KR20170065027A - 객담유래 세포의 dna 메틸화 표현형결정에 의한 조기 폐암 검출 - Google Patents

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Abstract

특정 구현예에서, 본원은 폐암을 검출하기 위한 방법을 개시한다. 이 방법은 폐암 발병 5 초기에 암이 되는 상부 호흡기 세포의 중요한 조직 대체물 및 공급원인 인간의 객담에서 추출한 세포의 특성화를 포함한다. 이 방법은 광학 현미경으로 가시화될 수 있는 표지된 세포의 핵에 특정 패턴을 생성하는 형광 리포터로 추출 세포를 염색하는 것을 포함한다. 상기 패턴은 정상적인 호흡기 세포와 비교하여 암이 발병하는 동안 폐의 특정 세포에서 변하는 DNA 메틸화로 알려진 DNA의 후생적 암호화의 유형과 관련이 있다.

Description

객담유래 세포의 DNA 메틸화 표현형결정에 의한 조기 폐암 검출{EARLY LUNG CANCER DETECTION BY DNA METHYLATION PHENOTYPING OF SPUTUM-DERIVED CELLS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 35 U.S.C.§119(e) 하에 현재 계류중인 2014년 8월 28일자로 출원된 미국 가출원 제 62/043,346 호를 우선권으로 주장하며, 이의 내용을 그 전체로 본원에 참고로 인용한다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 암, 특히 폐암의 진단, 예후 및 치료에 관한 것이다.
하기 설명은 본 발명을 이해하는 데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본원에 제공된 어떤 정보라도 선행 기술이거나 현재 청구된 발명과 관련이 있다는 것을 인정하는 것은 아니다.
폐암을 검사하는 전통적인 방법으로는 종격동 내시경 검사, 및 컴퓨터 단층 촬영(CT) 및 양전자 방출 단층 촬영(PET)과 같은 방사선 촬영법이 있다. 불행하게도, 이러한 방법은 값이 비싸고/거나 환자에게 잠재적으로 해로운 이온화 방사선에 노출되어야 한다. 또한, 스캔은, 방사선 촬영법으로 검출하기에는 너무 작을 수 있지만 환자에게 심각한 위험을 초래하는 초기-단계 폐암의 검출에 대해서 신뢰할 만하지 못하다. 이것은 초기-단계 폐암 검출이 후기-단계 검출보다 훨씬 유리한 예후와 관련되기 때문에 특히 관련이 있다.
특히 초기 단계에 폐암을 검출하기 위한 안전하고 비교적 저렴하며 민감한 방법이 당업계에 명백히 요구된다.
다양한 구현예에서, 본 발명은, 세포의 핵에서 전체 5-메틸시토신(5mC) 함량 및/또는 5mC 및 전체 DNA(gDNA)의 공간적 핵 공-분포를 결정하는 단계; 및 세포의 핵에서 전체 5-메틸시토신(5mC) 함량 및/또는 5mC 및 전체 DNA(gDNA)의 공간적 핵 공-분포가 비-암성 또는 비-전암성 참조 세포 및/또는 비-암성 또는 비-전암성 참조 세포 집단과 현저히 상이한 경우에 상기 세포가 암성이거나 또는 전암성인 것으로 결정하는 단계; 또는 세포의 핵에서 전체 핵 5mC 함량 및/또는 5mC 및 gDNA의 공간적 핵 공-분포가 비-암성 또는 비-전암성 참조 세포 및/또는 비-암성 또는 비-전암성 참조 세포 집단과 현저히 상이하지 않은 경우에 상기 세포가 암성이 아니거나 또는 전암성이 아닌 것으로 결정하는 단계를 포함하는, 세포가 암성인지 또는 전암성인지를 결정하는 방법에 대해 교시한다. 일부 구현예에서, 세포는 전체 5mC 함량이 비-암성 또는 비-전암성 참조 세포 및/또는 비-암성 또는 비-전암성 참조 세포 집단보다 현저히 낮은 경우에 암성이거나 전암성인 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 세포는 생물학적 샘플로부터 얻어진다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 객담을 포함한다. 특정 구현예에서, 객담은 호흡기 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 암성 세포 또는 전암성 세포는 폐암 기원이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 담배를 피운 병력이 있는 대상체로부터 얻는다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 담배를 피운 병력이 없는 대상체로부터 얻는다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 폐암을 갖고 있지만 폐암 치료를 받지 않은 대상체로부터 얻는다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 방사선 요법, 화학 요법, 수술 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 폐암 치료를 받은 대상체로부터 얻는다. 일부 구현예에서, 세포를 (a) 5mC에 특이적인 항체로 면역형광 염색시키고, (b) 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 대조 염색시킨 후, 전체 5mC 및 gDNA 함량을 현미경으로 측정한다. 특정 구현예에서, 세포를 (a) 5mC에 특이적인 항체로 면역형광 염색시키고, (b) 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 대조 염색시킨 후, 5mC 및 gDNA의 공간적 핵 공-분포를 현미경으로 측정한다. 일부 구현예에서, 객담 샘플은 대상체의 호흡 기관에 고장성(hypertonic) 염수를 투여하고; 상기 고장성 염수를 흡입한 결과 대상체로부터 방출된 객담의 양을 수집하는 것을 포함하는 방법에 의해 대상체로부터 얻는다. 일부 구현예에서, 고장성 염수는 분무기를 통해 투여된다. 특정 구현예에서, 고장성 염수는 3 내지 5% NaCl이다. 특정 구현예에서, 현미경은 500 나노미터 이하의 분해능을 갖는 공초점 주사 현미경이다.
다양한 구현예에서, 본 발명은, 대상체로부터 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 세포의 핵에서 전체 5-메틸시토신(5mC) 함량 및/또는 5mC 및 전체 DNA(gDNA)의 공간적 핵 공분포를 측정하는 단계; 세포의 핵에서 전체 5mC 함량 및/또는 5mC 및 gDNA의 공간적 핵 공분포가 비-암성 또는 비-전암성 참조 세포 및/또는 비-암성 또는 비-전암성 세포 집단과 현저히 상이한 경우에 상기 세포가 암성이거나 또는 전암성인 것으로 결정하는 단계; 및 세포가 암성 또는 전암성인 것으로 결정되는 경우, 대상체는 임상적으로 검증가능한 암이 발병할 위험이 높은 것으로 결정하는 단계를 포함하는 방법을 교시한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 또한 대상체에 임상적으로 검증가능한 암이 발병할 위험이 높다고 결정되는 경우 또는 대상체에 임상적으로 검증가능한 암이 발병했다는 것이 결정되는 경우에 대상체의 암을 치료하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 객담을 포함한다. 일부 구현예에서, 객담은 호흡기 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 암성 세포 또는 전암성 세포는 폐암 기원이다. 특정 구현예에서, 대상체는 담배를 피운 병력이 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 담배를 피운 병력이 없다.
예시적인 구현예가 참조 도면에 도시되어 있다. 본원에 개시된 구현예 및 도면은 제한적인 것이 아니라 예시적인 것으로 간주되어야 한다.
도 1은, 본 발명의 일 구현예에 따라, (1) 세포학적 표본 제조/염색, (2) 표본의 3D-이미징(imaging), (3) 표본 특성화를 위한 컴퓨터 이미지/데이터 분석의 3단계를 포함하는 3D 정량적 DNA 메틸화 이미징(3D-qDMI)의 작업 흐름도를 도시한다.
도 2는, 본 발명의 일 구현예에 따라, 3D 이미지 분석(DU145 인간 전립선 암 세포로 나타낸 예)의 작업 흐름도를 도시한다. 5-메틸시토신(5mC)과 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)의 두 채널로부터의 공초점 2D 이미지 스택이 로딩된다. DAPI는 전체 핵 DNA(gDNA)를 나타낸다. 추출된 핵 5mC/DAPI 패턴은 두 채널의 복셀(voxel)-세기의 2D 밀도 산포도로서 표시된다. 두 개의 선택된 핵에 대한 실시예 패턴이 표시된다. 전체 집단의 5mC/DAPI 공-분포 패턴은 핵 5mC 및 DAPI 신호의 고 차등 공-분포를 나타내는 외관/통계에서 뚜렷할 수 있는 모든 개별적인 핵으로부터의 패턴 중첩을 통해 생성된다. 산포도의 축에 표시된 단위는 임의 세기 단위이다.
도 3은, 본 발명의 일 구현예에 따라, 3D-qDMI의 진단 출력(좌측): 5mC(녹색) 및 gDNA/DAPI(청색) 텍스처 특징(DNA 메틸화 표현형)에 기초한 객담 세포 집단의 특성화 형광 이미지를 나타낸다. 세포는 색상 코드와 관련된 값 범위가 증가하는 "소프트-한정자(soft-qualifier)"에 의해 서로 다른 유사도로 분류될 수 있다(우측). 3D-qDMI 소프트웨어는 이러한 코드를 사용하여 원래의 형광 이미지(모든 공초점 이미지 층에서)를 컬러 맵(color map)과 해당 표 형식 디스플레이로 변환하여 결과 데이터를 더 잘 보여주고 해석할 수 있도록 한다. 이 데이터는 여러 유형의 세포를 식별하고 나열하여 세포 집단에서의 DNA 메틸화 표현형의 이질성을 결정한다.
