BR102021015972B1

BR102021015972B1 - Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus sars-cov-2 inativado, antígeno, correspondente aos vírus sars-cov-2, inativado, composição antigênica, kits e seus usos

Info

Publication number: BR102021015972B1
Application number: BR102021015972-3A
Authority: BR
Inventors: Ricardo Das Neves Oliveira; Ana Marisa Chudzinski-Tavassi; Denise Vilarinho Tambourgi; Viviane Fongaro Botosso; Soraia Attie Calil Jorge; Renato Mancini Astray; Monica Beatriz Mathor
Original assignee: Instituto Butantan
Priority date: 2021-08-12
Filing date: 2021-08-12
Publication date: 2023-12-26
Also published as: BR102021015972A2

Abstract

processo de produção de um antígeno, correspondente aosvírus sars-cov-2 inativado, antígeno, correspondente aos vírus sars-cov-2, inativado, composição antigênica, kits e seus usos. a presente invenção se refere a técnicas e processos para a produção, purificação, inativação e análise de sarscov-2. a presente invenção se refere ao processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus sars-cov-2 inativado por irradiação gama. o processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus sars-cov-2 inativado por irradiação gama é para ser utilizado na produção de uma nova vacina, antígeno para a produção de plasma hiperimune em cavalos para soroterapia, e, em diferentes espécies animais para produção de anticorpos/insumos à pesquisa e estabelecimento de técnicas de sorodiagnóstico. a presente invenção se refere a composição antigênica em que compreende o antígeno, correspondente aos vírus sars-cov-2, inativado e um veículo, excipiente, diluente farmaceuticamente aceitável. refere-se também a um processo para produção de imunoglobulina anti-sars-cov-2 utilizando o vírus sars-cov2 inativado por irradiação gama.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO:

[001] A presente invenção se refere a técnicas e processos para a produção, purificação, inativação e análise de SARS-CoV-2. A presente invenção se refere ao processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV- 2 inativado por irradiação gama. O processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado por irradiação gama é para ser utilizado na produção de uma nova vacina, antígeno para a produção de plasma hiperimune em cavalos para soroterapia, e, em diferentes espécies animais para produção de anticorpos/insumos à pesquisa e estabelecimento de técnicas de sorodiagnóstico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] No final de 2019, a China relatou o primeiro caso de COVID-19 (Coronavirus Disease 2019), uma síndrome respiratória aguda grave causada por SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2). O novo vírus se espalhou rapidamente pelo mundo, atingindo 167 milhões de casos e 3,5 milhões de mortes em maio de 2021 (JHUM, 2020). Embora as vacinas tenham se tornado disponíveis em menos de um ano, as abordagens para o tratamento com COVID-19 permanecem escassas. Muitos estudos têm buscado diferentes intervenções terapêuticas, que vão desde o uso de medicamentos antivirais e antiparasitários até a imunoterapia com interleucinas (por exemplo, como interferon-alfa). Células NK ou células-tronco mesenquimais, bem como a transfusão de plasma de paciente convalescente (Li et al., 2020). Apesar dos inúmeros estudos, ainda não existe um medicamento específico para combater o COVID-19 e o tratamento permanece, em sua maioria, sintomático.

[003] Imunoglobulina de origem animal ou plasma de pacientes convalescentes pode constituir um tratamento específico para garantir a neutralização do vírus nas fases iniciais da infecção, principalmente, em pacientes com fatores de risco e alta probabilidade de evolução para doença grave. Esse tipo de abordagem, também conhecida como imunização passiva, teve origem no final do século 19, quando foram realizados os primeiros testes de imunização passiva para difteria e tétano (Kantha, 1991; Winau & Winau, 2020). Desde então, mais de 120 anos de experiência na produção desse tipo de imunobiológico se acumularam em várias partes do mundo. Independentemente da origem da imunoglobulina, o objetivo da seroterapia é neutralizar o patógeno por meio de anticorpos, embora a fagocitose e a citotoxicidade celular dependente de anticorpos também possam ocorrer (Van Erp et al., 2019; Gunn et al., 2018), evitando a infecção clínica ou reduzindo gravidade clínica em indivíduos com exposição recente a um patógeno. Assim, a terapia de anticorpos passivos é mais eficaz quando administrada profilaticamente ou usada logo após o início dos sintomas (Casadevall & Pirofski, 2003; Casadevall & Scharff, 1994), fornecendo a única estratégia de curto prazo para conceder imunidade imediata a indivíduos suscetíveis, que é primordial no caso do COVID-19.

[004] Apesar de sua longa história de uso no tratamento de doenças infecciosas (Luke et al., 2006; Soo et al., 2004; Hung et al., 2011; Zhou et al., 2007; Burnouf & Seghatchian, 2014). resultados de ensaios clínicos controlados randomizados envolvendo transfusão de plasma convalescente em COVID-19 são mistos (Focosi et al., 2020; Rajendran et al., 2020). Muitos fatores podem ter influenciado esses resultados, particularmente o tamanho da população inscrita, o título de anticorpos das unidades de plasma e o estágio da doença ou dias desde o início dos sintomas no momento da transfusão de plasma (The RECOVERY Collaborative Group, 2021; Joyner et al., 2021; Casadevall et al., 2020; Cohn et al., 2021). Nenhum ensaio clínico foi conduzido logo após a infecção por SARS-CoV-2 ou antes do início de uma doença significativa.

[005] Embora promissora, a transfusão de plasmas convalescentes tem limitações importantes. Em primeiro lugar, a obtenção do plasma depende da doação voluntária de pacientes convalescentes. Além disso, existe uma grande heterogeneidade na potência dos anticorpos gerados entre os indivíduos. A este respeito, a agência reguladora americana, o FDA, recomendou títulos de anticorpos neutralizantes no plasma de convalescentes superiores a> 1:320 para uso em COVID-19 (Centro de Avaliação e Pesquisa Biologica, 2020). Todos esses fatores juntos levam a um baixo rendimento na obtenção do produto final para o tratamento de pessoas infectadas.

[006] Essas desvantagens podem ser superadas com o uso de anticorpos heterólogos, obtidos do plasma de cavalos imunizados com SARS-CoV-2. Entre outros aspectos, o uso de imunoglobulinas equinas tem como vantagens a geração de anticorpos por longos períodos, uma vez que os cavalos recebem reforços de imunização periódicos, grande quantidade de plasma e maior controle nas preparações finais homogênicas. O produto final é composto por anticorpos altamente purificados, e não plasma bruto, proporcionando maior segurança e eficácia. Além disso, é possível realizar a digestão enzimática da molécula de imunoglobulina, removendo a fração Fc, sem perda da capacidade neutralizante, que é conferida pela porção Fab da imunoglobulina.

[007] Em todo o mundo, poucos ensaios clínicos usando imunoglobulinas anti-SARS-CoV-2 equinas purificadas para o tratamento de pacientes com COVID-19 estão em andamento. Um estudo clínico de fase 2 foi iniciado em outubro de 2020 na Costa Rica, avaliando duas formulações diferentes produzidas a partir da imunização de cavalos com proteínas virais (http://www.clinicaltrials.gov. Identifier NCT04610502) (León et al., 2020).

[008] Um ensaio clínico de fase 2/3 foi realizado na Argentina para avaliar a eficácia e segurança de uma fração Fab purificada de soro hiperimune equino gerado a partir de estimulação antigênica com a proteína RBD SARS- CoV-2. Os resultados preliminares mostraram que a terapia com anticorpos equinos foi bem tolerada, pois as reações adversas foram leves e moderadas, e os pacientes hospitalizados apresentaram melhora clínica da pneumonia por SARS-CoV-2, especialmente aqueles com doença grave (Lopardo et al., 2021). Em paralelo, duas formulações diferentes de IgG foram preparadas a partir do plasma de cavalos imunizados com S1 ou uma mistura de proteínas recombinantes SARS-CoV- 2, e ambas exibiram alta capacidade de neutralização in vitro (León et al., 2021). Um ensaio clínico está em andamento para comparar a segurança e eficácia da formulação de anticorpo anti-S1 equino para tratar casos de COVID-19 moderados e graves.

[009] Todos esses ensaios utilizaram a proteína spike ou porções dela como antígenos para imunizar os cavalos, pois esta é a proteína responsável pela ligação do vírus ao receptor humano ACE2 (Du et al., 2009). Nenhuma dessas formulações usou todo o vírus, o que poderia, em teoria, aumentar anticorpos adicionais que podem interromper outros processos virais e ajudar a combater a infecção

SARS-CoV-2

[0010] O SARS-CoV-2 pertence a uma grande família de vírus denominada coronavírus. É um vírus RNA de cadeia simples positiva (+ssRNA). Os coronavírus têm a capacidade de causar várias doenças em seres humanos, desde a simples constipação até doenças mais graves como a síndrome respiratória do Médio Oriente (MERS). O SARS-CoV-2 é o sétimo coronavírus conhecido a poder infetar seres humanos, sendo os restantes o 229E, NL63, OC43, HKU1, MERS-CoV e o SARS- CoV original.

[0011] Tal como a cepa que causou o surto de SARS em 2003, o SARS-CoV-2 é um membro do sub-gênero Sarbecovirus (betacoronavírus linhagem B). A sua sequência de RNA tem o comprimento de aproximadamente 30 000 nucleobases. No entanto, o SARS-CoV-2 é o único dos coronavírus a incorporar um local de clivagem polibásico, uma característica que se sabe aumentar a patogenicidade e ritmo reprodutivo de outros vírus.

[0012] A partir de um número suficiente de genomas sequenciados, é possível reconstruir a árvore filogenética do historial de mutações de uma família de vírus. Em 12 de janeiro de 2020 foram isolados em Wuhan cinco genomas de SARS-CoV-2. Em 30 de janeiro de 2020 eram conhecidos 42 genomas. Uma análise filogenética dessas amostras revelou estarem relacionados até sete mutações com um ancestral comum, o que significa que a primeira infeção em seres humanos ocorreu em novembro ou dezembro de 2019. Em 13 de março de 2020 estavam já amostrados e disponíveis publicamente 410 genomas de SARS-CoV-2.

[0013] Em 11 de fevereiro de 2020, o Comité Internacional de Taxonomia de Vírus anunciou que, de acordo com as regras vigentes que determinam as relações hierárquicas entre os coronavírus com base nas sequência conservadas dos ácidos nucleicos, as diferenças entre o SARS- CoV-2 e o SARS-CoV responsável pelo surto de SARS eram insuficientes para serem classificados como duas espécies virais diferentes. Desta forma, o SARS-CoV-2 foi classificado como cepa dos coronavírus associados à síndrome respiratória aguda (SARS-CoV).

[0014] Cada virion de SARS-CoV-2 mede aproximadamente 50-200 nanômetros de diâmetro. Tal como outros coronavírus, o SARS-CoV-2 tem quatro proteínas estruturais, conhecidas como proteínas S (spike), E (envelope), M (membrana) e N (nucleocapsídeo). A proteína N contém o genoma RNA e em conjunto as proteínas S, E e M criam o envelope viral. A proteína S é a proteína que permite ao vírus ligar-se à membrana celular de uma célula hospedeira.

Radiação gama

[0015] A energia radiante para esterilizações vem sendo aplicada com sucesso nestes últimos anos. Produtos alimentícios, cosméticos, materiais cirúrgicos descartáveis, vacinas, soros e produtos do sangue e outros, são descontaminados por radiações.

[0016] A energia eletromagnética derivada de cobalto é a que se utiliza com maior frequência na esterilização dos materiais mencionados. Este tipo de energia, como a radiação gama, não aquece o produto, podendo, assim, ser também aplicada a produtos biológicos que, na maioria das vezes, são susceptíveis a temperaturas relativamente elevadas.

[0017] A esterilização de soros terapêuticos e de algumas vacinas não adicionadas de adjuvantes particulados é feita geralmente pela filtração. Na dependência do tipo de produto e dos filtros esterilizantes usados, o processo é relativamente demorado e, invariavelmente, ocorrem perdas de volumes que são, às vezes, consideráveis. Devido a falhas humanas ou outras causas, após a filtração observam-se contaminações relativamente frequentes que, ou condenam o produto definitivamente ou, pelo menos, obrigam a uma nova filtração e, consequentemente, aumenta a perda em volume. Tratando-se de vacinas adicionadas de adjuvantes particulados, todo o trabalho é executado sob condições estéreis. Neste caso, quando ocorre contaminação, o produto não tem condições de ser recuperado.

[0018] A radiação gama, devido ao seu elevado poder de penetração, esteriliza os produtos após o envasamento e, inclusive, após ter sido acondicionado em embalagens habituais.

[0019] O estado da técnica não traz informações suficientes quanto a utilização deste tipo de energia na esterilização de produto de natureza biológica, tais como soros hiperimunes ou vacinas. Não há, praticamente, dúvidas quanto à ação dos raios gama esterilizantes, mas, sim, quanto a redução de atividade biológica, por destruição de princípios ativos destes produtos.

[0020] O pedido de patente BR 11 2013 001946 8, depositado em 04 de agosto de 2011, publicado em 24 de maio de 2016; titular: MERCK SHARP & DOHME CORP. (US)), intitulado: “VÍRUS VARICELA ZOSTER INATIVADO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA PREPARAR UM VÍRUS VARICELA ZOSTER INATIVADO, VACINA, E, MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE HERPES ZOSTER EM UM INDIVÍDUO” fornece um vírus varicela zoster (VZV) inativado e composições e vacinas compreendendo o dito VZV inativado, e, que a infectividade do VZV não é detectável, e, em que o VZV inativado induz uma resposta imune contra VZV quando administrado a um paciente. em modalidades das composições aqui descritas, o VZV é inativado com radiação gama. O pedido de patente BR 11 2013 001946 8 também fornece um método de preparar uma vacina de VZV inativado, o método compreendendo realizar radiação gama em uma amostra que compreende um VZV pelo uso de cerca de 5 kGy a cerca de 50 kGy de radiação gama. É também fornecido pelo pedido de patente BR 11 2013 001946 8 um método de tratamento ou imunização contra Hz ou outra doença associada à reativação de VZV, o método compreendendo administrar a um indivíduo uma vacina ou composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um VZV inativado e um carreador farmaceuticamente aceitável, em que o VZV é inativado por irradiação gama.

[0021] O pedido de patente BR 11 2013 001946 8 revela que o VZV (Vírus Varicela Zoster) é inativado com radiação gama. O método compreendendo realizar radiação gama em uma amostra que compreende um VZV pelo uso de cerca de 5 kGy a cerca de 50 kGy de radiação gama.

[0022] É importante destacar que no caso dos vírus, estes em geral são muito resistentes à radiação ionizantes e cada vírus tem que ser estudado de forma independente (inclusive cada cepa viral dentro do mesmo tipo de vírus), primeiro para determinar sua radiossensibilidade, conhecida como D10 (dose suficiente para reduzir em 1 Log a carga microbiológica), e a partir desta determinação, da carga viral total e levando em consideração qual o nível de segurança desejado (SAL) pode-se determinar qual a dose absorvida que se deseja para inativar todo o material com segurança.

[0023] No caso da maioria dos vírus, esta dose final acaba sendo muito alta e, portanto, inviabilizando sua inativação, sem alterar as características do material a ser esterilizado ou no caso de focar no próprio vírus, para utilizar em vacinas ou soroterapia, destruindo a estrutura terciária do mesmo, perdendo suas características imunogênicas.

[0024] O Pedido de Patente Norte-Americano US 2006121580, depositado em 20 de janeiro de 2006, publicado em 08 de junho de 2006, em nome de CRUCELL, intitulado “BINDING MOLECULES AGAINST SARS-CORONAVIRUS AND USES THEREOF” se refere a moléculas de ligação que se ligam especificamente a SARS-CoV, moléculas de ácido nucleico que codificam as moléculas de ligação, composições que compreendem as moléculas de ligação e métodos para identificar ou produzir as moléculas de ligação. As moléculas de ligação são capazes de se ligar especificamente ao SARS- CoV e podem ser usadas no diagnóstico, profilaxia e / ou tratamento de uma condição resultante de SAR.

[0025] O Pedido de Patente Norte-Americano US 2006121580 revela o uso de cerca de 45 kGy de radiação gama para inativar SARS-COV. O presente pedido revela um processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado por irradiação gama, preferencialmente, utilizando cerca de 15 kGy de radiação gama.

[0026] Os inventores do presente pedido destacam que, no caso da maioria dos vírus, esta dose final (45 kGy) acaba sendo muito alta e, portanto, inviabilizando sua inativação, sem alterar as características do material a ser esterilizado ou no caso de focar no próprio vírus, para utilizar em vacinas ou soroterapia, destruindo a estrutura terciária do mesmo, perdendo suas características imunogênicas.

[0027] O Pedido de Patente Internacional WO2009106629, depositado em 27 de fevereiro de 2009, publicado em 03 de setembro de 2009, em nome de UNIVERSITEIT GENT, intitulado “VIRAL INACTIVATION PROCESS” se refere a métodos para determinar o efeito de um procedimento de inativação viral na antigenicidade do vírus inativado. Em particular, para um vírus que é um membro da família Arteriviridae ou Coronaviridae ou Asfarviridae, em particular, para o vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRSV). O Pedido de Patente Internacional WO2009106629 fornece ainda métodos para determinar a antigenicidade de um vírus inativado, bem como métodos para rastrear compostos antivirais usando qualquer um dos métodos mencionados acima. Métodos de uso do vírus inativado e imunogênico assim obtido, em particular na fabricação de uma vacina também são fornecidos pelo Pedido de Patente Internacional WO2009106629.

[0028] O referido Pedido de Patente Internacional WO2009106629 revela que a inativação viral pode ser feita por temperatura, irradiação gama, luz UV e BEI para membros da família Arteriviridae ou Coronaviridae ou Asfarviridae. O dito documento é completamente silencioso quanto a quantidade de raios gama utilizado e nem específica SARS- COV-2.

[0029] A Patente Norte-Americana US 8,106,170, depositada em 10 de novembro de 2005, publicada em 18 de maio de 2006, e concedida em 31 de junho de 2012 em nome de CRUCELL HOLLAND B.V., intitulada “COMPOSITIONS AGAINST SARS- CORONAVIRUS AND USES THEREOF se refere a composições de moléculas de ligação que se ligam especificamente a um coronavírus, como o SARS-CoV, e são capazes de neutralizar uma infecção causada pelo vírus. As composições são adequadas para diagnosticar, prevenir e / ou tratar uma condição resultante de um coronavírus, como SARS-CoV.

[0030] A Patente Norte-Americana US 8,106,170 revela composições de moléculas de ligação que se ligam especificamente a um coronavírus, como o SARS-CoV, e são capazes de neutralizar uma infecção causada pelo vírus. A inativação pode ser feita por irradiação gama a 45 kGy. Mais uma vez destaca-se que, no caso da maioria dos vírus, esta dose final (45 kGy) acaba sendo muito alta e, portanto, inviabilizando sua inativação, sem alterar as características do material a ser esterilizado ou no caso de focar no próprio vírus, para utilizar em vacinas ou soroterapia, destruindo a estrutura terciária do mesmo, perdendo suas características imunogênicas.

