉末状199培养基,货号(Cat.No.)为31100-035,可购买自Invitrogen。
进一步的,本发明还提出了所述的耐热冻干保护剂在疫苗制备中的应用。
在本发明中,优选的,所述的疫苗为鸡新城疫弱毒活疫苗。
在本发明中,优选的,将所述的耐热冻干保护剂与病毒液按照体积比为1:1混合后,按照疫苗制备的常规方法进行冻干。
相较于现有技术,本发明的优势在于:
(1)改良后的耐热冻干保护剂能够使疫苗在2-8℃下保存期由原来的2年提高到3年;
(2)改良后的耐热冻干保护剂在使用时能够缩短冻干时间至24小时,原有方法其冻干时间不超过48个小时;
(3)使用改良后的耐热冻干保护剂保护的冻干产品(疫苗),耐热后病毒含量下降约0.2个滴度,原有方法下降约0.8个滴度;
(4)改良后的耐热冻干保护剂的冻干产品免疫后10周抗体开始下降,原有方法其免疫后5周抗体开始下降。
由此说明,本发明的一种改良后的耐热冻干保护剂能够提高产品的保护期限,更大限度的维持病毒滴度,并且缩短了冻干时间,抗体持续时间长,有利于工业化大规模生产的使用。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1耐热冻干保护剂的制备
(1)按照以下重量称取各物质:
称取海藻糖2g,硫代硫酸纳3g,酶水解酪素1.5g,硫脲1.5g,GIBCO199培养基(购买自Invitrogen,货号(Cat.No.)为31100-035,批号(Lot.No.)为909374,粉末状)1g,O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖0.5g,明胶2g,蛋白胨8g,蔗糖8g;
(2)A液的制备:
将称取的海藻糖,硫代硫酸纳,酶水解酪素,硫脲,199培养基,O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖,分别加入到少量质量百分比浓度为4%的聚乙烯吡咯烷酮(PVPK30)水溶液中,充分溶解,搅拌均匀后,再用质量百分比浓度为4%的聚乙烯吡咯烷酮(PVPK30)水溶液定容至100ml,用0.22um滤器除菌,备用,即得A液;
(3)B液的制备:
将称取的明胶,蛋白胨,蔗糖分别加入到少量去离子水中,充分溶解,搅拌均匀后,再用去离子水定容至100ml,高压灭菌后备用,即得B液;
(4)将A液和B液按照体积比为1:1混合,即得耐热冻干保护剂。
实施例2耐热冻干保护剂的制备
(1)按照以下重量称取各物质:
称取海藻糖1g、硫代硫酸纳3g、酶水解酪素1g、硫脲2g,GIBCO199培养基(购买自Invitrogen,货号(Cat.No.)为31100-035,批号(Lot.No.)为909374,粉末状)2g,O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖0.1g,明胶3g、蛋白胨5g以及蔗糖10g。
(2)A液的制备:
将称取的海藻糖,硫代硫酸纳,酶水解酪素,硫脲,199培养基以及O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖,分别加入到少量质量百分比浓度为2%的聚乙烯吡咯烷酮(PVPK30)水溶液中,充分溶解,搅拌均匀后,再用质量百分比浓度为2%的聚乙烯吡咯烷酮(PVPK30)水溶液定容至100ml,用0.22um滤器除菌,备用,即得A液;
(3)B液的制备:
将称取的明胶,蛋白胨,蔗糖分别加入到少量去离子水中,充分溶解,搅拌均匀后,再用去离子水定容至100ml,高压灭菌后备用,即得B液;
(4)将A液和B液按照体积比为1:1混合,即得耐热冻干保护剂。
实施例3耐热冻干保护剂的制备
(1)按照以下重量称取各物质:
称取海藻糖3g、硫代硫酸纳1g、酶水解酪素2g、硫脲1g、GIBCO199培养基(购买自Invitrogen,货号(Cat.No.)为31100-035,批号(Lot.No.)为909374,粉末状)0.5g,O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖1g,明胶1g、蛋白胨10g以及蔗糖5g;
(2)A液的制备:
将称取的海藻糖,硫代硫酸纳,酶水解酪素,硫脲,199培养基以及O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖,分别加入到少量质量百分比浓度为6%的聚乙烯吡咯烷酮(PVPK30)水溶液中,充分溶解,搅拌均匀后,再用质量百分比浓度为6%的聚乙烯吡咯烷酮(PVPK30)水溶液定容至100ml,用0.22um滤器除菌,备用,即得A液;
(3)B液的制备:
将称取的明胶,蛋白胨,蔗糖分别加入到少量去离子水中,充分溶解,搅拌均匀后,再用去离子水定容至100ml,高压灭菌后备用,即得B液;
(4)将A液和B液按照体积比为1:1混合,即得耐热冻干保护剂,
实施例4耐热冻干保护剂在疫苗生产中的应用
1、疫苗的制备:
(1)病毒增殖
将鸡新城疫病毒La Sota株用无菌生理盐水按体积比1:1000倍稀释后,经尿囊腔接种11日龄SPF鸡胚,每胚0.1mL,置37℃继续孵育,弃去24h前死胚,96h后取出所有胚放入4℃冰箱过夜,收集鸡胚尿囊液,4℃保存备用;
(2)耐热冻干保护剂的配制
按照实施例1的方法配制。
(3)将配制得到的耐热冻干保护剂与病毒液按照体积比为1:1混合后冻干,冻干全程为24个小时左右,得到鸡新城疫冻干疫苗。
2、疫苗的保存期、免疫持续期测定
2.1、保存期及鸡胚半数感染量测定:
将上述制备得到的冻干疫苗在2-8℃条件下,可保存36个月。37℃放置10天,测定鸡胚半数感染量,结果:鸡胚半数感染量(EID50)下降0.2个滴度。
2.2、抗体持继期测定:
每周采血分离血清,检测HI抗体效价几何平均值。
结果:免疫后10周抗体开始下降。
对比例1
为了验证新方法的生产性能,分别利用本发明的方法以及现有方法各制备了10批疫苗,对所制备得到的疫苗的相关性能进行了比较。
1、方法
1.1本发明的方法(新方法):制备方法同实施例4
1.2现有方法(旧方法)
1.2.1病毒增殖
将鸡新城疫病毒La sota株用无菌生理盐水按体积比1:1000倍稀释后,经尿囊腔接种11日龄SPF鸡胚,每胚0.1mL,置37℃继续孵育,弃去24h前死胚,96h后取出所有胚放入4℃冰箱过夜,收集鸡胚尿囊液,4℃保存备用。
1.2.2保护剂的配制
物质组成配比:聚乙烯吡咯烷酮(PVPK90)2%-5%、明胶1.5%-2%、山梨醇2%、蔗糖5%-6%、糊精5%-10%、谷氨酸钠1%-2%。百分比剩余份均为蒸馏水。将可高压灭菌的组份配成溶液116℃灭菌30分,将不耐高温的组份配成溶液后用0.22um滤膜过滤除菌,再将二种溶液按1:1混合,即得到配制的保护剂。
1.2.3将配制得到的保护剂与病毒液按照体积比为1:1混合后冻干,冻干全程为不超过48个小时,得到鸡新城疫冻干疫苗。
2、结果:
2.1冻干曲线时间
旧方法的冻干曲线:产品在-30℃入箱,预冻在-45℃下5h后加温,曲线全程共计不超过48h,在升华过程中真空度维持在10mHg以下,冷凝器保持在-70℃。
新方法的冻干曲线:产品在0-5℃入箱,预冻在-30~-50℃下60~70分后加温,15-18小时后板层温度升温至25~28℃,维持4~6小时出箱,全程24~28小时。
两种方法的冻干曲线时间如表1所示:
表1两种方法制备的疫苗冻干曲线比较(单位:小时)
疫苗批次 | 01 | 02 | 03 | 04 | 05 | 06 | 07 | 08 | 09 | 10 | 平均值 |
旧方法 | 40 | 40 | 40 | 40 | 40 | 40 | 40 | 40 | 40 | 40 | 40 |
新方法 | 24 | 24 | 24 | 24 | 24 | 24 | 24 | 24 | 24 | 24 | 24 |
2.2、保存期及鸡胚半数感染量测定
使用本发明方法(新方法)制备得到的冻干疫苗在2-8℃条件下,可保存36个月。37℃放置10天,测定鸡胚半数感染量,结果:鸡胚半数感染量(EID50)平均下降0.24个滴度。
使用现有方法(旧方法)制备得到的冻干疫苗在2-8℃条件下,可保存24个月,37℃放置10天,测定鸡胚半数感染量,结果:鸡胚半数感染量(EID50)平均下降0.86个滴度。结果如表2和表3所示。
表2两种方法制备的疫苗2-8℃保存期的比较(单位:10XEID50/0.1ml)
表3两种方法制备的疫苗37℃保存10天病毒含量下降的比较(单位:滴度)
2.3抗体持续期测定
使用新方法制备的疫苗每周采血按规程要求检测HI抗体效价几何平均值,抗体持续期10周后开始下降,使用旧方法制备的疫苗抗体持继期5周后开始下降。结果如表4所示。
表4疫苗抗体持续期比较(单位:log2)
Claims (6)
1.一种耐热冻干保护剂,其特征在于由A液和B液按照体积比为1:1混合而成,
其中,A液中含有0.01-0.03g/ml的海藻糖、0.01-0.04g/ml的硫代硫酸纳、0.01-0.02g/ml的酶水解酪素、0.01-0.02g/ml的硫脲、0.005-0.02g/ml的199培养基,以及0.001-0.01g/ml的O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖,用质量百分比浓度为2%-6%的聚乙烯吡咯烷酮(PVPK30)水溶液溶解并定容,用0.22um滤器除菌;
其中,按质量体积百分比计,B液中含有0.01-0.03g/ml的明胶、0.05-0.1g/ml的蛋白胨以及0.05-0.1g/ml蔗糖,用去离子水溶解并定容,高压灭菌后备用。
2.如权利要求1所述的耐热冻干保护剂,其特征在于由A液和B液按照体积比为1:1混合而成,
其中,A液中含有0.02g/ml的海藻糖、0.03g/ml的硫代硫酸纳、0.015g/ml的酶水解酪素、0.015g/ml的硫脲、0.01g/ml的199培养基以及0.005g/ml的O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖,用质量百分比浓度为4%的聚乙烯吡咯烷酮(PVPK30)水溶液溶解并定容,用0.22um滤器除菌;
其中,按质量体积百分比计,B液中含有0.02g/ml的明胶、0.08g/ml的蛋白胨以及0.08g/ml蔗糖,用去离子水溶解并定容,高压灭菌后备用。
3.如权利要求1或2所述的耐热冻干保护剂,其特征在于所述的199培养基为GIBCO粉末状199培养基,货号为31100-035。
4.权利要求1-3任一项所述的耐热冻干保护剂在疫苗制备中的应用。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述的疫苗为鸡新城疫弱毒活疫苗。
6.如权利要求4或5所述的应用,其特征在于将所述的耐热冻干保护剂与病毒液按照体积比为1:1混合后,按照疫苗制备的常规方法进行冻干。
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