도 4는, 본 발명의 일 구현예에 따라, 정상 실질(parenchyma) 및 새로 진단된 수술적 절제된 폐암으로부터의 형광 표지된 절편의 종양 영역을 도시한다. 정상 소엽(A)과 확대된 박스 하위영역(B)의 세포핵(파란색)은 동일한 절편 상의 종양(C)과 확대된 상자 하위영역(D)의 도관 영역에서 심하게 저 메틸화된 핵에 비해 고도의 DNA 메틸화를 보여준다; 시토케라틴 8(적색)이 상피 구획을 묘사하는 마커로 사용되었다.
도 5a 및 5b는, 본 발명의 일 구현예에 따라, 3D-qDMI에 의한 세포 및 조직의 전체 DNA 메틸화 표현형을 도시한다. 이 방법은, 각각의 세포 카테고리에 대해 선택된 핵 N1 및 N2에 대해 도시된 각각의 핵에 대해서뿐만 아니라 참조 플롯으로서의 전체 세포 집단에 대한 개별 히트 맵 산포도(DAPI = x 축, 5mC = y 축)로 계산되고 표시된, 차등 5mC/DAPI 분포 패턴(산포도)을 기반으로 한 다양한 세포 유형들을 성공적으로 구별할 수 있었다. 비소 세포 폐암(NSCLC) 세포주 A549 및 H157은 불멸화된 상피 호흡기 세포(BEAS-2B)에 비해 전체 5mC의 감소를 나타낸다. A549 세포보다 전이 잠재력이 더 높다고 보고된 H157 세포는 훨씬 더 저 메틸화된다(더 평평한 곡선). 동일한 비교 관계는 폐암 환자와 인접한 정상 폐 조직으로부터 외과적으로 제거된 조직에서 발견될 수 있으며 또한 폐암 환자 대 건강한 사람(암이 없는)의 대응하는 객담 샘플에서 찾을 수 있다: 건강한 객담 세포에서 발견되는 세포분석기 5mC/DAPI 시그니처(signature)는 표현형 정상 영역(실제 이미지의 경우 도 3 참조) 및 BEAS-2B 세포에서 보이는 패턴과 매우 유사하다. 대조적으로, 심각한 저 메틸화는 종양 영역 및 보다 악성인 H157 세포주(높은 전이 잠재력)에서의 세포 시그니처와 매칭되는 암 환자의 - 정상 5mC-표현형(N1-유형)을 가진 더 많은 수의 세포가 배경인 - 소수의 객담 세포(N2-유형)에서 관찰될 수 있다. 즉, 비정상적인 5mC-표현형을 가진 희소한 객담 세포는 (종양 및 종양-유도된 세포주에서) 잘 특징지어지는 악성 암세포와 매우 유사하다. 회귀선(노란색 점선)과 위쪽 및 아래쪽 신호 경계선 ML1 및 ML2가 특징적이며 각각의 프로토타입 세포 유형에 대해 4개의 각 α, β, γ 및 δ를 결정한다. 생성 계수 F = [(α/γ) × (β/δ)]는 각각의 세포 유형에 따라 다르다. 모든 세포 집단은 높은 균질성: 즉, 각각의 카테고리-맵에 의해 판단되는 세포들 사이의 고도의 5mC-표현형 유사성 및 각각의 전체 집단의 산포도에 대한 개별 핵(N1 및 N2)의 산포도 사이의 유사성을 나타낸다. 도 5a 및 5b의 산포도의 축상에 표시된 단위는 임의 세기 단위이다.
도 6은, 본 발명의 구현예에 따라, 유도된 객담으로부터 유래된 비교적 편평한 인간 상피 세포의 명 시야 현미경 이미지를 도시한다. (A) 세포를 객담의 점액-액체 분획으로부터 단리하고 배양 기법을 사용하여 유리 슬라이드 상에 포획하였다. 몇 ml의 객담은 수백에서 수천 개의 세포를 함유할 수 있다. (B) 영역 확대도는 단핵 적층 세포들의 상대적 하위구조를 나타낸다.
도 7은, 본 발명의 일 구현예에 따라, 형광 표지된 객담-유도된 인간 세포의 공초점 이미지를 도시한다. 세포질은 상피-세포 마커 시토케라틴 19(적색의 CK19)에 의해 표시되고, 세포핵은 DAPI(청색)에 의해 표시되며, 전체 핵 DNA 메틸화는 5mC에 특이적인 항체(녹색)에 의해 시각화된다. 건강한 사람(대조군)의 객담은 고도의 메틸화 세포(유형 1, 왼쪽 칼럼)의 압도적인 다수 및 산발적인 몇몇의 CK19-양성 저 메틸화 세포(유형 2, 왼쪽 칼럼)를 함유한다. 저 메틸화는 세포 분열 이후 초기 단계에 효과가 있다고 가정한다. 대조적으로, 폐암 환자의 객담은 추가로 세포질이 거의 없는 둥근 세포를 상당 부분 함유하고 있다(유형 2, 오른쪽 칼럼). 이들 세포는 CD34/CD45 음성이어서 조혈 및/또는 백혈구 특성이 아님을 나타낸다. 산포도로 제시된 각각의 핵 5mC/DAPI 코드 분포 패턴은 두 명의 객담 기증자 그룹에서 정상적으로 메틸화된(유형 1) 세포가 가파른 회귀선(∂> 45°)을 나타내는 반면, 저 메틸화 세포(유형 2)는 훨씬 더 편평한 회귀선(∂<< 45°)을 나타내는 것을 보여준다. 더욱이, 폐암-특이적 둥근 세포의 전형적인 시그니처는 5mC 및 DAPI의 공-분포가 훨씬 덜 분산되어 있고 좁다. 산포도의 축에 표시된 단위는 임의 세기 단위이다.
본원에 인용된 모든 문헌은 본원에 완전히 개시된 것처럼 그 전체를 본원에 참고로 인용한다. 다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 문헌[Allen et al., Remington : The Science and Practice of Pharmacy 22 nd ed., Pharmaceutical Press (September 15, 2012)]; [Hornyak et al., Introduction to Nanoscience and Nanotechnology, CRC Press (2008)]; [Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3 rd ed., revised ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2006)]; [Smith, March's Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 7 th ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2013)]; [Singleton, Dictionary of DNA and Genome Technology 3 rd ed., Wiley-Blackwell (November 28, 2012)]; 및 [Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012)]은 당업자에게 본원에 사용된 다수의 용어에 대한 일반적인 지침을 제공한다. 항체 제조에 대한 참고문헌에 대해서는 문헌[Greenfield, Antibodies A Laboratory Manual 2 nd ed., Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor NY, 2013)]; [
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and Milstein, Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion, Eur. J. Immunol. 1976 Jul, 6(7):511-9]; [Queen and Selick, Humanized immunoglobulins, U. S. Patent No. 5,585,089 (1996 Dec)]; 및 [Riechmann et al., Reshaping human antibodies for therapy, Nature 1988 Mar 24, 332(6162):323-7]을 참조한다.
당업자는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 많은 방법 및 물질을 인식할 것이다. 실제로, 본 발명은 기재된 방법 및 물질에 결코 제한되지 않는다. 본 발명의 목적을 위해, 특정 용어가 하기에 정의된다.
본원에서 사용된 "상태" 및 "질환 상태"는 폐암, 두경부암, 상부 호흡소화기관암, 자궁경부암, 난소암, 요도암, 방광암 및 대장암 등을 비롯한 암 또는 전암과 관련된 상태를 포함할 수 있지만 이에 국한되지 않는다.
본원에서 사용된 "포유동물"은 제한 없이 인간 및 비인간 영장류 예를 들어 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종; 소, 양, 돼지, 염소 및 말과 같은 가축; 개 및 고양이와 같은 육종 포유류; 마우스, 랫트 및 기니아 피그와 같은 설치류를 비롯한 실험용 동물 등을 포함하는 포유류의 모든 구성원을 의미한다. 이 용어는 특정 연령이나 성별을 나타내지 않는다. 따라서 성인과 신생아는 남성인지 여성인지에 관계 없이 상기 용어의 범위에 포함된다. 암 또는 전암이 본원에 기재된 본 발명의 방법에 따라 인간에서 검출될 수 있지만, 본 발명의 방법에 따라 임의의 포유동물에서 암을 검출하는 것은 본 발명의 범주 내에 있다.
용어 "전체 5mC" 및 "5mC 함량"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 각각의 경우에 세포핵에 존재하는 5-메틸시토신 분자의 총량으로 정의될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "전체 DNA(gDNA)"는 세포핵에 존재하는 DNA의 총량을 의미한다.
본원에서 사용된 "임상적으로 검증가능한 암"이란 용어는 최소-침습적 종격 내시경 검사, 비-침습적 방사선 촬영법 예를 들어 컴퓨터 단층 촬영(CT), 양전자 방출 단층 촬영(PET), 자기 공명 영상(MRI) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 전통적인 암 검출 수단에 의해 검증할 수 있는 암을 의미한다.