[0031] A Patente Norte-Americana US 8,506,968, depositada em 28 de dezembro de 2009, publicada em 23 de junho de 2011, e concedida em 13 de agasto de 2013 em nome de LILLY CO ELI, intitulado “SARS VACCINE COMPOSITIONS AND METHODS OF MAKING AND USING THEM” descreve uma composição e método para reduzir a ocorrência e gravidade de doenças infecciosas, especialmente, doenças infecciosas como a SARS, em que organismos virais infecciosos contendo lipídios são encontrados em fluidos biológicos, como o sangue. A Patente Norte-Americana US 8,506,968 emprega solventes úteis para extrair lipídios do organismo viral infeccioso contendo lipídios, criando desse modo partículas virais modificadas imunogênicas parcialmente delipidadas com infecciosidade reduzida. A Patente Norte-Americana US 8,506,968 fornece composições de vacinas virais delipidadas, tais como composições de vacinas terapêuticas, compreendendo essas partículas virais modificadas parcialmente delipidadas com infecciosidade reduzida, opcionalmente combinadas com um veículo farmaceuticamente aceitável ou um imunoestimulante.

[0032] A Patente Norte-Americana US 8,506,968 revela composição e método para reduzir a ocorrência e gravidade de doenças infecciosas, especialmente, doenças infecciosas como a SARS. A inativação pode ser feita por irradiação gama a 50 kGy. Sabe-se que, no caso da maioria dos vírus, esta dose final (50 kGy) acaba sendo muito alta e, portanto, inviabilizando sua inativação, sem alterar as características do material a ser esterilizado ou no caso de focar no próprio vírus, para utilizar em vacinas ou soroterapia, destruindo a estrutura terciária do mesmo, perdendo suas características imunogênicas.

[0033] O artigo de Christin Scheller e colaboradores, intitulado: “PHYSICOCHEMICAL PROPERTIES OF SARS-COV-2 FOR DRUG TARGETING, VIRUS INACTIVATION AND ATTENUATION, VACCINE FORMULATION AND QUALITY CONTROL”. Electrophoresis; 41(13-14):1137-1151, publicado em 08 de junho de 2020 discute as propriedades materiais da síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) e suas proteínas. No dito artigo é discutido que a radiação gama pode inativar o material biológico pelo deslocamento de elétrons, a quebra de ligações covalentes ou danos indiretos por meio de radicais livres formados após a quebra de ligações covalentes. Neste estudo, uma solução SARS-CoV-1 (400 μL de 106, 33 TCID50 por mL) foi submetida à radiação gama (30, 50, 100 e 150 Gy) de uma fonte de 60Co. No entanto, nenhum efeito significativo na infectividade do vírus foi observado após 15 minutos de exposição.

[0034] Basicamente, a artigo de de Christin Scheller revela inativação de SARS-COV-1 pelo uso de 30, 50, 100 e 150 KGy. No entanto, o próprio artigo revela também que: “No entanto, uma vez que diferenças aparentemente pequenas podem ter efeitos fortes, por exemplo, em configurações de epítopos imunologicamente relevantes, a transferência de conhecimento não avaliada de SARS-CoV-1 para SARS-CoV-2 não pode ser aconselhada”.

[0035] O artigo de Feldmann F. e colaboradores, intitulado: “GAMMA IRRADIATION AS AN EFFECTIVE METHOD FOR INACTIVATION OF EMERGING VIRAL PATHOGENS”. Am J Trop Med Hyg, publicado em maio de 2019; 100(5):1275-1277O comenta que a irradiação gama usando uma fonte de cobalto-60 é um método comumente usado para a inativação de amostras infecciosas a serem manuseadas com segurança em procedimentos laboratoriais subsequentes. No referido artigo foi determinado as doses de irradiação para inativar com segurança espécimes proteicos líquidos contendo diferentes patógenos virais emergentes / reemergentes conhecidos por causar doenças tropicais negligenciadas e outras doenças de importância regional ou global para a saúde pública. Ao usar um arenavírus representativo, bunyavírus, coronavírus, filovírus, flavivírus, ortomixovírus e paramixovírus, descobriu-se que esses vírus envelopados diferiam em sua suscetibilidade ao tratamento por irradiação com doses adsorvidas para inativação de uma dose alvo de 1 x 106 50% de cultura de tecidos infecciosos dose (TCID50) / mL variando de 1 a 5 MRads.

[0036] O artigo de Feldmann F. revela inativação por irradiação gama de várias espécies de vírus, entre elas SARS- COV (cepa Tor 2). Utiliza entre 10 a 50 kGy para inativação por irradiação gama. Conforme comentado acima, no caso dos vírus, estes em geral são muito resistentes à radiação ionizantes e cada vírus tem que ser estudado de forma independente (inclusive cada cepa viral dentro do mesmo tipo de vírus). Já com o SARS-CoV-2, os inventores do presente pedido puderam determinar uma alta radiossensibilidade, possibilitando sua inativação, mesmo em altas concentrações sem alterar sua estrutura terciária, mantendo sua imunogenicidade, assim como mantendo a atividade biológica de plasmas infectados e sobrenadantes celulares.

[0037] O artigo de Leung Anders e colaboradores, intitulado: “IN VITRO INACTIVATION OF SARS-COV-2 USING GAMMA RADIATION” - Appl. Biosafety ; publicado em 30 de julho de 2020, revela que o coronavírus 2 (SARS-CoV-2) é classificado como um patógeno do Grupo de Risco 3; o trabalho de propagação com este vírus vivo deve ser conduzido em laboratórios de nível de biossegurança 3 (BSL-3). No entanto, o vírus inativado pode ser manipulado com segurança em laboratórios BSL-2. A irradiação gama é um dos métodos usados para inativar uma variedade de patógenos, incluindo vírus. O artigo revela inativação de SARS-COV-2 por radiação gama usando 10 kGy de radiação gama.

[0038] No artigo de Leung Anders é descrito um processo de irradiação gama para a inativação de vírus SARS- CoV-2 com o objetivo de encontrar a dose necessária para a esterilização do vírus, sem comprometer sua detecção por reação em cadeia da polimerase (PCR). O artigo faz uso da mesma técnica utilizada para a inativação do SARS-CoV-2 para fins de produção do antígeno utilizado na imunização dos cavalos, para a obtenção do soro. No entanto, a análise realizada para verificar o procedimento de inativação do material visou dois objetivos diferentes, utilizaram métodos diferentes e levaram a conclusões diferentes. A conclusão do artigo sobre a integridade do material genético do SARS-CoV- 2 não habilita o vírus inativado a ser utilizado como antígeno, uma vez que não há qualquer análise bioquímica da integridade ou da imunogenicidade e antigenicidade das proteínas virais, o que é essencial para um antígeno ser utilizado para a produção de soro hiperimune.

[0039] No presente pedido de patente são apresentados dados de análises realizadas para a verificação da qualidade das proteínas virais após a inativação, incluindo a prova de que o material, posteriormente utilizado para a imunização de animais, foi capaz de gerar anticorpos neutralizantes. Apenas a inativação viral por irradiação não garante a priori que o material seja suficientemente imunogênico, o que é facilmente verificado pela exposição de uma mesma amostra a diferentes quantidades de radiação, resultando em diferentes níveis de reconhecimento do antígeno, fruto da destruição parcial e dose-dependente das proteínas virais pela exposição à radiação. Por fim, o material utilizado no processo de irradiação descrito no artigo não estava purificado ou formulado, sendo apenas uma coleta de sobrenadante de cultura celular infectada. No caso do descrito no presente pedido de patente, o material foi irradiado purificado e formulado em tampão de preservação. Como em qualquer outro método de inativação, influenciam na performance da irradiação as concentrações do microrganismo ativo, assim como as concentrações de outros subprodutos da produção do material em células (lisados celulares compostos de proteínas e DNA/RNA celular). Assim sendo, não se pode assumir que o material irradiado sem o tampão de preservação ou em sua forma não purificada conseguirá manter as mesmas características proteicas do material irradiado na forma pura e em tampão de preservação.

[0040] Como pode ser observado nenhum documento do estado da técnica descreve ou sugere processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado por inativação por raio gama tal como revelado pelo presente pedido.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0041] Para solucionar os problemas acima mencionados, a presente invenção propiciará vantagens significativas em relação aos processos de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, utilizando inativação por raio gama, possibilitando um aumento do seu desempenho e apresentando uma relação custo/benefício mais favorável.

[0042] Com base em todas as informações mencionadas acima e considerando a urgência de um tratamento específico para COVID-19, o objetivo do presente pedido foi desenvolver uma imunoglobulina F (ab')2 equina anti-SARS-CoV-2 para o tratamento de COVID- 19, ressaltando que é um produto final conhecido, testado e aprovado, com ampla aplicação no tratamento de outras patologias. Assim, no presente pedido, os inventores descrevem o desenvolvimento de imunoglobulinas equinas anti-SARS-CoV-2 F (ab')2 usando um antígeno viral SARS-CoV-2 recentemente desenvolvido que foi purificado e inativado por radiação. Ensaios celulares e pré-clínicos mostraram que o soro pode neutralizar o vírus com sucesso, é seguro em modelos animais e é capaz de reduzir a gravidade da doença em um modelo de hamster com infecção e doença por SARS-CoV-2.

[0043] A presente invenção se refere a um processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS- COV-2 inativado compreendendo as etapas de cultivar e multiplicar o vírus SARS-CoV-2 em células de mamíferos; coleta; purificação do vírus; estabilização viral, e inativação viral, em que a inativação viral é por irradiação gama.

[0044] Em uma segunda concretização, a presente invenção se refere a testes para detecção do vírus ativo e verificação da inativação em amostras de vacina, kits, sobrenadantes de cultura, lisados celulares ou células íntegras.

[0045] Em uma terceira concretização, a presente invenção se refere ao uso do antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado obtido pelo processo da presente invenção para a preparação de uma nova vacina.

[0046] Em uma quarta concretização, a presente invenção se refere ao uso do antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado obtido pelo processo da presente invenção para a produção de plasma hiperimune em cavalos para soroterapia.

[0047] Em uma quinta concretização, a presente invenção se refere ao uso do antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado obtido pelo processo da presente invenção em diferentes espécies animais para produção de anticorpos/insumos à pesquisa e kits de sorodiagnóstico.

[0048] Em uma sexta concretização, a presente invenção se refere ao uso do antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado obtido pelo processo da presente invenção para a preparação de uma composição destinada à imunização para a proteção do indivíduo ou animal imunizado.

[0049] Em uma sétima concretização, a presente invenção se refere a uma composição antigênica compreendendo o vírus SARS-COV-2 inativado obtido pelo processo da presente invenção.

[0050] Em uma oitava concretização, a presente invenção se refere a uma composição vacinal compreendendo o soro hipermune para soroterapia.

[0051] Em uma nona concretização, a presente invenção se refere a um kit de diagnóstico com a composição antigênica compreendendo o vírus SARS-COV-2 inativado obtido pelo processo da presente invenção e um diluente.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0052] A estrutura e operação da presente invenção, juntamente com vantagens adicionais da mesma podem ser mais bem entendidas mediante referência aos desenhos em anexo e a seguinte descrição:

[0053] A Figura 1 mostra a Produção de vírus com diferentes MOI (0,1, 0,05 e 0,01) e diferentes tempos após infecção;

[0054] A Figura 2 mostra a ultracentrifugação em gradiente de sacarose realizada em rotor zonal. Fração 12* corresponde às frações 12 a 24 (sacarose 55 a 35%) contendo o pico de vírus.

[0055] A figura 3 mostra um fluxograma detelhado das etapas do processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado;

[0056] A figura 4 mostra a determinação do D10 (dose necessária para inativar 1 log da população microbiológica), em que a concentração viral: lote 1 quarta passagem ~ 107, Doses de irradiação (sete amostras) prevendo um D10 entre 2 e 2,5 kGy: não irradiado; 1 kGy; 2,5 kGy; 5 kGy; 7,5 kGy; 10 kGy e 15 kGy; Irradiação feita na GammaCell com início no dia 30 de abril e término dia 1° de maio de 2020.

[0057] A figura 5 mostra um fragmento de DNA contendo a sequência da proteína E (alvo prot Charité) e região do fragmento correspondente ao RNA subgenômico que foi sintetizado;

[0058] A figura 6 mostra a inativação do soro 450. Soro 761 e soro humano 861;

[0059] A Figura 7 mostra o resultado do tempo de protrombina, onde o plasma pobre em plaquetas (100 μL) foi exposto a diferentes doses de radiação ionizante (5 a 25 kGy). Após incubação, 100 μL de tromboplastina foram adicionados e o tempo de coagulação medido. As colunas representam a média das triplicatas ± DP. (- %) = percentual de atividade das enzimas da coagulação;

[0060] A Figura 8 mostra o tempo de tromboplastina parcialmente ativada, onde o plasma pobre em plaquetas (100 μL) foi exposto a diferentes doses de radiação ionizante (5 a 25 kGy). Após incubação do PPP com cefalina e ácido elágico, 100 μL de CaCl2 foram adicionados. As colunas representam a média das triplicatas ± DP. (- %) = percentual de atividade das enzimas da coagulação;

[0061] A Figura 9 mostra a quantificação de citocinas inflamatórias utilizando kits de Multiplex (Merck) no equipamento Luminex em sobrenadantes de células THP-1 após irradiação com doses de 10kGy, 15kGy e 25kGy. Foram dosadas as citocinas IL-6, Il-8, IL-1β, IL-4, IL-10 e TNFα.

[0062] A figura 10 mostra a análise do vírus SARS- CoV-2 purificado e inativado. [A] SDS-PAGE: gel SDS-PAGE de gradiente de 4-15%, sob condições não redutoras e corado com prata. (1) LMW -10 a 250 kDa; (2) SARS-CoV-2 purificado e inativado. [B] Western blot: amostras do vírus, separadas em SDS-PAGE de gradiente de 4-15%, foram transferidas para membranas de nitrocelulose e incubadas com anticorpos monoclonais (MoAb) anti-SARS-CoV-2 S proteína (pista 4) ou proteína anti-SARS-CoV-2 N (pista 5), LMW -10 a 250 kDa (pistas 3 e 6). As membranas foram incubadas com IgGs anti-coelho conjugados específicos (1: 5000) e as reações foram reveladas pelo substrato quimioluminescente Super signal West pico. [C] Identificação de proteínas por meio de análise de espectrometria de massa em tandem (LC-MS / MS) de antígeno purificado de SARS-CoV-2 inativado. Apenas proteínas com pelo menos 1 peptídeo único, com uma pontuação -log10P> 20 e com taxa de descoberta falsa <1% foram aceitas para identificação e estão representadas na tabela. A proporção de proteínas das proteínas foi estimada com base na contagem de espectros de massa de cada proteína identificada.

[0063] A Figura 11 mostra a imunogenicidade do vírus SARS-CoV-2 purificado e inativado em modelo murino. [A] As placas de ELISA foram revestidas com 100 μL de SARS-CoV-2 purificado e inativado (4,2 x 104 vírus / mL) e incubadas com diluições crescentes de soros não imunes ou experimentais obtidos de camundongos BALB / c e incubados com anti - rato IgG conjugado com HRPO. A reação foi realizada com a adição de substrato TMB, e as leituras espectrofotométricas foram feitas a À 450 nm. O título foi estabelecido como a diluição de soro mais alta em que a absorbância medida era duas vezes mais alta que a determinada para soro normal de camundongo (grupo de controle). [B] Soros de camundongos imunizados com antígeno SARS CoV-2 purificado e inativado também foram testados no CPE-VNT. O título de neutralização foi definido pelo inverso da maior diluição de soro que bloqueia a replicação viral. As análises estatísticas foram realizadas usando t-student seguido pelo teste de Mann Whitney (* p< 0,05).

[0064] A Figura 12 mostra títulos do plasma hiperimune de cavalo anti-SARS-CoV-2. [A] As placas de ELISA foram revestidas com 100 μL de SARS-CoV-2 purificado e inativado (4,2 x 104 vírus / mL) e incubadas com diluições crescentes dos soros pré-imunes ou experimentais, obtidos de cavalos hiperimunizados com o SARS inativado -CoV-2. Em seguida, as placas foram incubadas com IgG conjugado com HRPO anti-cavalo. A reação foi realizada com a adição de substrato TMB, e as leituras espectrofotométricas foram feitas a À 450 nm. O título foi estabelecido como a maior diluição de soro em que a absorbância medida foi duas vezes mais alta que a determinada para o soro pré-imune (grupo controle). [B] Soros de cavalos imunizados com antígeno SARS CoV-2 purificado e inativado também foram testados no CPE- VNT. O título de neutralização foi definido pelo inverso da maior diluição de soro que bloqueia a replicação viral. As análises estatísticas foram realizadas usando t-student seguido pelo teste de Mann Whitney (* p≤ 0,05).

[0065] A Figura 13 mostra o perfil de proteína de soro hiperimune de cavalo anti-SARS-CoV-2 e identificação de imunoglobulina anti-pico específica por meio de análise LC- MS / MS. [A] Perfil de proteína SDS-PAGE: 1, 2 e 3 correspondem às amostras dos lotes 0001, 0002 e 0003, respectivamente, os tempos de incubação, a 37 ° C, são mostrados acima do gel e os marcadores de massa molecular são indicados no lado esquerdo. [B] Exemplo de identificação de proteína de espectrometria de massa de imunoglobulinas anti-Spike específicas. A mesma sequência foi identificada em todos os lotes analisados;

[0066] A Figura 14 mostra a toxicidade e segurança: análise hematológica. A Figura 14A mostra em camundongos com 14 dias e a Figura 14B mostra em camundongos com 90 dias;

[0067] A Figura 15 mostra a toxicidade e segurança: análise bioquímica. A Figura 15A mostra em camundongos com 14 dias e a Figura 14B mostra em camundongos com 90 dias;

[0068] A Figura 16 mostra o perfil de toxidade e segurança. A - Análise hematológica em coelhos com 14 dias e B - Análise bioquímica em coelhos com 14 dias;

[0069] A Figura 17 mostra a análise histopatológica realizada 14 dias após a administração de soro anti-SARS- CoV-2 em teste de toxicidade e segurança em murinos. As concentrações de soro anti-SARS-CoV-2 de 33,635 U / RBD / g, 3,365 U / RBR / ge 0,3365U / RBD / g foram administradas por via intravenosa. Não foram observadas alterações nas estruturas do pulmão, fígado e parênquima renal. Nenhum processo inflamatório, degenerativo ou fibrose foi encontrado. Ampliação 40X;

[0070] A Figura 18 mostre o Teste de desafio em hamsters sírios dourados. [A] Desenho do estudo - esquema de infecção de animais com sars-cov-2 seguido de tratamento com soro equino anti-SARS-CoV-2. [B] Cópias de RNA de SARS-CoV- 2 conforme medido por meio de RT-qPCR por número de cópias de RNA de β-actina por grama de tecido. Verde: animais G1 (n = 6 por grupo), i.e., animais infectados com SARS-CoV-2 tratados com soro; Vermelho: animais G2 (n = 6 por grupo), ou seja, animais infectados com SARS-CoV-2 não tratados. p.i. = pós-infecção; n.s.: não significativo (valor p> 0,05); ** valor de p = 0,0043 (dia 3 p.i.)

