ES2353208T3 - Extracto dializado de leucocitos para el tratamiento de enfermedades infecciosas en animales. - Google Patents
Extracto dializado de leucocitos para el tratamiento de enfermedades infecciosas en animales. Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención consiste en un compuesto farmacológico elaborado con el extracto soluble dializado de leucocitos lisados de origen animal, los cuales se obtienen de tejido sanguíneo o linfático de animales domésticos sensibilizados ó no sensibilizados con antígenos específicos para su aplicación en animales en el tratamiento de enfermedades infecciosas, tales como moquillo canino.
Description
Extracto dializado de leucocitos para el
tratamiento de enfermedades infecciosas en animales.
La presente invención se refiere al sector del
tratamiento de enfermedades infecciosas mediante la transferencia y
estimulación de inmunidad mediada por células a través de extractos
de leucocitos dializados, así como métodos de obtención y
preservación del extracto.
Las enfermedades siempre han sido parte de la
experiencia de la vida humana y animal. Desde el establecimiento de
las bases para la prevención y tratamiento de las infecciones se han
implementado terapias eficaces contra la mayoría de las
enfermedades.
A pesar de todos los adelantos en el tratamiento
de enfermedades en animales, no existían, hasta antes de la
presente invención, tratamientos terapéuticos efectivos contra
ciertos tipos, tales como aquellos en los que el pronóstico es poco
favorable para el animal después de que aparecen los signos típicos
de la enfermedad, con lo cual el paciente tiene pocas
probabilidades de sobrevivir. En estos casos, el tratamiento se
había limitado a tratar de conservar al animal en el mejor estado
fisiológico posible a fin de permitir que su propio sistema
inmunológico fuese capaz de responder. Ejemplos de estas
enfermedades son la enfermedad de Aujesky y el moquillo
canino.^{1}
El moquillo canino representa hasta el día de
hoy, una de las enfermedades domésticas más importantes a nivel
doméstico y de diseminación mundial.
El moquillo canino es una enfermedad sistémica,
infecciosa, altamente contagiosa e inmunosupresora, de evolución
aguda o subaguda, con signos clínicos respiratorios,
gastrointestinales y neurológicos. Esta dolencia tiene un alto
índice de mortalidad que afecta a perros y otros carnívoros en todo
el mundo y se transmite por un agente viral. Es la enfermedad viral
más prevaleciente en los perros y se considera que hay pocos en el
mundo que viven en zonas aisladas y que no han sido expuestos o
infectados con el virus.
El contagio se produce principalmente al
propagarse el virus por el aire o por el contacto directo con perros
infectados, replicándose así en los tejidos linfoides sistémicos,
provocando fiebre, viremia y la diseminación a los tejidos
epiteliales y al sistema nervioso central; la evolución depende de
la cantidad del inóculo, la cepa viral y la respuesta inmunológica
del huésped. La enfermedad presenta signos multisistémicos, fiebre
y un alto porcentaje de mortalidad; una vez que los signos clínicos
característicos del moquillo canino se hacen evidentes, el
pronóstico es extremadamente pobre, la mayoría de ellos progresan de
manera desfavorable, independientemente del tratamiento y de los
periodos de mejoría aparente; como consecuencia, los animales mueren
con o sin signos neurológicos.
El moquillo canino es la enfermedad
infectocontagiosa con los mayores índices de morbilidad en los
perros, la cual oscila entre el 25 y el 50%. La mortalidad es tan
alta como del 50 al 100% de los casos dependiendo de la cepa viral,
el tipo de población canina afectada, la edad de los perros, el
estado de inmunización poblacional y la respuesta inmunológica de
los animales. La rabia es la única enfermedad que tiene un índice de
mortalidad mayor al del moquillo canino, ya que éste es siempre del
100%.
Antes de la presente invención, no existía un
tratamiento específico para esta enfermedad. El tratamiento
consistía únicamente en la administración de fármacos
quimioterapéuticos, de tal manera que el tratamiento se limitaba a
la restauración de medidas sintomáticas y la eutanasia una vez que
se observaban signos neurológicos. Durante la evolución de la
enfermedad, es posible que ocurra la recuperación espontánea de
algunos perros con moquillo sistémico no nervioso, con la
aplicación de medidas terapéuticas sintomáticas, lo que puede
otorgar créditos inapropiados a determinados regímenes
terapéuticos.^{2,3,4,5,6,7}
Al igual que en el moquillo canino, en diversas
enfermedades infecto-contagiosas, se observa una
afectación importante en la respuesta del sistema inmunológico, lo
que permite una evolución mayor de la enfermedad.
Dentro de los factores que pueden causar o
favorecer la inmunodeficiencia en los animales, están la
desnutrición grave, la quimioterapia citotóxica, la superpoblación
así como cualquier otra causa que provoque estrés intenso o
prolongado, por citar algunas. La inmunosupresión genera varios
efectos, tales como una mayor frecuencia de infecciones de tipo
severo, parasitosis, infecciones bacterianas o virales persistentes
o recurrentes, poca o ninguna respuesta al tratamiento adecuado y
la infección por microorganismos no patógenos. Se han realizado
estudios exhaustivos en relación al funcionamiento del sistema
inmune en animales y el papel que éste juega en los organismos para
combatir las infecciones. Entre las diversas líneas de investigación
que se han estudiado en este sentido, está el estudio de la
transferencia de inmunidad de un organismo a otro a través de
diversas estrategias, que involucran principalmente fluidos o
células del sistema inmunológico.
Landsteiner y Chase describieron la
transferencia de inmunidad que podría realizarse a través de células
de cobayas sensibilizadas donantes a cobayas receptoras no
sensibilizadas, al inducir alergias por contacto al cloruro de
picrilo inyectando células de exudado peritoneal de los animales
sensibilizados en la piel de los animales receptores. Más tarde
demostraron que la inyección intradérmica de leucocitos aislados de
exudado peritoneal inducido en cobayas sensibilizadas a la
tuberculina puede producir hipersensibilidad cutánea específica
"retardada" a la tuberculina en cobayas no sensibilizadas. En
ese mismo trabajo se intentó realizar la transferencia de esta
reactividad utilizando suero y células muertas, sin buenos
resultados. Posteriormente se determinó que bajo ciertas
condiciones era posible transferir la hipersensibilidad por contacto
de cobayas sensibilizadas con antígenos del veneno de hiedra
venenosa a cobayas receptoras no sensibilizadas, mediante la
inyección de células linfoides muertas. Asimismo en experimentos
posteriores se lograron resultados semejantes en la transferencia
de inmunidad celular mediante la utilización de clorodinitrobenceno
como antígeno y extractos leucocitarios como vehículo de
transferencia.
Lawrence revela que la inyección intradérmica de
leucocitos viables obtenidos de donantes humanos positivos a la
intradermorreacción con tuberculina en personas negativas al citado
antígeno, puede inducir hipersensibilidad cutánea pasiva; también
menciona que la hipersensibilidad cutánea transferida es transitoria
con una duración de cuatro días a tres meses.^{8} Posteriormente
confirma que el grado de duración del estado sensitivo transferido
guarda una relación con el grado de sensibilización del leucocito
donante y la cantidad de leucocitos utilizados; asimismo, que la
sensibilidad retardada inducida tras la inyección de lisados de
leucocitos es similar a la observada con la inyección de leucocitos
viables.^{9} Hasta ese momento el significado de la transferencia
de la hipersensibilidad cutánea era desconocido y, en consecuencia,
estos trabajos recibieron poca atención. Los resultados obtenidos
por Lawrence, relacionados con el extracto dializado de leucocitos
(EDL) fueron vistos con escepticismo por algunos inmunólogos y se
propusieron explicaciones alternativas. Una se basó en el punto de
que Lawrence en sus experimentos siempre utilizaba antígenos de
agentes infecciosos o componentes de vacunas comunes y que el
organismo receptor reaccionaba por sensibilización primaria; también
se propuso que los contenidos de receptores en los extractos
dializados de leucocitos ya estaban sensibilizados a los antígenos y
el extracto dializado actuaba como refuerzo o amplificador de las
sensibilidades preexistentes. En experimentos posteriores con
antígenos sintéticos y estudios controlados realizados con ratones
fue posible rechazar estas posibilidades. También se postuló que el
dializado contenía fragmentos de antígenos altamente inmunogénicos y
que el extracto dializado de leucocitos producía sus efectos por
sensibilización activa de los receptores, teoría que a la fecha ha
sido desechada.
En la década de los 70 resurge el interés por el
EDL y los factores de transferencia contenidos en él, cuando se
observó que su aplicación en personas con determinados síndromes de
inmunodeficiencia de origen genético, tales como el síndrome
Wiskott-Aldrich, mejoraba los parámetros clínicos e
inmunológicos. Con ello se inició la investigación clínica con la
aplicación del extracto dializado de leucocitos.^{10}
En el área clínica de la medicina humana se ha
descrito la utilización del EDL para el tratamiento de diversas
enfermedades, tales como las infecciones por virus herpes simplex,
viruela^{11}, sarampión, afecciones dermatológicas del tipo de
melasma, acné, condilomatosis y papilomatosis.^{12} También ha
mostrado eficacia contra las infecciones por Candida
albicans,^{13} Varicella zoster,^{14}
Cryptosporidium spp,^{15,16} Mycobacterium
tuberculosis^{17} y Actinobacillus
pleuropneumoniae.
En animales se ha descrito la transferencia de
hipersensibilidad retardada en diversas enfermedades. Para el caso
de cerdos en colibacilosis, enfermedad de Aujesky, cólera porcino y
gastroenteritis transmisible; en bovinos en rinotraqueitis
infecciosa, salmonelosis y paratuberculosis; en pollos en enfermedad
de Newcastle, laringotraquitis infecciosa, enfermedad de Marek y
coccidiosis; y en conejos en catarro infeccioso.
Sin embargo, en múltiples estudios realizados en
animales y seres humanos para fines terapéuticos utilizando el
extracto dializado, se ha observado una gran heterogeneidad en los
resultados obtenidos, dado que no se reportan tratamientos que
funcionen de manera consistente en un alto porcentaje de los
pacientes y en los cuales se observe una recuperación total del
estado de salud; tal es el caso de infecciones ocasionadas por
Candida albicans,^{18,19} Leismania y
Salmonella.^{20} En algunos casos, la aplicación del
extracto a enfermos con infecciones crónicas o recurrentes se ha
realizado como un último esfuerzo en pacientes en los cuales los
tratamientos han fracasado sin obtener resultados positivos en su
recuperación, observándose incluso la muerte.^{21}
Según lo reportado hasta la actualidad, el éxito
de tales terapias depende de múltiples factores, desde el estado de
salud del paciente (incluyendo la fase de evolución de la
enfermedad), la enfermedad en sí, e incluso la fuente de la cual se
obtuvo el extracto de leucocitos;^{22} en este sentido, la previa
sensibilización del donante de leucocitos a los antígenos
específicos implicados en la enfermedad que será tratada en los
pacientes, es un factor determinante para la observación de los
efectos terapéuticos.^{23,24,34}
En relación al extracto de leucocitos, estudios
posteriores permitieron determinar algunas de sus propiedades, las
cuales ubicaban al extracto como dializable, termoestable,
resistente a la congelación y al tratamiento con ADNasa, ARNasa o
tripsina,^{25} que contenía moléculas de un peso molecular menor a
10.000 Daltones,^{26} adenina, guanina, citosina, uracilo y
ribofosfato en material polinucleotídico^{27,28} y pequeños
polipéptidos.
Posteriormente se determinó que el extracto
contiene más de 200 moléculas diferentes con pesos moleculares de
1.000 a 12.000 Daltones y de las cuales se han podido identificar
algunas (nicotinamida, serotonina, ascorbato, timosina,
prostaglandinas, interleucina-8, factores de
transferencia, hipoxantina y uracilo, entre otras). Asimismo, hasta
el momento se han podido determinar y aislar algunas de estas
moléculas así como fracciones del extracto y estudiar su papel en
los efectos terapéuticos que se han observado derivados de su
aplicación, tales como una fracción denominada
"inmunopéptido"^{29} (responsable de la formación de rosetas
de células T con eritrocitos de carnero), la fracción B consistente
en doce aminoácidos y de tres a cuatro bases de ARN^{30}
(responsable del efecto de hipersensibilidad retardada a receptores
no inmunes), la fracción Tx^{31} (capaz de transferir
hipersensibilidad retardada a cobayas) y péptidos altamente polares,
hidrofílicos y con una actividad biológica muy potente, como por
ejemplo los péptidos LLYAQDLEDN y LLYAQDVEDN.^{32}
Por otro lado, se ha dado a conocer que el
extracto dializado de leucocitos presenta una estabilidad mediana,
conservándose únicamente sus efectos terapéuticos durante varios
meses a temperaturas de -20ºC a -70ºC.^{34} Estos métodos de
conservación del extracto no son fáciles de controlar, aun en
situaciones de administración a pacientes en el campo (en granjas o
zonas rurales donde no existen aparatos de congelación a estas
temperaturas) así como para su venta y distribución al público.