추가적인 배경으로, DNA 메틸화와 같은 후생적 메커니즘은 다중 세포 시스템의 개발, 건강 유지, 및 유전적 돌연변이의 공존과 함께 그리고 심지어는 공존 없이도 노화 중에 그리고 암과 같은 질환 가속시 구조적 및 기능적 감소에 강한 영향을 미치고 있음이 점점 더 분명해지고 있다. 따라서 DNA 메틸화를 측정하는 방법은 암 퇴치 및 건강한 노화 확보를 위한 노력에서 이러한 메커니즘을 이해하는 데 중요하다. 분자 기법과 함께 이미징이 세포와 조직의 DNA 메틸화의 차등 정량화에 없어서는 안될 역할을 한다는 것은 의심의 여지가 없다.
DNA 메틸화의 변화를 측정하는 것은 중요하다. 왜냐하면, 이는 발암 및 종양 진행의 초기 사건과 관련이 있으며 조기 진단 및 치료 모니터링에서 시그니처 역할을 할 수 있기 때문이다. 이러한 의미에서, 폐암의 조기 발견을 위한 정량적 DNA 메틸화 이미징을 적용하는, 본원의 특성 구현예에서 기재된 바와 같은, 본 발명자들의 접근법은 세포 단위별 병리 진단을 위한 특성화를 위해 폐색된 호흡기 세포에서의 DNA 메틸화와 같은 후생적 특징을 동일계내(in situ) 측정하는 개념을 부활시킨다.
1990년대 말에 조직의 특성 규명을 위해 도입되었던 DNA 메틸화 이미징은 PCR 기반, 어레이 기반, 시퀀싱, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 질량 분석법을 비롯하여 동시대에 개발된 분자적 방법에 비해 다음과 같은 두 가지 이유로 많은 인기를 얻지 못했다: (i) 이는 민감도, 다중화 능력이 부족하거나 또는 어레이의 재현성/일관성에 영향을 미치는 검출용 방사성 표지된 또는 효소적 리포터와 함께 적용되었고 (ii) 낮은 이미지 분해능으로 인해 차등 결과에서 충분한 유의성을 제공하지 못했다. 최근 몇 년 동안 고분해능 이미징 및 계산 용량의 엄청난 향상은 생물의학 연구 및 임상 진단에 적용할 수 있는 세포 기반 분석에서 보다 정교한 툴(tool)을 개발하는 데 도움이 되었다. 이것은 전체 DNA 메틸화와 같은 후생적 리포터에 의한 고차원 염색질 구조상의 대규모 변화의 비파괴 이미징 개념을 재검토하기 위한 3D-qDMI 개발의 전제조건이기도 했다.
요약하면, 본원에 기술된 3D-qDMI 접근법은 (1) 5-메틸시토신(5mC) 및 전체 DNA(gDNA)의 고분해능 이미징 및 (2) 조기 폐암 검출을 위한 진단 시그니처로서의 5mC 관련 3가지 특징: (i) 5mC 부하(함량), (ii) 5mC 및 gDNA의 공간적 핵 공-분포 및 (iii) 첫 번째 두 가지 5mC 특징을 기반으로 한 세포-집단 이질성 측정의 디지털 추출을 가능하게 하여, 객담 샘플에서의 호흡기 상피 세포를 특성화하기 때문에 특히 유리하다(도 2).
많은 세포 집단에서 평균 5mC 측정을 하거나 세포핵에서 평균 5mC 세기 값만을 측정하는 몇몇 이전의 저분해능 이미징-기반 시도와 현재의 분자적 접근법과 비교하여, 3D-qDMI는 세포성 변이, 특히 gDNA의 저 메틸화를 통해 일어나는 DNA 메틸화 불균형의 2차적인 효과를 고려하여 차등 5mC-관련 정보의 추출을 활용한다. 특히 후자의 메커니즘은 세포핵 내 게놈의 재구성을 유도하여 핵 제조에 영향을 미친다. 이러한 현상은 기본적인 세포 생물학적 연구에서 잘 설명되어 있지만 아직 암 병리학에서 잘 이용되지는 못했다. 본 발명의 방법의 일부 구현예에서 적용된 이미지 분석은 이러한 갭을 커버하고 상기 현상을 반영하는 2가지 유형의 신호: (a) 면역형광 표적화를 통해 생성된 5mC-신호 및 (b) DAPI가 고도로 반복적이며 콤팩트한 헤테로색소 시퀀스의 주요 구성요소인 AT-풍부 DNA 내로 인터칼레이트됨에 따라, 동일한 세포의 후속적인 대조-염색에 의해 생성되는 DAPI-신호로 표현되는 gDNA의 세기 분포로서 관련 변화를 표시한다. 전반적으로, 이 방법은 세포 형태학(상피 및 중간엽 세포 표현형) 및 성장 거동(고-증식성 암세포, 알맞게 성장하는 정상 세포 및 성장-정지된 노화 세포)과 상관관계가 있는 차등 DNA 메틸화 표현형(5mC/DAPI 텍스처 특징)의 스펙트럼을 갖는 객담 세포의 지도를 나타내는 이미지를 생성한다.
비록 폐암 세포가 본원에 기술된 방법에 따라 검출될 수 있는 암세포의 한 유형이지만, 5mC 함량 및/또는 5mC 및 gDNA 공간적 핵 공-분포 분석은 임의의 암세포를 검출하는 데 사용될 수 있다.
전술한 추가 배경을 염두에 두고, 특정의 비-한정적인 구현예를 하기에 기술한다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 세포가 암성인지 또는 전암성인지를 결정하는 방법을 교시한다. 본 발명은, 세포의 핵내 5-메틸시토신(5mC) 함량 및/또는 5mC 및 전체 DNA(gDNA)의 공간적 핵 공-분포를 결정하는 단계; 및 세포의 핵에서 5mC 함량 및/또는 5mC 및 gDNA의 공간적 핵 공-분포가 비-암성 또는 비-전암성 참조 세포 및/또는 비-암성 또는 비-전암성 참조 세포 집단과 현저히 상이한 경우에 상기 세포가 암성이거나 또는 전암성인 것으로 결정하는 단계; 또는 세포의 핵에서 5mC 함량 및/또는 5mC 및 gDNA의 공간적 핵 공-분포가 비-암성 또는 비-전암성 참조 세포 및/또는 비-암성 또는 비-전암성 참조 세포 집단과 현저히 상이하지 않은 경우에 상기 세포가 암성이 아니거나 또는 전암성이 아닌 것으로 결정하는 단계를 포함하거나 또는 이들로 이루어지거나 또는 이들로 본질적으로 이루어진다. 이 문맥에서, 중요한 차이는 5mC 함량에서 25% 이상으로 및/또는 δ 또는 ∂로 표시되는 회귀선(추세선이라고도 함)의 각도에서 20° 이상으로 정의됨으로써, (DAPI 값이 x-축을 정의하고 5mC 값이 y-축을 정의하는 경우) 참조 비암성 또는 비-전암성 세포 또는 비암성 또는 비-전암성 세포 집단에 비해, 암성 또는 전암성 세포가 5mC/DAPI 동시발현 산포도의 5mC 함량 및/또는 보다 작은 회귀선 각도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 5mC 함량의 25 내지 99%, 또는 30 내지 80%, 또는 40 내지 60% 차이가 중요하다. 일부 구현예에서, 20 내지 90도 또는 30 내지 80도 또는 40 내지 70도 또는 50 내지 60도의 회귀선 각도가 중요하다. 특정 구현예에서, 세포는 5mC 함량이 비-암성 또는 비-전암성 참조 세포 및/또는 비-암성 또는 비-전암성 참조 세포 집단보다 현저히 낮으면 암성 또는 전암성인 것으로 결정된다. 특정 구현예에서, 세포는 생물학적 샘플로부터 얻어진다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 객담을 포함한다. 특정 구현예에서, 객담은 호흡기 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 암성 세포 또는 전암성 세포의 기원은, 폐로부터 입술 또는 코의 비공까지의 경로에서 임의의 해부학적 구조 또는 일련의 구조와 관련된 세포를 포함하는 상부 호흡소화기관의 것이다. 여기에는 폐, 기관지, 식도, 입, 코, 부비동의 세포가 포함될 수 있지만, 이에 국한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 암성 세포 또는 전암성 세포는 폐암 기원이다. 일부 구현예에서, 암성 세포 또는 전암성 세포는 폐 종양 기원이다. 일부 구현예에서, 암성 세포 또는 전암성 세포는 식도 기원이다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 담배를 피운 병력을 가진 대상체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 담배를 피운 병력을 갖지 않은 대상체로부터 수득된다. 다양한 구현예에서, 생물학적 샘플은 방사선 요법, 화학 요법, 수술 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 폐암 치료를 받은 대상체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 폐암 치료를 받지 않은 대상체로부터 수득된다. 특정 구현예에서, 개별적인 세포핵의 전체 5mC 및 gDNA 함량뿐만 아니라 5mC 및 gDNA의 공간적 핵 공-분포는 세포를 (a) 5mC에 특이적인 항체로 면역형광 염색을 하고 (b) 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 대조염색한 후에 현미경으로 측정된다.