[0071] A Figura 19 mostra o Teste de desafio em hamsters sírios dourados. [A] Alterações de peso observadas em animais infectados ou não com SARS-CoV-2, submetidos ou não ao tratamento sorológico. [B] Carga viral expressa em 50% de dose infecciosa de cultura de tecidos / grama de tecido. Verde: animais G1 (n = 6 por grupo), i.e., animais infectados com SARS-CoV-2 tratados com soro; Vermelho: animais G2 (n = 6 por grupo), ou seja, animais infectados com SARS-CoV-2 não tratados. p.i. = pós-infecção; n.s.: não significativo (valor de p> 0,05);

[0072] A Figura 20 mostra o padrão pneumônico de animais infectados e tratados com soro equino anti-SARS-CoV- 2. Painéis mostram a evolução do processo infeccioso no curso da infecção experimental do hamster SARS-CoV-2 e tratamento com o soro equino. Animais infectados e não tratados apresentam evolução mais acentuada do padrão de pneumonia intersticial difusa, principalmente no 5° dia após a infecção, em relação aos animais infectados e tratados com SARS-CoV-2. As amostras de controle mostram o padrão histológico normal do tecido. Bar: 500 μm; Coloração com hematoxilina e eosina (H&E).

[0073] A Figura 21 mostra as alterações histopatológicas em hamsters infectados e tratados com soro equino anti-SarCoV-2. Análise histopatológica da vascular (a.1-5: b.1-5: c.1-5), brônquica (a.2-6: b.2-6: c.2-6), alveolar / intersticial (a.3-7: b.3-7: c.3-7) e epitélio pleural (a.4-8: b.4-8: c.4-8) em 3, 5 e 7 dias [D1] após a infecção experimental, mostrando broncopneumonia, com diferenças na integridade do epitélio brônquico (setas) entre os tratamentos. (*) indica a luz das estruturas; () a degeneração ou não do epitélio com células descamadas; () mostra região perivascular inchada / infiltrados de leucócitos, (He) mostra glóbulos vermelhos no lúmen / interstício; (Ed) formação de edema / substância hialina e (#) depósito de substâncias amorfas (c). Vasos sanguíneos (b.1) e bronquíolos (b.2), normais representativos do grupo de controle não infectado. Pontuação de bronquite (d), edema (e) e pneumonia. Leucócitos infiltram cinética (g) neutrófilos e (h) mononucleares. Dados expressos em média + desvio padrão, de amostras de 6 (seis) animais por grupo, para os escores e 5 (cinco) campos / imagens por lâmina. Os dados foram analisados estatisticamente com o One-Way ANOVA, seguido do pós-teste de Tukey. **** p <0,0001. Barra: 50 μm; Coloração com hematoxilina e eosina (H&E).

[0074] A Figura 22 mostra a detecção de anticorpos no modelo COVID de hamster sírio dourado. (a) Imunofluorescência positiva para F (ab ') 2 no pulmão no grupo não infectado. ((b) As placas de ELISA foram revestidas com 100 μL de IgG de coelho anti-cavalo e, em seguida, incubadas com uma curva padrão previamente preparada consistindo em concentrações conhecidas de anti-SARS-CoV-2 cavalo F (ab ') 2, paralelo ao soro de hamster O cavalo F (ab ') 2 na curva padrão ou nas amostras foi então detectado pela adição de IgG anti-cavalo conjugado com peroxidase, seguido de substrato TMB. As absorvâncias foram tomadas a 450 nm. A curva padrão foi linearizada por transformação log-log e depois submetida à regressão linear.A concentração de F (ab')2 de cavalo em amostras de soro de hamster foi estimada por interpolação das amostras para a curva padrão;

[0075] A Figura 23 mostra o efeito protetor do anti- SARS-CoV-2 no pulmão do hamster sírio dourado modelo COVID. (a-b-c-d) Imunocoloração positiva para proteína Spike e F(ab')2 em tecido pulmonar de animais infectados e tratados com soro. (g-h) Análise 3D mostrando em detalhes a cinética e a interação de SARS-CoV-2 com F(ab')2. (e-f) Distribuição de SARS-CoV-2 em tecido pulmonar infectado experimentalmente e (i-j) cinética de infecção 3D. (*) Luz dos bronquíolos ou alvéolos; (estrela amarela) interstício; (estrela azul) endotélio vascular; (setas pontilhadas) indicam a área em maior ampliação à direita; (ponta de seta) regiões de adesão viral e anticorpos; (seta): efeito protetor do F (ab')2 em uma célula epitelial brônquica ou apenas infectada. Barra: 20 μm, e

[0076] A figura 24 mostra o procedimento de plasmaferese realizado três vezes (dias 28, 35 e 49 após a primeira).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO:

[0077] A produção de vírus SARS-CoV-2 pode ser realizada em células de mamíferos. Em um contexto, as células preferencialmente usadas são as VERO CCL-86 ou VERO E6 (Cercopithecus aethiops) qualificadas para a produção de imunobiológicos.

[0078] As células de mamíferos são cultivadas em meios de cultura específicos, preferencialmente, adaptadas ao crescimento em meio livre de soro fetal bovino. Em um contexto preferencial esses meios de cultura são os meios VP SFM (Thermo Scientific) e OptiPro (Thermo Scientific).

[0079] As células são cultivadas em aderência a superfícies ou cultivadas em suspensão.

[0080] As superfícies usadas podem ser bidimensionais ou tridimensionais, compostas de plástico ou resinas, sendo frascos, microcarregadores porosos ou não porosos, compostos de fibras sintéticas ou naturais, ou derivados da indústria petroquímica. Os frascos de cultivo podem ser do tipo T, garrafas tipo “roller”, biorreatores de leito fixo ou fluidizado, equipamentos de uso único ou não, verticais ou horizontais, sistemas de cultivo de células em altas densidades, frascos multicamadas, placas de petri, discos de plástico dentre outros métodos e materiais conhecidos pelo estado da técnica. Em um contexto preferencial, essas superfícies são compostas de plástico especialmente tratado para a aderência celular, em frascos T 225 cm2.

[0081] O vírus SARS-CoV-2 utilizado nos experimentos pode tratar-se de um isolado humano ou animal, produto de isolamento primário ou de procedimento de separação de clone ou subclone, ou ainda de ser reconstruído parcial ou totalmente por técnicas de engenharia genética, produzindo variantes mais produtivas ou vírus atenuados. Em um contexto preferencial, o isolado viral trata-se de SARS-CoV- 2/SP02/human/2020/BRA (GeneBank MT126808.1), gentilmente cedida pelo Prof. Edison Luis Durigon, do Instituo de Ciências Biomédicas da USP, com a qual foram preparados os bancos semente e de trabalho.

[0082] Para a produção viral, uma quantidade de vírus em uma multiplicidade de infecção MOI definida é inoculada nas células em cultura. É possível utilizar diversos MOI diferentes, como 0,00001; 0,0001; 0,001; 0,01; 0,1; 1; 10; 100 e seus intermediários. Em um contexto preferencial, o MOI utilizado é de 0,1. Esse vírus é adicionado às células com ou sem troca do meio de cultura presente. Em um contexto preferencial o meio de cultura é drenado e o vírus é inoculado em um volume de 3 mL por frasco. Após a inoculação do vírus o conjunto de células é incubado por um período de 1 a 120 h. Em um contexto preferencial, as células são incubadas com o vírus por 1 h, após o que o volume de meio de cultura é completado para o volume final requerido no frasco de cultivo, preferencialmente esse volume é de 100 mL. Os frascos são então incubados por 2 a 120 h para a produção do vírus à temperatura entre 24 °C e 37 °C. Preferencialmente a produção de vírus é realizada em 48 h com incubação a 37 °C, conforme visto na Figura 1.

[0083] Após o tempo de incubação necessário o vírus é separado das células na etapa de coleta em que o conteúdo de múltiplos frascos é reunido em um frasco quando necessário, utilizando técnicas do estado da técnica, como inversão, aspiração ou bombeamento. A etapa de coleta não é necessária em produção de vírus que ocorra em frasco único.

[0084] Após a etapa de coleta, o material é preferencialmente encaminhado para a purificação. Em um contexto preferencial, a primeira etapa de purificação é a remoção de restos celulares e outras partículas microscópicas por meio de clarificação. O processo de clarificação poderá ser realizado por centrifugação convencional ou de fluxo contínuo; ultracentrifugação; remoção auxiliada por cargas iônicas ou magnetismo; sedimentação ou precipitação; filtração. No contexto preferencial a remoção das partículas é realizada por meio de filtração.

[0085] Na etapa de filtração para clarificação ou para esterilização ou redução de microrganimos do material, podem ser utilizados diferentes tipos de filtros ou técnicas de filtração. Podem ser utilizadas membranas compostas de poliéster, PVDF, celulose ou celulose regenerada, dentre outras em diferentes porosidades, incluindo a possibilidade de utilização de dispositivos com diversas porosidades de membrana combinadas. Essas membranas podem estar posicionadas em suportes para membranas, cartuchos, cápsulas, ou outros itens em que seja possível separar o lado em que o material a ser removido será retido do material filtrado. Em um contexto preferencial a filtração é realizada por meio da utilização de uma cápsula com membrana de polietersulfona e porosidade de 0,22 μm.

[0086] O material viral poderá ser purificado ativo ou inativo para a remoção de restos de meio de cultura, proteínas celulares e material genético não viral. Essa purificação poderá ser realizada por diversas técnicas tais como ultracentrifugação, cromatografia, filtração, filtração tangencial, ultrafiltração, precipitação e outras técnicas típicas da purificação de produtos biotecnológicos.

[0087] Em um contexto preferencial a amostra viral é concentrada a 1/2 até 1/10 do volume original antes da purificação. Em um contexto preferencial essa concentração é realizada por técnica de filtração tangencial em membrana de 300 kDa a 1/8 do volume original. A concentração pode ser realizada igualmente por membranas compostas de poliéster, PVDF, celulose ou celulose regenerada, dentre outras em diferentes porosidades, incluindo a possibilidade de utilização de dispositivos com diversas porosidades de membrana combinadas.

[0088] Após a concentração ou em processo combinado com ela, ou ainda a partir do volume de material coletado ou clarificado sem concentrar, o material poderá ser submetido a um processo de troca de solvente. O novo solvente será composto de solução aquosa com tamponamento de pH. A solução tampão poderá ser composta de diversos componentes, sendo os mais comuns sais de sódio e potássio, fosfatos, citratos ou carbonatos, tampões do tipo TRIS, HEPES ou outros tampões regularmente utilizados em purificação de vírus e proteínas virais. Em um contexto preferencial será realizada diafiltração em membrana de 300 kDa constituída de PES em três diavolumes para a troca do solvente da suspensão viral. A composição da membrana poderá ser variada, como explicado anteriormente. A quantidade de diavolumes utilizada também poderá ser variada, não consistindo em variação à técnica aqui descrita.

[0089] Outra etapa de purificação consiste na redução de contaminantes do material através de processos de cromatografia de diversos tipos, como mas não se limitando a troca iônica, exclusão molecular, afinidade, imunoafinidade, isoelétrica, fase reversa, etc.

[0090] Em outro contexto a purificação é realizada por ultracentrifugação em colchão de sacarose e em gradiente de sacarose. Em outro escopo o processo de ultracentrifugação pode ser realizado na presença de outros agentes formadores de fases ou gradientes, como cloreto de césio e iodixanol. Em um contexto preferencial a ultracentrifugação é realizada primeiramente com o material concentrado sendo posicionado em um gradiente de sacarose e em rotor zonal e o processo é realizado por ultracentrifugação (Zonal 1), seguido pela (Zonal 2). O SARS-Cov-2 poderá ser recuperado de diversas fases do gradiente entre as diferentes concentrações do reagente de separação. Preferencialmente o vírus será retirado das frações 55-28% (zonal 1) e 55-35% (zonal 2).

[0091] O produto obtido a partir da purificação possui estabilidade comprovada de até 07 dias em câmara-fria (6 °C ± 2 °C). O produto poderá ser dialisado em solução tampão ou diafiltrado em condições já descritas para a troca do tampão e retirada do reagente de formação de gradiente, ou ainda dos sais e compostos utilizados para sua eluição de colunas cromatográficas. O produto poderá ser congelado entre - 20 °C e - 196 °C para preservação do ingrediente farmacêutico ativo. Preferencialmente o produto será congelado a - 80 °C. A esterilização final do produto poderá ser realizada utilizando as mesmas condições e membranas citadas no item de “clarificação”. Preferencialmente a filtração será realizada utilizando-se membrana 0,22 μm de polietersulfona.

[0092] O produto final será obtido a partir da combinação ou não do vírus purificado e inativado com adjuvantes. Os adjuvantes poderão ser compostos de sais de alumínio, esqualeno e derivados de proteínas bacterianas, em soluções aquosas ou emulsões, combinados ou não. Em um contexto preferencial o adjuvante utilizado é o hidróxido de alumínio.

[0093] O processo de inativação viral, executado logo após a etapa de coleta, clarificação ou no produto purificado poderá ser realizado pela adição de reagentes químicos ou utilização de radiação gama. Os reagentes químicos utilizados podem ser, mas não se limitam a Betapropiolactona, formaldeído, ácido ascórbico, ácido lático, etc... Poderão ser utilizados diversas concentrações e tempos de incubação para a inativação.

[0094] Preferencialmente a inativação química será realizada com betapropiolactona em concentração ativa de 0,05 % e incubação a 4 °C durante 24 horas, seguida de incubação a 37 °C por duas horas.

[0095] A inativação por radiação gama será realizada preferencialmente pela aplicação de 15 kGy (kilo Grays) por XXX minutos, tanto para amostras de vírus purificado como para amostras de vírus contidas em placas de cultura, tubos de ensaio, microtubos, frascos de vidro, polipropileno ou outros plásticos. As amostras de vírus poderão estar dentro ou fora das células, em soluções tampão ou não, tendo ou não tendo sido previamente tratadas para inativação por outra metodologia.

[0096] A figura 3 mostra um fluxograma detalhado com todas as etapas processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado.

Verificação da inativação

[0097] A verificação da inativação é realizada pela incubação de amostra do vírus inativado em cultura de células. Em uma abordagem a incubação poderá ser realizada de dois a quatorze dias em uma passagem ou pelo mesmo período em mais passagens até a verificação da ausência ou presença de efeito citopático ou da presença de multiplicação viral. Preferencialmente a incubação será realizada por três passagens com incubações de três ou quatro dias cada e as células serão lisadas para a análise do conteúdo de RNA viral. O RNA viral poderá ser verificado através de técnicas diversas, preferencialmente será quantificado por RT-PCR em tempo real. Preferencialmente o RNA quantificado é o RNA subgenômico viral, presente apenas em situações, em que o vírus se encontra ativo. A quantificação do RNA subgenômico em amostras de RNA extraído das células é realizada pela inoculação de quantidades específicas de RNA total extraído para a realização da transcrição reversa. Preferencialmente são utilizados 40 ng de RNA total extraído. Após a transcrição reversa são utilizados oligonucleotídeos iniciadores (primers) para a realização da amplificação na presença de sondas ou de reagente intercalante de bases. Preferencialmente os primers são sequências baseadas em trabalho científico publicado (Wolfel et al. 2020). A verificação da inativação é feita pela manutenção da quantidade de RNA subgenômico detectado (residual), sendo que se observada a amplificação de maiores quantidades de material a cada passagem da amostra viral nas células, o material deve ser considerado ativo.

[0098] A verificação do título viral ativo poderá ser realizada por titulação em placa ou utilizando amplificação em termociclador em tempo real ou equivalente. Para a titulação em placa serão realizadas diluições seriadas da amostra viral que será utilizada para a inoculação de células em placas de cultura. Preferencialmente essas células serão células VERO descritas anteriormente. As placas de cultura serão incubadas por 24 a 72 h para a observação do efeito citopático das amostras de vírus. Preferencialmente as placas contendo vírus diluídos seriadamente na base 10 e células serão incubadas por 72 h. Será removido o meio de cultura das placas e o tapete celular remanescente será observado diretamente ou fixado e corado. O tapete poderá ser fixado com reagentes diversos como formaldeído, metanol, acetona ou ácido acético e corado com corantes diversos, sendo preferencialmente fixado com ácido acético e corado com azul de Naftol. A titulação de vírus infeccioso será feita pela determinação da dose infectante em cultura de tecidos 50% (TCID50), baseado no método de Reed & Muench, 1938.

[0099] A titulação por PCR em tempo real poderá ser realizada através da detecção de qualquer segmento gênico do SARS-CoV-2. Preferencialmente será feito seguindo o protocolo da Universidade de Charité (https://www.who.int/docs/default- source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf?sfvrsn=a9ef618c2), adaptado à quantificação absoluta baseada em curva de quantificação. A curva de quantificação viral poderá ser obtida através da utilização de diluições de vírus, de lisado de células infectadas, fragmentos de DNA, diluições de vetores plasmidiais ou diluições de RNA viral sintético ou extraído ou de seus fragmentos. Preferencialmente a curva de quantificação será realizada pela diluição de fragmentos de DNA dupla fita. Uma curva de correlação entre o título de vírus infectante e a quantidade de cópias do material genético amplificado deverá ser realizada a cada diluição da curva de modo a se definir um fator de conversão entre o número inicial de cópias amplificadas e portanto, o ciclo de amplificação gerado pelo equipamento, e o título de vírus infeccioso.

[00100] A extração do material genético viral poderá ser realizada a partir de suspensão viral ou amostra de células. Preferencialmente o RNA viral será extraído de suspensões virais. Para a extração do RNA poderão ser utilizados reagentes de extração e kits de extração baseados em colunas.

[00101] O RNA extraído será submetido ao processo de transcrição reversa utilizando primers randômicos. Oligo-dTs ou específicos de forma a gerar o cDNA apto à amplificação. A transcrição reversa poderá ser realizada como parte do mesmo ciclo de amplificação (one-step) ou em um processo anterior à realização da reação em cadeia da polimerase (PCR). A PCR poderá ser realizada utilizando-se sondas fluorescentes específicas ao fragmento amplificado ou através da utilização de reagente fluorescente intercalante de bases. Preferencialmente será utilizado reagente do tipo intercalante de bases para permitir a análise de curvas de dissociação após a PCR.

[00102] Após verificação do reconhecimento dos antígenos produzidos por anticorpos específicos anti-S (gentilmente cedidos por Dr. Edison Durigon) e por soro de pacientes positivos para Covid 19 (identificados por soroneutralização), os antígenos estão sendo utilizados para imunização de camundongos para verificação da imunogenicidade. A seguir, serão utilizados para imunização de cavalos e obtenção dos soros heterólogos para tratamento.