En estudios posteriores, se logró aumentar su
estabilidad al almacenaje a 4ºC mediante la adición al extracto de
albúmina sérica bovina,^{33} con lo cual se adicionan sustancias
que pueden provocar efectos adversos al paciente (transmisión de
enfermedades o incremento de respuestas inmunes al preservador) o
hacer más susceptible de contaminación al extracto.
En cuanto a sus efectos terapéuticos, es
conocido que el extracto dializado de leucocitos tiene muchos
efectos sobre la inmunidad celular ya que contiene factores
inductores y supresores obtenidos de células
t-auxiliares y células t-supresoras
respectivamente. Se ha argumentado que la variedad de actividades
biológicas observadas, se debe a que el extracto contiene una
mezcla heterogénea de moléculas, siendo cada una de ellas
responsable de uno o varios efectos. Las respuestas y efectos
observados en las aplicaciones clínicas del extracto han permitido
ubicarlo como un inmunomodulador útil para la inmunoterapia e
inmunoprofilaxis de enfermedades donde la inmunidad celular se
encuentra deprimida de forma primaria o secundaria, así como en
estados morbosos en los que la inmunidad se encuentra exacerbada,
induciendo lesiones por autoinmunidad.
Se ha observado que el extracto dializado de
leucocitos transfiere hipersensibilidad local y sistémica y no
causa reacción incompatible aun entre diversas especies, transfiere
rechazos de haloinjertos, ejerce una acción directa sobre la
producción de interleucina 1, 8 y 12, produce un incremento de la
activación de macrófagos, aumenta la síntesis de ADN antígeno
dependiente de los linfocitos, resintetiza el receptor del factor de
transferencia, promueve la quimiotaxis de monocitos y neutrófilos,
aumenta la actividad de células asesinas naturales (NK), acelera la
formación de rosetas de células T, induce la formación de
poblaciones de linfocitos que reaccionan específicamente ante un
antígeno, expande las poblaciones de linfocitos y la inmunidad
celular, incrementa la producción de linfocinas y aumenta la
citotoxicidad de células T contra antígenos tumorales específicos;
asimismo no se descarta la posibilidad de que cause otros posibles
efectos.^{34}
Hasta la fecha, no se conoce el mecanismo de
acción del EDL por el cual puedan explicarse todos los efectos
observados en sus aplicaciones clínicas.
La presente invención utiliza el EDL como el
principio activo de un medicamento que permite tratar y prevenir
diversas enfermedades infecciosas en animales, preferentemente
aquellas enfermedades que afecten a caninos, equinos y porcinos,
como por ejemplo perros, caballos y cerdos.
La presente invención se sustenta en los
antecedentes documentales del EDL tanto en humanos como en animales,
con la diferencia de que se utiliza con fines terapéuticos, jamás
descritos en Medicina Veterinaria. Se prueba en una amplia gama de
enfermedades de perros, caballos y cerdos, con dosis reducidas que
optimizan su utilización, obtenido de diferentes tejidos y
administrado por vía parenteral con EDL de origen tisular propio y
diferente de la especie receptora. De acuerdo con lo que se ha
descrito anteriormente, uno de los objetivos de la presente
invención es dar a conocer un tratamiento en animales eficaz contra
enfermedades infectocontagiosas con un elevado grado de morbilidad
en fases avanzadas mediante la aplicación de un extracto de
leucocitos dializado, dado que con anterioridad a la presente
invención dicho tratamiento no existía. Un objetivo adicional de la
presente invención es dar a conocer un tratamiento en animales
eficaz contra enfermedades infectocontagiosas que deprime el
sistema inmune mediante la administración de un extracto de
leucocitos dializado.
Un objetivo adicional de la presente invención
es dar a conocer un tratamiento para perros eficaz contra el
moquillo canino con alto grado de morbilidad en fases avanzadas
mediante la aplicación de EDL, ya que con anterioridad a la
presente invención, no se conocían tratamientos eficaces que
permitieran restablecer la salud de los perros después de la
aparición de los signos clínicos de la enfermedad.
Otro objetivo de la presente invención es dar a
conocer un método de obtención de EDL a partir de linfonodos, bazo y
timo con rendimientos mayores a los métodos conocidos hasta la
fecha.
Otro objetivo de la presente invención es dar a
conocer un EDL estable a 4ºC sin utilizar conservantes o
preservantes, con los que se conservan sus propiedades
terapéuticas, ya que con anterioridad a la presente invención no se
habían obtenido extractos dializados de leucocitos estables a esta
temperatura y sin la utilización de sustancias ajenas al extracto.
Esto se logra a través de la esterilización del EDL por ozono.
Otro objetivo de la presente invención es dar a
conocer un kit terapéutico que contiene EDL para el tratamiento de
animales afectados por enfermedades altamente infectocontagiosas con
alto grado de morbilidad en etapas avanzadas.
Los EDL del presente trabajo, pueden utilizarse
para el tratamiento de enfermedades asociadas a inmunodepresión,
tales como las siguientes, las cuales se muestran únicamente para
ilustrar el espectro de aplicación de los extractos sin limitar su
utilización a otras enfermedades o bien a otros animales:
- En bovinos:
- Rinotraqueitis infecciosa bovina (\alphaherpesvirus), mamilitis ulcerativa (\alphaherpesvirus), fiebre catarral maligna (\alphaherpesvirus), enfermedad de Aujesky (\alphaherpesvirus), fiebre catarral maligna (\gammaherpesvirus), peste bovina (morbillivirus), parainfluenza-3 (morbillivirus), virus sincitial bovino (pneumovirus), diarrea neonatal de la ternera (coronavirus), papilomatosis (papilomavirus), leucosis bovina (oncornavirus), septicemia hemorrágica (Pasteurella multocida, Pasteurella hemolytica), pleuroneumonía contagiosa (Mycoplasma mycoides), mastitis bovina (Mycoplasma alkalescens, M. canadense, M. bovis, M. laidlawii), paratuberculosis, tuberculosis, actinomicosis, actinobacilosis, leptospirosis, coccidioidomicosis, coccidiosis, erliquiosis.
- En equinos:
- Rinoneumonitis equina (\alphaherpesvirus, tipo I y IV), exantema coital equino (\alphaherpesvirus, tipo\cdot3), influenza equina (ortomixovirus), parainfluenza-3 (paramixovirus), anemia infecciosa equina (lentivirus), papilomatosis (papilomavirus), histoplasmosis, coccidiosis, erliquiosis, leptospirosis.
- En caninos:
- Moquillo canino (morbillivirus), parainfluenza SV-5 canina (paramixovirus), herpesvirus canino (\alphaherpesvirus), enfermedad de Aujesky (\alphaherpesvirus), papilomatosis (papilomavirus), histoplasmosis, coccidioidomicosis, criptococosis, blastomicosis, criptococosis, aspergilosis, candidiasis, coccidiosis, toxoplasmosis, neosporosis, leishmaniasis, criptosporidiosis, balantidiasis, amibiasis, erliquiosis, leptospirosis, brucelosis.
- En felinos:
- Rinotraqueitis felina (\alphaherpesvirus), urolitiasis felina (\betaherpesvirus), enfermedad de Aujesky (\alphaherpesvirus), peritonitis infecciosa felina (coronavirus), leucemia viral felina (oncovirus).
- En porcinos:
- Herpesvirus del cerdo lactante (\alphaherpesvirus), rinitis atrófica (\betaherpesvirus, Bordetella bronchiséptica, Hemophilus suis, Pasteurella multocida), enfermedad de Aujesky (\alphaherpesvirus), influenza porcina (ortomixovirus), gastroenteritis transmisible (coronavirus), encefalomielitis hemoaglutinante (coronavirus), enfermedad de ojo azul (paramixovirus), neumonía enzootica de los lechones (Mycoplasma hyopneumoniae), disentería porcina (Treponema hyodisenteriae), coccidiosis, balantidiasis, leptospirosis, tuberculosis.
- En ovinos:
- Adenomatosis pulmonar (\gammaherpesvirus), enfermedad de Aujesky (\alphaherpesvirus), parainfluenza-3 (paramixovirus), peste bovina (morbillivirus), septicemia hemorrágica (Pasteurella hemolytica, Pasteurella multocida), enteritis por coronavirus, campilobacteriosis, ectima cotagioso, paratuberculosis, tuberculosis, coccidiosis, micoplasmosis, brucelosis, toxoplasmosis, erliquiosis.
- En aves:
- Laringotraquitis infecciosa (\alphaherpesvirus), enfermedad de Marek (\gammaherpesvirus), peste aviar (ortomixovirus), enfermedad de Newcastle (paramixovirus), Bronquitis infecciosa (coronavirus), leucosis aviar (oncovirus), enfermedad respiratoria crónica (Mycoplasma gallisepticum), sinovitis infecciosa (Mycoplasma sinoviae), coccidiosis, cólera aviar (Pasteurella multocida), aspergillosis.
\vskip1.000000\baselineskip
Asimismo, el EDL de la presente invención posee
características de estabilidad de almacenamiento que le permite
conservar sus propiedades terapéuticas a 4ºC durante un periodo de
12 meses, preferentemente de 7 a 8 meses, mediante la aplicación de
ozono en cantidades de 0,2 a 0,5 ppm, preferentemente hasta 0,3 ppm.
De manera sorprendente, a pesar de que el ozono es una sustancia
altamente reactiva y con propiedades reductoras, las propiedades
terapéuticas del EDL obtenido en este trabajo no se modificaron,
incrementándose únicamente el tiempo de conservación de los
mismos.
Por otra parte, los métodos de obtención de EDL
de la presente invención permiten la obtención de altos rendimientos
a partir de tejidos linfoides, tales como linfonodos, bazo y timo
por ejemplo, ya sea de animales previamente sensibilizados a
antígenos relacionados con la enfermedad a tratarse o de animales no
sensibilizados. Estos métodos permiten obtener EDL con
concentraciones equivalentes a 6 X 10^{6} a 1,6 X 10^{7}
leucocitos/ml a partir de sangre, de 1 X 10^{7} a 8,3 X 10^{7}
leucocitos/g a partir de bazo, de 9 X 10^{6} a 6 X 10^{7}
leucocitos/g a partir de timo y de 1,6 X 10^{7} a 1,8 X 10^{9}
leucocitos/g a partir de linfonodos.
Por otra parte, los métodos de obtención de EDL
de la presente invención permiten obtener una gran cantidad y
variedad de dosis individuales de EDL para ser administradas en
volúmenes pequeños al animal, con lo cual se evitan molestias
innecesarias al paciente por su administración. Asimismo, esto
permite la administración a un mayor número de pacientes y ajustar
la concentración del EDL con una mayor facilidad a las dosis
necesarias según convenga durante el transcurso del tratamiento y
sin obtener volúmenes considerables. Según una de las modalidades
de la presente invención, el volumen obtenido de las dosis de EDL a
administrarse al paciente puede fluctuar de 0,5 a 2 ml por dosis,
preferentemente de 1 a 1,7 ml y más preferentemente de 1,3 a 1,5
ml.
Los rendimientos obtenidos de EDL en el presente
trabajo, permiten obtener dosis individuales para cada esquema de
tratamiento, con lo cual pueden obtenerse kits terapéuticos que
contienen EDL en las cantidades y dosis adecuadas para el
tratamiento de los pacientes. En general, pueden obtenerse kits de 6
a 10 dosis individuales de EDL, preferentemente de 6 a 8 dosis
individuales para las enfermedades mencionadas con anterioridad.
Como una modalidad del kit terapéutico de la
presente invención, los estuches comprenden dosis individuales
iniciales al tratamiento de 3 a 300 veces más altas en concentración
(de 3 X 10^{6} a 5 X 10^{8}) que las dosis proporcionadas
posteriormente (de 1 X 10^{5} a 1,5 X 10^{6}).
