CN103656660A - 一种动物活疫苗耐热冻干保护剂、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种动物活疫苗耐热冻干保护剂，各成分含量为：乳糖80-200g/L、水解乳白蛋白10-40g/L、聚乙烯吡咯烷酮5-20g/L、甘露醇0-20g/L、谷氨酸钠5-20g/L、精氨酸盐酸盐5-15g/L、水解蚕丝蛋白10-30g/L，加水溶解后高压灭菌制得。将冻干保护剂与病毒液混合，冷冻干燥后即得冻干疫苗。本发明的耐热冻干保护剂配方简单，制备容易，适于大规模生产，对疫苗具有良好的保护功效。制得的疫苗安全无菌、质量稳定，具有耐热、保存时间长的特点，解决了疫苗在运输过程中需要低温冷冻、贮存不便等问题。本发明的耐热冻干保护剂可以使猪繁殖与呼吸综合征疫苗和伪狂犬活疫苗在2～8℃条件下保存24个月。

Description

一种动物活疫苗耐热冻干保护剂、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及兽用生物制品领域，具体地说，涉及一种动物活疫苗耐热冻干保护剂、其制备方法及应用。

背景技术

随着生物工程技术和生物化学、分子生物学的发展，兽用生物制品的动物疫苗种类，类型上均有重要的进展，各种新疫苗不断研制成功。大体分为：灭活疫苗、弱毒疫苗、单价疫苗、多价疫苗、混合疫苗、同源疫苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗。

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratorysyndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）变异株引起的一种急性、高致病性传染病，以引起母猪繁殖障碍、仔猪和育成猪呼吸道症状及体温高、发病率高和死亡率高的“三高”为主要特征。严重危害世界养猪业，被世界卫生组织（OIE）列为B类传染病，尤其是2006年夏季在我国较大范围流行，使我国养殖猪业遭受到前所未有的惨重经济损失。

伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus，PRV）是一种α-疱疹病毒，可引起多种家畜野生动物的伪狂犬病。除猪以外的其他动物表现为致死性感染，猪是PRV的天然宿主和贮存宿主，呈流行性感染。成年猪常表现为隐性感染和呼吸道症状，母猪流产、产死胎和木乃伊胎，公猪表现为睾丸炎。仔猪表现为发热、昏迷和神经症状，死亡率很高，因此伪狂犬病是养猪业的一种重要繁殖障碍性传染病。

目前，采用特异性疫苗成为防控上述疾病的主要措施。其中弱毒冻干活疫苗占国内市场相当大的比例。冻干保护剂及其制备方法是冻干活疫苗生产工艺中的一项关键技术，对疫苗的保存、运输和使用均产生影响。目前国内常规的保护剂主要为脱脂牛奶、蔗糖、明胶等组分，组方简单，但热稳定性和保护功能差，疫苗在运输过程中需要-15℃冷藏保存。在我国一些经济不发达地区，运输条件很难要求，由此会造成疫苗失活、免疫失败以致疾病爆发。然而耐热冻干保护剂考虑了活疫苗在较高温度和较长保存时间的情况下，冻干物质可能产生的物理和化学变化对活疫苗存活的影响，因此可以使活疫苗在不需要冷链系统的情况下也能保证活性。目前国外的活疫苗冻干制品都已基本达到2～8℃15个月以上保存期，但保护剂配方是严格保密的，加上国内传统的生物制品保护剂的研制相对滞后，使得我国成品疫苗的长期保存和运输受到了极大限制。

影响冻干保护剂保护性能的因素主要来自两方面：一是微生物因素，微生物的种类和结构差异（如病毒有无囊膜）、培养方法的选择以及疫苗的种类等；二是保护剂的配方，选用保护剂的原料及其性质、原料配比及与该疫苗适应的冻干曲线等。病毒对热、酸敏感，在存放和运输过程中容易受到环境中温度和酸碱度的影响，因此需要选择一种合适的病毒保护剂，能够在不同保存条件下有效的防止病毒遭受破坏，保持病毒滴度，以延长病毒的存放期。目前使用的耐热保护剂组分过于复杂；生产成本较高；保护性能不理想。因此，研制一种配方简单、适于大规模生产、保护功能强的动物活疫苗耐热冻干保护剂显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种配制方法简单、成本低、具有良好保护性能的动物活疫苗耐热冻干保护剂。