[00103] A Verificação da inativação foi feita por 2 métodos:

Método 1: Passagem seriada em cultura de células Vero

[00104] 100 μL da amostra são incubados com células Vero (placa de 12 wells) por 72 h e posteriormente 100 μL dessa cultura são passados para uma nova placa para o mesmo período de incubação (repete-se mais uma vez, totalizando três passagens).

[00105] Ausência de efeito citopático e de TCID50 no material final indicam inativação.

[00106] Foi determinado que uma TCID50 é capaz de gerar pelo menos 100 TCID50 a cada incubação. Dessa forma 1 TCID50 / 100 μL está dentro de um limite de detecção estimado para o teste, uma vez que o ensaio de titulação é capaz de detectar até 102 TCID50 / mL.

Método 2: Amplificação do RNA subgenômico

[00107] Coronavírus possui um RNA subgenômico “exclusivo” da etapa intracelular de seu ciclo.

[00108] Foi sintetizado um fragmento de DNA contendo a sequência da proteína E (alvo prot Charité) e região do fragmento correspondente ao RNA subgenômico (Figura 5).

[00109] A amplificação do RNA subgenômico em um estudo cinético de infecção pode identificar se há vírus ativo, conforme mostrado na tabela 1. Tabela 1 - amplificação do RNA subgenômico em um estudo cinético de infecção

[00110] A figura 6 mostra a inativação do soro 450. Soro 761 e soro humano 861.

[00111] A Irradiação (5-25kGreis) de plasma humano não altera testes globais de coagulação.

Coleta de sangue

[00112] O sangue humano foi obtido via punção venosa de forma consensual, de indivíduos aparentemente saudáveis e que não faziam uso de medicações, como contraceptivos e anti-inflamatórios por pelo menos 10 dias antes da coleta (Plataforma Brasil - n° - 32443020.4.0000.5501) e coletado em tubos contendo citrato de sódio 3,8% na proporção citrato: sangue (1: 9 v/v).

Preparo do Plasma Pobre em Plaquetas (PPP)

[00113] Para a obtenção do plasma pobre em plaquetas (PPP), o sangue humano foi centrifugado a 2.500 g por 20 minutos em centrífuga da marca Eppendorf (modelo 5810R a 25°C. O PPP obtido foi fracionado em alíquotas de 1 mL que foram armazenadas a - 20°C até o momento de uso.

Irradiação com fonte de Co-60 do Plasma Pobre em Plaquetas

[00114] O Plasma Pobre em Plaquetas foi submetido ou não (controle) a irradiação com fonte de Co-60 nas doses de 5 a 25 kGy (kilograys) no irradiador multipropósito do Centro de Tecnologia das Radiações (CETER) do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN) - CNEN/São Paulo.

Testes Globais de Coagulação

[00115] Após a irradiação ou não (controle), o PPP foi submetido a testes globais da coagulação, Tempo de Protrombina (TP) e Tempo de Tromboplastina Parcialmente ativada (TTPa), para avaliar o percentual de manutenção da atividade das enzimas da coagulação sanguínea. Os ensaios forram realizados como descrito a seguir: a) Determinação do tempo de protrombina (TP): Para a determinação do tempo de protrombina foi utilizado o reagente (Hyphen®) reconstituído no momento do uso, de acordo com as instruções do fabricante. Em coagulômetro semi-automático (Diagnostica Stago - França), o plasma pobre em plaquetas (100 μL) exposto a diferentes doses de radiação ionizante (5 a 25 kGy) foi incubado durante 2 minutos a 37°C. Após a incubação, 100 μL de tromboplastina foram adicionados e o cronometro acionado. Esses experimentos foram realizados no Laboratório de Desenvolvimento e Inovação e as determinações foram realizadas em triplicata. b) determinação do Tempo de Tromboplastina Parcialmente ativada (TTPa): A determinação do tempo de tromboplastina parcialmente ativada foi realizada em coagulômetro semi-automático (Diagnostica Stago - França). O plasma pobre em plaquetas (100 μL) exposto a diferentes doses de radiação ionizante (5 a 25 kGy) foi incubado a 37°C, durante 3 minutos com 100 μL de reagente (cefalina e ácido elágico - Hyphen®). Após a incubação, 100 μL de CaCl2 foram adicionados e o cronometro acionado. Esses experimentos foram realizados no Laboratório de Desenvolvimento e Inovação e as determinações foram realizadas em triplicata.

Resultados

[00116] A Figura 7 mostra o resultado do tempo de protombina, onde o plasma pobre em plaquetas (100 μL) foi exposto a diferentes doses de radiação ionizante (5 a 25 kGy). Após incubação, 100 μL de tromboplastina foram adicionados e o tempo de coagulação medido. As colunas representam a média das triplicatas ± DP. (- %) = percentual de atividade das enzimas da coagulação.

[00117] A Figura 8 mostra o tempo de tromboplastina parcialmente ativada, onde o plasma pobre em plaquetas (100 μL) foi exposto a diferentes doses de radiação ionizante (5 a 25 kGy). Após incubação do PPP com cefalina e ácido elágico, 100 μL de CaCl2 foram adicionados. As colunas representam a média das triplicatas ± DP. (- %) = percentual de atividade das enzimas da coagulação.

[00118] A inativação por IRRADIAÇÃO GAMA (10-25 kGreis), de meios de cultura expostos ao vírus não altera perfil proteico dos meios, podendo serem utilizados em testes laboratoriais a serem desenvolvidos em laboratórios de análise clínicas, de pesquisa ou de produção de produtos biotecnológicos.

[00119] Inativação viral por radiação de sobrenadantes de cultura de células para utilização em laboratórios de análises clínicas, pesquisa ou laboratórios de produção de produtos biotecnológicos garante o uso seguro de amostras em Laboratórios que não possuem qualificação de níveis de segurança biológica (por exemplo NB2, NB3), para trabalhar com agentes infecciosos como vírus, tal qual o SARCS COV-2. A técnica utilizada para inativação mostrou não afetar a quantificação de proteínas presentes nos sobrenadantes de cultivo celular tornando sua medida possível.

EXEMPLOS Exemplo 1: Sobrenadantes de macrófagos derivados da linhagem monocítica THP-1 foram irradiados com 10, 15 e 25 KGreis e citocinas inflamatórias foram quantificadas. Metodologia

[00120] Obtenção dos macrófagos: Os monócitos THP-1 foram diferenciados em macrófagos utilizando protocolo descrito e caracterizado por Lund e colaboradores (2016). Brevemente as células (2x106) foram incubadas por 48h em 3 mL de meio RPMI contendo 25nM de PMA. Após este período, os macrófagos foram mantidos em descanso por 24h em meio livre de PMA.

[00121] Tratamento: Os macrófagos, após o protocolo de diferenciação, foram tratados durante 24 horas com: LPS (1 μg/mL) para indução da expressão e liberação das citocinas inflamatórias.

[00122] Análises: Os sobrenadantes dos macrófagos tratados com LPS foram coletados, submetidos à irradiação e as concentrações de IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNFα e IL-1β liberadas foram avaliadas, tanto em amostras irradiadas quanto em não irradiadas, usando kits de Multiplex (Merck) no equipamento Luminex, seguindo o protocolo do fabricante.

Resultados

[00123] Sobrenadantes coletados de macrófagos derivados da linhagem monocítica THP-1, estimulados com LPS, não irradiados e irradiados com as doses de 10kGy, 15kGy e 25kGy tiveram as citocinas inflamatórias IL-6, IL-8, IL-1β, IL-4, IL-10 e TNFα quantificadas (Figura 9). Os dados mostraram que nenhuma das doses de irradiação testadas afetou a quantificação das citocinas inflamatórias quando comparada à quantificação de sobrenadantes não irradiados.

[00124] A Figura 9 mostra a quantificação de citocinas inflamatórias utilizando kits de Multiplex (Merck) no equipamento Luminex em sobrenadantes de células THP-1 após irradiação com doses de 10kGy, 15kGy e 25kGy. Foram dosadas as citocinas IL-6, Il-8, IL-1β, IL-4, IL-10 e TNFα. OUTRA CONCRETIZAÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO.

Produção de SARS-CoV-2 purificado e inativado Banco SARS-CoV-2

[00125] O SARS-CoV-2/SP02/2020HIAE (GeneBank MT126808.1. B.1.1.28) é um isolado clínico de um paciente internado no Hospital Israelista Albert Einstein (São Paulo, Brasil). O material clínico foi testado para SARS CoV-2, de acordo com Corman et al., (2020), e para 15 agentes virais por PCR em tempo real (Influenza A e B, Coronavírus endêmico - CoV-NL63, -229E, -HKU1 e - OC43, Enterovírus, Parainfluenzavírus 1, 2, 3 e 4; Metapneumovírus Humano, Rinovírus, Vírus Sincicial Respiratório e Adenovírus) (Araujo et al., 2020), que foram todos negativos. O vírus foi isolado em células VERO E6 e a caracterização da cepa é descrita por Araujo et al., (2020). O estoque de sementes de vírus de trabalho (WVSS) foi preparado infectando VERO CCL- 81.4 ECAAC General Collection 88020401, adaptado para meio sem soro VP (ThermoFisher, MA, EUA) no Instituto Butantan com um MOI (multiplicidade de infecção) de 0,1 durante 48 h, 37 ° C e 5% de CO2. O vírus produzido foi esterilizado por filtração (0,22 μm), formulado com SPG (7,462 g / L de sacarose, 0,0517 g / L de KH2PO4, 0,1643 g / L de K2HPO4.3 H2O e 0,0907 g / L de glutamato de potássio) e congelado a - 80° C. O título WVSS final foi de 9,79E + 06 TCID50 / mL. Todas as manipulações do vírus ativo foram realizadas em um laboratório BSL3.

Titulação de vírus - Determinação da dose infecciosa de cultura de tecidos de 50% (TCID50)

[00126] As amostras de vírus foram retiradas das etapas de cultura ou purificação e imediatamente congeladas a -80° C antes da análise. Após o descongelamento, as amostras foram diluídas em série dez vezes (10-1 - 10-12) em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 2,5% de soro fetal bovino (FBS) e inoculadas em seis repetições em placas de 96 poços semeadas com VERO ATCC Células CCL-81.4 (2 x 104 células / poço). Após incubação a 37° C com 5% de CO2 por 72 h, as placas foram inspecionadas microscopicamente para efeitos citopáticos (CPE) causados por SARS-CoV-2. Para confirmação dos resultados, as monocamadas foram fixadas e coradas com solução de Naftol Blue Black (Sigma-Aldrich) (0,1% de azul de naftol p / p com 5,4% de ácido acético e 0,7% de acetato de sódio) e analisadas. O título viral foi calculado usando o algoritmo de Spearman & Karber conforme descrito por Hierholzer & Killington (1996) e foi expresso em TCID50 / mL.

Produção e inativação de antígenos

[00127] Para a produção de antígeno, células Vero (ATCC CCL-81.4) foram semeadas em frascos T 225 cm2 (107 células / frasco) e cultivadas por 48 h antes da infecção. O SARS-CoV-2 / SP02 / 2020HIAE foi inoculado a um MOI de 0,1 em 5 mL de meio de cultura e deixado adsorver por uma hora a 37 ° C. Meio isento de soro foi adicionado às culturas até atingir o volume de 100 mL. As culturas foram incubadas a 37° C, CO2 a 5%, durante 48 h. Antes da colheita, os frascos foram inspecionados microscopicamente quanto aos efeitos citopáticos e ausência de contaminação e, em seguida, o meio de cultura foi drenado para um novo frasco. Três bateladas de SARS-CoV-2 ativo foram clarificadas por meio de filtração de 0,22 μm (Opticap XL2 Durapore, MerckMillipore) e agrupados (6 L) para o seguinte processo de purificação. O material clarificado foi concentrado por filtração de fluxo tangencial (TFF) usando um sistema Minipellicon com uma membrana Ultracell 300 kDa (MerckMillipore). O concentrado (2 L) foi submetido a duas rodadas de ultracentrifugação (XPN 90, BeckmanCoulter) em gradientes de sacarose (65% - 34%) utilizando um rotor zonal Ti15 por 3 h a 4° C e 25 krpm. As frações contendo o vírus purificado foram reunidas após cada procedimento de ultracentrifugação. O material purificado final foi diluído com 1X PBS para uma concentração de sacarose de 20%, esterilizado por filtração (0,22 μm) e congelado a -80° C.

[00128] Alíquotas congeladas de SARS-CoV-2 purificado foram submetidas à inativação do vírus por irradiação gama no Instituto de Pesquisas Nucleares (IPEN, São Paulo, Brasil). Nesse sentido, as suspensões virais foram submetidas ao processo de inativação por radiação gama (Gammacell 220 Irradiation unit, Nordion, Canadá). A dose de radiação para inativar 1 log do título do vírus foi inicialmente determinada (D10). Primeiro, sete amostras de vírus foram irradiadas com diferentes doses de radiação gama (0,1, 2,5, 5,5, 10, 15 kGy). Em seguida, outro experimento foi realizado para confirmar D10 com sete doses de radiação (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 kGy). O título do vírus foi quantificado pela determinação de TCID50 / mL.

Teste de inativação de vírus

[00129] A eficácia do processo de inativação do SARS- CoV-2 foi avaliada pela detecção do efeito citopático e análise cinética do RNA viral subgenômico por RT-qPCR no VERO CCL 81.4. após a inoculação do antígeno SARS-CoV-2. Resumidamente, alíquotas de 0,1 mL do vírus inativado foram incubadas com 1E + 05 VERO CCL - 81,4 células por 1 h a 37 ° C, seguido pela adição de 1,4 mL de meio de cultura DMEM + SFB 10%. As placas foram incubadas por 72 horas e, na ausência de efeito citopático, uma alíquota de 0,1 mL do sobrenadante foi transferida para uma nova cultura de células VERO CCL 81,4 para a segunda passagem. O procedimento foi repetido pelo menos mais uma vez. Para a análise cinética do RNA viral subgenômico, 1 mL do vírus inativado foi inoculado em alíquotas de 0,1 mL em dez poços de uma placa de 12 poços contendo células VERO por 72 h. O sobrenadante de todos os poços foi reunido e alíquotas de 0,1 mL foram colocadas em um novo poço de uma placa de 12 poços para a segunda passagem em células VERO.

[00130] Para a análise de quantidades crescentes de RNA subgenômico durante a incubação, indicativo de replicação do vírus, as amostras foram coletadas após 1 h, 24 h e 48 h de incubação por lise de células em monocamada, com tampão de lise do PureLink ™ RNA Mini Kit (ThermoFisher), seguindo as instruções do fabricante. O RNA foi extraído e 100 ng do RNA total foram submetidos à transcrição reversa seguida por qPCR usando os kits High-Capacity cDNA Reverse Transcription e Fast SYBR ™ Green Master Mix, respectivamente (ThermoFisher). A PCR quantitativa foi realizada utilizando diluições em série de uma sequência sintética correspondente ao fragmento de amplificação como curva padrão (GeneBlocks, IDT). Os primers foram sintetizados com base na metodologia publicada (Wolfel et al., 2020).

Caracterização do antígeno: pureza, identidade e qualidade

[00131] A pureza das amostras de vírus inativadas foi avaliada por SDS-PAGE usando 4-15% CriterionTM TGXTM Precast Midi Protein gel, em condições não redutoras (Bio-Rad). A eletroforese foi realizada por 1 h a 100 V e o gel foi corado usando Pierce ™ Silver Stain Kit (Thermo Fisher Scientific). Além disso, a quantidade de proteína celular VERO residual foi quantificada por Ensaio Imunoenzimétrico de Proteínas de Células Hospedeiras de Células VERO (Tecnologia Cygnus), conforme recomendado pelo fabricante. A pureza e identidade do antígeno também foram realizadas por meio de análise de espectrometria de massa.

[00132] O conteúdo de endotoxina na amostra de vírus purificada e inativada foi quantificado usando o ensaio PYROGENTTM Plus Gel Clot LAL (Lonza, EUA), de acordo com as recomendações dos fabricantes.

[00133] A qualidade do antígeno foi analisada com base na preservação do antígeno após o processo de inativação por Western blotting. Para esta análise, 400 μL do antígeno purificado e inativado foram submetidos a SDS-PAGE conforme descrito acima, e as proteínas transferidas para membrana de nitrocelulose por 1 h em corrente de 90 V - 150 mA. A membrana foi bloqueada com a solução de bloqueio por 3 h à temperatura ambiente, sob agitação. Em seguida, a membrana foi lavada com tampão de fosfato mais Tween 20 a 0,05% (3 x 5 min), seguido de incubação com anticorpo monoclonal de coelho [CR3022] para SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein (Abcam - Ab273074) e anticorpo policlonal de coelho para SARS Proteína -CoV-2 N, gentilmente cedida pela Dra. Roxane Piazza (Instituto Butantan, Brasil), diluída em diluente de amostra, por 1 h. O anticorpo IgG anti-coelho de cabra marcado com peroxidase (KPL) foi usado para marcação e a membrana foi revelada com substrato quimioluminescente Super sinal West pico (ThermoFisher). As imagens foram adquiridas com um equipamento Uvitec Alliance 2.7.

Análise de imunogenicidade do vírus inativado

[00134] Camundongos fêmeas BALB / c (18 - 22 g) foram obtidos do Center for Animal Breeding do Butantan Institute. O uso de camundongos no presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional do Instituto Butantan (protocolo de aprovação n° 9165080620). Os animais (n = 5) foram imunizados por via subcutânea com SARS-CoV-2 purificado e inativado (correspondendo a 1,74 x 104 TCID50 / animal) misturado com Al (OH) 3 (0,25 mg / animal) para atingir um volume final de 200 μL. Esses animais receberam três doses de reforço (1,74 x 104 TCID50 / animal) em intervalos de 7 dias. Animais controle (n = 5) foram inoculados com solução salina estéril com Al (OH) 3 (0,25 mg / animal). Sangramentos foram realizados 21 e 35 dias após o priming para coleta de soro e as amostras foram armazenadas a -80°C até o uso. As amostras de soro foram posteriormente analisadas por Elisa (conforme descrito na seção 2.2.8.1) ou no teste de neutralização do vírus baseado no efeito citopático (CPE-VNT). Para CPE-VNT, os soros foram previamente inativados a 56 ° C por 45 min.

Produção de imunoglobulina equina anti-SARS-CoV-2 Animais

[00135] Os procedimentos envolvendo os cavalos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Uso e Cuidado de Animais do Instituto Butantan (protocolo de aprovação n° 6016030720). Dez equinos saudáveis, não previamente imunizados, foram selecionados e treinados para serem manejáveis para o trabalho. A condição clínica e o comportamento foram avaliados e aqueles que eram adequados, tiveram amostras de sangue coletadas para exames laboratoriais, incluindo hemograma completo (glóbulos vermelhos, leucócitos, plaquetas, hemoglobina, hematócrito), painel metabólico básico (cálcio, glicose, sódio, potássio, nitrogênio ureico no sangue, creatinina), painel metabólico completo (proteína total, albumina, gamaglobulina, fosfatase alcalina, alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase, bilirrubina), painel lipídico (lipoproteína de alta densidade, lipoproteína de baixa densidade), creatina fosfoquinase, testes de coagulação (teste do tempo de protrombina e teste do tempo de tromboplastina ativada). Amostras de sangue foram coletadas da veia jugular e analisadas em laboratório de análises clínicas veterinárias.