En una modalidad preferente de kit terapéutico,
éste puede estar conformado por dosis individuales de EDL en
concentraciones equivalentes a 3 X 10^{6} hasta 5 X 10^{8}
linfocitos. Tales dosis conformarían del 30 al 50% del total de
dosis individuales contenidas en el estuche, mientras que el resto
de las dosis individuales tendrían concentraciones de EDL
equivalentes a 1 X 10^{5} hasta 1,5 X 10^{6} linfocitos,
conformando del 50 al 70% del total de dosis individuales contenidas
en el estuche.
Asimismo, la fuente de obtención del EDL de las
dosis individuales iniciales del estuche, puede ser,
preferentemente, de tejido linfático, preferentemente sanguíneo
linfático y más preferentemente de bazo o timo; en relación a la
fuente de obtención del EDL de las dosis individuales finales del
estuche puede ser de tejido sanguíneo o linfático, preferentemente
sanguíneo. Asimismo, los tejidos sanguíneos o linfáticos a partir de
los que de obtiene el EDL, pueden derivarse de animales previamente
sensibilizados o inmunizados con el antígeno de interés o bien sin
sensibilización o inmunización previa.
La utilización médica de la presente invención
comprende una selección previa de los pacientes a recibir el
tratamiento, proceso en el cual se detectan signos clínicos
importantes de la enfermedad, tales como reacciones positivas a
pruebas de laboratorio, dentro de las que se encuentran solo para
ilustrar la presente invención, las pruebas de aglutinación en
placa, inmunofluorescencia directa en frotis de epitelio,
microaglutinación sérica directa, examen coproparasitoscópico,
seroneutralización, aislamiento bacteriano y diagnóstico
anatomopatológico y microbiológico, entre otros.
El esquema de tratamiento desarrollado en el
presente trabajo comprende la administración del EDL al paciente en
dosis equivalentes a 1,0 X 10^{5} leucocitos hasta 5 X 10^{8}
leucocitos por kg de peso, preferentemente a dosis equivalentes a
1,0 X 10^{6} leucocitos hasta 5 X 10^{8} leucocitos por kg de
peso o bien, más preferentemente a dosis equivalentes a 1,5 X
10^{6} leucocitos hasta 5 X 10^{6} leucocitos por kg de peso.
Tales dosis pueden ser aplicadas en dosis únicas o bien, cada 24 a
96 horas, preferentemente cada 48 horas y hasta un periodo de 15 a
30 días o bien, hasta la completa recuperación del paciente. La
administración del EDL se realiza por vía parenteral, y aunque se
prefiere la vía subcutánea, pueden ser utilizadas otras vías de
administración.
Este esquema permite la administración de
diferentes dosis del EDL con la finalidad de hacer responder al
paciente de manera eficaz y mantener su recuperación hasta el
completo restablecimiento de su estado de salud; por ello, en una
modalidad del método de tratamiento de la presente invención, pueden
administrarse dosis mayores de EDL en el 50% del total de dosis
individuales administradas durante el tratamiento, preferentemente
al inicio del mismo. El resto de las dosis individuales tendrían
concentraciones menores como máximo en el 70% del total de dosis
administradas. Preferentemente, el porcentaje de dosis individuales
con concentraciones mayores al inicio del tratamiento sería del 30
al 50% del total de dosis individuales administradas, mientras que
para dosis individuales con concentraciones menores sería del 50 al
70% del total de dosis individuales administradas. Asimismo la
fuente de obtención del EDL administrado en las fases iniciales del
tratamiento puede ser de tejido linfático, preferentemente
sanguíneo linfático, y más preferentemente de bazo o timo; en
relación a la fuente de obtención del EDL administrado en las fases
finales y de mantenimiento del tratamiento puede ser de tejido
sanguíneo o linfático, preferentemente sanguíneo.
Asimismo, como una modalidad adicional del
tratamiento de la presente invención, pueden administrarse dosis
individuales de la misma concentración equivalente a 1 X 10^{5}
hasta 5 X 10^{8} leucocitos durante el transcurso del
tratamiento, preferentemente a dosis equivalentes a 1 X 10^{6}
hasta 5 X 10^{8} leucocitos o bien, o más preferentemente a dosis
equivalentes a 1,5 X 10^{6} hasta 5 X 10^{6} leucocitos.
Los EDL de la presente invención pueden ser
almacenados en envases diseñados para su aplicación terapéutica,
tales como frascos de vidrio farmacéuticos que permiten su
conservación, o bajo condiciones de refrigeración o congelación.
Los extractos pueden ser obtenidos en forma líquida o bien en forma
sólida después de someterlos a un tratamiento por liofilización u
otro tratamiento que permita conservar sus cualidades terapéuticas.
Si la forma de distribución elegida del EDL al paciente es por
liofilizados, posteriormente el EDL puede ser reconstituido
mediante la adición de agua inyectable estéril o algún otro medio
líquido terapéuticamente conveniente para su administración.
Para los fines de la presente invención, el EDL
puede ser obtenido a través de la siguiente metodología:
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.970000\baselineskip
La elaboración del EDL requiere diversos pasos y
cada uno se puede llevar a cabo con diferentes técnicas de las
cuales se mencionan las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
El EDL puede ser elaborado a partir de los
tejidos de un animal de la misma especie (homólogo) o de otra
especie diferente a la del receptor (heterólogo), por lo que el
individuo donante de linfocitos puede ser de cualquier especie. Si
el objetivo es obtener EDL específico para algún antígeno, se
requiere de la sensibilización antigénica del donante previa a la
obtención de los linfocitos. La sensibilización puede realizarse
inoculando repetidamente el microorganismo patógeno por vía
intranasal, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica, subcutánea
entre otras y obteniendo la muestra de leucocitos cuando se haya
producido una respuesta inmune secundaria adecuada. En caso de
carecer de microorganismo patógeno, se puede sustituir por
aplicaciones en serie de vacuna o bien, bacterias o toxinas
comerciales administradas por las mismas vías. También se puede
determinar la sensibilización antigénica específica por pruebas
inmunológicas específicas, tanto in vitro como in vivo
que demuestren la exposición natural al antígeno específico. Si el
objetivo es realizar EDL inespecífico, no es necesario realizar la
sensibilización previa de los animales.
\vskip1.000000\baselineskip
La recolección de leucocitos se podrá llevar a
cabo a partir de:
- a)
- Sangre, obteniéndose ésta, por ejemplo, por punción cardiaca, de la arteria carótida, femoral, caudal o del seno retro-orbitario, de las venas radial, cefálica, safena, yugular, o bien cualquier otro vaso que pudiera servir para este fin.
- b)
- Órganos linfoides primarios o secundarios, tales como timo, bazo o linfonodos.
\vskip1.000000\baselineskip
En éste sentido y como un resultado de la
presente invención, la utilización de órganos linfoides permite la
obtención de rendimientos significativamente mayores a los obtenidos
por los métodos conocidos utilizando como fuente de obtención tejido
sanguíneo. Sin embargo, para los fines del presente trabajo,
cualquiera de los tejidos mencionados puede ser utilizado para la
obtención de EDL con actividad terapéutica.
La recolección de la sangre puede realizarse en
bolsas para transfusión sanguínea o frascos estériles utilizando
como anticoagulante heparina, ácido cítrico, dextrosa, citrato de
sodio o EDTA. La recolección de órganos se podrá realizar utilizando
bolsas o frascos estériles, se refrigerarán de manera inmediata y
posteriormente se disgregarán mediante macerado y tamizado de los
órganos.
\vskip1.000000\baselineskip
La separación de los leucocitos o linfocitos se
realiza utilizando agentes separadores por gradiente de
concentración como el "ficoll hypacke", por separación manual
con pipetas tras centrifugar las muestras, permitiendo la
sedimentación del paquete celular sanguíneo con la utilización, de
potenciadores de sedimentación, tales como el fibrinógeno y otros, o
sin ellos, o bien a través de la utilización de la prensa francesa o
algún otro medio o metodología conocida para fines de separación
celular.
\vskip1.000000\baselineskip
La lisis de los leucocitos se puede realizar
utilizando métodos de ruptura celular como el ultrasonido,
microondas, agentes químicos, diferenciales de presión osmótica con
agua destilada o utilizando métodos de lisis por cambio de
temperatura y para este fin se puede utilizar la congelación de los
concentrados de leucocitos con nitrógeno liquido, refrigeración a
diversas temperaturas (por ejemplo -20ºC o -70ºC), la congelación
convencional a 4ºC, la mezcla de hielo seco-acetona
y el posterior calentamiento de la muestra en baño maría a 37ºC,
repitiendo el procedimiento las veces que sean necesarias. En todos
los casos se verifica que la lisis se haya completado a través de la
observación microscópica del tejido.
\vskip1.000000\baselineskip
La separación de las moléculas de los lisados de
leucocitos, se puede llevar a cabo a través de membranas de diálisis
con la capacidad de retener moléculas mayores de 10.000 a 12.000
Daltones o utilizando la ultrafiltración con bomba peristáltica y
membranas con microporos menores de 10.000 a 12.000 Daltones. La
diálisis se realiza con agua destilada o bien con algún tampón
convencional.
\global\parskip1.000000\baselineskip
El vehículo empleado para suspender las
moléculas obtenidas en el proceso de separación mediante diálisis
puede ser agua destilada o inyectable y para el proceso de
ultrafiltración solución salina fisiológica, solución salina
tamponada o solución Hartman.
\vskip1.000000\baselineskip
El extracto de leucocitos obtenido es
esterilizado por burbujeo con ozono a 0,3 ppm.
\vskip1.000000\baselineskip
El extracto puede conservarse en refrigeración o
congelación a temperaturas inferiores a 4ºC, ya sea en forma líquida
o después de realizar un proceso de liofilización. Se le puede
adicionar alguna combinación de antibióticos de amplio espectro para
el mismo fin. Asimismo, se deberá envasar en frascos de vidrio
debidamente sellados para su almacenamiento.
Los siguientes ejemplos específicos ilustran la
aplicación de la invención que permite utilizar el EDL para el
tratamiento de diversas enfermedades en animales. Hay que considerar
que otros ejemplos podrían ser aplicados para las enfermedades
infecciosas más comunes en algunas especies animales por alguna
persona con conocimientos medios en la materia, por lo que la
presente invención no se limita a los siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo sangre a partir del animal donante
seleccionado mediante punción con jeringa de la arteria femoral,
vena radial, cefálica, safena o yugular, según las condiciones del
donante. La sangre fue recolectada mediante bolsas de transfusión
comerciales para utilización humana conectadas a la jeringa mediante
mangueras, con capacidad de 500 ml, que contenían citrato de sodio
como anticoagulante. Durante la recolección de la sangre, la bolsa
se mantuvo en constante agitación ligera y por debajo de la zona de
punción. Una vez contenida la sangre dentro de la bolsa, se tomó una
muestra y se realizó un conteo leucocitario mediante observación
microscópica por duplicado, utilizando pipetas de Thomas, líquido de
Turk, y cámara de Newbauer. Después del conteo, la sangre se sometió
a centrifugación a 1.200 rpm durante 20 minutos utilizando una
centrífuga con contenedores con una capacidad de 500 ml.