5mC에 특이적인 임의의 상업적으로 입수가능한 모노클로날 항체는 본원에 기술된 본 발명의 방법과 함께 이용될 수 있다. 예를 들어, 5mC 항체는 아비바 시스템즈 바이올로지 코포레이션(Aviva Systems Biology, Corp.)(캘리포니아주 샌디에고), 제네텍스 인코포레이티드(GeneTex, Inc.)(캘리포니아주 어바인), 액티브 모티프 인코포레이티드(Active Motif, Inc.)(캘리포니아주 칼스배드) 및 다이아제노드 인코포레이티드(Diagenode, Inc.)(뉴저지주 덴빌)에서 제공한다. 일부 구현예에서, 5mC 항체는 문헌[Reynaud C, Bruno C, Boullanger P, Grange J, Barbesti S, Niveleau A. Monitoring of urinary excretion of modified nucleosides in cancer patients using a set of six monoclonal antibodies. Cancer Lett 1992 Mar 31;63(1):81]에 기술된 항체이며, 이 문헌은 본원에 완전히 개시된 것처럼 그 전체를 본원에 참고로 인용한다.
특정 구현예에서, 개별적인 객담-유도된 세포의 표현형은 세포를 세포-유형 특이적 마커에 대한 항체로 면역형광 염색을 한 후에 현미경으로 측정한다. 여기에는 시토케라틴 및 세포 표면 분자에 특이적인 항체가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 객담 샘플은 대상체의 호흡기관 내로 고장성 염수를 투여하고; 상기 고장성 염수를 흡입한 결과 대상체로부터 방출된 객담의 양을 수집하는 것을 포함하는 방법에 의해 대상체로부터 수득된다. 특정 구현예에서, 고장성 염수는 초음파 분무기 또는 비-초음파 분무기를 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 고장성 염수는 3 내지 5% NaCl이다.
5mC 함량, gDNA 및/또는 5mC 및 gDNA의 공간적 핵 공-분포의 시각화 및/또는 정량화가 요구되는 본 발명의 구현예에서, 이들 특징은 광학 이미징 시스템 예를 들어 대면적 형광 현미경 및 스캐너, 다초점 현미경 및 스캐너, 다중-광자 현미경 및 스캐너, 초-고분해능 현미경(나노스코프) 및 스캐너, 및 이들의 조합 방식 등의 사용을 통해 시각화 및/또는 정량화될 수 있다. 일부 구현예에서, 현미경이 이러한 시각화 및/또는 정량화에 사용된다. 일부 구현예에서, 현미경은 공초점 주사 현미경이다. 일부 구현예에서, 공초점 주사 현미경은 약 100 내지 200 nm 범위의 횡방향 분해능(x-축 및 y-축) 및 약 500 nm의 수직 분해능(z-축)을 갖는다.
다양한 구현예에서, 본 발명은, 생물학적 샘플이 세포를 포함하는 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 세포핵 내의 5-메틸시토신(5mC) 함량 및/또는 5mC 및 전체 DNA(gDNA)의 공간적 핵 공-분포를 결정하는 단계; 세포핵 내의 5mC 함량 및/또는 5mC 및 gDNA의 공간적 핵 공-분포가 비-암성 또는 비-전암성 참조 세포 및/또는 비-암성 또는 비-전암성 세포 집단과 현저히 상이한 경우에 세포가 암성인지 또는 전암성인지를 결정하는 단계; 및 세포가 암성 또는 전암성인 것으로 결정되는 경우 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 암 대상체를 치료하는 단계를 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 또는 이들로 본질적으로 이루어지는 방법을 교시한다. 일부 구현예에서, 대상체가 암성 또는 전암성 상태를 갖는 것으로 결정되면, 대상체는 치료를 수행하기보다는 질병 진행에 대해 모니터링된다. 일부 구현예에서, 암성 세포 또는 전암성 세포는 본원에서 기술된 바와 같이 호흡소화 기관에서 유래한다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 객담을 포함한다. 일부 구현예에서, 객담은 호흡기 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 암성 세포 또는 전암성 세포는 폐암 기원이다. 일부 구현예에서, 대상체는 본원에 기재된 임의의 암 유형을 포함하여 암에 대해 이전에 치료를 받은 대상체이다. 일부 구현예에서, 대상체는 본원에 기재된 임의의 암 유형을 포함하여 암에 대해 이전에 치료를 받지 않은 대상체이다. 일부 구현예에서, 대상체는 담배를 피운 병력이 있다. 특정 구현예에서, 대상체는 담배를 피운 병력이 없다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 다수의 세포를 포함하는 생물학적 샘플에서의 암성 세포 또는 전암성 세포의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 교시한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은, 생물학적 샘플 내의 다수의 세포 각각에 대한 5-메틸시토신(5mC) 부하/함량 및/또는 5mC 및 전체 DNA(gDNA)의 공간적 핵 공-분포를 결정하기 위한 고분해능 이미징을 이용하는 단계; 및 선택적으로, 상기 MeC 부하 및 5mC 및 gDNA의 공간적 핵 공-분포에 기초하여 복수의 세포에 대한 세포 집단 이질성을 결정하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플 내의 임의의 세포에서의 5mC 부하 및/또는 5mC 및 gDNA의 공간적 핵 공-분포가 비-암성 또는 비-전암성 참조 세포 집단과 현저히 상이한 경우에 및/또는 생물학적 샘플에서 시각화된 세포의 전체 집단의 전체 패턴과 비교하여 생물학적 샘플 내의 임의의 세포가 5mC 부하 및/또는 5mC 및 gDNA의 공간적 핵 공분포에 대해 현저히 상이한 경우에 암성 세포 또는 전암성 세포가 생물학적 샘플에 존재한다고 결정한다. 일부 구현예에서, 5mC 부하 및/또는 5mC 및 gDNA의 공간적 핵 공분포가 비-암성 또는 비-전암성 참조 세포 집단의 것과 현저한 차이가 나지 않는 경우에 및/또는 생물학적 샘플 내의 어떠한 세포도 생물학적 샘플 내의 전체 세포 집단의 전체 패턴과 비교하여 5mC 부하 및/또는 5mC 및 gDNA의 공간적 핵 공분포와 관련하여 현저히 상이하지 않은 경우에 암성 세포 또는 전암성 세포가 생물학적 샘플에 존재하지 않는다고 결정한다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 객담을 포함한다. 특정 구현예에서, 객담은 호흡기 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 검출/결정된 암성 세포 또는 전암성 세포는 폐암과 관련된다. 특정 구현예에서, 검출/결정된 암성 세포 또는 전암성 세포는 비소 세포 폐암(NSCLC)과 관련된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 생물학적 샘플에서 암세포의 존재를 기초로 임의의 단계에서 NSCLC를 포함하는 폐암을 가지는 대상체를 진단하는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 객담은 담배를 피운 병력이 있는 대상체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 객담은 방사선 요법, 화학 요법, 수술 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 폐암 치료를 받은 대상체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 객담은 상기 암 치료법 중 하나 이상을 투여받지 않은 대상체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 객담은 암 치료를 받지 않은 대상체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 객담은 암으로 진단된 적이 없는 개인으로부터 수득된다. 특정 구현예에서, 5mC 패턴은 5mC에 특이적인 항체로 면역형광 염색 후 가시화된다. 일부 구현예에서, gDNA는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 대조염색 후 가시화된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 전술한 시험 방법을 수행함으로써 암성 또는 전암성 세포로 확인된 샘플 중의 세포의 수를 정량화하는 단계, 및 암성 또는 전암성 세포의 수를 암 또는 전암성인 개인의 암성 또는 전암성 세포의 참조 번호와 비교하는 단계, 및/또는 시험된 샘플을 암이 없는 개인의 암성 또는 전암성 세포의 참조 개수와 비교하는 단계를 교시한다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 본 발명의 방법은 대상체로부터 객담 샘플을 얻는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 객담 샘플은 고장성 염수를 대상체의 호흡 기관에 투여하고; 상기 고장성 염수를 흡입한 결과 대상체로부터 배출된 객담의 양을 수집함으로써 얻어진다. 특정 구현예에서, 고장성 염수는 초음파 분무기를 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 고장성 염수는 약 3 내지 5% NaCl이다. 일부 구현예에서, 초음파 분무기는 약 1 내지 2 mL/분의 출력을 갖는다. 일부 구현예에서, 염수 용액은 약 5 내지 20분 동안 흡입된다. 일부 다른 구현예에서, 객담 샘플은 휴대용 분무기를 사용하여 대상체의 호흡 기관 내로 고장성 염수를 분배함으로써 얻어진다. 일부 구현예에서, 고장성 염수는 상기 NaCl의 범위 내에 있다. 일부 구현예에서, 고장성 염수는 전술한 범위 내에서 일정 기간 동안 분배된다.