Imunização

[00136] Cavalos (n = 10) foram injetados quatro vezes com suspensão viral inativada de SARS-CoV-2 (correspondendo a 4,5 x 105 TCID50 / animal / dose). Subcutaneamente, com um intervalo de uma semana, o adjuvante óleo em água MontanideTM ISA 50V (Seppic; Shangai, China) foi incluído na primeira e na terceira dose para aumentar a resposta do anticorpo. Amostras de soro foram coletadas antes e durante a imunização e armazenadas a - 20oC até o uso. Parâmetros hematológicos e bioquímicos e títulos de anticorpos contra as proteínas SARS-CoV-2 (por ELISA) foram monitorados antes e após o cronograma de imunização.

Coleta de plasma

[00137] O plasma foi coletado por plasmaferese automatizada, utilizando o sistema Cobe Spectra® (Terumo BCT) para procedimentos terapêuticos de aférese. Resumidamente, um cateter de duplo lúmen foi inserido na veia jugular. Uma maneira era tirar sangue total do cavalo, que era adicionado ao anticoagulante ACD. Os componentes do sangue foram separados com base na gravidade específica das células por tecnologia centrífuga de fluxo contínuo. O plasma foi coletado em um saco temporário e transferido para um personalizado. A outra forma do cateter permitiu o retorno de componentes não coletados ao animal com solução de lactato de Ringer. O procedimento de plasmaferese foi realizado três vezes (dias 28, 35 e 49 após a primeira) de acordo com a Figura 24.

[00138] Cada procedimento de plasmaferese gerou uma batelada de plasma hiperimune, portanto, três bateladas foram obtidas sequencialmente. As amostras de plasma foram analisadas para testes de biocarga e títulos de anticorpos.

Purificação de imunoglobulinas

[00139] O pool de plasma inicial foi submetido ao fracionamento por precipitação com sulfato de amônio. O precipitado foi centrifugado e a fração líquida foi descarregada. O produto foi então solubilizado e o pH foi ajustado para a digestão enzimática pela pepsina para hidrolisar as proteínas não IgG e clivar a molécula em fragmentos F(ab')2, removendo o fragmento Fc. Uma segunda precipitação foi realizada adicionando sulfato de amônio e o pH foi ajustado com adição de ácido caprílico e agitação. Em seguida, a termocoagulação a 56o C separou as proteínas termolábeis inespecíficas e o precipitado foi eliminado. O sobrenadante foi submetido à diafiltração, cromatografia de troca iônica e concentrado por ultrafiltração tangencial. Fenol foi adicionado como conservante e a concentração de cloreto foi ajustada. A solução F(ab')2 foi então submetida a filtração de 0,22 μm e mantida em sacos plásticos descartáveis. Todas as etapas de produção foram realizadas em condições de GMP.

Perfil de proteína do produto final (Bateladas 00001, 00002, 00003)

[00140] O perfil de proteína das bateladas de produto final foi analisado usando SDS-PAGE (12,5%) em condições de redução. Para avaliar a existência de quaisquer produtos proteolíticos, as amostras de cada batelada foram incubadas a 37° C por 30 min, 1 h, 2 h ou 3 h e submetidas a SDS-PAGE. Os géis foram corados usando corante Coomassie Blue (40% de metanol, 10% de ácido acético e 0,25% de azul de Coomassie) e destinados usando metanol 40% com 10% de ácido acético.

Identificação de proteínas por meio de análise LC-MS / MS (cromatografia líquida e espectrometria de massa em tandem)

[00141] Amostras do vírus inativado purificado (batelada 8911/20) e do produto de soro final anti-SARS-CoV- 2 (Bateladas 00001, 00002, 00003) foram submetidas ao protocolo FASP (Wisniewski et al., 2009) usando unidades de filtro de 10 kDa (Merck-Millipore). Os peptídeos trípticos foram dessalinizados usando pontas de estágio caseiras, os peptídeos eluídos foram secos a vácuo usando um concentrador centrífugo (Eppendorf). As amostras foram dissolvidas em 20 μl de tampão aquoso contendo 0,1% de ácido fórmico e dois microlitros de cada amostra foram injetados em uma coluna de armadilha Acclaim PepMap100 C18 (Thermo Scientific) 3 μm de tamanho de partícula, 100 Â de tamanho de poro, 75 μm de diâmetro interno, coluna de 20 mm comprimento e analisado por um espectrômetro de massa Orbitrap Q-Exactive plus (Thermo Scientific) acoplado a um Easy nanoLC 1200 (Thermo Scientific), com uma taxa de fluxo de 200 nl / min, o tampão A continha 0,1% (v / v) de ácido fórmico e tampão B 0,1% (v / v) de ácido fórmico em 80% de acetonitrila. Os peptídeos foram aplicados com um gradiente crescente de acetonitrila ao longo do tempo (0-90% (v / v) acetonitrila em 30 min) para separar os peptídeos na coluna analítica Coluna Acclaim PepMap (Thermo Scientific) 2 μm de tamanho de partícula, 100 Â tamanho dos poros, comprimento 150 mm, diâmetro interno 50 μm. O MS foi operado em modo dependente de dados com um dos 7 métodos principais na razão massa-carga de 300-2000. A tensão de pulverização foi definida em 2,4 kV e o espectrômetro de massa foi operado no modo dependente de dados positivo, no qual uma varredura completa de MS foi adquirida na faixa de m / z de 300-1500 seguida pela aquisição de MS / MS usando dissociação colisional de alta energia (HCD) dos sete íons mais intensos da varredura MS usando janela de isolamento de 2,0 m / z.

Análise de dados LC-MS / MS

[00142] Os espectros de MS e MS / MS obtidos foram analisados usando PEAKS STUDIO versão X e as pesquisas foram realizadas contra banco de dados específico construído. Para a análise dos dados do antígeno, o banco de referência usados incluiu todas as sequências SARS-CoV-2 e sequências revisadas de Chlorocebus aethiops disponibilizadas do Uniprot (total de 162 sequências). Para a análise dos dados das três bateladas de anti-SARS-CoV-2, o banco de referência foi construído usando todas as sequências anti-SARS-CoV-2, disponibilizadas do GeneBank e sequências revisadas de Equus caballus do Uniprot (total de 2.190 sequências). Ambos os bancos de dados de referência foram concatenados com contaminantes comuns para experimentos de espectrometria de massa (116 sequências) e as sequências decoy foram usadas para o controle da taxa de descoberta falsa. O mecanismo de busca foi configurado para detectar peptídeos semitrípticos a um FDR de 0,01. A oxidação da metionina e a acetilação dos terminais N da proteína foram definidas como modificações variáveis e a carbamidometilação da cisteína foi definida como uma modificação fixa. Recursos identificados como contaminantes e proteínas sem peptídeos exclusivos foram filtrados. Contagens espectrais foram utilizadas para estimar a proporção de proteínas em cada amostra.

Análise de potência sérica anti-SARS-CoV-2 ELISA para detecção de IgG anti-SARS-CoV-2

[00143] Para avaliar os títulos de anticorpos séricos dos camundongos e cavalos imunizados, placas ELISA (Costar®) foram revestidas com 100 μL de SARS-CoV-2 purificado e inativado (4,2 x 104 vírus / mL) e incubadas durante a noite a 4° C. as placas foram então bloqueadas com 5% de BSA em 1X PBS por 2 h a 37° C e incubadas com diluições crescentes de amostras de soro não imunes ou experimentais por 1 h em temperatura ambiente. Após a incubação, as placas foram lavadas com PBS-Tween 20 0,05% e incubadas com os anticorpos IgG-HRPO anti-camundongo (1:2000) ou IgG-HRPO anti-cavalo (1:5000) em BSA / PBS 0,1%, a seguir, as placas foram lavadas e as reações desenvolvidas com substrato TMB (BD OptEIA™), de acordo com as instruções do fabricante. As absorvâncias foram registradas em um leitor de ELISA (espectrofotômetro BioTek Elx800) a 450 nm. O título foi estabelecido como a diluição de soro mais alta em que a absorbância medida foi duas vezes mais alta do que a determinada para soro normal de camundongo (grupo de controle) ou para plasma de cavalo pré-imune.

Teste de neutralização de vírus baseado em efeito citopático (CPE-VNT)

[00144] Para avaliar os títulos de anticorpos séricos dos camundongos e cavalos imunizados, o CPE-VNT foi realizado com o uso da variante B.1.1.28 do tipo selvagem SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2/humano/BRA/SP02/2020 (MT126808.1). As 3 bateladas do produto final (soro anti-SARS-CoV-2 equino) também foram testados contra a variante P.1./Gamma SARS-CoV- 2 (cepa IMT 87201) e variante P.2. / Zeta (hCoV-19 / Brasil / RS-00601/2020 - LMM- EPI_ISL_779155, gentilmente cedido pelo Dr. Fernando Spilki - Universidade Feevale, RS, BR). Os ensaios foram realizados em placas de 96 poços semeadas de 24 a 28 h antes com 2 x 104 células / poço de células VERO (ATCC CCL-81.4.). Uma diluição em série de cada soro (1:20 a 1: 40960) em DMEM com 2,5% de FBS foi realizada e então 100 TCID50 do vírus (v/v). A mistura de vírus / soro foi incubada a 37° C por 1 h para permitir a neutralização do vírus. Em seguida, a mistura foi transferida para a monocamada de células VERO confluentes e incubada por 72 h a 37 ° C, sob 5 % CO2. Após o período de incubação, as placas foram inspecionadas novamente microscopicamente para CPE causado por SARS-CoV-2 e subsequentemente coradas com 0,2% de solução de azul de naftol preto e analisadas para confirmar o título. O título de neutralização de vírus, referido como VNT100, é descrito como a maior diluição de soro que neutralizou o crescimento do vírus. Em cada ensaio, um soro positivo e um soro negativo foram incluídos como controles.

Kit ELISA cPassTM

[00145] O kit cPassTM para detecção de anticorpos de neutralização de SARS-CoV-2 (GenScript, Cat.: L00847) foi usado de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante, para uma detecção direta qualitativa de anticorpos neutralizantes totais para SARS-CoV-2 no anti-soro. Inicialmente, as amostras dos três lotes de anti-SARS-CoV-2 equino foram diluídas 1:100, 1:1000 e 1:2500 com tampão PBS pH 7,4. A placa de soro neutralização foi bloqueada com 200 μL / poço de PBS + BSA 1% e então incubada a 37 ± 2° C por 1 a 2 h. Amostras e controles foram adicionados aos poços e incubados a 37 ± 2° C por 30 minutos com solução RBD-HRP. As mesmas amostras e controles foram então transferidos da placa de neutralização de soro para a placa de captura (ELISA), incubados a 37 ± 2° C por 15 min e lavados quatro vezes com uma solução de lavagem fornecida 1x (diluição 1:20 com ddH2O, 300 μL por poço). Após a etapa de lavagem, a solução de substrato TMB foi adicionada (100 μL por poço) e incubada à temperatura ambiente (25 ± 3° C) por 20 min, protegida da luz. Para finalizar, a solução de parada fornecida foi adicionada (50 μL por poço) para interromper a reação de HRP e TMB. A absorbância das amostras foi medida imediatamente a 450 nm.

ElecsysAnti-SARS-CoV-2 S

[00146] As três bateladas de soro equino anti-SARS- CoV-2 foram diluídas em solução salina pirogênica estéril, na proporção 2, de 1/20 a 1/20480. As amostras foram transferidas para tubos de coleta do tipo vacutainer, compatíveis com equipamentos Cobas e Roche. As análises foram realizadas de forma automatizada, utilizando o kit Elecsys®Anti-SARS-CoV-2 (Roche, xx), para a determinação quantitativa de anticorpos (incluindo IgG) contra o domínio RBD da proteína SARS-CoV-2 Spike. Os resultados foram expressos em U / mL com base na curva de anticorpo monoclonal padrão do Kit, com 1 nM do MoAb anti-RBD correspondendo a 20 U / mL.

Toxicologia pré-clínica e estudos de segurança

[00147] Os protocolos usados no presente estudo foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado de Animais Institucionais do Instituto Butantan (aprovação do protocolo n° 9165080620). Camundongos machos e fêmeas BABL / c, pesando de 20 a 25 g, foram obtidos no Centro de Criação de Animais do Instituto Butantan. A temperatura da sala durante o estudo foi mantida entre 18 e 22° C, umidade de 50 e 65% e a iluminação em um ciclo de 12h de luz e 12h de escuro. Cada gaiola foi fornecida com alimento comercial CR1-Nuvital Nuvilab® e água ad libitum. Coelhos machos e fêmeas da raça Nova Zelândia (vinte semanas de idade) foram obtidos na Granja-RG (Suzano, São Paulo Brasil) e mantidos em estantes ventiladas, sob temperatura e umidade controladas e ciclo claro / escuro de 12 h / 12 h com acesso ad libitum a comida e água.

[00148] Os estudos de segurança foram elaborados seguindo as orientações da Agência Reguladora Brasileira (ANVISA, 2013). Todos os experimentos com animais obedeceram às diretrizes ARRIVE e foram realizados de acordo com o UK Animals Act 1986 e regras associadas. Resumidamente, para estudos de toxicidade aguda de dose única, a dose limite foi de 200 μL para camundongos e 1,5 mL para coelho. Os animais foram observados durante 14 dias (camundongos) ou 90 dias (coelho) após a administração do soro anti-SARS-CoV-2. Os grupos de ratos foram divididos em quatro grupos de 20 animais cada (10 machos e 10 machos) homogeneizados com base no peso e i.p. injetado com solução salina aprirogênica (controle) ou com diferentes doses do anti-SARS-CoV-2, ou seja, 33.635 U / RBD / g. 3,365 U / RBR / ge 0,3365U / RBD / g, conforme determinado pela análise da potência do soro (seção 2.2.8.4). Dois grupos de 12 coelhos (6 machos e 6 fêmeas), homogeneizados com base no peso, foram i.v. injetado com solução salina aprirogênica ou 8,268 U / RBD do soro anti-SARS-CoV-2.

Avaliação clínica de camundongos

[00149] A massa corporal e o consumo de água foram avaliados ao longo do experimento. A triagem hipocrática foi realizada por meio de observações individuais dos animais nos períodos de 15 min, 30 min, 1, 2, 4 h após a injeção e, posteriormente, a cada 24 h por 14 e 90 dias após o tratamento. Foram avaliados o estado de consciência e disposição geral, coordenação motora, tônus muscular, reflexos e atividade do sistema nervoso autônomo. A coleta de sangue dos animais para análises hematológicas e bioquímicas foi realizada em animais profundamente anestesiados (cloridrato de xilazina 10 mg / kg e cloridrato de cetamina 100 mg / kg). Os parâmetros hematológicos e bioquímicos foram avaliados por meio de kits específicos de acordo com os fabricantes. Todas as medições foram realizadas usando um ProCyte Dx Hematology Analyzer e Catalyst One Chemistry Analyzer (IDEXX Distribution, Wisconsin US).

Análise histopatológica e massa relativa dos órgãos

[00150] Os animais sob anestesia profunda foram sacrificados. na sequência de um exame externo detalhado (cor e integridade da pele e do cabelo, alterações de todos os tecidos e da forma do abdômen) e interno. Órgãos (rim, baço, fígado, coração, pulmão, nódulos linfáticos, placas de Peyer, testículos, ovários, pele e cérebro) de cada animal foram removidos e pesados. A massa relativa dos órgãos de cada animal foi calculada dividindo o peso de cada órgão (g) pelo peso corporal de cada animal no dia da coleta e multiplicando o resultado por 100.

Teste de desafio em hamsters sírios dourados Design de estudo

[00151] Setenta e dois hamsters sírios dourados convencionais (Mesocricetus auratus) (36 machos e 36 fêmeas, 115-148 g, 10-11 semanas de idade) foram obtidos no Centro de Criação de Animais do Instituto Butantan. Os hamsters foram alojados individualmente e divididos em quatro grupos de 18 animais cada (9 machos e 9 machos) homogeneizados com base no peso. No dia zero, os animais foram anestesiados com cetamina e xilazina, e dois grupos (G1 e G2) foram inoculados por via intranasal com 50 μL de 1 x 105 TCID50 de SARS-CoV- 2 (SARS-CoV-2 / SP02 / 2020HIAE, GeneBank MT12680.1, 4a passagem em células VERO) em DMEM com 2% de FBS. enquanto os dois grupos restantes (G3 e G4) foram inoculados com 50 μL de DMEM 2% FBS.

[00152] No dia 2 p.i. (pós-infecção), os hamsters de G1 e G3 foram tratados com 500 μL de soro hiperimune equino (7,2 mg / animal), enquanto os hamsters de G2 e G4 receberam 500 μL de solução salina apirogênica estéril, ambos por via intraperitoneal. Nos dias 3, 5 e 7 p.i., subgrupos de 6 animais (3 machos e 3 fêmeas) de cada grupo foram sacrificados com overdoses de cetamina e xilazina e necropsiados. Fragmentos dos pulmões foram coletados em tampão de lise (kit Mag MaxCore Thermo Fisher Scientific) (para extração de RNA), em meio de transporte viral [VTM - DMEM + 2% FBS + antibióticos / antifúngicos (Vitrocell - penicilina 10.000U, estreptomicina 10 mg, 25 μg de anfotericina B / mL] (para titulação do vírus) e em formalina 10% (para análise histopatológica). Todos os cinco lobos dos pulmões foram representados em cada amostra para extração de RNA e isolamento do vírus, e foram analisados separadamente na histopatologia. Os pulmões inteiros e todos os fragmentos de tecido foram pesados. As amostras coletadas para isolamento do vírus foram congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e armazenadas a -80° C até o processamento. Os animais também foram sangrados e o soro analisado quanto à presença de anticorpos equinos por ELISA.

[00153] Os procedimentos envolvendo os hamsters foram aprovados pelo Comitê Institucional de Uso e Cuidado de Animais do Instituto Butantan (protocolo de aprovação n°9165080620) e do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo (protocolo de aprovação n° 6103261120). Os experimentos foram realizados em uma instalação de animais de nível 3 de biossegurança.

Quantificação da carga viral de amostras de tecido

[00154] A quantificação da carga viral foi realizada por determinação do TCID50 / g de tecido (usando amostras em VTM) e determinação do número de cópias de RNA viral / cópias de β actina RNA (usando amostras em tampão de lise). Resumidamente, todas as amostras de conchas nasais, traqueia e pulmões foram descongeladas e submetidas à ruptura usando 2 mm de contas de vidro em equipamento TissueLyser II (Qiagen) a 30 Hz por 2 minutos, duas vezes, seguido de centrifugação a 13.000 rpm (Eppendorf- Centrífuga 5804R) por 30 segundos. Os sobrenadantes foram utilizados para quantificação da carga viral. A determinação de TCID50 foi feita conforme descrito acima.