Una vez terminada la centrifugación, se retiró
la bolsa del contenedor y se colocó en una superficie previamente
esterilizada con cloro y luz ultravioleta, sujetándola con pinzas
quirúrgicas por los 2 extremos superiores de manera que la bolsa
quedara colgando para realizar posteriormente un corte en la parte
antero-superior. La fase final del líquido contenido
en la bolsa fue separada del paquete celular con pipetas de vidrio y
se depositó en un frasco de vidrio con tapa hermética, siendo
congelada finalmente. Los leucocitos obtenidos de este modo fueron
lisados por congelación a -20ºC mediante un congelador comercial y
calentamiento inmediato a 38ºC en baño maría. El proceso de
congelación-descongelación se realizó 10 veces y se
comprobó la existencia de lisis en el 98% de las células mediante
conteo a través de cámara de Newbauer mediante observación
microscópica. La mezcla obtenida se dializó con agua inyectable
guardando una relación entre el volumen de ésta y el volumen
contenido en la bolsa de diálisis de 2:1 respectivamente. La
diálisis se realizó durante 48 horas a 4ºC mediante membranas de
diálisis con capacidad de retención de moléculas mayores a 12.000
Daltones (Sigma 50, diámetro 49 por mm), previamente lavadas y
esterilizadas, colocadas en un frasco de vidrio. Terminado el
proceso de diálisis, se retiró la membrana y el líquido contenido en
el frasco de vidrio fue esterilizado mediante burbujeo con 0,3 ppm
de ozono durante 5 a 10 min. Posteriormente el líquido resultante
fue repartido manualmente con jeringas de plástico en envases de
vidrio con capacidad de 3 ml. Una vez realizado el llenado de 10
frascos, se colocaron tapas de goma estériles y se sellaron con
gárgolas de aluminio. Los frascos con el EDL se almacenaron en
refrigeración o congelación hasta su utilización. Mediante éste
método se obtuvieron de 6.000 a 16.000 leucocitos por \mul de
sangre. Asimismo, en relación al número de dosis a una concentración
equivalente de 1,5 X 10^{6} leucocitos, se obtuvieron 10 dosis por
cada 13,6 ml
de sangre.
de sangre.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recolectó el órgano linfático de interés
(bazo, timo, linfonodos) de individuos sanos los cuales fueron
sometidos a eutanasia con anestésicos, mediante extracción
quirúrgica; una vez separados de residuos de tejido de órganos
circundantes y limpiados con agua destilada, se mantuvieron en
congelación (-17ºC) hasta su procesamiento. El órgano se colocó en
un frasco previamente esterilizado y se adicionaron de 50 a 250 ml
de solución salina fisiológica. Posteriormente se tomó una muestra
de aproximadamente 1 g de peso, la cual se maceró con 1 ml de
solución salina fisiológica utilizando una microrejilla metálica,
tomándose 5 \mul con una pipeta de Thomas y diluyéndose con
líquido de Turk. La muestra se colocó en una cámara de Newbauer y se
realizó un conteo celular mediante microscopía. Al mismo tiempo, el
órgano fue cortado en pequeños trozos con tijeras quirúrgicas y
macerado con una licuadora previamente esterilizada utilizando de 50
a 200 ml de solución salina fisiológica. El macerado resultante se
colocó en frascos de vidrio con tapa hermética y fue congelado.
Los leucocitos obtenidos de este modo fueron
lisados por congelación a -20ºC mediante un congelador comercial y
posterior calentamiento inmediato a 38ºC en baño maría. El proceso
de congelación-descongelación se realizó 10 veces y
se comprobó la existencia de lisis en el 98% de las células mediante
conteo a través de cámara de Newbauer mediante observación
microscópica. La mezcla obtenida se dializó con agua inyectable
guardando una relación entre el volumen de ésta y el volumen
contenido en la bolsa de diálisis de 2:1 respectivamente. La
diálisis se realizó durante 48 horas a 4ºC mediante membranas de
diálisis con capacidad de retención de moléculas mayores a 12.000
Daltones (Sigma 50, diámetro 49 por mm), previamente lavadas y
esterilizadas, colocadas en un frasco de vidrio. Terminado el
proceso de diálisis, se retiró la membrana y el líquido contenido en
el frasco de vidrio fue esterilizado mediante burbujeo con 0,3 ppm
de ozono durante un periodo de 5 a 10 min. Posteriormente el líquido
resultante fue repartido manualmente con jeringas de plástico en
envases de vidrio con capacidad de 3 ml. Una vez realizado el
llenado de 10 frascos, se colocaron tapas de goma estériles y se
sellaron con gárgolas de aluminio. Los frascos con el EDL se
almacenaron en congelación hasta su utilización.
Mediante éste método se obtuvieron de 10.000 a
70.000 leucocitos por \mug de tejido en el caso de bazo, de 9.000
a 60.000 leucocitos por \mug de tejido en el caso de timo y de
16.000 a 230.000 leucocitos por \mug de tejido en el caso de
linfonodos. Asimismo, en relación al número de dosis a una
concentración equivalente de 1,5 X 10^{6} leucocitos, se
obtuvieron 10 dosis por cada 1,8 g de bazo, 10 dosis por cada 4,4 g
de timo y 10 dosis por cada 0,08 g de
linfonodos.
linfonodos.
El EDL se obtuvo a partir de animales
sensibilizados a la enfermedad tratada en el ensayo clínico
correspondiente, previamente al sacrificio se inmunizaron con dosis
de vacuna que contenía el antígeno de interés con programas
particulares de administración según lo requerido en el ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron perros Rottweiler adultos como
donantes de sangre, clínicamente sanos, con sus calendarios de
vacunación completos y vigentes (vacuna antirrábica, triple y
parvovirus), desparasitados anualmente y con un adecuado estado
nutricional. De los donantes se obtuvieron 450 ml de sangre completa
mediante sangría y con la finalidad de obtener EDL, el EDL se
procesó según lo especificado en el ejemplo no. 1, se obtuvo el EDL
de animales sensibilizados a la enfermedad tratada en el ensayo
clínico correspondiente, a los que se les había aplicado una dosis
de vacuna que contenía el antígeno de interés 15 días antes de su
sangría. Las donaciones sanguíneas se realizaron cada 60 días hasta
finalizar el ensayo clínico correspondiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó sangre de toro raza Holstein
clínicamente sano de un año y seis meses de edad, vacunado
exclusivamente contra brucelosis y sin ningún antecedente de
vacunación contra rinotraqueitis viral bovina, parainfluenza,
leptospirosis, pasteurelosis, carbón sintomático ni edema maligno.
De los donantes se obtuvieron 450 ml de sangre completa mediante
sangría y con la finalidad de obtener EDL, se procesó según lo
especificado en el ejemplo no. 1. El EDL se obtuvo a partir de
animales sensibilizados a la enfermedad tratada en el ensayo clínico
correspondiente, a los cuales se aplicó por vía subcutánea una dosis
doble de vacuna triple canina (moquillo canino, hepatitis y
leptospira) 30, 20 y 10 días previos a la recolección sanguínea.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó sangre de cerdo no sensibilizado
criado en una granja comercial. De los donantes se obtuvieron 450 ml
de sangre completa mediante sangría y con la finalidad de obtener
EDL, se procesó según lo especificado en el ejemplo no. 1. El EDL se
obtuvo a partir de animales sensibilizados a la enfermedad tratada
en el ensayo clínico correspondiente, los cuales se inmunizaron con
dosis de vacuna que contenía el antígeno de interés con programas
particulares de administración según lo requerido en el ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.930000\baselineskip
Se utilizó sangre de caballo criollo adulto,
clínicamente sano, no sensibilizado, proveniente de un rastro. De
los donantes se obtuvieron 15 litros de sangre completa mediante
sangría y con la finalidad de obtener EDL, se procesó según lo
especificado en el ejemplo no. 1. En el caso de que el EDL se
obtuviera a partir de animales sensibilizados a la enfermedad
tratada en el ensayo clínico correspondiente, éstos se inmunizaron
con dosis de vacuna que contenía el antígeno de interés con
programas particulares de administración conforme lo requería el
ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Previo a la lisis de los leucocitos, el número
de éstos, obtenidos del proceso de separación, fue contabilizado
mediante cámara de Newbawer. Después de obtenerse la cuenta de
leucocitos de los 4 cuadrantes de la cámara, las cantidades
obtenidas se sumaron y se multiplicaron por 50 para obtener así el
número total de leucocitos por \mul contenido en el líquido.
Después de realizada la lisis celular, para obtener la dosis
adecuada a aplicarse en los ensayos, ésta se calculó con respecto al
número total de células antes de la lisis y posteriormente se
realizaron diluciones adecuadas con agua destilada estéril hasta su
obtención. Las dosis obtenidas se ajustaron a un volumen total de
1,5 ml, dosis adecuada para un animal de 10 kg de peso. Para los
fines de la presente invención, para referirse a las dosis obtenidas
tal como se describió en este ejemplo, se denominarán como "dosis
equivalente a (número) de leucocitos".
\vskip1.000000\baselineskip
Para que un paciente pudiera ser considerado
como candidato a ingresar al ensayo clínico debió cumplir con los
siguientes criterios:
Para el caso de moquillo canino:
- 1.
- De inclusión: presentar signos clínicos indicativos de infección de la enfermedad, no presentar signos neurológicos antes de iniciar el tratamiento y demostrar la infección viral mediante la prueba de inmunofluorescencia directa en frotis de epitelio conjuntival, sanguíneo o vesical.
- 2.
- De exclusión: no tener propietario, padecer desnutrición severa, sufrir otras enfermedades o patologías concurrentes.
- 3.
- De eliminación: suspensión del tratamiento, muerte por otra causa diferente a la infección por moquillo, extravío del paciente, no tener al paciente bajo techo y cobijo, y no aportarle la dieta prescrita.
\vskip1.000000\baselineskip
Para el caso de leptospirosis:
- 1.
- De inclusión: presentar signos clínicos indicativos de infección por Leptospira interrogans, demostrar la infección mediante la prueba de microaglutinación sérica directa con títulos superiores a 1/100.
- 2.
- De exclusión: no tener propietario, padecer desnutrición severa, padecer deshidratación moderada a severa, tener signos de uremia, presentar niveles de creatinina mayores de 2 mg/dl, sufrir otras enfermedades o patologías concurrentes.
- 3.
- De eliminación: suspensión del tratamiento, muerte durante el desarrollo del ensayo clínico, no aportarle la dieta prescrita.
\vskip1.000000\baselineskip
Los pacientes incluidos en los ensayos
recibieron terapia antimicrobiana, previamente a la administración
de EDL. La terapia consistió de la administración de amoxicilina (11
mg/kg cada 12 horas, vía oral) y gentamicina (4 mg/kg cada 24 horas,
vía intramuscular) durante 7 días. Cada paciente fue evaluado de
manera individual y se le aplicaron las medidas terapéuticas
necesarias para su estabilización clínica. Para cada uno de los
pacientes incluidos en los ensayos, se calcularon las necesidades
energéticas (en base a la fórmula [peso corporal X 30 + 70] x 2),
las cuales se aportaron con alimento comercial seco granulado. Se
mantuvo al paciente bajo techo y cobijo las 24 horas del día
mientras duró el tratamiento, permitiendo solo salidas momentáneas
para la excreción de deyecciones fecales y orina.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los criterios de discriminación de éxito o
fracaso del tratamiento fueron de vivo o muerto o bien de positivo o
negativo a la prueba de aglutinación en placa, según el ensayo
correspondiente. Los resultados obtenidos, a menos que se indique lo
contrario, se sometieron a una evaluación estadística mediante la
prueba de Ji-cuadrada.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo corresponde a un ensayo clínico
prospectivo, longitudinal y observacional en el que se utilizó EDL
obtenido de sangre de perro sensibilizado a moquillo canino (como se
muestra en el ejemplo no. 3), se utilizó una dosis equivalente a 1,5
x 10^{6} leucocitos por kg de peso con intervalos de aplicación de
48 horas por vía subcutánea para el tratamiento del moquillo canino.
Para dicho ensayo se utilizaron 370 perros infectados naturalmente
con el virus de moquillo canino y se incluyeron alternativamente en
el grupo A o en el grupo B, con lo cual 185 animales se integraron
en el grupo A, y los otros 185 perros formaron el grupo B. Los
perros fueron seleccionados según lo descrito en el ejemplo no. 8 y
no se consideró la raza, edad, sexo, ni vacunaciones previas.
Asimismo, los pacientes fueron tratados previamente al tratamiento
con EDL según lo indicado en el ejemplo no. 9.
Después de obtenido el extracto, éste se
estandarizó a una concentración equivalente a 1,5 X 10^{6}
leucocitos por dosis, según como se muestra en el ejemplo no. 7.
A los perros incluidos en el grupo A se les
aplicó por vía subcutánea EDL a una dosis equivalente a 1,5 x
10^{6} leucocitos por kg de peso con un intervalo entre dosis de
48 horas durante 10 días, seguido de intervalos entre dosis de cada
96 horas hasta que el paciente estuviera 15 días clínicamente sano o
hasta su muerte. A los animales del grupo B se les aplicó solución
salina fisiológica, con la misma frecuencia de aplicación que en el
grupo A. El grupo A, tuvo un recorrido poblacional de un mes a ocho
años (media de dos años y cinco meses), siendo el 60,5% de la
población menor de un año de edad. El grupo B, presentó un recorrido
poblacional de dos meses a siete años, (media de dos años y un mes),
siendo el 65,7% de la población menor de un año de edad. Los
resultados obtenidos, después del tratamiento, se muestran en la
siguiente tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la evaluación de los resultados como
se indica en el ejemplo no. 10, bajo el diseño de este ensayo
clínico la aplicación de EDL en el tratamiento de moquillo canino
incrementa notablemente la supervivencia de los perros afectados a
niveles altamente significativos (p \leq 0,01).