고장성 염수의 투여가 객담 유도의 한 방법이지만, 객담 유도의 다른 방법이 또한 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 샘플을 얻는 데 사용될 수 있음을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 단지 비-제한적인 예로서, 기관지 내시경 및 기관지 폐포 세척이 또한 사용될 수 있다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 하나 이상의 방법에 따라 암 또는 전암성 상태로 진단받은 대상체를 치료하는 방법을 교시한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 화학 요법 및/또는 방사선 요법을 투여하고/하거나 대상체의 종양의 전부 또는 일부를 절제하기 위한 수술을 수행하는 것을 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 또는 이들로 본질적으로 이루어지고, 여기서 대상체는 본원에 기재된 임의의 방법을 통해 암 또는 전암성 상태로 진단되었다. 일부 구현예에서, 대상체는 폐암으로 진단되었다.
전술한 방법이 대상체의 폐암 및 전암성 병변을 검출하는 것을 목표로 하지만, 상기한 바와 같이, 본원에 기재된 본 발명의 방법의 동일한 기본적 원리를 이용하여 샘플을 분석하고 다른 기원의 암 또는 전암성 병변을 검출할 수도 있다. 단지 비-제한적인 예로서, 객담 및/또는 점액 분비물을 분석하여 두부 및/또는 경부 암의 유무를 결정할 수 있고; 결장 및/또는 직장 분비물을 분석하여 결장암 및/또는 직장암의 유무를 결정할 수 있고; 자궁 경부 분비물을 분석하여 자궁 경부암은 자궁 경부암의 유무를 결정할 수 있고; 질 및/또는 자궁 경부 분비물을 분석하여 난소암의 유무를 결정할 수 있고; 요도로부터의 유체를 분석하여 요도, 방광 또는 신장암의 유무를 결정할 수 있다.
또한, 5mC를 포함하는 시험이 본원에 기재된 실시예의 주된 초점이지만, 당업자는 3-메틸시토신, 5-하이드록시메틸시토신, 5-포밀시토신 및 5-카복실시토신과 같은 다른 시토신 변이체가 또한 본원에 기재된 것과 본질적으로 동일한 검출 및 분석 방법을 적용하여 암성(또는 전암성) 및 비암성 세포를 구별하기 위한 기초로 사용할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 임의의 시토신 메틸화를 평가하는 것은 본원의 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 더욱이, 본원에 기재된 특정 실시예에서 기술된 시험이 핵 부피뿐만 아니라 gDNA를 묘사하기 위한 1차 염료로서 DAPI를 포함하지만, 당업자는 또한 비서열-특이적 방식으로 이중 가닥 DNA를 결합시키는 다른 염료가 gDNA 정량화에 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이는 프로피듐 요오다이드, 회흐스트(Hoechst) 염료(예를 들어, 회흐스트 33258 및 회흐스트 33342), 에티듐 브로마이드, SYBR 그린, SYBR 골드, 피코(Pico) 그린, SYTOX 염료(예를 들어, SYTOX 그린, SYTOX 블루 및 SYTOX 오렌지), SYTO 염료, YOYO 및 TOTO 계열의 염료(예를 들어, YOYO, TOTO, JOJO, BOBO, POPO, YO-PRO 및 PO-PRO), 및 액티노마이신 D 및 7-아미노액티노마이신 D(7-AAD)을 포함할 수 있으나 이들로 국한되지는 않으며, 이들도 동일한 목적으로 사용될 수 있다.
전암성 또는 암성 세포와 이들의 정상 세포들 사이의 전체 핵 5mC 부하 및 분포의 상당한 차이를 고려할 때, 이러한 차이는 생물학적 샘플 내의 수천 가지의 세포들의 특성 분석을 위한 단일-세포 분해능의 신속한 병렬적 방식의 광학 현미경을 사용하여 시각화하고 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, 객담-유도된 세포 및 세포 집단에서의 5mC의 전체 핵 함량 및 상대적 분포 대 전체 gDNA(DAPI에 의해 묘사됨)가 분석된다. 이러한 핵체는 정적 상태가 아니며 정상적인 건강한 세포가 전암성 및 암성 세포로 세포성 변형되는 동안 재구성된다. 이러한 맥락에서, 산포도의 강력한 측면은 변수들 간의 단순한 관계의 혼합 모델을 묘사할 수 있는 능력이다. 이러한 관계는 세포의 패턴을 특정 시그니처로 반영할 수 있으며, 여기서 이들 변수는 DAPI-염색된 gDNA에 대한 핵 5mC 패턴의 경우에 나타낸 바와 같은 핵 구조일 수 있다(문헌[(Tajbakhsh J, Wawrowsky KA, Gertych A, Bar-Nur O, Vishnevsky E, Lindsley EH, Farkas DL)]; [Characterization of tumor cells and stem cells by differential nuclear methyl- ation imaging. In: Farkas DL, Nicolau DV, Leif RC, editors. Proceedings Vol. 6859 Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues VI 2008. p 68590F]). 본 발명자들은 이러한 재구성이 전체 5mC 및 gDNA의 신호 분포를 산포도화시키는 것으로 동적 모니터링할 수 있다는 것을 보여 주었고, 여기서 이들의 차등 분포는 플롯된 패턴의 변화로 볼 수 있게 되었다. 즉, 2D 산포도는 표적화된 2개의 핵체의 신호 주파수 공-분포를 나타내며, 공-분포 플롯은 세포-특이적 시그니처로 간주될 수 있다(문헌[Tajbakhsh J, Wawrowsky KA, Gertych A, Bar-Nur O, Vishnevsky E, Lindsley EH, Farkas DL]; [Characterization of tumor cells and stem cells by differential nuclear methylation imaging. In: Farkas DL, Nicolau DV, Leif RC, editors. Proceedings Vol. 6859 Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues VI 2008. p 68590F]; [Gertych A, et al. Automated quantification of DNA demethylation effects in cells via 3D mapping of nuclear signatures and population homogeneity assessment. Cytometry A 2009; 75:569-83]; [Gertych A, et al. Measuring topology of low-intensity DNA methylation sites for high-throughput assessment of epigenetic drug-induced effects in cancer cells. Exp Cell Res 2010; 316(19):3150-60]; [Oh JH, et al. Nuclear DNA methylation and chromatin condensation phenotypes are distinct between normally proliferating/aging, rapidly growing/immortal, and senescent cells. Oncotarget 2013; 4:474-93]). 일부 구현예에서, 전체 5mC 및 gDNA의 함량과 함께 이들 5mC/gDNA 공-분포 시그니처는 객담-유래 개별 세포 및 전암성 및 암성 세포의 동정을 위한 세포 집단의 특성 분석에서 고려되는 3가지 파라미터/바이오마커이다.
당업자는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 많은 방법 및 물질을 인식할 것이다. 실제로, 본 발명은 기술된 방법 및 물질에 결코 제한되지 않는다.
실시예
실시예 1
추가적인 배경
폐암 및 현재의 진단 상태
2010년에 미국에서 보고된 폐암의 새로운 사례가 20만 건 이상 발생하여 모든 새로운 암 사례의 15%를 차지하였다. 같은 기간에 추정된 폐암 사망자 수는 약 16만 명으로 모든 암-관련 사망자의 28%를 차지하였다. 불행히도 제한된 치료 옵션으로 인해 폐암은 암 관련 사망의 가장 흔한 원인이다. 이러한 질환이 초기 단계에서 진단되면, 종양의 완전한 외과적 절제가 치료의 유리한 기회를 제공한다. 따라서 이러한 질환의 조기 검출이 지난 수십 년 동안 중점적으로 많이 시도되었다. 흉부 X-레이, 흉부 컴퓨터 단층 촬영(CT), 양전자 방출 단층 촬영(PET) 스캔을 포함한 방사선 촬영 기법을 이용한 여러 시험에서 명확하지 않은 임상적 이점이 혼재된 결과를 보였으며 비용이 매우 많이 들었다. 위에서 기술한 바와 같이, 흉부 CT 스캔을 포함한 폐암의 조기 검출을 위한 방사선 촬영 기법은 높은 방사선량을 필요로 하기 때문에 그 자체로 자주 사용하면 2차 악성 종양이 발생할 위험이 더 높다. 결과적으로, 흉부 CT 스캔을 폐암 스크리닝에 자주 사용하는 것은 안전하지 않거나 경제적이지 않을 수 있다.
중요하게도, 이전의 시험들은 폐암의 조기 발견을 위해 객담 세포학을 이용하였지만, 주로 박리된 상피 호흡기 세포의 형태학적 변화를 평가하는 것에 의존하였으며, 각각의 시험은 의미 있는 임상적 이점을 나타낼 수 있는 시점까지는 폐암 사례를 검출하지 못했다.
반면에, 고위험 환자의 객담 샘플에서 특정 유전자의 메틸화 상태 평가는 폐암 병변의 조기 검출에 성공적이었다. 불행히도 폐암은 이질적인 질병 군이며 모든 경우에 균일한 이상이 확인되지는 않는다. 마찬가지로 많은 수의 세포에서 유전자 메틸화 상태를 평균화하는 세포 샘플의 분석은 객담의 암세포의 작은 하위 그룹에 특이한 중요한 미묘한 정보를 위장하여 분석 결과를 편향시킬 수 있다. 따라서 폐 종양을 검출하기 위해 모든 객담 세포에 걸친 유전자의 하위-세트의 이상에 의존하는 것은 아마도 사례의 하위 그룹만을 커버할 수 있다. 종래에 이용가능한 진단 방법의 단점을 고려한 후에, 본 발명자들은 객담 내의 박리된 호흡기 세포의 전체적인 DNA 메틸화 상태를 폐암의 조기 검출을 위한 도구로서 세포 단위별 방식으로 분석하고자 하였다.