本发明的另一个目的是提供所述动物活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法。

本发明的再一个目的是提供所述动物活疫苗耐热冻干保护剂的应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种动物活疫苗耐热冻干保护剂，各成分含量为：乳糖80-200g/L、水解乳白蛋白10-40g/L、聚乙烯吡咯烷酮5-20g/L、甘露醇0-20g/L、谷氨酸钠5-20g/L、精氨酸盐酸盐5-15g/L、水解蚕丝蛋白10-30g/L，以水配制。其中，所述的水为纯净水或蒸馏水。

本发明还提供所述动物活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：

1）将按比例称取各成分，溶于50-60℃水中；

2）110-121℃高压灭菌10-15分钟（优选110℃高压灭菌15分钟）；

3）2-8℃保存，即得。

本发明还提供所述动物活疫苗耐热冻干保护剂在制备动物疫苗中的应用。

前述的应用，其是将动物活疫苗耐热冻干保护剂与病毒液等体积混合，然后进行冷冻干燥处理，即得动物疫苗冻干产品。

优选地，所述病毒液为猪繁殖与呼吸综合征病毒或伪狂犬病毒的培养液。

本发明还提供一种动物疫苗冻干产品，向病毒液中加入所述动物活疫苗耐热冻干保护剂，并将得到的混合液进行冷冻干燥处理，即得动物疫苗冻干产品。

优选地，前述动物疫苗冻干产品中，病毒液与动物活疫苗耐热冻干保护剂按等体积混合。

本发明的耐热冻干保护剂配方简单，制备容易，适于大规模生产，对疫苗具有良好的保护功效。制得的疫苗无菌安全，且性状稳定，具有耐热、保存时间长的特点，解决了疫苗在运输过程中需要低温冷冻、贮存不便等问题。本发明的耐热冻干保护剂可以使动物耐热活疫苗在2～8℃条件下保存24个月，且疫苗效价达标。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

本发明中涉及到的百分号“%”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。

实施例1耐热猪繁殖与呼吸综合征病毒（CH1R株）活疫苗的制备

（1）冻干保护剂的配方及配制方法

冻干保护剂配方为：乳糖8%、水解乳白蛋白1%、聚乙烯吡咯烷酮2%、谷氨酸钠0.5%、精氨酸盐酸盐0.5%、水解蚕丝蛋白3%，双蒸水100mL；110℃灭菌15分钟，即为耐热冻干保护剂。

（2）将（1）中制备的耐热冻干保护剂与检验合格的PRRSV-CH1R病毒抗原按1:1体积比充分摇匀，定量分装后进行冷冻干燥。同时设蔗糖脱脂乳保护剂疫苗作为对照组。

（3）疫苗技术参数及保存期效价测定

产品的物理性状、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、安全检验、剩余水分测定和真空度测定按《中华人民共和国兽药典》的方法及标准进行；2-8℃保存24个月效价下降在1个滴度内。（表1和表2）

表1冻干产品物理性状及剩余水分等测定结果

表2疫苗2-8℃保存不同时间的TCID₅₀/mL

（4）疫苗安全性试验

按产品使用剂量的100倍稀释该疫苗，颈部肌肉注射25-30日龄健康断奶猪繁殖与呼吸综合征抗原抗体双阴仔猪，设立同等剂量生理盐水为对照，每组5头，每日测温并观察生长状况至21日，均未发现体温升高和临床症状。