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo se describe la utilización del
EDL obtenido de sangre de perro sensibilizado (como se muestra en el
ejemplo no. 3) a dosis equivalente a 5 x 10^{8} leucocitos en
dosis única, 5 x 10^{6} leucocitos por kg de peso corporal cada 48
horas durante 10 días, 1,5 x 10^{6} leucocitos por kg de peso
corporal cada 48 horas durante 10 días y 1 x 10^{5} leucocitos por
kg durante 10 días, por vía subcutánea, en perros enfermos de
moquillo canino. En este ensayo se utilizaron 50 perros de tres
meses a un año de edad, infectados naturalmente con el virus de
moquillo canino, los cuales se numeraron e incluyeron
progresivamente en los grupos A, B, C, D o E según el momento en que
se presentaran para su atención, con lo cual se integraron cinco
grupos de 10 perros cada uno. Los pacientes fueron seleccionados
según lo descrito en el ejemplo no. 8 y no se consideró la raza,
edad, sexo, ni vacunaciones previas. Asimismo, los pacientes fueron
tratados previamente al tratamiento con EDL según lo indicado en el
ejemplo no. 9.
A los perros incluidos en el grupo A se les
aplicó EDL a una dosis equivalente a 5 x 10^{8} leucocitos en
aplicación única. A los animales del grupo B se les aplicó una dosis
equivalente a 5 x 10^{8} leucocitos por kg de peso corporal cada
48 horas durante 10 días. Al grupo C se le aplicó una dosis de EDL
equivalente a 1,5 x 10^{6} leucocitos por kg de peso corporal cada
48 horas durante 10 días. Para los perros del grupo D se utilizó una
dosis equivalente a 1 x 10^{5} leucocitos por kg cada 48 horas
durante 10 días. A los perros del grupo E se les aplicó solución
salina fisiológica. En todos los pacientes se utilizó la vía
subcutánea. Los resultados obtenidos, después del tratamiento, se
muestran en la siguiente tabla:
Después de la evaluación de los resultados tal
como se indica en el ejemplo no. 10, bajo el diseño de este ensayo
clínico, la aplicación de EDL en el tratamiento de moquillo canino
de los perros tratados con las dosis de EDL de los grupos A, B, C
incrementa estadísticamente la supervivencia de los perros afectados
a niveles altamente significativos (p \geq 0,01) al compararlos
con el grupo control (grupo E). Al analizar los resultados obtenidos
de los tratamientos de los perros de los grupos A, B y C no se
observó diferencia estadísticamente significativa (p \geq 0,05),
sin embargo entre los tratamientos de los perros de los grupos B y C
los tratamientos fueron mejores con diferencias significativas (p
\leq 0,05) al compararlo con el grupo D.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe la utilización de EDL
obtenido a partir de sangre (tal como se muestra en el ejemplo no.
3), linfonodos y bazo de perro para el tratamiento de moquillo
canino. En este caso, se utilizaron 45 perros de cuatro meses a un
año de edad, infectados naturalmente con el virus de moquillo
canino, los cuales se numeraron y se incluyeron progresivamente en
los grupos A, B y C según el momento en que se presentaran para su
atención, con lo cual se integraron tres grupos de 15 perros cada
uno. Los perros fueron seleccionados según lo descrito en el ejemplo
no. 8 y no se consideró la raza, edad, sexo, ni vacunaciones
previas. Asimismo, los pacientes fueron tratados previamente al
tratamiento con EDL según lo indicado en el ejemplo no. 9.
Para la elaboración de EDL a partir de tejido,
se utilizaron linfonodos y bazos de perros sacrificados diferentes
de los donantes de los linfonodos tal como se describe en el ejemplo
no. 2. Después de obtenido el extracto, éste se estandarizó a una
concentración equivalente a 1,5 X 10^{6} leucocitos por dosis,
según se muestra en el ejemplo no. 7.
A los perros incluidos en el grupo A se les
aplicó una dosis de EDL de origen sanguíneo equivalente a 1,5 x
10^{6} leucocitos por kg de peso corporal cada 72 horas durante 10
días seguido de aplicaciones durante otros 15 días cada 48 horas. Al
grupo B se le aplicó EDL de linfonodos a la misma dosis y frecuencia
de aplicación. Para los perros del grupo C se utilizó EDL preparado
de bazo a la misma dosis de leucocitos y a la misma frecuencia que a
los perros de los grupos A y B. En todos los pacientes se utilizó la
vía de aplicación subcutánea. Los resultados obtenidos, después del
tratamiento, se muestran en la siguiente tabla:
Después de la evaluación de los resultados, tal
como se indica en el ejemplo no. 10, bajo el diseño de este ensayo
clínico se puede afirmar que no hay diferencia estadísticamente
significativa entre los tres grupos de estudio (p > 0,01) al
utilizar EDL de diferentes tejidos (sangre, linfonodos y bazo).
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo corresponde a un ensayo clínico
prospectivo, transversal, observacional que describe la utilización
de EDL obtenido de sangre de bovinos sensibilizados, con vacuna
triple canina, y no sensibilizados. Aplicado a una dosis equivalente
a 1,5 x 10^{6} leucocitos por kg de peso con intervalos de
aplicación de cada 48 horas por vía subcutánea para el tratamiento
del moquillo canino. En este caso, se utilizaron 45 perros de cuatro
meses a un año de edad, infectados naturalmente con el virus de
moquillo canino, los cuales se numeraron y se incluyeron
progresivamente en los grupos A, B y C según el momento en que se
presentaran para su atención, con lo cual se integraron tres grupos
de 15 perros cada uno. Los perros fueron seleccionados según lo
descrito en el ejemplo no. 8 y no se consideró la raza, edad, sexo,
ni vacunaciones previas. Asimismo, los pacientes fueron tratados
previamente al tratamiento con EDL según lo indicado en el ejemplo
no. 9.
El extracto de linfocitos (EDL) de bovino se
obtuvo según se describe en el ejemplo no. 4, mientras que el EDL de
perro fue obtenido según se muestra en el ejemplo no. 3. Después de
obtenidos los extractos, éstos se estandarizaron a una concentración
equivalente a 1,5 X 10^{6} leucocitos por dosis, según se muestra
en el ejemplo no. 7.
A los perros incluidos en el grupo A se les
aplicó por vía subcutánea una dosis de EDL de origen bovino
sensibilizado equivalente a 1,5 x 10^{6} leucocitos por kg de peso
corporal cada 48 horas durante 10 días y cada 72 horas durante 15
días. Al grupo B se le aplicó una dosis de EDL de origen bovino no
sensibilizado por la misma vía, y frecuencia de aplicación. Y al
grupo C se le aplicó EDL de origen canino de forma idéntica que en
los otros dos grupos.
Los resultados obtenidos, después del
tratamiento, se muestran en la siguiente tabla:
Después de la evaluación de los resultados, tal
como se indica en el ejemplo no. 10, bajo el diseño de este ensayo
clínico se puede afirmar que no hay diferencia estadística entre los
tres grupos de estudio (p > 0,01) al utilizar EDL de bovino
sensibilizado, bovino no sensibilizado o perro no sensibilizado para
tratar el moquillo canino.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo corresponde a un ensayo clínico
prospectivo, transversal, observacional que describe la utilización
del EDL obtenido de linfonodos y bazo de bovinos sensibilizados a
una dosis equivalente a 1,5 x 10^{8} leucocitos por kg de peso con
intervalos de aplicación de 48 horas por vía subcutánea para el
tratamiento del moquillo canino. En este ensayo se utilizaron 45
perros de cuatro meses a un año de edad, infectados naturalmente con
el virus del moquillo canino, los cuales se numeraron y se
incluyeron progresivamente en los grupos A, B y C según el momento
en que se presentaran para su atención. Con esta estrategia se
integraron tres grupos de 15 perros cada uno. Los perros fueron
seleccionados según lo descrito en el ejemplo no. 8 y no se
consideró la raza, edad, sexo, ni vacunaciones previas. Asimismo,
los pacientes fueron tratados previamente al tratamiento con EDL
según lo indicado en el
ejemplo no. 9.
ejemplo no. 9.
Para la elaboración de EDL a partir de tejido,
se utilizaron linfonodos y bazos de bovinos criollos adultos
obtenidos de un rastro municipal, los cuales una vez limpiados
fueron mantenidos en congelación (-17ºC) hasta su procesamiento,
según se muestra en el ejemplo no. 2. Cabe citar que se desconocía
la edad, sexo, vacunaciones previas y tipo de alimentación de los
animales donantes. El EDL de sangre de perro fue obtenido según se
muestra en el ejemplo no. 3. Después de obtenidos los extractos,
éstos se estandarizaron a una concentración equivalente a 1,5 X
10^{6} leucocitos por dosis, según se muestra en el ejemplo no.
7.
A los perros incluidos en el grupo A se les
aplicó por vía subcutánea el EDL de origen esplénico bovino no
sensibilizado a una dosis equivalente a 1,5 x 10^{6} leucocitos
por kg de peso corporal cada 48 horas durante 10 días y cada 72
horas durante 15 días. Al grupo B se le aplicó EDL de origen
linfonodo bovino no sensibilizado por la misma vía, dosis y
frecuencia de aplicación. Al grupo C se le aplicó EDL de origen
hemático canino de idéntica forma que en los otros dos grupos.
Los resultados obtenidos, después del
tratamiento, se muestran en la siguiente tabla:
Después de la evaluación de los resultados, tal
como se indica en el ejemplo no. 10, bajo el diseño de este ensayo
clínico se puede afirmar que no hay diferencia estadística
significativa entre los tres grupos de estudio (p > 0,05) al
utilizar EDL de bazo o linfonodo de bovino sensibilizado al
compararlo con el EDL elaborado con sangre de perro sensibilizado
para tratar moquillo canino.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo corresponde a un ensayo clínico
prospectivo, transversal, observacional que describe la utilización
del EDL obtenido de sangre, linfonodos y bazo de cerdos
sensibilizados a una dosis equivalente a 1,5 x 10^{6} leucocitos
por kg de peso con intervalos de cada aplicación de 48 horas por vía
subcutánea para el tratamiento del moquillo canino. En este ensayo
se utilizaron 40 perros de cuatro meses a un año de edad, infectados
naturalmente con el virus canino de moquillo canino, los cuales se
numeraron y se incluyeron progresivamente en los grupos A, B, C y D
según el momento en que se presentaran para su atención. Con esta
estrategia se integraron cuatro grupos de 10 perros cada uno. Los
perros fueron seleccionados según lo descrito en el ejemplo no. 8 y
no se consideró la raza, edad, sexo, ni vacunaciones previas.
Asimismo, los pacientes fueron tratados previamente al tratamiento
con EDL según lo indicado en el ejemplo no. 9.
Para la elaboración del EDL se utilizaron
linfonodos, bazos y sangre de 3 cerdos criados en una granja
comercial, los cuales fueron inmunizados dos veces con dosis dobles
de vacuna triple canina (moquillo canino, hepatitis, leptospira) con
intervalos entre dosis de 10 y 15 días previos al sacrificio. Los
extractos fueron obtenidos según se describe en el ejemplo no. 2. El
EDL de sangre de perro fue obtenido según se describe en el ejemplo
no. 3. Después de obtenidos los extractos, éstos se estandarizaron a
una concentración equivalente a 1,5 x 10^{6} leucocitos por dosis,
según se muestra en el ejemplo no. 7.