암 진단에서의 DNA 메틸화
정상 세포의 완전한 후생적 평형은 세포가 형질전환될 때 실질적으로 변한다. DNA 수준에서 생성되는 후생적 변형은 두 가지 범주로 나뉜다: (i) CpG-섬이라고 불리는 유전자가 풍부한 게놈 부위의 유전자 프로모터에서 CpGs의 유전자-특이 적 과메틸화, (ii) 반복적인 DNA 요소에서 발생하는 많은 양의 게놈-전반의 저메틸화. 불규칙적인 메틸화 패턴은 여러 가지 암 유형과 관련이 있다. 게놈-전반의 저메틸화는 악성 종양과 밀접한 관련이 있으며 도처에서 발견된다. DNA 저메틸화의 분석은 거의 개발되지 않았다. 연구 모델로 널리 사용되는 암 세포주는 조직-특이성과 확률론적 과정으로 인한 결과를 반영하는 게놈-전반의 탈메틸화에 큰 변화를 보여준다. 악성 세포는 정상적인 것보다 20 내지 60% 적은 게놈성 메틸시토신을 함유할 수 있다. 메틸 기의 소실은 주로, 진화를 통해 레트로바이러스로서 대부분 획득되는 짧고 긴 산재된 핵 요소(각각 SINES 및 LINES)와 같은 전이 요소(게놈의 약 48%)를 포함한, 인간 게놈의 90% 이상을 차지하는 반복적인 DNA 서열의 저메틸화에 의해 이루어진다. 전반적인 메틸화는 여러 종류의 암 유형에서의 임상적 결과와 전반적인 메틸화 수준 사이의 연관성에 의해 입증된 바와 같이 임상적으로도 관련이 있다. 전반적인 저메틸화는 전암성 병변이 진행됨에 따라 전반적인 메틸화의 손실이 더 두드러지기 때문에 암의 진행과 관련이 있는 것으로 보인다. 현재까지 차등 DNA 메틸화 분석은 주로 전기영동, 크로마토그래피, PCR-기반, 어레이-기반 및 시퀀싱 기술을 포함한 분자적 접근법을 통해 정량적으로 평가되었다. 특이성, 민감성 및 이들 방법의 고유한 단일-염기 분해능이 엄청나게 향상되었지만, 단일 세포의 고-처리량 분석에서는 기술적으로 어려움을 겪고 있다. 여기에는 멀티플렉싱(multiplexing)에서의 PCR-기반 접근법의 제한, 특히 반복적인 요소의 심문을 위한 전체 게놈 시퀀싱의 해결해야 할 민감성 및 비용 문제가 포함된다. 대안적으로, DNA 메틸화 불균형의 유병률과 부하, 특히 반복적인 요소의 저메틸화를 고려하여, 근본적인 분자적 과정이 광학 현미경으로 볼 수 있는 대규모 염색질 재구성을 필요로 하기 때문에, 이미징-기반의 전반적인 핵 5mC 패턴 평가가 많은 수의 세포를 동시에 분석하고 특성화할 수 있는 강력한 툴을 제공한다.
정량적 DNA 메틸화 이미징의 중요성
본원에서 입증된 바와 같이, 정량적 DNA 메틸화 이미징(3D-qDMI) 방법이 개발되어 폐암에 적용되었다. 이러한 비파괴적 방법은 세포와 조직의 특성을 규명하기 위해 5-메틸시토신 부하와 공간적 핵 분포의 병행하는 정량적 측정을 필요로 한다(문헌[Tajbakhsh J, et al. Characterization of tumor cells and stem cells by differential nuclear methylation imaging. In: Farkas DL, Nicolau DV, Leif RC, eds. Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues. San Jose, CA: Proceedings of the SPIE 2008; 6856:6859F1-10]; [Gertych A, et al. Automated quantification of DNA demethylation effects in cells via 3D mapping of nuclear signatures and population homogeneity assessment. Cytometry A 2009; 75:569-83]; [Gertych A, et al. Measuring topology of low-intensity DNA methylation sites for high-throughput assessment of epigenetic drug-induced effects in cancer cells. Exp Cell Res 2010; 316:3150-60]; [Gertych A, et al. Homogeneity assessment of cell populations for high-content screening platforms. In: Information Technology in Biomedicine. Vol. 2. Advances in intelligent and soft computing, Vol. 69. Ewa Pietka and Jacek Kawa, Editors, Springer Verlag, Heidelberg, Germany]; [Tajbakhsh, J. et al. (2012). 3-D Quantitative DNA Methylation Imaging for Chromatin Texture Analysis in Pharmacoepigenomics and Toxicoepigenomics. In Epigenomics: From Chromatin Biology to Therapeutics. K. Appasani, editor. Cambridge University Press, Cambridge, United Kingdom] 참조; 이들 문헌 각각은 본원에 완전히 개시된 것처럼 그 전체가 본원에 참고로 인용된다). 3D-qDMI의 구현예의 작업 흐름도가 도 1에 도시되어 있다.
5mC 부하 및 분포에서 큰 동적 범위가 주어지는 경우, 3D-qDMI는 이질성 객담 샘플 내에서 수천 개의 세포를 신속하고 병렬적인 형태적 단일-세포 분해능 특성을 제공한다. 다음은 폐암 진단 및 임상 의사 결정에서 객담 샘플과 같은 비-침습적 대체물을 사용하는 데 적용할 수 있는 3D-qDMI의 장점 중 일부를 강조한다: (i) 3D-qDMI는 오류가 발생하기 쉬운 분리 방법을 통해 세포 농축을 필요로 하지 않고; (ii) 상기 방법은 시간 소모적인 DNA 추출 및 DNA 증폭을 필요로 하지 않으며; (iii) 3D-qDMI는 세포 단위별 분석을 제공하고; (iv) 상기 방법은 DNA 메틸화 특징과 관련하여 상이한 세포 유형의 빈도를 포함하는 세포 집단의 이질성 평가를 가능하게 하고; (v) 무관한 세포를 확인하고 분석에서 제외하여, 조혈 세포에 침투하는 것에 의한 샘플 불순물을 통한 데이터 비대칭을 방지하고; (vi) 비용 효율적인 세포분석 접근법이 자동화될 수 있으며 규모에 따라 조정될 수 있으므로 임상 설정을 쉽게 개발하고 구현할 수 있다. 세포분석 접근법은 동시 다중-색상 고화질 이미징에 적용할 수 있다. 따라서, 관심 세포 및/또는 침윤 조혈 세포는 세포-특이적 마커에 대해 추가로 표지될 수 있다. 결과적으로, 관련없는 세포를 출력 데이터에서 식별하고 데이터 분석 전에 제거할 수 있다. 또한, 이 방법은 객담-유래 세포의 침전을 위한 지지체로서 현미경 슬라이드 및 생체분자학회(SBS)-포맷 마이크로플레이트를 사용할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 암 진단을 위해 상기 포맷을 일상적으로 적용하는 고 처리량의 임상 및 진단 환경에서의 구현 가능성을 갖는다. 상세하게는, 세 가지 단계의 샘플 제조, 염색 및 스캐닝은 기존의 상업적으로 이용 가능한 고-처리량 기기를 사용하여 자동화할 수 있다. 이미지 및 데이터 분석은 자동화된 방식으로 자연스럽게 수행되며 전산 용량에 의해서만 제한된 전산화된 프로세스이다.
샘플 분석
본원에 기술된 특정 구현예에서 구현된 3D-qDMI 소프트웨어는 이미지 프레임 내에서 (집단 분석 및 결과-출력과는 대조적으로) 개별적인 세포의 정교한 3-D 이미지 분석을 수행하도록 설계되었으므로, 변수 통계에 대한 세포의 유연한 제거 및 조합을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 5mC/DAPI 동시-국소화(colocalization) 패턴의 결과는 산포도로 나타낼 수 있다(도 2 참조). 그러나 당업자는 이러한 유형의 데이터를 표현하는 많은 다른 방법이 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 5mC/DAPI 동시-국소화 패턴과 같은 5mC 특징은 집단 내의 세포들 간에 다를 수 있다. 따라서, 세포 집단 이질성 평가는 세포의 조성, 즉 악성 암세포와 유사한 이상한 MeC 표현형을 나타낼 수 있는 적은 수의 세포의 동정에 중요한 표현형 변이의 정도를 결정하는 데 중요한 특징이다. 동질성은 개별 핵 5mC/DAPI 패턴과 모든 개별적인 핵 패턴(참조 패턴)의 합계를 나타내는 전체 세포 집단의 전체 패턴 사이의 관계를 나타냄으로써 전체 세포 집단 내의 구조적 유사성의 비교에 의해 평가될 수 있다.