[00155] O ácido nucleico total foi extraído usando o Kit Magmax Core no processador de partículas magnéticas MagMAX Express (ThermoFischer Scientific), seguindo as instruções do fabricante. A detecção do RNA SARS-CoV-2 foi realizada com base em um protocolo previamente descrito (Corman et al., 2020) usando um kit de ensaio de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) de uma etapa (AgPath- ID ™ One-Step) Reagentes RT-PCR - Applied Biosystems Inc., Waltham, EUA) em uma máquina de PCR em tempo real ABI 7500 SDS (Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemanha). A reação foi realizada como um duplex usando iniciadores específicos de SARS-CoV-2 e iniciadores para β actina (ActB Rv 5'CAC CAT CAC CAG AGT CCA TCA C 3', ActB F CTG AAC CCC AAA GCC AAC; ActB_P- HEX TGT CCC TGT ATG CCT CTG GTC GTA ZEN / IOWA PRETO) como gene de manutenção. O número de cópias de RNA / mL foi quantificado com base em uma curva padrão obtida pela diluição em série de uma sequência de dsDNA sintética (GeneBlocks, IDT) correspondente ao fragmento de amplificação do gene alvo.

Capture-ELISA para detecção de anticorpos de cavalo nas amostras de soro de hamster

[00156] Os ensaios de captura-ELISA foram realizados para identificar anticorpos de cavalo nas amostras de soro de hamster. Resumidamente, as placas de ELISA foram revestidas com 100 μL de IgG de coelho anti-cavalo (500 ng / mL) (Sigma), durante a noite, a 4 ° C. As placas foram lavadas com 200 μL de PBS e bloqueadas com 200 μL de BSA 5% em PBS, durante 2 h, a 37 ° C. As placas foram então lavadas três vezes com 200 μL de PBS, e a curva padrão previamente preparada (anti-SARS-CoV-2 cavalo F (ab')2 diluído em série em PBS, de 262 μg / mL a 0,13 μg / mL) e amostras de soro (diluídas 1/10 em PBS) foram adicionadas em triplicado. Após 1 h de incubação a 37 ° C, as placas foram lavadas três vezes com PBS / Tween 20 0,05% e incubadas com IgG anti-cavalo conjugado com peroxidase (diluído 1/5000 em PBS / Tween 20 0,05% / BSA 0,1%) (Zymed Technologies), por 1 h a 37° C. As placas foram lavadas três vezes com PBS / Tween 20 0,05% e as reações desenvolvidas durante 15 min com substrato TMB (BD OptEIA ™), de acordo com as instruções do fabricante. As absorvâncias foram registradas em um leitor de ELISA (espectrofotômetro BioTek Elx800) a 450 nm. A curva padrão foi linearizada por transformação log-log e, em seguida, submetida à regressão linear. A concentração de cavalo F (ab ') 2 em amostras de soro foi estimada interpolando as amostras para a curva padrão.

Exame histopatológico

[00157] Após a eutanásia, os pulmões foram extraídos dos hamsters e fixados em formol a 10% por 24 horas. As amostras pulmonares foram então submetidas a fixação histológica de rotina e coradas com hematoxilina e eosina (HE). Os achados histopatológicos para alterações relacionadas ao SARS-CoV-2 foram avaliados com base na literatura (Roberts et al., 2005; Gruber et al., 2020; Geramizadeh et al., 2020).

[00158] As amostras de tecido foram examinadas sob um microscópio de luz para a presença de alterações celulares / tecidos, conforme descrito em detalhes na Tabela S1 (Material Suplementar), e um escore histopatológico foi determinado, sendo muito leve (I), leve (II), moderado (III) e grave (IV). As seções de pulmão foram avaliadas às cegas por patologistas veterinários certificados. A métrica nos permitiu gerar uma pontuação numérica para o grau de bronquite, edema e pneumonia para determinar a eficácia terapêutica dos tratamentos (Kreye et al., 2020). Para tanto, foram analisadas cinco estruturas anatômicas dos pulmões, por animal, identificadas como: lobo craniano direito; lobo médio direito; lobo caudal direito; lobo acessório e pulmão esquerdo.

Análise de infiltração de leucócitos no tecido pulmonar

[00159] Para analisar melhor o processo inflamatório, foi determinado o número de neutrófilos, monócitos e linfócitos presentes no tecido pulmonar dos hamsters. Para isso, cinco campos por animal / lâmina foram capturados em uma câmera digital (DS-Fi1c Digital Camera da Nikon) utilizando o microscópio (Nikon Eclipse Ti-S, Melville, NY). As imagens utilizadas foram coradas com eosina e hematoxilina. Para a contagem de leucócitos, foram utilizados o software ImageJ e o plugin Color Deconvolution 2 para visualizar os núcleos separados do citoplasma (Fig. S1 - Material Suplementar), que implementa a separação das manchas pelo método de Ruifrok & Johnston (2001). Para a contagem de células, foi utilizado o plugin Cell Counter. Essa análise permitiu a contagem diferencial entre núcleos segmentados e mononucleares.

Imunofluorescência

[00160] Cortes finos de tecido pulmonar foram submetidos à desparafinização, reidratação e recuperação do antígeno. As peroxidases endógenas foram então bloqueadas, seguido por permeabilização do tecido usando 0,4% Triton X 100 em PBS. Ligações inespecíficas foram bloqueadas e as seções finas foram lavadas duas vezes com PBS-Tween e tratadas com anticorpos primários de glicoproteína de pico anti-SARS-CoV-2 (abcam, ab272504, 1: 100) por uma hora em temperatura ambiente. Eles foram então lavados com PBS-Tween duas vezes e tratados com o anticorpo anti-coelho secundário Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific; A21244, 1: 100) por 30 minutos em uma câmara escura em temperatura ambiente. Após a lavagem, foi adicionado IgG FITC anti-cavalo (Sigma- Aldrich; F-7759, 1: 100) durante uma hora à temperatura ambiente. As seções finas foram lavadas e as lâminas foram montadas usando Hoechst (Thermo Fisher Scientific; 62249, 1: 1000) e ProLong ™ Glass Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific; P36980). As lâminas foram lidas em microscópio confocal (Leica TSC SP8 DSL Hyvolution). As imagens foram montadas e analisadas em 3D no software Imaris Viewer.

Análise estatística

[00161] Os dados foram expressos como média ± erro padrão e analisados estatisticamente com GraphPad Prism, versão 9.1 para Windows (San Diego. EUA). Para as comparações, foram utilizados os seguintes testes: One Way ANOVA e comparações múltiplas realizadas por post-hoc Tukey HSD; ANOVA de duas vias seguida de teste post hoc de Bonferroni e teste t de Student. Preciso completar todos os testes usados.

Resultados Produção de antígeno

[00162] O SARS-CoV-2 foi propagado em bateladas de 6 L usando células Vero em monocamada estática em meio sem soro. O vírus foi colhido de forma eficiente e clarificado por filtração profunda com recuperação de praticamente 100%. O vírus ativo mostrou boa estabilidade a 4 ° C por pelo menos 24 h nesta condição. A concentração por TFF usando uma membrana de 300 kDa também mostrou bons rendimentos de recuperação (> 90%) e nenhum vírus pôde ser realmente quantificado no permeado. A ultracentrifugação foi aplicada para purificação do vírus em duas etapas. Após a primeira etapa, o vírus foi recuperado em muitas frações do gradiente de sacarose, que foram então reunidas, diluídas e carregadas no segundo gradiente. O material purificado final foi recuperado de uma fração de gradiente mais estreito (58% a 35% de sacarose). A inativação do vírus foi eficaz e segura usando irradiação gama 15 KGy, considerando um nível de garantia de esterilidade (SAL) aplicado para materiais que devem estar em contato com humanos e animais. Os testes de inativação não mostraram efeito citopático nas monocamadas de células Vero após três passagens cegas. O teste para a cinética do RNA subgenômico viral também não mostrou evidência de replicação viral em células Vero por 72 h de incubação, pois nenhuma diferença estatística na quantidade de RNA foi encontrada durante a avaliação cinética (dados não mostrados).

Análise de antígeno

[00163] As amostras de vírus purificadas e inativadas foram analisadas quanto à infecção, características antigênicas e imunogênicas. A pureza do antígeno foi verificada por SDS-PAGE (Figura 10A) mostrando apenas quatro fragmentos com tamanhos das três proteínas estruturais virais (N, M, E e S; Malik, 2020). Além disso, a proteína residual da célula hospedeira foi medida por ELISA específico (234,33 ng / mL). Anticorpos específicos anti-SARS-Cov-2 proteína S e anti-SARS-CoV-2 proteína N reconheceram ambas as proteínas no vírus purificado e inativado por Western Blotting (Figura 10B). Além disso, essas três proteínas virais (N, S e M) foram identificadas por meio de análise LC-MS / MS do antígeno (Figura 10C). Além disso, a proporção do conteúdo de proteína estimada com base em contagens espectrais mostrou que as proteínas virais totais representam aproximadamente 90% da amostra de antígeno purificado e inativado (Figura 10C). As medições de endotoxina nas amostras de vírus purificadas e inativadas mostraram um nível abaixo da sensibilidade do ensaio (<0,125 EU / mL) (dados não mostrados).

[00164] A imunogenicidade da amostra de vírus purificada e inativada, bem como sua toxicidade potencial in vivo, foram avaliadas pela medição da resposta específica do anticorpo eliciada após a imunização de camundongos e por parâmetros de toxicidade, respectivamente. A Figura 11A mostra que o vírus inativado é imunogênico, induzindo um aumento na produção de anticorpos ao longo do tempo de imunização, conforme medido por ELISA, usando o vírus como antígeno. A presença de anticorpos neutralizantes contra SARS-CoV-2 vivo (variante B.1.1.28) também foi medida. Os títulos de anticorpos neutralizantes, conforme determinado por CPE-VNT, após 4 doses foram de 1:256 em média (Figura 11B). Além disso, a inoculação repetida do vírus inativado, no modelo murino, não produziu nenhum efeito tóxico nos animais (dados não mostrados). Assim, esses resultados nos permitem utilizar o vírus purificado e inativado para a imunização de equinos.

Produção de plasma hiperimune anti-SARS-CoV-2

[00165] Os cavalos foram injetados quatro vezes com suspensão viral inativada de SARS-CoV-2, por via subcutânea, com intervalo de uma semana. Os exames laboratoriais não mostraram alterações relevantes nos parâmetros hematológicos ao longo do esquema de imunização. A análise bioquímica mostrou valores normais, exceto por leve aumento da proteína total e gamaglobulina após as quatro doses de imunização e antes dos procedimentos de plasmaférese.

[00166] Amostras de soro foram coletadas antes e durante a imunização e os títulos de anticorpos contra as proteínas SARS-CoV-2 foram monitorados por ELISA e CPE-VNT. Da mesma forma, ao observado para camundongos, a titulação de amostras de plasma equino também permitiu verificar a eficácia do esquema de imunização, atingindo os maiores títulos de anticorpos 28 dias após o primer (Figura 12A). Como esperado, os cavalos desenvolveram títulos de anticorpos muito mais elevados para o SARS-CoV-2 inativado do que os camundongos, permitindo a obtenção de três bateladas de plasma hiperimune para a produção de fragmentos de imunoglobulina F (ab') 2, nos dias 28, 35 e 49 após o primer. Além disso, níveis aumentados de anticorpos neutralizantes também foram observados durante o processo de imunização de cavalos (Figura 12B).

[00167] O plasma foi coletado quando os níveis de anticorpos anti-SARS-CoV-2 foram considerados como atingindo um pico. Primeiramente, os cavalos foram examinados, incluindo avaliação de peso, escore de condição corporal e avaliação da motilidade intestinal por ausculta digestiva, frequência cardíaca e respiratória por ausculta cardiorrespiratória. Em seguida, os animais foram submetidos à plasmaférese automatizada e a equipe veterinária monitorou os animais durante toda a coleta de plasma que durou em média 3 h, período em que os animais foram alimentados e oferecida água, até que fossem coletados pelo menos 10-12 litros, ou os animais apresentassem algum desconforto, devido à permanência nas baias. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as boas práticas de manejo de animais. Após a secção automatizada do plasma, observou-se ligeira tendência de diminuição da proteína sérica total e da gama globulina entre a 2a e a 3a plasmaférese. Os valores basais de peso e proteína sérica ocorreram no máximo sete dias após os dois primeiros procedimentos de plasmaférese, exceto para a terceira coleta de plasma. Nesse caso, optouse por adiar mais uma semana para permitir a recuperação do nível de proteína sérica (Tabela 2). Tabela 2 - Peso dos animais e parâmetros laboratoriais de cavalos submetidos à imunização com vírus inativado por SARS- CoV-2 e coleta de plasma

[00168] Foram obtidas três bateladas de plasma hiperimune e o volume final de cada um foi composto pela soma do plasma coletado dos 10 animais em diferentes períodos de tempo após o esquema de imunização. Os parâmetros da coleta de plasma são mostrados na Tabela 3. Uma semana após a plasmaférese automatizada, os animais recuperaram para os parâmetros normais. Foram mantidos em piquete com fornecimento regular de pasto e adicional de grãos e água, sob vigilância veterinária. Tabela 3 - Parâmetros de coleta dos três lotes de plasma hiperimune anti-SARS-CoV-2

Produção de imunoglobulina equina anti-SARS-CoV-2

[00169] Bateladas de plasma foram obtidos com um total de 428,130 mL de plasma foram coletados e submetidos ao processamento industrial. Bulks resultou em três bateladas de imunoglobulina anti-SARS-CoV-2 fragmentada específica purificada, que foram preenchidos em frascos de 5,0 mL.

[00170] Amostras das três bateladas foram submetidas à análise SDS-PAGE para avaliação da existência de produtos proteolíticos. Não houve alterações no perfil de proteína das três bateladas, mesmo após incubação por 3 h a 37 ° C, indicando uma falta de eventos proteolíticos de amostras anti-SARS-CoV-2 (Figura 13A). Além disso, foi possível identificar por meio da análise de espectrometria de massa em tandem a presença de regiões específicas anti-Spike das imunoglobulinas nas amostras dos três lotes (Figura 13B).

[00171] As amostras foram testadas no Controle de Qualidade do Instituto Butantan para verificar os resultados de aparência, pH, osmolalidade, vedação do frasco, cloreto de sódio, fenol, sulfato de amônio, nitrogênio não proteico, sólidos totais, proteína total, volume extraível, volume entregável, pureza, distribuição molecular, agregados de proteínas, esterilidade e pirogênio. Todos os resultados estavam de acordo com a Farmacopeia Brasileira (dados não mostrados).

Análise da potência do soro hiperimune anti-SARS-CoV-2

[00172] A análise de potência do soro hiperimune anti- SARS-CoV-2 foi avaliada por três metodologias diferentes: ELISA competitivo (GenScript) e CPE-VNT para detecção de anticorpos de neutralização e ELISA quantitativo para detecção de anticorpos de domínio RBD (ROCHE) (Tabela 4). Todas as três bateladas mostraram anticorpos neutralizantes quando testados por CPE-VNT. Os títulos médios de anticorpos neutralizantes contra as três variantes atualmente em circulação no Brasil variaram de 1120 a 2140 para a variante B.1.1.28. de 100 a 200 para variante P.1. gama e de 1120 a 2560 para a variante P.2./Zeta (Tabela 4). Esses resultados concordam com os resultados da avaliação de inibição por ELISA competitivo, em que, todos as bateladas de soro anti- SARS-CoV-2 analisados foram positivos (cut off = 20%) para a presença de anticorpo neutralizante pelo menos até a diluição 1/2500. O ELISA competitivo foi realizado em condições de GLP e a metodologia foi previamente validada para uso com soro equino. Por outro lado, a quantificação dos anticorpos anti-Spike totais mostrou que a quantificação dos títulos variou de 5477,6 U / mL a 7798,3 U / mL. Tabela 4. Potência sérica hiperimune anti-SARS-CoV-2 equina

Estudos pré-clínicos de segurança

[00173] O comportamento de camundongos e coelhos foi sistematicamente observado para avaliar a toxicidade aguda após 24 horas, 14 e 90 dias da administração do soro hiperimune. A análise hipocrática não mostrou nenhuma mudança comportamental em camundongos e coelhos. Não houve alterações quantitativas no peso total dos animais que receberam soro hiperimune em comparação com os grupos controle e veículo e, após a necropsia, não houve diferenças nos pesos dos órgãos internos (dados não mostrados). As análises macroscópicas dos órgãos internos após 14 e 90 dias da administração do soro não mostraram alterações. Não foram observados focos de hemorragia nas cavidades ou parênquima dos diferentes órgãos, formação de ascite ou fluido cavitário, formação de pus, exsudato inflamatório ou obstrução em órgãos internos dos órgãos.

[00174] Após 14 e 90 dias da inoculação do soro, não houve alteração quantitativa no número total de eritrócitos. hematócrito ou número de plaquetas, em camundongos machos e fêmeas (Fig. 14A e Fig 14B). Histologicamente, todo o parênquima dos órgãos internos está preservado.

[00175] As análises hematológicas dos coelhos não mostraram diferenças significativas nos números total e absoluto, no número de leucócitos totais, ou no número de eritrócitos e plaquetas (Fig. 15A e Fig 15B). As determinações bioquímicas, após 14 dias da administração do soro, não revelaram qualquer alteração na toxicidade aguda nos grupos tratados com o soro em comparação com os grupos controle, veículo e os valores de referência para as espécies, tanto para camundongos quanto para coelhos (Fig. 16A e Fig 16B). Nas análises histopatológicas da região da pele e anexos dos camundongos dos grupos controle, veículo e tratado com soro, pode-se observar a organização e preservação das regiões da epiderme, derme e hipoderme, bem como a presença do pilo. - músculo eretor, sem qualquer evidência de reações de lesão ou inflamação. Análises histopatológicas realizadas 14 dias após a administração de soro anti-SARS-Cov-2 em camundongos tratados com doses aumentadas de soro anti-SARS-Cov-2 (33.635 U / RBD / g, 3.365 U / RBR / ge 0.3365U / RBD / g) não mostraram alterações nas estruturas do parênquima pulmonar, hepático e renal. Nenhum processo inflamatório, degenerativo ou de fibrose foi detectado (Figura 17).

Infecção de hamster com SARS-CoV-2

[00176] Hamsters sírios dourados foram usados para a avaliação pré-clínica da eficácia protetora do soro equino anti-SARS-CoV-2. Os inventores avaliaram a eficácia do tratamento com soro equino realizado 2 dias p.i. por meio da avaliação de peso, sinais clínicos, carga viral do pulmão, traqueia e conchas nasais (fig. 5A). Como esperado, os animais infectados com SARS-CoV-2 apresentaram perda de peso progressiva quando comparados aos animais não infectados, com leve recuperação nos dias 6 e 7 p.i. As alterações de peso observadas em animais infectados com SARS-CoV-2 que receberam o tratamento com soro não foram diferentes dos animais infectados com SARS-CoV-2 que receberam solução salina (valor p> 0,05) (Figura S6A - Material Suplementar). Os sinais clínicos de espirros e fricção do focinho foram evidentes a partir do dia 3 p.i. em todos os animais infectados, persistindo até o último dia do experimento, e ausente nos animais não infectados.