A los perros incluidos en el grupo A se les
aplicó por vía subcutánea el EDL de origen esplénico porcino
sensibilizado a una dosis equivalente a 1,5 x 10^{6} leucocitos
por kg de peso corporal cada 48 horas durante 10 días y cada 72
horas durante 15 días. Al grupo B se le aplicó EDL de linfonodo
porcino sensibilizado por la misma vía, dosis y frecuencia de
aplicación. Al grupo C se le aplicó EDL de origen hemático porcino
de idéntica forma que en los otros dos grupos. Finalmente se inyectó
por la misma vía y a la misma dosis EDL de origen sanguíneo canino
sensibilizado a los perros del grupo D. Los resultados obtenidos,
después del tratamiento, se muestran en la siguiente tabla:
Después de la evaluación de los resultados, tal
como se indica en el ejemplo no. 10, bajo el diseño de este ensayo
clínico se puede afirmar que no hay diferencia estadística entre los
cuatro grupos de estudio (p > 0,05) al utilizar EDL de sangre,
bazo o linfonodo de cerdos sensibilizados y EDL elaborado con sangre
de perro sensibilizado para tratar moquillo canino.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo corresponde a un ensayo clínico
prospectivo, transversal, observacional que describe la utilización
del EDL obtenido de sangre, linfonodos y bazo de caballos no
sensibilizados a una dosis equivalente a 1,5 x 10^{6} leucocitos
por kg de peso con intervalos de cada aplicación de 48 horas por vía
subcutánea para el tratamiento del moquillo canino. En este ensayo
se utilizaron 40 perros de cuatro meses a un año de edad, infectados
naturalmente con el virus de moquillo canino, los cuales se
numeraron y se incluyeron progresivamente en los grupos A, B, C y D
según el momento en que se presentaran para su atención. Con esta
estrategia se integraron cuatro grupos de 10 perros cada uno. Los
perros fueron seleccionados según lo descrito en el ejemplo no. 8 y
no se consideró la raza, edad, sexo, ni vacunaciones previas.
Asimismo, los pacientes fueron tratados previamente al tratamiento
con EDL según lo indicado en el ejemplo no. 9.
Para la elaboración del EDL se utilizaron
linfonodos, bazos y sangre de equinos sacrificados en un rastro
municipal. Los extractos fueron obtenidos según se describe en el
ejemplo no. 2. El EDL de sangre de perro fue obtenido según se
muestra en el ejemplo no. 3. Después de obtenidos los extractos,
éstos se estandarizaron a una concentración equivalente a 1,5 X
10^{6} leucocitos por dosis, según se muestra en el ejemplo no.
7.
A los perros incluidos en el grupo A se les
aplicó por vía subcutánea el EDL de origen esplénico equino no
sensibilizado a una dosis equivalente a 1,5 x 10^{6} leucocitos
por kg de peso corporal cada 48 horas durante 10 días y cada 72
horas durante 15 días. Al grupo B se le aplicó EDL de linfonodo
equino no sensibilizado por la misma vía, dosis y frecuencia de
aplicación. Al grupo C se le aplicó EDL de origen hemático equino de
idéntica forma que en los otros dos grupos. Finalmente, al grupo D
se le aplicó EDL de sangre canina con los mismos criterios de
aplicación que los grupos anteriores. Los resultados obtenidos,
después del tratamiento, se muestran en la siguiente tabla:
Después de la evaluación de los resultados, tal
como se indica en el ejemplo no. 10, bajo el diseño de este ensayo
clínico se puede afirmar que no hay diferencia estadística entre los
tres grupos de estudio (p > 0,05) al utilizar EDL de origen
hemático, esplénico o linfático de equino no sensibilizado y EDL
elaborado con sangre de perro sensibilizado para tratar moquillo
canino.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo corresponde a un ensayo clínico
prospectivo, transversal, observacional que describe la utilización
de EDL obtenido de bazo de perros sensibilizados a una dosis
equivalente a 1,5 x 10^{6} leucocitos por kg de peso con
intervalos de cada aplicación de 48 horas por vía subcutánea para el
tratamiento de la leptospirosis canina. En este ensayo se utilizaron
30 perros, infectados naturalmente con Leptospira
interrogans, los cuales se numeraron por orden de aparición y se
incluyeron alternativamente en los grupos A y B según el momento en
que se presentaran para su atención. Con esta disposición se
integraron dos grupos de 15 perros cada uno. Los perros fueron
seleccionados según lo descrito en el ejemplo no. 8 y no se
consideró la raza, edad, sexo, ni vacunaciones previas. Para cada
uno de los pacientes incluidos en los ensayos, se calcularon las
necesidades energéticas (en base a la fórmula [peso corporal X 30 +
70] x 2), las cuales se aportaron con alimento comercial seco
granulado. Se mantuvo al perro bajo techo y cobijo las 24 horas del
día mientras duró el tratamiento, permitiendo solo salidas
momentáneas para la excreción de deyecciones fecales y orina.
Para la elaboración de EDL a partir de tejido,
se utilizaron bazos de perros sacrificados, tal como se describe en
el ejemplo no. 2. Después de obtenidos los extractos, éstos se
estandarizaron a una concentración de 1,5 X 10^{6} leucocitos por
dosis, según se muestra en el ejemplo no. 7. A los perros incluidos
en el grupo A se les aplicó por vía subcutánea el EDL a una dosis
equivalente a 1,5 x 10^{6} leucocitos por kg de peso corporal cada
48 horas durante 15 días. Al grupo B se le aplicó penicilina G
procaínica (40.000 U/kg) y estreptomicina (22 mg/kg) cada 24 horas
durante 15 días.
Los signos clínicos se describieron desde el
inicio del ensayo y cada 7 días, de la siguiente manera:
- 0,
- cuando no hay signos.
- 1,
- cuando el paciente presentaba solo signos prodrómicos.
- 2,
- cuando los signos específicos se limitaban a vómito, diarrea, poliuria, hematuria.
- 3,
- cuando se observaba ictericia, hematuria, diarrea con melena, hematemesis.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados obtenidos, después del
tratamiento, se muestran en las siguientes tablas:
Asimismo, para estos grupos se realizó un
análisis serológico al inicio del tratamiento así como otro 21 días
después para detectar anticuerpos anti-Leptospira mediante la
técnica de microaglutinación con antígeno vivo.
Los resultados de esta prueba se muestran a
continuación:
Los resultados obtenidos se sometieron a una
evaluación estadística. En el caso de la valoración de los signos
clínicos, se utilizó la prueba de Kruskall-Wallis y
para el caso de la microaglutinación la prueba de t de Student.
Después de la evaluación de los resultados, bajo el diseño de este
ensayo clínico, se puede afirmar que no hay diferencia estadística
significativa entre los grupos de estudio (p > 0,05) al utilizar
EDL de origen canino no sensibilizado y el tratamiento con
compuestos antimicrobianos. En otras palabras, ambos tratamientos
resultaron igualmente eficaces contra la leptospirosis canina.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo corresponde a un ensayo clínico
prospectivo, transversal y observacional que describe la utilización
del EDL obtenido de bazo de perros no sensibilizados a una dosis
equivalente a 1,5 x 10^{6} leucocitos por kg de peso con
intervalos de aplicación de cada 48 horas por vía subcutánea para el
tratamiento de la brucelosis canina. En este ensayo se utilizaron 26
perros asintomáticos, infectados naturalmente con Brucella
canis, que fueron diagnosticados en una población canina abierta
de un consultorio veterinario, los cuales se numeraron por orden de
diagnóstico positivo y se incluyeron alternativamente en los grupos
A y B según el momento en que se detectó su positividad. Con esta
disposición se integraron dos grupos de 13 perros cada uno. No se
consideró la raza, edad, sexo, ni vacunaciones previas y los
pacientes fueron seleccionados en base a los siguientes
criterios:
- 1.
- De inclusión: demostrar la infección asintomática por Brucella canis mediante la prueba positiva de aglutinación en placa.
- 2.
- De exclusión: no tener propietario, padecer desnutrición severa, sufrir otras enfermedades o patologías concurrentes.
- 3.
- De eliminación: suspensión del tratamiento, muerte durante el desarrollo del ensayo clínico, extravío del paciente, no tener al paciente bajo techo y cobijo, y no suplementarle la dieta prescrita.
\vskip1.000000\baselineskip
Para cada uno de los pacientes incluidos en los
ensayos, se calcularon las necesidades energéticas (en base a la
fórmula [peso corporal X 30 + 70] x 2), las cuales se aportaron con
alimento comercial seco granulado. Se mantuvo al perro bajo techo y
cobijo las 24 horas del día mientras duró el tratamiento,
permitiendo sólo salidas momentáneas para la excreción de
deyecciones fecales y orina.
Para la elaboración de EDL a partir de tejido,
se utilizaron bazos de perros sacrificados tal como se describe en
el ejemplo no. 2. Después de obtenidos los extractos, éstos se
estandarizaron a una concentración equivalente a 1,5 X 10^{6}
leucocitos por dosis, según se muestra en el ejemplo no. 7. A los
perros incluidos en el grupo A, el EDL fue aplicado a una dosis
equivalente de 1,5 x 10^{6} leucocitos por kg de peso corporal por
vía subcutánea cada 48 horas durante 30 días. Al grupo B se le
aplicó un tratamiento con minociclina y estreptomicina durante tres
semanas. El criterio de discriminación de éxito o fracaso del
tratamiento fue negativo o positivo a la prueba de aglutinación en
placa para Brucella cannis a los 45 días posteriores al
inicio del ensayo clínico.
Los resultados obtenidos, después del
tratamiento, se muestran en la siguiente tabla:
Después de la evaluación de los resultados tal
como se indica en el ejemplo no. 10, bajo el diseño de este ensayo
clínico se puede afirmar que al utilizar EDL de origen canino no
sensibilizado para el tratamiento de la brucelosis canina hay
diferencia estadística altamente significativa entre los grupos de
estudio A y B (p < 0,01).
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo corresponde a un ensayo
experimental, prospectivo, que describe la utilización del EDL
obtenido de bazo de perros no sensibilizados a una dosis equivalente
a 1,5 x 10^{6} leucocitos por kg de peso con intervalos de
aplicación de cada 48 horas por vía subcutánea para el tratamiento
de coccidiosis canina. En este ensayo se utilizaron 38 perros
infectados naturalmente con Isospora canis, que fueron
diagnosticados, en un brote ocurrido en un criadero de perros pastor
alemán. Se integraron dos grupos de 19 cachorros cada uno,
denominados A y B. No se consideró la raza, edad, sexo, ni
vacunaciones previas y los pacientes fueron seleccionados en base a
los siguientes criterios:
- 1.
- De inclusión: presentar cuadro diarreico con evolución no mayor a siete días, demostrar la infección por Isospora canis mediante examen coproparasitoscópico, mediante técnica de flotación, edad entre 2 y 6 meses.
- 2.
- De exclusión: no tener propietario, padecer desnutrición severa, sufrir deshidratación moderada a severa, sufrir otras enfermedades o patologías concurrentes.
- 3.
- De eliminación: suspensión del tratamiento, incremento de la diarrea con deshidratación severa, muerte durante el desarrollo del ensayo clínico, no suplementarle la dieta prescrita.
\vskip1.000000\baselineskip
Para cada uno de los pacientes incluidos en los
ensayos, se calcularon las necesidades energéticas (en base a la
fórmula [peso corporal X 30 + 70] x 2), las cuales se aportaron con
alimento comercial seco granulado. Se mantuvo al perro bajo techo y
cobijo las 24 horas del día mientras duró el tratamiento,
permitiendo solo salidas momentáneas para la excreción de
deyecciones fecales y orina.
Para la elaboración de EDL a partir de tejido,
se utilizaron bazos de perros sacrificados tal como se describe en
el ejemplo no. 2. Después de obtenidos los extractos, éstos se
estandarizaron a una concentración equivalente a 1,5 X 10^{6}
leucocitos por dosis, según se muestra en el ejemplo no. 7. A los
perros incluidos en el grupo A, se les aplicó una dosis equivalente
a 1,5 x 10^{6} leucocitos por kg de peso corporal, por vía
subcutánea cada 48 horas durante 10 días. Al grupo B se le aplicó un
tratamiento con sufamerazina y trimetoprim durante 10 días. Los
criterios de discriminación de éxito o fracaso del tratamiento
fueron negativos o positivos a la prueba en serie de tres muestras
por examen coproparasitoscópico mediante la técnica de flotación,
los días 11, 13 y 15 después del inicio del ensayo clínico.
\newpage
Los resultados obtenidos, después del
tratamiento, se muestran en la siguiente tabla:
Después de la evaluación de los resultados tal
como se indica en el ejemplo no. 10, bajo el diseño de este ensayo
clínico se puede afirmar que existen diferencias estadísticas
significativas entre los grupos de estudio (p < 0,05) al utilizar
EDL de origen canino no sensibilizado para el tratamiento de la
coccidiosis canina.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo corresponde a un ensayo clínico
prospectivo, transversal, observacional que describe la utilización
del EDL obtenido de sangre de caballos sensibilizados a una dosis
equivalente a 1,5 x 10^{6} leucocitos por kg de peso con
intervalos de aplicación de cada 48 horas por vía subcutánea para el
tratamiento de leptospirosis equina. En este ensayo se utilizaron 30
caballos pura sangre inglés, infectados naturalmente con
Leptospira interrogans, que fueron detectados en la cuadra
del agrupamiento ecuestre de la Policía, los cuales se numeraron por
orden de positividad y se incluyeron alternativamente en los grupos
A y B según el momento en que se presentaran para su atención. Con
esta disposición se integraron dos grupos de 15 caballos cada uno.