객담 시험
본 발명자들은 건강한 개인(암의 병력이 없는 비-흡연자)의 객담, 폐암 환자(흡연자)의 객담 세포 및 매칭되는 조직 표본으로부터 유도된 인간 호흡기 세포뿐만 아니라 3개의 인간 세포주에서 3D 핵 5mC 패턴을 탐색하였다. 세포주에는 불멸화된 정상 인간 상피 세포주(BEAS-2B), NSCLC 세포주 A549(폐포 기저 상피 세포) 및 H157(고도 침윤성 폐암 세포)이 포함되어 있다. 도 4는 새로 진단되고 수술적으로 절제된 폐암의 형광 표지된 절편의 정상 실질 및 종양 영역을 도시한다. 본 발명자들은 거의 전반적으로 저메틸화된 암세포의 5mC/DAPI 패턴 및 암 환자의 비정상적 객담 세포와 현저히 상이한 건강한 세포들 사이에서의 공통적인 전반적인 DNA 메틸화 패턴을 관찰하였다(도 5). 세 가지 상이한 세포주 및 객담-유래 세포의 모든 집단과 정상 조직은 5mC/DAPI 공-분포에 대해 고도의 균질성(KL 카테고리 맵을 통해 시각화됨)을 나타내었으며 세포 집단 수준으로 개별적인 대표 핵에 대한 산포도로 표시되었다.
본 발명자들은 각각의 세포 유형의 측정 가능한 디스크립터(descriptor)를 도입하였다(도 5): 플롯의 회귀선 및 상부 및 하부 신호 경계선(ML1 및 ML2)은 각각의 프로토타입 세포 유형에 대해 특징적이며 4개의 각(α, β, γ 및 δ)을 결정한다. 생성 차등 인자 F = [(α/γ)×(β/δ)]는 각각의 세포 유형에 특이적이다: 0.54(BEAS-2B), 0.42(A549), 0.12(H157), 0.78(전형적인 정상 조직 세포), 0.45(정상 객담 세포), 0.44(암 환자 객담의 대다수 N1-형 세포), 0.01(암 환자의 객담 내 N2-형 세포) 및 0.05(전형적인 암 조직 세포). 이러한 측정은 정상 세포와 악성 세포를 검출하기 위한 전반적인 메틸화 패턴을 차별화하는 동력을 강조한다. 특히 암환자 객담과 전형적인 종양 조직 세포에서 (N2-형) 세포 시그니처 사이의 유사점은 종양 형성 초기에 객담 샘플에서 비정상 세포를 검출하는 데 중심적인 역할을 할 수 있다. 도 4 및 5에서 3D 핵 DNA 메틸화 패턴은 호흡 기관의 악성 세포를 비침습적으로 검출하기 위한 새로운 바이오마커 역할을 한다. 일부 측면에서, 본 발명의 방법은 3D-qDMI를 이용하여 폐암 발생 위험이 높은 개인의 객담 샘플에서 박리된 호흡기 세포의 차별적인 전체 DNA 메틸화 패턴을 결정한다. 특히, 각각의 객담 세포 집단은 악성 세포의 검출을 용이하게 할 수 있는 세포 조성의 추정치를 제공하는 결정된 F-인자의 통계에 의해 특성화될 수 있다.
실시예 2
방법
세포 표본의 제조
고장성 염수(3 내지 5% NaCl)의 흡입을 통해 객담 유도를 수행할 수 있다. 에어로졸은 분무기를 사용하여 1.5 mL/min의 출력으로 생성할 수 있다. 대상체는 최대 20분 동안 염수 용액 에어로졸을 흡입한다. 5분마다 수돗물로 입안을 헹군 후 대상체에게 객담을 뱉을 것을 권장한다. 박리된 상부 호흡기 세포를 단리하여 슬라이드/커버슬립 또는 마이크로플레이트 웰에 고정시킨다. 플라스틱 용기에 수집된 샘플은 처리할 때까지 4℃에서 보관한다. 10% 스푸토라이신 용액으로 일반적으로 알려진 0.1% 디티오트레톨(DTT)을 함유한 인산염 완충 염수(PBS) 용액으로 샘플을 희석하고 이를 실온에서 5 내지 10분 동안 300 내지 1500×g에서 원심 분리하기 전에 20분간 배양하여 세포와 유체(점액) 상들을 분리한다. 이 과정은 세포 현탁액이 균질하고 투명해질 때까지 반복된다. 그런 다음, 세포 펠렛을 PBS에 재현탁시키고, 세포를 40 내지 100 μm 나일론 메쉬(세포 스트레이너(cell strainer))를 통해 필터링하여 잔류 점액과 잔해를 제거한다. 이어서 세포를 300 내지 1500×g에서 5 내지 10분 동안 원심 분리한다. 세포 펠렛(모든 수확된 세포를 함유하는)을 1 내지 2 마이크로리터의 상피 세포 배지에 재현탁하고 현미경 유리 커버슬립으로 옮기고 세포가 커버슬립에 부착될 수 있도록 37℃ 및 5% CO2에서 16 내지 48시간 배양한다. 일부 구현예에서, 세포 카운트는 원심분리된 샘플(시토스핀(cytospin)) 상에서 수행하고 세포 샘플을 현미경 슬라이드/커버슬립 또는 마이크로플레이트 웰 상에 펼친다. 이어서 세포를 4% 파라폼알데히드에서 15 내지 45분간 고정하고 4℃에서 PBS에 보관한다. 그런 다음, 본원에 기술된 바와 같이, 고정 세포의 특성화를 3D 정량적 DNA 메틸화 이미징(3D-qDMI)에 의해 수행한다.
전술한 기도 객담 처리 방법에 대한 대안으로서, 기도 객담은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 처리될 수 있다. 단지 예시로서, 기도 객담 처리는 문헌[Hamid et al. Eur Respir J 2002; 20 Suppl. 37, 19s-23s]에 기술되거나 참조된 임의의 방법에 따라 수행될 수 있다.
생화학
샘플 분석은 세포핵 내의 5-메틸시토신에 대한 특정 마우스 모노클로날 항체(클론 33D3)에 의한 오버레이 메틸시토신 패턴의 시각화를 위한 면역형광 염색과 전체 핵 DNA의 묘사를 위한 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)에 의한 대조 염색의 조합을 통해 달성된다. 5-메틸시토신 및 gDNA의 시각화를 위한 염색을 위한 많은 공개적으로 이용가능한 프로토콜이 있지만, 일부 구현예에서, 다음과 같은 참고문헌의 프로토콜을 사용한다: 문헌[Tajbakhsh J, et al. Characterization of tumor cells and stem cells by differential nuclear methylation imaging. In: Farkas DL, Nicolau DV, Leif RC, eds. Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues. San Jose, CA: Proceedings of the SPIE 2008; 6856:6859F1-10;33]; [Gertych A, et al. Automated quantification of DNA demethylation effects in cells via 3D mapping of nuclear signatures and population homogeneity assessment. Cytometry A 2009; 75:569-83]; [Gertych A, et al. Measuring topology of low-intensity DNA methylation sites for high-throughput assessment of epigenetic drug-induced effects in cancer cells. Exp Cell Res 2010; 316:3150-60]; [Gertych A, et al. Homogeneity assessment of cell populations for high-content screening platforms. In: Information Technology in Biomedicine. Vol. 2. Advances in intelligent and soft computing, Vol. 69, 2010]; [Gertych A, et al. 3-D DNA methylation phenotypes correlate with cytotoxicity levels in prostate and liver cancer cell models. BMC Pharmacol Toxicol. 2013 Feb 11;14:1]; [Tajbakhsh J, et al. Early In Vitro Differentiation of Mouse Definitive Endoderm is Not Correlated with Progressive Maturation of Nuclear DNA Methylation Patterns. PLoS ONE 2011;6(7):e21861]; [Tajbakhsh J. Covisualization of methylcytosine, global DNA, and protein biomarkers for In Situ 3D DNA methylation phenotyping of stem cells. Methods Mol Biol. 2013; 1052:77-88]; [Oh JH, et al. Nuclear DNA methylation and chromatin condensation phenotypes are distinct between normally proliferating/aging, rapidly growing/immortal, and senescent cells. Oncotarget 2013; 4:474-93]; [Tajbakhsh J, et al. Dynamic heterogeneity of DNA methylation and hydroxymethylation in embryonic stem cell populations captured by single-cell 3D high-content analysis. Exp Cell Res. 2015; 332:190-201](이들 각각의 문헌은 본원에 완전히 개시된 것처럼 그 전체를 본원에 참고로 인용한다). 염색에 사용되는 5mC 항체는 (문헌[wwwdotncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term= Reynaud%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=1739950) Boullanger P, Grange J, Barbesti S, Niveleau A. Monitoring of urinary excretion of modified nucleosides in cancer patients using a set of six monoclonal antibodies. Cancer Lett 1992 Mar 31;63(1):81])에 기재된 것일 수 있다. 항-5mC 항체의 특이성은 시토신 변이체를 포함한 DNA 마이크로어레이 및 면역세포화학과 함께 표준 대조군 실험을 사용하여 확인될 수 있다. 하류 분석에서 조혈 세포, 특히 백혈구 세포(백혈구)를 배제하기 위해, 표본을 항-CD34 항체 및 항-CD45 항체와 동시-면역표현형이 될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명자들은 또한 상피 세포 마커를 공-라벨링하기 위해 CK8, CK18 및 CK19와 같은(이에 제한되지 않음) 시토케라틴에 대한 항체를 사용한다. 그러나 악성 호흡기 세포는 많은 수의 (슬라이드 위의) 정상 상피 세포에 분산되어 있다. 따라서 상피 마커는 정상 세포와 비정상 세포의 구분에 도움이 되지 않을 수 있다.