[00177] Embora nenhuma diferença estatística tenha sido observada no isolamento do vírus do trato respiratório entre animais tratados e não tratados (Figura 19), conforme medido pelo TCID50, o SARS-CoV-2 RT-qPCR específico mostrou carga viral significativamente mais baixa nos pulmões de animais tratados com soro no dia 3 pi quando comparados aos animais que não receberam o soro equino (Figura 18B). As cargas virais foram todas negativas para animais não infectados.

Patologia de SARS-CoV-2 no modelo de hamster

[00178] No dia 3 pi, lesões patológicas macroscópicas compatíveis com hemorragia nos pulmões de animais infectados com SARS-CoV-2 (G1 e G2) foram observadas, progredindo para extenso envolvimento pulmonar (frequentemente> 50% dos lobos) nos dias 3, 5 e 7 pi No dia 7 p.i., a hepatização de áreas pulmonares era comum em animais infectados com SARS- CoV-2. Nenhuma lesão macroscópica foi observada em outros órgãos de animais infectados com SARS-CoV-2, ou em animais não infectados com SARS-CoV-2.

[00179] A análise histopatológica dos pulmões de animais infectados com SARS-CoV-2 mostrou pneumonia intersticial, difusa ou não, com envolvimento broncoalveolar, edema do interstício e espaço perivascular, infiltrado de leucócitos, descamação do epitélio brônquico, hemorragia intersticial difusa e deposição de membrana de hialina (Figura 20).

[00180] Animais infectados com SARS-CoV-2, não tratados, mostraram uma evolução mais acentuada do padrão de pneumonia intersticial difusa, escores de bronquite e edema principalmente nos dias 3 e 5 pi, em comparação com animais infectados com SARS-CoV-2, tratados com soro (valor de p <0,05). Nos dias 3 e 5 p.i., os animais não tratados infectados com SARS-CoV-2 tinham neutrofilia marcada em comparação com os animais tratados com soro. O número de células mononucleares, embora não significativo, aumentou apenas às 7 p.i em animais tratados com soro infectados com SARS-CoV-2. As amostras controle (animais não infectados, tratados ou não) apresentaram o padrão histológico normal do tecido (Figura 21).

Detecção de anticorpos no modelo COVID de hamster

[00181] A detecção de anti-SARS-CoV-2 F (ab')2 de cavalo em amostras de soro de hamster revelou a presença de fragmentos de imunoglobulina de cavalo, confirmando que o soro anti-SARS-CoV-2 injetado intraperitonealmente, atingiu a circulação sanguínea. A concentração mais elevada foi detectada aos 3 dias p.i., tanto nos grupos infectados como não infectados, e diminuiu ao longo do tempo, de forma semelhante entre os grupos (Figura 22). A cinética da infecção e o efeito protetor da imunoterapia no tecido pulmonar são mostrados na Figura 23. O SARS-CoV-2 infectou o epitélio alveolar brônquico e o endotélio vascular e pode ser visto como uma forma extracelular no interstício ou como uma forma intracelular nos leucócitos e células somáticas. A fração F(ab')2 é distribuída nos mesmos locais que o vírus, e a sobreposição do complexo F(ab')2-SARS-CoV-2 pode ser vista em detalhes na análise 3D do tecido pulmonar dos animais infectados que foram tratados com soro. O tecido do grupo de controle com solução salina foi incubado com os mesmos anticorpos primários e secundários e nenhuma reação específica foi observada (dados não mostrados).

Discussão

[00182] Os inventores mostram que cavalos imunizados com SARS-CoV-2 purificado e inativado forneceram plasma com altos títulos de anticorpos como material de partida para a produção de imunoglobulinas anti-SARS-CoV-2 F (ab')2, em um ambiente GMP.

[00183] O antígeno e o produto final foram caracterizados por meio de abordagens bioquímicas, imunológicas e biológicas.

[00184] Em primeiro lugar, a inativação do antígeno foi avaliada quanto à atividade residual do vírus após a irradiação, não mostrando nenhuma evidência de vírus ativo demonstrando a eficácia da radiação ionizante para a inativação, conforme descrito anteriormente para outros vírus e SARS-CoV-2 (Shahrudin et al., 2018; Leung et al., 2020; Sir Karakus et al., 2020).

[00185] O processo de produção do vírus purificado também foi eficiente na redução do nível de proteínas da célula hospedeira, garantindo a pureza do produto verificada por MS, SDS-PAGE e ELISA quantitativo.

[00186] Além disso, o antígeno não apresentava contaminantes e o nível de endotoxinas era inferior ao limite aceito para produtos parenterais.

[00187] Por fim, a análise imunológica do antígeno mostrou que camundongos imunizados com o vírus inativado não apresentavam sinal de toxicidade e geravam altos níveis de anticorpos neutralizantes contra SARS-CoV-2, evidenciando a preservação de epítopos cruciais da proteína S do vírus (Jiang & Hillye , 2020).

[00188] A imunoglobulina anti-SARS-CoV-2 F(ab')2 foi avaliada usando a análise físico-química e microbiológica padrão realizada para todos os 13 produtos de imunoglobulina do portfólio do Instituto Butantan. O novo produto não apresentou diferenças marcantes e as análises de qualidade foram consideradas adequadas para o controle de qualidade da liberação de lotes de imunoglobulinas anti-SARS-CoV-2.

[00189] Apesar de apresentar diferenças na potência, o produto foi capaz de neutralizar in vitro três variantes do SARS-CoV-2, de forma semelhante ao que está sendo encontrado em vários testes para o estabelecimento da eficácia da vacina em humanos contra cada nova variante do vírus (Salim et al., 2021; Palacios et al., 2021).

[00190] Hamsters sírios dourados foram usados para a avaliação pré-clínica da eficácia protetora do soro equino anti-SARS-CoV-2. A análise da carga viral no pulmão medida por qRT-PCR após 3 dias de infecção mostrou uma diferença estatística (p <0,05) entre os animais tratados e não tratados com o anti-soro. No entanto, não houve diferença estatística na carga viral na traqueia e conchas nasais medidas por ambos, qRT-PCR e determinação do TCID50, entre os dois grupos.

[00191] A análise histopatológica mostrou que o tratamento sorológico após 48 horas da infecção prejudicou o desenvolvimento da doença, reduzindo significativamente o edema e a ativação de neutrófilos no pulmão. Esses dados suportam os benefícios potenciais desse tratamento para pacientes humanos, que geralmente sofrem de inflamação desencadeada por COVID-19 e armadilhas extracelulares de neutrófilos. É também importante mencionar que os estudos de desafio foram conduzidos usando uma única dosagem de anti- soro, que foi planejada para ser a dose mais baixa em relação ao peso corporal de um sujeito humano que poderia ser injetada. Esta pode ser a explicação para a não detecção de redução sensível da carga viral, visto que foi demonstrado in vitro que os lotes de soro possuem alta potência de neutralização. Além disso, os ensaios Capture Elisa confirmaram a presença de imunoglobulinas equinas em circulação do terceiro ao sétimo dia após a inoculação.

[00192] A distribuição da fração F(ab')2 no epitélio alveolar brônquico e no endotélio, observada por imunofluorescência, mostrou a formação de uma barreira que parecia ter efeito protetor no tecido pulmonar. Além disso, o sequestro de F (ab')2 para o tecido pulmonar pode explicar sua redução no soro de hamster observada no ensaio ELISA.

[00193] Outro fato importante é que embora os efeitos da imunoterapia no tecido pulmonar tenham sido descritos na literatura, geralmente com avaliação do grau de lesão e cinética leucocitária (Frage et al., 2020; Rogers et al., 2020; Hassan et al., 2020), no presente pedido, os inventores mostraram o complexo F(ab') 2-SARS-CoV-2 in situ, fornecendo assim novas informações sobre a farmacocinética da imunoterapia contra SARS-CoV-2.

[00194] Na prática clínica, anticorpos originados de cavalos imunizados com venenos de animais, toxinas bacterianas e vírus da raiva têm sido utilizados desde a introdução das primeiras antitoxinas diftérica e tetânica no século XIX. Anteriormente, o uso de imunoglobulinas derivadas de equinos deu origem a problemas consideráveis relacionados a reações precoces anafiláticas e não anafiláticas, e doença do soro, talvez relacionada aos volumes substanciais do produto injetado. As etapas de purificação geraram produtos de qualidade muito melhor e as reações adversas diminuíram em frequência e gravidade.

[00195] Assim, os antivenenos permanecem a pedra angular no tratamento do envenenamento por picada de cobra em todo o mundo, enquanto as antitoxinas e a imunoglobulina anti-rábica equina ainda são amplamente utilizadas, especialmente em países de baixa e média renda. Os anticorpos equinos também podem ser administrados profilaticamente após a exposição ao organismo, como na profilaxia pós-exposição à raiva, em indivíduos imunodeficientes ou imunossuprimidos ou quando não houver vacinas disponíveis.

[00196] Um outro uso possível da terapia de anticorpos equinos, neste caso para infecção por COVID-19, é quando os pacientes são infectados, enquanto ainda protegidos pelos anticorpos. Nesse caso, os anticorpos funcionariam como vacina substituta, conforme observado para os anticorpos IgG contra a gripe, que mostraram proteção do pulmão contra doenças, mas não protegeram o nariz da infecção em camundongos (Renegar et al., 2004).

[00197] Um ensaio clínico de fase I / II foi recentemente aprovado pela autoridade reguladora brasileira e com o objetivo de avaliar a segurança, farmacocinética e eficácia de anti-SARS-CoV-2 F (ab') 2 IgG equino do presente pedido em pacientes em estágio inicial de COVID -19 com risco aumentado para casos graves.

[00198] Em conclusão, os dados apresentados no presente pedido mostram que o anti-SARS-CoV-2 F(ab')2 IgG equino pode neutralizar o vírus com sucesso, é seguro em modelos animais e é capaz de reduzir a gravidade do COVID em um modelo de hamster de SARS -CoV-2. Com base nesses resultados, a Agência Reguladora Brasileira (ANVISA) autorizou o início de um ensaio clínico para testar a eficácia desse anti-soro em pacientes com COVID.

[00199] Assim sendo, as concretizações do presente pedido são conforme os itens abaixo: Item 1. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado compreendendo as seguintes etapas a) Cultivo e multiplicação do vírus SARS-CoV-2 em células de mamíferos, b) Coleta, c) purificação do vírus, d) estabilização viral, e e) inativação viral em que a inativação viral é por irradiação gama e mantendo sua imunogenicidade. Item 2. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com o Item 1, em que a inativação por radiação gama é realizada, preferencialmente, pela aplicação de 15 kGy (kilo Grays), tanto para amostras de vírus purificado como para amostras de vírus contidas em placas de cultura, tubos de ensaio, microtubos, frascos de vidro, polipropileno ou outros plásticos. Item 3. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com qualquer um dos Item 1 a 2, em que vírus inativado por irradiação gama é imunogênico, induzindo um aumento na produção de anticorpos ao longo do tempo de imunização. Item 4. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com o Item 1, em que na etapa (a) células Vero (ATCC CCL-81.4) foram semeadas e cultivadas por 48 h antes da infecção, em que o SARS-CoV-2 foi inoculado a um MOI de 0,1 em 5 mL de meio de cultura e deixado adsorver por uma hora a 37 ° C, meio isento de soro foi adicionado às culturas até atingir o volume de 100 mL. Item 5. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com o Item 4, em que as culturas foram incubadas a 37° C, CO2 a 5%, durante 48 h. Item 6. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com os Itens 1 a 5, em que o SARS-CoV-2 ativo foi clarificado por meio de filtração de 0,22 μm (Opticap XL2 Durapore, MerckMillipore) e agrupado para a etapa (c) de purificação. Item 7. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com os Itens 1 a 6, em que o material clarificado foi concentrado por filtração de fluxo tangencial (TFF) usando um sistema Minipellicon com uma membrana Ultracell 300 kDa (MerckMillipore), em que o concentrado foi submetido a duas rodadas de ultracentrifugação (XPN 90, BeckmanCoulter) em gradientes de sacarose (65% - 34%) utilizando um rotor zonal Ti15 por 3 h a 4° C e 25 krpm, as frações contendo o vírus purificado foram reunidas após cada procedimento de ultracentrifugação. Item 8. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com os Item 1 a 7, em que o material purificado final foi diluído com 1X PBS para uma concentração de sacarose de 20%, esterilizado por filtração (0,22 μm) e congelado a -80° C. Item 9. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com os Item 1 a 8, em que a eficácia do processo de inativação do SARS-CoV-2 foi avaliada pela detecção do efeito citopático e análise cinética do RNA viral subgenômico por RT-qPCR no VERO CCL 81.4. após a inoculação do antígeno SARS-CoV-2. Item 10. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com o Item 9, em que alíquotas de 0,1 mL do vírus inativado foram incubadas com 1E + 05 VERO CCL - 81,4 células por 1 h a 37 ° C, seguido pela adição de 1,4 mL de meio de cultura DMEM + SFB 10%, as placas foram incubadas por 72 horas e, na ausência de efeito citopático, uma alíquota de 0,1 mL do sobrenadante foi transferida para uma nova cultura de células VERO CCL 81,4 para a segunda passagem, o procedimento foi repetido pelo menos mais uma vez. Item 11. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com qualquer um dos Itens 9 a 10, em que para a análise cinética do RNA viral subgenômico, 1 mL do vírus inativado foi inoculado em alíquotas de 0,1 mL em dez poços de uma placa de 12 poços contendo células VERO por 72 h, o sobrenadante de todos os poços foi reunido e alíquotas de 0,1 mL foram colocadas em um novo poço de uma placa de 12 poços para a segunda passagem em células VERO. Item 12. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com os Itens 1 a 11, em que a pureza das amostras de vírus inativadas foi avaliada por SDS-PAGE usando 4-15% CriterionTM TGXTM Precast Midi Protein gel, em condições não redutoras (Bio-Rad), a eletroforese foi realizada por 1 h a 100 V e o gel foi corado usando Pierce ™ Silver Stain Kit (Thermo Fisher Scientific), a quantidade de proteína celular VERO residual foi quantificada por Ensaio Imunoenzimétrico de Proteínas de Células Hospedeiras de Células VERO, a pureza e identidade do antígeno também foram realizadas por meio de análise de espectrometria de massa. Item 13. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com os Itens 1 a 12, em que a qualidade do antígeno foi analisada com base na preservação do antígeno após o processo de inativação por Western blotting, em que, 400 μL do antígeno purificado e inativado foram submetidos a SDS-PAGE, e as proteínas transferidas para membrana de nitrocelulose por 1 h em corrente de 90 V - 150 mA, a membrana foi bloqueada com a solução de bloqueio por 3 h à temperatura ambiente, sob agitação, em seguida, a membrana foi lavada com tampão de fosfato mais Tween 20 a 0,05% (3 x 5 min), seguido de incubação com anticorpo monoclonal de coelho [CR3022] para SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein (Abcam - Ab273074) e anticorpo policlonal de coelho para Proteína SARS -CoV-2 N, diluída em diluente de amostra, por 1 h, o anticorpo IgG anti-coelho de cabra marcado com peroxidase (KPL) foi usado para marcação e a membrana foi revelada com substrato quimioluminescente Super sinal West pico (ThermoFisher). Item 14. Antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV- 2, inativado em que é obtido pelo processo conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 13. Item 15. Composição antigênica em que compreende o antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2, inativado conforme definido pelo Item 14 e um veículo, excipiente, diluente farmaceuticamente aceitável. Item 16. Uso do antígeno, correspondente aos vírus SARS- COV-2, inativado conforme definido pelo Item 14 ou da Composição antigênica conforme definido pelo Item 15 em que é para a produção de uma composição imunizante para induzir a produção de soro hiperimune compreendendo imunoglobulina em animais. Item 17. Uso do antígeno, correspondente aos vírus SARS- COV-2, de acordo com o Item 16, em que a imunoglobulina é, preferencialmente, imunoglobulina equina anti-SARS-CoV-2. Item 18. Uso do antígeno, correspondente aos vírus SARS- COV-2 inativado conforme definido pelo Item 14, em que é em diferentes espécies animais para produção de anticorpos/insumos à pesquisa e kits de sorodiagnóstico. Item 19. Uso do antígeno, correspondente aos vírus SARS- COV-2 inativado conforme definido pelo Item 14, em que é para a preparação de uma composição destinada à imunização para a proteção do indivíduo ou animal imunizado. Item 20. Processo para produção de imunoglobulina anti- SARS-CoV-2 através da imunização de diferentes espécies animais com o antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado conforme definido pelo Item 14 em que compreende as seguintes etapas: a) administrar o antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado conforme definido pela reivindicação 14 ou a Composição antigênica conforme definido pela reivindicação 15 a uma espécie animal; b) coletar plasma hiperimune de uma amostra obtida da imunização da dita espécie animal; c) purificar as imunoglobulinas; d) avaliar os títulos de anticorpos séricos. Item 21. Processo para produção de imunoglobulina anti- SARS-CoV-2, de acordo com o Item 20, em que a imunização para produção de imunoglobulina anti-SARS-CoV-2 é, preferencialmente, em cavalos. Item 22. Processo para produção de imunoglobulina anti- SARS-CoV-2, de acordo com o Item 20, em que o pool de plasma inicial foi submetido ao fracionamento por precipitação com sulfato de amônio, em que o precipitado foi centrifugado e a fração líquida foi descarregada, onde o produto foi então solubilizado e o pH foi ajustado para a digestão enzimática pela pepsina para hidrolisar as proteínas não IgG e clivar a molécula em fragmentos F(ab')2, removendo o fragmento Fc. Item 23. Processo para produção de imunoglobulina anti- SARS-CoV-2, de acordo com o Item 20, em que uma segunda precipitação foi realizada adicionando sulfato de amônio e o pH foi ajustado com adição de ácido caprílico e agitação, em seguida, a termocoagulação a 56o C separou as proteínas termolábeis inespecíficas e o precipitado foi eliminado, em que o sobrenadante foi submetido à diafiltração, cromatografia de troca iônica e concentrado por ultrafiltração tangencial; fenol foi adicionado como conservante e a concentração de cloreto foi ajustada, onde a solução F(ab')2 foi então submetida a filtração de 0,22 μm e mantida em recipientes descartáveis. Item 24. Processo para produção de imunoglobulina anti- SARS-CoV-2, de acordo com qualquer um dos Itens 20 a 23, em que o perfil de proteína do produto final foi analisado usando SDS-PAGE (12,5%) em condições de redução, onde para avaliar a existência de quaisquer produtos proteolíticos, a amostra foi incubada a 37° C por 30 min, 1 h, 2 h ou 3 h e submetida a SDS-PAGE, em que os géis foram corados usando corante Coomassie Blue (40% de metanol, 10% de ácido acético e 0,25% de azul de Coomassie) e destinados usando metanol 40% com 10% de ácido acético. Item 25. Processo para produção de imunoglobulina anti- SARS-CoV-2, de acordo com os Itens 20 a 24, em que foi utilizado ELISA para detecção de IgG anti-SARS-CoV-2 para avaliar os títulos de anticorpos séricos obtidos, placas ELISA (Costar®) foram revestidas com 100 μL de SARS-CoV-2 purificado e inativado (4,2 x 104 vírus / mL) e incubadas durante a noite a 4° C. as placas foram então bloqueadas com 5% de BSA em 1X PBS por 2 h a 37° C e incubadas com diluições crescentes de amostras de soro não imunes ou experimentais por 1 h em temperatura ambiente, após a incubação, as placas foram lavadas com PBS-Tween 20 0,05% e incubadas com anticorpos IgG-HRPO anti-camundongo (1:2000) ou IgG-HRPO anti-cavalo (1:5000) em BSA / PBS 0,1%, a seguir, as placas foram lavadas e as reações desenvolvidas com substrato TMB (BD OptEIA™), as absorvâncias foram registradas em um leitor de ELISA (espectrofotômetro BioTek Elx800) a 450 nm, onde o título foi estabelecido como a diluição de soro mais alta em que a absorbância medida foi duas vezes mais alta do que a determinada para soro normal de camundongo (grupo de controle) ou para plasma de cavalo pré-imune. Item 26. Processo para produção de imunoglobulina anti- SARS-CoV-2, de acordo com os Itens 20 a 25, em que foi efetuado teste de neutralização de vírus baseado em efeito citopático (CPE-VNT), em que para avaliar os títulos de anticorpos séricos, o CPE-VNT foi realizado com o uso da variante B.1.1.28 do tipo selvagem SARS-CoV-2 (SARS-CoV- 2/humano/BRA/SP02/2020 (MT126808.1), onde o produto final (soro anti-SARS-CoV-2 equino) também foi testado contra a variante P.1./Gamma SARS-CoV-2 (cepa IMT 87201) e variante P.2./Zeta (hCoV-19 / Brasil / RS-00601/2020 - LMM- EPI_ISL_779155, em que os ensaios foram realizados em placas de 96 poços semeadas de 24 a 28 h antes com 2 x 104 células / poço de células VERO (ATCC CCL-81.4.), onde uma diluição em série de cada soro (1:20 a 1: 40960) em DMEM com 2,5% de FBS foi realizada e então 100 TCID50 do vírus (v/v), a mistura de vírus / soro foi incubada a 37° C por 1 h para permitir a neutralização do vírus, em seguida, a mistura foi transferida para a monocamada de células VERO confluentes e incubada por 72 h a 37° C, sob 5 % CO2, após o período de incubação, as placas foram inspecionadas novamente microscopicamente para CPE causado por SARS-CoV-2 e subsequentemente coradas com 0,2% de solução de azul de naftol preto e analisadas para confirmar o título. Item 27. Processo para produção de imunoglobulina anti- SARS-CoV-2, de acordo com os Itens 20 a 26, em que os títulos médios de anticorpos neutralizantes contra três variantes variam de 1120 a 2140 para a variante B.1.1.28; de 100 a 200 para variante P.1. gama e de 1120 a 2560 para a variante P.2./Zeta. Item 28. Composição vacinal compreendendo a imunoglobulina anti-SARS-CoV-2 obtida pelo processo conforme definido por qualquer um dos Itens 20 a 27 e um veículo, excipiente, diluente, adjuvante farmaceuticamente aceitável. Item 29. Uso da composição vacinal conforme definido pelo Item 28, em que é para a preparação de um medicamento para tratamento de pacientes com infecção por COVID-19. Item 30. Kit de diagnóstico para COVID-19 compreendendo a composição antigênica conforme definida pelo Item 14 e um diluente e/ou marcador. Item 31. Kit compreendendo a composição vacinal conforme definida pelo Item 28 e um diluente e/ou adjuvante. Item 32. kit imunizante compreendendo a composição antigênica conforme definida pelo Item 14 e um diluente. Item 33. Método para induzir a produção do soro hiperimune compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2, inativado conforme definido pelo Item 14 ou da Composição antigênica conforme definido pelo Item 15 em animais Item 34. Método de tratamento de pacientes com infecção por COVID-19 compreendendo a administração de uma quantidade eficaz da imunoglobulina anti-SARS-CoV-2 obtida pelo processo conforme definido por qualquer um dos Itens 20 a 27 ou da composição vacinal conforme definido pelo Item 28 no paciente. Item 35. Método de prevenção de infecção por COVID-19 compreendendo a administração de uma quantidade eficaz da imunoglobulina anti-SARS-CoV-2 obtida pelo processo conforme definido por qualquer um dos Itens 20 a 27 ou da composição vacinal conforme definido pelo Item 28 ao paciente. Item 36. Método de diagnóstico de COVID-19 compreendendo colocar antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2, inativado obtido pelo processo conforme definido por qualquer um dos Itens 1 a 13 ou a composição antigênica conforme definido pelo Item 14 em contato com uma amostra do paciente.