Los pacientes fueron seleccionados según lo descrito en el ejemplo
no. 8 y no se consideró la raza, edad, sexo, ni vacunaciones
previas. A cada uno de los pacientes incluidos en los ensayos, se le
alimentó con alimento comercial seco granulado. Para la elaboración
del EDL se utilizaron 15 litros sangre de tres caballos criollos
adultos, clínicamente sanos, no sensibilizados provenientes de un
rastro. Los extractos fueron obtenidos tal como se describe en el
ejemplo no. 6. Después de obtenidos los extractos, éstos se
estandarizaron a una concentración equivalente a 1,5 X 10^{6}
leucocitos por dosis, según como se muestra en el ejemplo no. 7.
A los caballos incluidos en el grupo A se les
aplicó por vía subcutánea el EDL a una dosis equivalente a 1,5 x
10^{6} leucocitos por kg de peso corporal cada 48 horas durante 15
días. Al grupo B se le aplicó penicilina G procaínica (4.000.000/U)
y estreptomicina (22 mg/kg) cada 24 horas durante 15 días.
Los signos clínicos se calificaron desde el
inicio del ensayo y cada 7 días, de la siguiente manera:
- 0,
- cuando no hay signos.
- 1,
- cuando el paciente presentaba solo signos prodrómicos.
- 2,
- cuando los signos específicos se limitaban a vómito, diarrea, poliuria, hematuria.
- 3,
- cuando se observaba ictericia, hematuria, diarrea con melena, hematemesis.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Los resultados obtenidos, después del
tratamiento, se muestran en las siguientes tablas:
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Asimismo, para estos grupos se realizó un
análisis serológico al inicio del tratamiento así como otro 21 días
después para detectar anticuerpos anti-Leptospira mediante la
técnica de microaglutinación con antígeno vivo.
Los resultados de esta prueba se muestran a
continuación:
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\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Los resultados obtenidos se sometieron a una
evaluación estadística. En el caso de la valoración de los signos
clínicos se utilizó la prueba de Kruskall-Wallis y
para el caso de la microaglutinación la prueba de t de Student.
Después de la evaluación de los resultados, bajo el diseño de este
ensayo clínico se puede afirmar que no hay diferencia estadística
entre los grupos de estudio (p > 0,05) al utilizar EDL de origen
equino no sensibilizado y el tratamiento con compuestos
antimicrobianos. En otras palabras, ambos tratamientos resultaron
igualmente eficaces contra la leptospirosis equina.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo corresponde a un ensayo clínico
prospectivo, transversal, observacional que describe la utilización
del EDL obtenido de bazo de caballos sensibilizados a una dosis
equivalente a 1,5 x 10^{6} leucocitos por kg de peso con
intervalos de aplicación de cada 48 horas por vía subcutánea para el
tratamiento de influenza equina. En este ensayo se utilizaron 20
caballos raza Appaloosa, infectados naturalmente con ortomixovirus
de la influenza equina, en un brote de un criadero. Esa población
equina se dividía en 4 machos y 16 hembras con edades entre dos y
veinte años; con estos animales se formaron dos grupos con edades y
sexos semejantes, a los cuales se les denominó grupo A y grupo B. No
se consideró la raza, edad, sexo, ni vacunaciones previas y los
pacientes fueron seleccionados en base a los siguientes
criterios:
- 1.
- De inclusión: presentar signos clínicos de influenza, demostrar la infección por ortomixovirus mediante la prueba de seroneutralización.
- 2.
- De exclusión: sufrir desnutrición severa, sufrir deshidratación moderada a severa, sufrir otras enfermedades o patologías concurrentes.
- 3.
- De eliminación: suspensión del tratamiento, muerte durante el desarrollo del ensayo clínico.
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A cada uno de los pacientes incluidos en los
ensayos, se les alimentó con alimento comercial seco granulado y
alfalfa achicalada.
Para la elaboración del EDL se utilizaron tres
bazos de caballos criollos, adultos, clínicamente sanos, no
sensibilizados, provenientes de un rastro. Los extractos fueron
obtenidos tal como se describe en el ejemplo no. 2. Después de
obtenidos los extractos, éstos se estandarizaron a una concentración
equivalente a 1,5 X 10^{6} leucocitos por dosis, tal como se
muestra en el ejemplo no. 7.
A los caballos incluidos en el grupo A se les
aplicó por vía subcutánea el EDL a una dosis equivalente a 1,5 x
10^{6} leucocitos por kg de peso corporal cada 48 horas durante 15
días. Al grupo B se le aplicó solución salina fisiológica por la
misma vía y a un volumen equivalente al utilizado para el EDL.
El criterio de éxito en el tratamiento consistió
en la desaparición clínica de todos los signos indicativos de sufrir
influenza equina. El criterio de fracaso fue el de la persistencia
de tan solo un signo clínico de la enfermedad. Se realizaron dos
valoraciones clínicas de los grupos en estudio, el primero a los
siete días del inicio y otro a los 15 días.
Los resultados obtenidos, después del
tratamiento, se muestran en la siguiente tabla:
Después de la evaluación de los resultados tal
como se indica en el ejemplo no. 10, bajo el diseño de este ensayo
clínico, se puede afirmar que existen diferencias estadísticas
significativas a favor del grupo de caballos tratados con EDL (p
< 0,05) con respecto al grupo no tratado, al utilizar EDL de
origen equino no sensibilizado para el tratamiento de influenza
equina.
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Este ejemplo corresponde a un ensayo clínico
prospectivo, transversal, observacional que describe la utilización
del EDL obtenido de sangre de cerdos sensibilizados a una dosis
equivalente a 1,5 x10^{6} leucocitos por kg de peso con intervalos
de aplicación de cada 48 horas por vía subcutánea para el
tratamiento de la enfermedad de Aujesky en cerdos. En este ensayo se
utilizaron 20 lechones raza Landrace de 6 semanas de edad, libres de
anticuerpos específicos contra la enfermedad de Aujesky. Después de
tres días de aclimatación, en jaulas cerradas (no a la intemperie)
colectivas con pavimento de cemento y muros de tabique, a
temperaturas promedio de 20ºC y humedad relativa de 40 a 50%, los
animales fueron agrupados en dos grupos de 15 lechones cada uno, los
cuales fueron denominados grupo A y grupo B. No se consideró la
raza, edad, sexo, ni vacunaciones previas y los pacientes fueron
seleccionados en base a los siguientes criterios:
- 1.
- De inclusión: estar clínicamente sano, no presentar anticuerpos contra la enfermedad de Aujesky.
- 2.
- De exclusión: sufrir desnutrición, sufrir otras enfermedades o patologías concurrentes.
- 3.
- De eliminación: suspensión del tratamiento, muerte por otra causa diferente a la infección por Aujesky.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los cerdos que reunieron los criterios de
inclusión en este ensayo fueron inoculados por vía intranasal con 3
ml de virus de desafío cepa Becker del virus de Aujesky (10^{7}
DICC50%/ml), la cual se propagó y tituló en células de riñón de
bovino (MDBK), utilizando como medio esencial mínimo adicionado con
el 10% de suero fetal bovino. A los cinco días después de la
inoculación y cada vez que se presentaron los signos indicativos de
infección respiratoria y viremia (rinorrea, epifora, estornudos,
tos, depresión y fiebre), se les administró EDL. Para la elaboración
del EDL se utilizaron 15 litros de sangre de cerdos sanos vacunados
contra la enfermedad de Aujesky con vacuna de virus activo
modificado de la cepa Bartha. Los extractos fueron obtenidos según
se describe en el ejemplo no. 5. Después de obtenidos los extractos,
éstos se estandarizaron a una concentración equivalente a 1,5 X
10^{6} leucocitos por dosis, según se muestra en el ejemplo no.
7.
El grupo A fue tratado con EDL a una dosis
equivalente a 1,5 x10^{6} leucocitos por kg de peso corporal con
intervalos de aplicación de cada 48 horas por vía intramuscular
durante 10 días; el grupo B recibió exclusivamente solución salina
fisiológica en volúmenes semejantes a los del EDL del grupo A.
Los signos clínicos se calificaron desde el
inicio del ensayo y cada 24 hrs, de la siguiente manera:
- 0
- cuando no hay signos.
- 1
- cuando el paciente presentó solo signos prodrómicos (fiebre, depresión mental, anorexia).
- 2
- cuando los signos específicos se limitaron a epifora, rinorrea, estornudo, tos, taquipnea.
- 3
- cuando se observó ataxia, parálisis, convulsiones, postración estuporosa y muerte.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Los resultados obtenidos, después del
tratamiento, se muestran en la siguiente tabla:
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Para el análisis estadístico se utilizó la
prueba de Kruskall-Wallis. El diseño de este ensayo
clínico permite afirmar que sí hay diferencias estadísticas
significativas a favor del grupo A con respecto al B (p \leq
0,01), al utilizar EDL de origen sanguíneo porcino sensibilizado
para el tratamiento de la enfermedad de Aujesky.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo corresponde a un ensayo clínico
prospectivo, transversal, observacional que describe la utilización
del EDL obtenido de bazo de cerdos sensibilizados a una dosis
equivalente a 1,5 x 10^{6} por kg de peso con intervalos de
aplicación de cada 48 horas por vía subcutánea para el tratamiento
de la rinitis atrófica en cerdos. En este ensayo se utilizaron 30
cerdos raza Duroc, infectados naturalmente con Bordetella
bronchiseptica y Pasterella multocida tipo D toxigénica,
que fueron muestreados en una granja de ciclo completo. Con dichos
pacientes se integraron dos grupos de 15 cerdos cada uno. No se tomó
en consideración la edad, el sexo, ni las vacunaciones previas. Para
que un cerdo pudiera ser considerado como candidato a ingresar a
este ensayo clínico debió cumplir con los siguientes criterios:
- 1.
- De inclusión: presentar signos clínicos de infección por Bordetella bronchiseptica y Pasterella multocida tipo D toxigénica, demostrar la infección por Bordetella bronchiseptica y Pasterella multocida tipo D toxigénica, a las 10 semanas de edad, mediante aislamiento bacteriano.
- 2.
- De exclusión: sufrir desnutrición severa, sufrir deshidratación moderada a severa, sufrir otras enfermedades o patologías concurrentes.
- 3.
- De eliminación: suspensión del tratamiento, muerte durante el desarrollo del ensayo clínico.
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A todos los cerdos que se les aplicaron los
criterios de inclusión y exclusión en este ensayo se les alimentó
con alimento comercial seco granulado.
Para la elaboración del EDL se utilizaron 20
litros de sangre de 5 cerdos sensibilizados en dos ocasiones, 30 y
15 días antes, con toxoide comercial contra Bordetella
bronchiseptica y Pasterella multocida tipo D toxigénica
(Atrobac, Lab. Pfizer). Los extractos fueron obtenidos según se
describe en el ejemplo no. 5. Después de obtenidos los extractos,
éstos se estandarizaron a una concentración equivalente a 1,5 X
10^{6} leucocitos por dosis, según se muestra en el ejemplo no.
7.
A los cerdos incluidos en el grupo A se les
aplicó por vía intramuscular el EDL a una dosis equivalente a 1,5 x
10^{6} leucocitos por kg de peso corporal cada 48 horas durante 15
días, iniciando su aplicación a las 12 semanas de vida. Al grupo B
se le aplicó solución salina fisiológica con el mismo volumen y a la
misma frecuencia. A las 24 semanas los cerdos fueron sacrificados y
se evaluó el grado de braquignatia y los grados de rinitis atrófica
según las técnicas descritas por Done.^{35}
Los resultados obtenidos, después del
tratamiento, se muestran en la siguiente tabla:
Después de la evaluación de los resultados, bajo
el diseño de este ensayo clínico se puede afirmar que no hay
diferencia estadística en la dimensión de la braquignatia entre los
grupos de estudio (p > 0,01) al utilizar EDL de origen porcino no
sensibilizado y el control. En cambio, sí se observaron diferencias
altamente significativas (p \leq 0,01) al valorar los grados de
rinitis, a favor del grupo de cerdos tratados con EDL de origen
sanguíneo porcino sensibilizado comparado con los cerdos sin
tratamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo corresponde a un ensayo clínico,
prospectivo, transversal, observacional que describe la utilización
del EDL obtenido de bazo de cerdos sensibilizados a una dosis
equivalente a 1,5 x 10^{6} leucocitos por kg de peso con
intervalos de aplicación de cada 48 horas por vía subcutánea para el
tratamiento de neumonía por Micoplasmosis complicada en cerdos. En
este ensayo se utilizaron 30 cerdos raza Landrace, infectados
naturalmente con Mycoplasma hyopneumaniae y Pasterella
multocida tipo D toxigénica, en un brote agudo de enfermedad
respiratoria en una granja de ciclo completo, en la cual se
diagnosticó micobacteriosis por lesiones anatomopatológicas y
pausterelosis por cultivo microbiológico. Con los 30 cerdos se
integraron dos grupos de 15 cerdos cada uno con edades entre 4 y 12
semanas de edad. No se tomó en consideración, el sexo, ni las
vacunaciones previas. Para que un cerdo pudiera ser considerado como
candidato a ingresar a este ensayo clínico debió cumplir con los
siguientes criterios:
- 1.