实施例2耐热高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（JXA1-R株）活疫苗的制备

（1）冻干保护剂的配方及配制方法

冻干保护剂配方为：乳糖20%、水解乳白蛋白4%、聚乙烯吡咯烷酮0.5%、谷氨酸钠2%、精氨酸盐酸盐0.5%、水解蚕丝蛋白1%，双蒸水100ml；110℃灭菌15分钟，即为耐热冻干保护剂。

（2）将（1）中制备的耐热冻干保护剂与检验合格的PRRSV-JXA1-R病毒抗原按1:1体积比充分摇匀，定量分装后进行冷冻干燥。同时设蔗糖脱脂乳保护剂疫苗作为对照组。

（3）疫苗技术参数及保存期效价测定

产品的物理性状、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、安全检验、剩余水分测定和真空度测定按《中华人民共和国兽药典》的方法及标准进行；2-8℃保存24个月效价下降在1个滴度内。（表3和表4）

表3冻干产品物理性状及剩余水分等测定结果

表4疫苗2-8℃保存不同时间的TCID₅₀/mL

（4）疫苗安全性试验

按产品使用剂量的100倍稀释该疫苗，颈部肌肉注射25-30日龄健康断奶高致病性猪繁殖与呼吸综合征抗原抗体双阴仔猪，设立同等剂量生理盐水为对照，每组5头，每日测温并观察生长状况至21日，均未发现体温升高和临床症状。

实施例3耐热伪狂犬病毒（Bartha-K61株）活疫苗的制备

（1）冻干保护剂的配方及配制方法

冻干保护剂配方为：乳糖16%、水解乳白蛋白4%、聚乙烯吡咯烷酮0.5%、谷氨酸钠2%、精氨酸盐酸盐2%、水解蚕丝蛋白1%、甘露醇2%，双蒸水100ml；110℃灭菌15分钟，即为耐热冻干保护剂。

（2）将（1）中制备的耐热冻干保护剂与检验合格的PRV-Bartha-K61病毒抗原按1:1体积比充分摇匀，定量分装后进行冷冻干燥。同时设蔗糖脱脂乳保护剂疫苗作为对照组。

（3）疫苗技术参数及保存期效价测定

产品的物理性状、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、安全检验、剩余水分测定和真空度测定按《中华人民共和国兽药典》的方法及标准进行；2-8℃保存24个月效价下降在1个滴度内。（表5和表6）

表5冻干产品物理性状及剩余水分等测定结果

表6疫苗2-8℃保存不同时间的TCID₅₀/mL

（4）疫苗安全性试验

按产品使用剂量的10倍稀释该疫苗，肌肉注射6-18个月无伪狂犬病病毒中和抗体的绵羊，设立同等剂量的PBS（0.01mol/L pH7.2）为对照，每组4只，观察14天，均未临床症状。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种动物活疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于，各成分含量为：乳糖80-200g/L、水解乳白蛋白10-40g/L、聚乙烯吡咯烷酮5-20g/L、甘露醇0-20g/L、谷氨酸钠5-20g/L、精氨酸盐酸盐5-15g/L、水解蚕丝蛋白10-30g/L，以水配制。

2.根据权利要求1所述的动物活疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于，所述的水为纯净水或蒸馏水。

3.权利要求1或2所述动物活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将按比例称取各成分，溶于50-60℃水中；

2）110-121℃高压灭菌10-15分钟；

3）2-8℃保存，即得。

4.权利要求1或2所述动物活疫苗耐热冻干保护剂在制备动物疫苗中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将动物活疫苗耐热冻干保护剂与病毒液等体积混合，然后进行冷冻干燥处理，即得动物疫苗冻干产品。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述病毒液为猪繁殖与呼吸综合征病毒或伪狂犬病毒的培养液。

7.一种动物疫苗冻干产品，其特征在于，向病毒液中加入权利要求1或2所述的动物活疫苗耐热冻干保护剂，并将得到的混合液进行冷冻干燥处理，即得动物疫苗冻干产品。

8.根据权利要求7所述的动物疫苗冻干产品，其特征在于，病毒液与动物活疫苗耐热冻干保护剂按等体积混合。