[00200] Assim, embora tenham sido mostradas apenas algumas concretizações e exemplificações da presente invenção, será entendido que várias omissões, substituições e alterações no processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus sars-cov-2 inativado da presente invenção podem ser feitas por um técnico versado no assunto, sem se afastar do espírito e escopo da presente invenção.

[00201] É expressamente previsto que todas as combinações dos elementos que desempenham a mesma função substancialmente da mesma forma, para alcançar os mesmos resultados, estão dentro do escopo da invenção. Substituições de elementos de uma concretização descrita para outra são também totalmente pretendidas e contempladas.

[00202] Também é preciso entender que os desenhos não estão necessariamente em escala, mas que eles são apenas de natureza conceitual. A intenção é, portanto, ser limitada, tal como indicado pelo escopo das reivindicações anexas.

REFERÊNCIAS

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Claims

1. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado compreendendo as seguintes etapas a) cultivo e multiplicação do vírus SARS-CoV-2 em células de mamíferos, b) coleta, c) purificação do vírus, em que a etapa de purificação é a remoção de restos celulares e outras partículas microscópicas por meio de clarificação, onde o processo de clarificação poderá ser realizado por centrifugação convencional ou de fluxo contínuo; ultracentrifugação; remoção auxiliada por cargas iônicas ou magnetismo; sedimentação ou precipitação; filtração, preferencialmente, a remoção das partículas é realizada por meio de filtração; outra etapa de purificação consiste na redução de contaminantes do material através de processos de cromatografia de diversos tipos, mas, não se limitando a troca iônica, exclusão molecular, afinidade, imunoafinidade, isoelétrica, fase reversa, d) estabilização viral, e e) inativação viral caracterizado pelo fato de que a inativação viral é por irradiação gama, a qual é realizada, preferencialmente, pela aplicação de 15 kGy (kilo Grays), e mantendo sua imunogenicidade, onde o vírus inativado por irradiação gama é imunogênico, induzindo um aumento na produção de anticorpos ao longo do tempo de imunização.

2. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (a) células Vero (ATCC CCL-81.4) foram semeadas e cultivadas por 48 h antes da infecção, em que o SARS-CoV-2 foi inoculado a um MOI de 0,1 em 5 mL de meio de cultura e deixado adsorver por uma hora a 37 ° C, meio isento de soro foi adicionado às culturas até atingir o volume de 100 mL.

3. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as culturas foram incubadas a 37° C, CO2 a 5%, durante 48 h.

4. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que SARS-CoV-2 ativo foi clarificado por meio de filtração de 0,22 μm (Opticap XL2 Durapore, MerckMillipore) e agrupado para a etapa (c) de purificação.

5. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o material clarificado foi concentrado por filtração de fluxo tangencial (TFF) usando um sistema Minipellicon com uma membrana Ultracell 300 kDa, em que o concentrado foi submetido a duas rodadas de ultracentrifugação (XPN 90, BeckmanCoulter) em gradientes de sacarose (65% - 34%) utilizando um rotor zonal Ti15 por 3 h a 4° C e 25 krpm, as frações contendo o vírus purificado foram reunidas após cada procedimento de ultracentrifugação.

6. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o material purificado final foi diluído com 1X PBS para uma concentração de sacarose de 20%, esterilizado por filtração (0,22 μm) e congelado a -80° C.

7. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a eficácia do processo de inativação do SARS-CoV-2 foi avaliada pela detecção do efeito citopático e análise cinética do RNA viral subgenômico por RT-qPCR no VERO CCL 81.4. após a inoculação do antígeno SARS-CoV-2.

8. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que alíquotas de 0,1 mL do vírus inativado foram incubadas com 1E + 05 VERO CCL - 81,4 células por 1 h a 37 ° C, seguido pela adição de 1,4 mL de meio de cultura DMEM + SFB 10%, as placas foram incubadas por 72 horas e, na ausência de efeito citopático, uma alíquota de 0,1 mL do sobrenadante foi transferida para uma nova cultura de células VERO CCL 81,4 para a segunda passagem, o procedimento foi repetido pelo menos mais uma vez.

9. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 8, caracterizado pelo fato de que para a análise cinética do RNA viral subgenômico, 1 mL do vírus inativado foi inoculado em alíquotas de 0,1 mL em dez poços de uma placa de 12 poços contendo células VERO por 72 h, o sobrenadante de todos os poços foi reunido e alíquotas de 0,1 mL foram colocadas em um novo poço de uma placa de 12 poços para a segunda passagem em células VERO.

10. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a pureza das amostras de vírus inativadas foi avaliada por SDS-PAGE usando 4-15% CriterionTM TGXTM Precast Midi Protein gel, em condições não redutoras (Bio-Rad), a eletroforese foi realizada por 1 h a 100 V e o gel foi corado usando kit de coloração em prata , a quantidade de proteína celular VERO residual foi quantificada por Ensaio Imunoenzimétrico de Proteínas de Células Hospedeiras de Células VERO, a pureza e identidade do antígeno também foram realizadas por meio de análise de espectrometria de massa.

11. Processo de produção de um antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a qualidade do antígeno foi analisada com base na preservação do antígeno após o processo de inativação por Western blotting, em que, 400 μL do antígeno purificado e inativado foram submetidos a SDS-PAGE, e as proteínas transferidas para membrana de nitrocelulose por 1 h em corrente de 90 V - 150 mA, a membrana foi bloqueada com a solução de bloqueio por 3 h à temperatura ambiente, sob agitação, em seguida, a membrana foi lavada com tampão de fosfato mais Tween 20 a 0,05% (3 x 5 min), seguido de incubação com anticorpo monoclonal de coelho [CR3022] para SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein (Abcam - Ab273074) e anticorpo policlonal de coelho para Proteína SARS -CoV-2 N, diluída em diluente de amostra, por 1 h, o anticorpo IgG anti-coelho de cabra marcado com peroxidase (KPL) foi usado para marcação e a membrana foi revelada com substrato quimioluminescente Super sinal West pico (ThermoFisher).

12. Composição antigênica caracterizada pelo fato de que compreende o antígeno, correspondente aos vírus SARS- COV-2, inativado obtido pelo processo conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 11e um veículo, excipiente, diluente farmaceuticamente aceitável.

13. Uso do antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV- 2, inativado obtido pelo processo conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ou da composição antigênica conforme definido pela reivindicação 12 caracterizado pelo fato de que é para a produção de uma composição imunizante para induzir uma resposta imune contra o vírus SARS-COV-2 em animais.

14. Uso do antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV- 2, de acordo com a reivindicação 13 caracterizado pelo fato de que um soro hiperimune compreendendo imunoglobulina é produzido a partir da resposta imune.

15. Uso do antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV- 2 inativado conforme definido pela reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é em diferentes espécies animais para produção de anticorpos/insumos à pesquisa e kits de sorodiagnóstico.

16. Uso do antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV- 2 inativado conforme definido pela reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição destinada à imunização para a proteção do indivíduo ou animal imunizado.

17. Processo para produção de imunoglobulina anti-SARS- CoV-2 através da imunização de diferentes espécies animais com o antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado obtido pelo processo conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 13 caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) administrar o antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2 inativado obtido pelo processo conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ou a composição antigênica conforme definido pela reivindicação 12 a uma espécie animal; b) coletar plasma hiperimune de uma amostra obtida da imunização da dita espécie animal; c) purificar as imunoglobulinas; d) avaliar os títulos de anticorpos séricos.

18. Processo para produção de imunoglobulina anti-SARS- CoV-2, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a imunização para produção de imunoglobulina anti-SARS-CoV-2 é, preferencialmente, em cavalos.

19. Processo para produção de imunoglobulina anti-SARS- CoV-2, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o pool de plasma inicial foi submetido ao fracionamento por precipitação com sulfato de amônio, em que o precipitado foi centrifugado e a fração líquida foi descarregada, onde o produto foi então solubilizado e o pH foi ajustado para a digestão enzimática pela pepsina para hidrolisar as proteínas não IgG e clivar a molécula em fragmentos F(ab')2, removendo o fragmento Fc.

20. Processo para produção de imunoglobulina anti-SARS- CoV-2, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que uma segunda precipitação foi realizada adicionando sulfato de amônio e o pH foi ajustado com adição de ácido caprílico e agitação, em seguida, a termocoagulação a 56o C separou as proteínas termolábeis inespecíficas e o precipitado foi eliminado, em que o sobrenadante foi submetido à diafiltração, cromatografia de troca iônica e concentrado por ultrafiltração tangencial; fenol foi adicionado como conservante e a concentração de cloreto foi ajustada, onde a solução F(ab')2 foi então submetida a filtração de 0,22 μm e mantida em recipientes descartáveis.

21. Processo para produção de imunoglobulina anti-SARS- CoV-2, de acordo com qualquer umas das reivindicações 17 a 20, caracterizado pelo fato de que o perfil de proteína do produto final foi analisado usando SDS-PAGE (12,5%) em condições de redução, onde para avaliar a existência de quaisquer produtos proteolíticos, a amostra foi incubada a 37° C por 30 min, 1 h, 2 h ou 3 h e submetida a SDS-PAGE, em que os géis foram corados usando corante Coomassie Blue (40% de metanol, 10% de ácido acético e 0,25% de azul de Coomassie) e destinados usando metanol 40% com 10% de ácido acético.

22. Processo para produção de imunoglobulina anti-SARS- CoV-2, de acordo com as reivindicações 17 a 21, caracterizado pelo fato de que foi utilizado ELISA para detecção de IgG anti-SARS-CoV-2 para avaliar os títulos de anticorpos séricos obtidos, placas ELISA foram revestidas com 100 μL de SARS-CoV-2 purificado e inativado (4,2 x 104 vírus / mL) e incubadas durante a noite a 4° C. as placas foram então bloqueadas com 5% de BSA em 1X PBS por 2 h a 37° C e incubadas com diluições crescentes de amostras de soro não imunes ou experimentais por 1 h em temperatura ambiente, após a incubação, as placas foram lavadas com PBS-Tween 20 0,05% e incubadas com anticorpos IgG-HRPO anti-camundongo (1:2000) ou IgG-HRPO anti-cavalo (1:5000) em BSA / PBS 0,1%, a seguir, as placas foram lavadas e as reações desenvolvidas com substrato TMB, as absorvâncias foram registradas em um leitor de ELISA a 450 nm, onde o título foi estabelecido como a diluição de soro mais alta em que a absorbância medida foi duas vezes mais alta do que a determinada para soro normal de camundongo (grupo de controle) ou para plasma de cavalo pré-imune.

23. Processo para produção de imunoglobulina anti-SARS- CoV-2, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 22, caracterizado pelo fato de que foi efetuado teste de neutralização de vírus baseado em efeito citopático (CPE- VNT), em que para avaliar os títulos de anticorpos séricos, o CPE-VNT foi realizado com o uso da variante B.1.1.28 do tipo selvagem SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2/humano/BRA/SP02/2020 (MT126808.1), onde o produto final (soro anti-SARS-CoV-2 equino) também foi testado contra a variante P.1./Gamma SARS- CoV-2 (cepa IMT 87201) e variante P.2./Zeta (hCoV-19 / Brasil / RS-00601/2020 - LMM- EPI_ISL_779155, em que os ensaios foram realizados em placas de 96 poços semeadas de 24 a 28 h antes com 2 x 104 células / poço de células VERO (ATCC CCL- 23.4. ), onde uma diluição em série de cada soro (1:20 a 1: 40960) em DMEM com 2,5% de FBS foi realizada e então 100 TCID50 do vírus (v/v), a mistura de vírus / soro foi incubada a 37° C por 1 h para permitir a neutralização do vírus, em seguida, a mistura foi transferida para a monocamada de células VERO confluentes e incubada por 72 h a 37° C, sob 5 % CO2, após o período de incubação, as placas foram inspecionadas novamente microscopicamente para CPE causado por SARS-CoV-2 e subsequentemente coradas com 0,2% de solução de azul de naftol preto e analisadas para confirmar o título.

24. Processo para produção de imunoglobulina anti-SARS- CoV-2, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 23, caracterizado pelo fato de que os títulos médios de anticorpos neutralizantes contra três variantes variam de 1120 a 2140 para a variante B.1.1.28; de 100 a 200 para variante P.1. gama e de 1120 a 2560 para a variante P.2./Zeta.

25. Composição vacinal caracterizada pelo fato de que compreende a imunoglobulina anti-SARS-CoV-2 obtida pelo processo conforme definido por qualquer uma das reivindicações 17 a 24 e um veículo, excipiente, diluente, adjuvante farmaceuticamente aceitável.

26. Uso da composição vacinal conforme definida pela reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para tratamento de pacientes com infecção por COVID-19.

27. Kit de diagnóstico para COVID-19 caracterizado pelo fato de que compreende a composição antigênica conforme definida pela reivindicação 12 e um diluente e/ou marcador.

28. Kit caracterizado pelo fato de que compreende a composição vacinal conforme definida pela reivindicação 25 e um diluente e/ou adjuvante.

29. kit imunizante caracterizado pelo fato de que compreende a composição antigênica conforme definida pela reivindicação 12 e um diluente.

30. Uso do antígeno correspondente aos vírus SARS-COV- 2 inativado conforme obtido pelo processo conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 13ou da composição antigênica conforme definido pela reivindicação 12 caracterizado pelo fato de ser para preparar um medicamento para induzir a produção do soro hiperimune em animais.

31. Uso da imunoglobulina anti-SARS-CoV-2 obtida pelo processo conforme definido por qualquer uma das reivindicações 17 a 24 ou da composição vacinal conforme definido pela reivindicação 25 caracterizado pelo fato de ser para preparar um medicamento para tratar infecção por COVID-19.

32. Uso da imunoglobulina anti-SARS-CoV-2 obtida pelo processo conforme definido por qualquer uma das reivindicações 17 a 24 ou da composição vacinal conforme definido pela reivindicação 25 caracterizado pelo fato de ser para preparar um medicamento para prevenção de infecção por COVID-19.

33. Método de diagnóstico de COVID-19 caracterizado pelo fato de que compreende colocar antígeno, correspondente aos vírus SARS-COV-2, inativado obtido pelo processo conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ou a composição antigênica conforme definido pela reivindicação 12 em contato com uma amostra do paciente.