- De inclusión: presentar signos clínicos de infección respiratoria, estar alojado en un corral en donde de haya muerto otro cerdo con diagnóstico anatomopatológico de Mycoplasma hyopneumaniae y microbiológico de Pasterella multocida, tener entre 4 y 12 semanas de edad, no presentar más de 7 días con signos de enfermedad respiratoria.
- 2.
- De exclusión: sufrir desnutrición severa, sufrir deshidratación moderada a severa, sufrir otras enfermedades o patologías concurrentes.
- 3.
- De eliminación: suspensión del tratamiento, muerte durante el desarrollo del ensayo clínico.
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A todos los cerdos que se les aplicaron los
criterios de inclusión y exclusión en este ensayo se les alimentó
con alimento comercial seco granulado, para la etapa de
crecimiento.
Para la elaboración del EDL se utilizaron 10
bazos de cerdos sensibilizados con bacterina contra Mycoplasma
hyopneumaniae y toxoide comercial contra Bordetella
bronchiseptica y Pasterella multocida tipo D toxigénica
(Atrobac, Lab. Pfizer). El tejido linfoide se obtuvo de un rastro
local. Los extractos fueron obtenidos según se describe en el
ejemplo no. 2. Después de obtenidos los extractos, éstos se
estandarizaron a una concentración equivalente a 1,5 X 10^{6}
leucocitos por dosis, según se muestra en el ejemplo no. 7.
A los cerdos incluidos en el grupo A se les
aplicó EDL por vía intramuscular a una dosis equivalente a 1,5 x
10^{6} leucocitos por kg de peso corporal cada 48 horas durante 10
días. Al grupo B se les aplicó solución salina fisiológica con el
mismo volumen y a la misma frecuencia que el EDL del grupo A.
Los signos clínicos se calificaron, en ambos
grupos, desde el inicio del ensayo y cada 24 horas durante los
siguientes 10 días, de la siguiente manera:
- 0
- cuando no hay signos.
- 1
- cuando el paciente presentaba ligera depresión mental, anorexia.
- 2
- cuando los signos específicos se limitaban a estornudo, tos seca, diarrea.
- 3
- cuando se observaba taquipnea, cianosis, postración estuporosa y muerte.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Los resultados obtenidos, después del
tratamiento, se muestran en las siguientes tablas:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para el análisis estadístico se utilizó la
prueba de Kruskall-Wallis. Después de la evaluación
de los resultados, bajo el diseño de este ensayo clínico se puede
afirmar que sí hay diferencias estadísticas a favor del grupo A con
respecto al B (p \leq 0,05), al utilizar EDL de origen sanguíneo
porcino sensibilizado para el tratamiento de la enfermedad
respiratoria por micoplasmosis y pasteurelosis porcina.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (31)
1. Extracto dializado de leucocitos estéril,
libre de células completas o viables y que contiene moléculas
menores de 12 KDal de peso, caracterizado porque es estable
en solución a 4ºC durante 7 a 12 meses sin el uso de conservantes y
en el que el extracto dializado se esteriliza mediante adición de
ozono.
2. Extracto, según la reivindicación 1,
caracterizado porque contiene una concentración equivalente
de leucocitos de 1 X 10^{5} a 5 X 10^{9} por ml.
3. Extracto, según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque los leucocitos provienen de sangre o
tejido linfático de animales.
4. Extracto, según la reivindicación 3,
caracterizado porque el tejido linfático es seleccionado de
timo, nódulos linfáticos, bazo o combinaciones de los mismos.
5. Extracto, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque es preparado a
partir de tejidos de animales previamente sensibilizados contra un
agente etiológico infeccioso específico.
6. Extracto, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque es preparado a
partir de tejidos de animales no sensibilizados contra un agente
etiológico infeccioso específico.
7. Composición farmacéutica,
caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente
efectiva del extracto dializado de leucocitos, según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, en un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
8. Composición farmacéutica, según la
reivindicación 7, caracterizada porque el extracto dializado
de leucocitos se encuentra en una concentración equivalente de
leucocitos de 1 X 10^{5} a 5 X 10^{9} por ml.
9. Composición farmacéutica, según la
reivindicación 7 u 8, caracterizada porque contiene
adicionalmente un antibiótico.
10. Composición farmacéutica, según la
reivindicación 9, caracterizada porque el antibiótico es
seleccionado del grupo que comprende sulfamerazina, trimetropina,
minociclina, amoxicilina, gentamicina, penicilina y
estreptomicina.
11. Kit terapéutico para el tratamiento de un
animal no humano afectado de una enfermedad infecciosa,
caracterizado porque comprende 6 a 10 dosis individuales de
la composición farmacéutica, según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 10, en el que de 30% a 50% de dichas dosis
individuales son de 3 a 300 veces mayores en la concentración del
extracto dializado de leucocitos que el resto de las dosis.
12. Método para obtener el extracto dializado de
leucocitos, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que
comprende los pasos de:
- Recolectar los tejidos celulares que contienen los leucocitos de un donante animal no humano,
- Separar los leucocitos de los tejidos celulares obtenidos en a),
- Lisar los leucocitos obtenidos en b),
- Dializar el extracto obtenido en el paso c),
- caracterizado porque el extracto dializado obtenido en el paso d) es esterilizado por la adición de ozono a una concentración de 0,2 a 0,5 ppm aplicado por burbujeo.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Método, según la reivindicación 12,
caracterizado porque el ozono es adicionado a una
concentración de 0,3 ppm.
14. Uso del extracto dializado de leucocitos,
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la manufactura
de un medicamento para el tratamiento de un animal vertebrado
no-humano con una infección causada por un
microorganismo seleccionado del grupo que consiste en bacterias,
hongos, protozoarios y virus, que incluye administrar al animal
no-humano infectado una cantidad terapéuticamente
efectiva del extracto.
15. Uso, según la reivindicación 14,
caracterizado porque el extracto dializado de leucocitos es
administrado con una dosis equivalente a 1 X 10^{6} a 5 X 10^{6}
leucocitos por Kg de peso corporal.
16. Uso, según la reivindicación 15,
caracterizado porque el extracto dializado de leucocitos es
administrado con una dosis equivalente a 1,5 x 10^{6} leucocitos
por Kg de peso corporal.
17. Uso, según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16, caracterizado porque el extracto
dializado de leucocitos es aplicado a un intervalo entre dosis de 8
horas a 30 días.
18. Uso, según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16, caracterizado porque el extracto
dializado de leucocitos es administrado vía parenteral o
enteral.
19. Uso, según la reivindicación 18,
caracterizado porque el extracto de dializado de leucocitos
es administrado vía subcutánea.
20. Uso, según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 19, caracterizado porque el extracto
dializado de leucocitos es aplicado en una única dosis.
21. Uso, según la reivindicación 14, en el que
el animal vertebrado no-humano es un mamífero o un
ave.
22. Uso, según la reivindicación 21, en el que
el mamífero es seleccionado del grupo que consiste en felinos,
caninos, porcinos, equinos, bovinos y ovinos.
23. Uso, según la reivindicación 21, en el que
el microorganismo es un virus seleccionado entre virus de herpes
\alpha, virus de herpes \beta, virus de herpes \gamma,
Morbilivirus, pneumovirus, coronavirus, papilomavirus, oncornavirus,
ortomixovirus, paramixovirus, lentivirus y oncovirus; o en el que el
microorganismo es una bacteria seleccionada entre Pasteurella,
Mycoplasma, Mycobacterium, Leptospira, Brucella, Bordetella,
Haemophilus, Treponema y Campylobacter; o en el que el
microorganismo es un hongo seleccionado de Actinomyces,
Coccidiodomicosis, Histoplasma, Criptococcus, Blastomyces,
Aspergilus y Candida; o en el que el microorganismo es un
protozoario seleccionado de Leishmania, Entamoeba, Toxoplasma,
Isospora, Erlichia, Neospora, Criptosporidium y
Balantidium.
24. Uso, según la reivindicación 21, en el que
la infección causada por virus es seleccionada de rinotraqueitis
bovina infecciosa, mamilitis ulcerativa, fiebre catarral maligna,
influenza, peste bovina, parainfluenza-3, virus
bovino sincicial, diarrea neonatal del carnero, papilomatosis,
leucosis bovina, rinoneumonitis equina, exantema coital equina,
anemia infecciosa equina, parainflueza SV-5,
herpesvirus canino, Rinotraqueitis felina, urolitiasis felina,
peritonitis infecciosa felina, leucemia viral felina, herpes virus
del cerdo lactante, rinitis atrófica, gastroenteritis transmisible,
encefalomielitis hemoaglutinante, enfermedad del ojo azul,
adenomatosis pulmonar, laringotraquitis infecciosa, enfermedad de
Marek, plaga de aves, enfermedad de Newcastle, bronquitis infecciosa
y leucosis aviar; o en el que la infección causada por bacterias se
selecciona de septicemia hemorrágica, pleuroneumonía contagiosa,
mastitis bovina, paratuberculosis, tuberculosis, leptospirosis,
brucelosis, neumonía enzoótica porcina, disentería porcina,
campilobacteriosis, enfermedad respiratoria crónica, sinovitis
infecciosa y cólera aviar; o en el que la infección causada por
hongos se selecciona de actinomicosis, coccidiomicosis,
histoplasmosis, criptococosis, blastomicosis, aspergilosis y
candidiasis; o en el que la infección causada por protozoarios se
selecciona de toxoplasmosis, leishmaniasis, balantidiasis,
amibiasis, coccidiosis, erliquiosis y neosporosis.
25. Uso, según la reivindicación 21, en el que
el extracto es preparado a partir de tejidos de un animal no humano
de la misma especie o de otra especie diferente que el animal no
humano que recibe el tratamiento.
26. Uso, según la reivindicación 14,
caracterizado porque la infección causada por virus es
seleccionada del grupo que consiste en moquillo canino y enfermedad
de Aujesky.
27. Uso, según la reivindicación 26,
caracterizado porque el extracto dializado de leucocitos es
administrado con una dosis equivalente a 1 X 10^{5} a 5 X 10^{9}
leucocitos por Kg de peso corporal; o porque el extracto dializado
de leucocitos es administrado con una dosis equivalente a 1,5 X
10^{6} leucocitos por Kg de peso corporal.
28. Extracto dializado estéril, según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 6, para ser usado en el tratamiento de
un animal vertebrado no-humano con una infección
causada por un microorganismo seleccionado del grupo que comprende
bacterias, hongos, protozoarios y virus, que incluye administrar al
animal no-humano infectado una cantidad
terapéuticamente efectiva del extracto.
29. Extracto dializado estéril para ser usado de
acuerdo a la reivindicación 28, caracterizado porque el
extracto es administrado con una dosis equivalente a 1 X 10^{6} a
5 X 10^{6} leucocitos por Kg de peso corporal; o porque el
extracto es administrado con una dosis equivalente a 1,5 X 10^{6}
leucocitos por Kg de peso corporal.
30. Extracto dializado estéril para ser usado de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 29 para el
tratamiento de un animal vertebrado no-humano con
una infección causada por un microorganismo seleccionado del grupo
que consiste en moquillo canino y enfermedad de Aujesky.
31. Extracto dializado de leucocitos estéril,
libre de células completas o viables que contienen moléculas menores
a 12 KDal de peso para usarse en el tratamiento de un animal
vertebrado no-humano con una infección causada por
un microorganismo seleccionado del grupo que consiste en moquillo
canino y enfermedad de Aujesky.
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