면역형광법 (IF)
다음 비-제한적 프로토콜은 18mm 둥근 유리 커버 슬립(1번)에 포획되어 12-웰 마이크로플레이트에서 처리되는 객담-유래 세포를 편리하게 가공하기 위한 프로토콜이다. 시약 부피는 다른 세포 지지체 및 반응 챔버에 맞게 조정해야 한다.
1일차
(a) 조직 절편의 고정
1) 객담-유래 세포를 실온에서 30 내지 45분 동안 4% 파라폼알데히드(PFA)/PBS에 고정시킨 후 실온에서 3 내지 5분 동안 PBS로 3회 세척한다. 즉시 처리하지 않은 세포는 2 내지 8℃에서 0.002% NaN3/PBS에 보관한다.
(b) 세포의 사전-IF 처리
2) 세포를 PBS(2 ml)로 5분간 세척한다.
3) 실온에서 0.5% 사포닌/0.5% 트리톤 X-100/PBS(5ml)로 세포를 20분간 침투시키고, 실온에서 3 내지 5분 동안 PBS(2ml)로 3회 세척한다.
4) 세포를 100 ㎍/ml RNase A/PBS(0.2 ml)로 37℃에서 30분간 처리하고, 실온에서 PBS(2 ml)로 3회 3 내지 5분간 세척한다.
5) (1차 항체를 적용하기 전에) 37℃에서 30분간 3% 소 혈청 알부민(BSA)/PBS(1 ml)로 조직을 차단한다.
(c) 제1 면역형광
6) 조직을 1차 항체 또는 3% BSA/PBS(0.7 ml)에서 세포 표현형(예를 들어, 1:1000 희석의 토끼 항-CK19 폴리클로날 항체, 앱캠(Abcam) Cat.# ab15463; 1 ㎍/ml 농도의 양 항-CD34 폴리클로날 항체, 알앤디 시스템즈(R&D Systems) Cat.# AF7227; 및 1:500 희석의 닭 항-CD45, 제네텍스(GeneTex) Cat.# GTX82139)에 대한 상용성 항체의 칵테일과 2 내지 8℃에서 밤새 배양한다.
2일차
7) 세포를 실온에서 1% BSA/0.1% 트윈(Tween)20/PBS(2 ml)로 5분간 4회 세척한다.
8) 조직을 1시간 동안 37℃에서 3% BSA/PBS(0.7 ml)에 각각 5 μg/ml의 농도로 2차 항체(예를 들어, 당나귀 항-염소 IgG(H+L)-알렉사(Alexa) 568, 인비트로겐(Invitrogen), A11057)와 배양한다.
9) 조직을 실온에서 3 내지 5분 동안 0.1% BSA/0.1% 트윈20/PBS(2 ml)로 4회 그리고 0.1% BSA/PBS(2 ml)로 1회 세척한다.
10) 조직을 실온에서 15분 동안 4% PFA/PBS(1 ml)에 고정시킨다. 세포를 PBS로 3 내지 5분 동안 3회 세척한다.
11) 세포를 실온에서 정확히 40분 동안 2N HCl(1 ml)로 제거한 다음 실온에서 3 내지 5분간 PBS(2 ml)로 3회 세척한다.
12) (1차 항체를 적용하기 전에) 세포를 37C에서 30분 동안 3% BSA/PBS(1 ml)로 차단한다.
(d) 제2 면역형광
13) 세포를 3% BSA/PBS(0.7 ml) 중의 1 내지 2 μg/ml의 농도에서 1 항체(예를 들어, 마우스 항-MeC, 클론 33D3 mAb, 아비바 시스템즈 바이올로지(Aviva Systems Biology), Cat.# AMM99021)와 2 내지 8℃에서 밤새 배양한다.
3일차
14) 세포를 실온에서 0.1% BSA/0.1% 트윈20/PBS(2 ml)로 5분간 4회 세척하고 0.1% BSA/PBS(2 ml)로 1 회 세척한다.
15) 세포를 2시간 동안 37℃에서 3% BSA/PBS(0.2 ml)에 둘 다 5 μg/ml의 농도로 2차 항체(예를 들어, 당나귀 항-마우스 알렉사 488 IgG(H+L), 인비트로겐 A21202; 닭 항-토끼 IgG(H+L)-알렉사 647, 인비트로겐 A21443)와 배양한다.
16) 조직을 0.1% BSA/0.1% 트윈 20/PBS(5 ml)로 5분간 4회 세척하고 실온에서 5분간 0.1% BSA/PBS로 1회 세척한다.
17) 조직을 실온에서 20분 동안 DAPI/PBS 용액(실온으로 따뜻하게) 5 ml에 배양한 다음 비-특이적 DAPI 오염을 세척하기 위해 PBS에 약 30초 동안 세정한다.
18) 마이크로플레이트에서 커버슬립을 꺼내 어둠 속에서 실온 또는 37℃ 오븐(10 내지 30분)에서 완전히 건조한다.
19) 7 내지 10 μl의 장착 용액(예를 들어, 프롤롱-골드(Prolong-Gold), 인비트로겐)을 깨끗하고 건조한 유리 슬라이드 섹션에 옮기고 커버슬립(유리 슬라이드에 면한 세포를 가짐)을 장착 방울 위에 놓는다(기포는 엄격히 피한다).
확증 분자적 방법
확증 분자적 방법은 이미지-세포측정(3D-qDMI) 5mC 특징적인 결과를 확인하기 위해 병렬로 단리된 세포로부터 (선택된 객담 샘플로부터) 추출한 DNA 상에서 수행할 수 있다: (i) 5mC 부하 및 (ii) 반복적인 DNA 요소 종류의 저메틸화(Alu/LINE-1/Satα/Sat2)-전체 DNA 저메틸화의 주요 원인-이들 둘 다 반복-시퀀스 메틸라이트(Repeat-Sequence MethyLight)에 의해 평가될 수 있다(문헌[Weisenberger DJ et al. Analysis of repetitive element DNA methylation by MethyLight. Nucleic Acids Res. 2005 Dec 2;33(21):6823-36] 참조; 이 문헌은 본원에 완전히 개시된 것처럼 그 전체가 본원에 참고로 인용된다). 이 방법은 전체 5mC 함량 측정에 일반적으로 사용되었던 5mC 부하 측정에서 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 고성능 모세관 전기영동(HPCE)의 정확한 대체 역할을 하는 것으로 입증되었다. 반복-시퀀스 메틸라이트 및 3D-qDMI에 의해 비교적 5mC 함량 측정이 수행된 결과 매우 높은 상관관계(0.86 내지 0.96)를 보였다(문헌[Gertych A, et al. 3-D DNA methylation phenotypes correlate with cytotoxicity levels in prostate and liver cancer cell models. BMC Pharmacol Toxicol. 2013 Feb 11;14:11] 참조; 이 문헌은 본원에 완전히 개시된 것처럼 그 전체가 본원에 참고로 인용된다).
이미지 획득
이미지 획득은 고-분해능 공초점 스캐닝 현미경을 사용하여 수행할 수 있다. 비-제한적인 몇몇 구현예에서, 레이카(Leica)의 상업용 TCS SP5 X 수퍼콘티늄(Supercontinuum) 현미경(레이카 마이크로시스템즈(Leica Microsystems))이 이용된다. 이 시스템은 470 내지 670 nm의 연속 범위 내에서 1 nm 증분으로 여기 및 방출에 대한 모든 자유도와 유연성을 제공한다. 현미경은 DAPI 형광의 여기를 위해 405 nm 다이오드 레이저 라인과 결합될 수 있다. 직렬 광학 섹션은 플랜-아포(Plan-Apo) 63X 1.4 오일 침지 렌즈 및 핀홀 크기 1.0 공기 단위로 200 내지 300 nm 증분으로 수집할 수 있다. 출혈을 피하기 위해, 각 채널의 이미지를 순차적으로 수집할 수 있다. 비-제한적 예로서, 전형적인 이미지 크기는 약 116nm × 116nm × 230.5nm(x, y 및 z 축)의 각각의 복셀 크기 및 1024 × 1024 내지 2048 × 2048의 범위일 수 있으며, 분해능은 모든 채널에서 픽셀 당 8 내지 16 비트(bit)일 수 있다. 출력 파일 형식은 3D-이미지 분석에 사용할 수 있는 일련의 TIFF 이미지일 수 있다.
3D 이미지 분석
3D 이미지 분석은 다음과 같은 문헌에 기술된 것처럼 패턴 인식 및 다중-파라미터식 고-집적 분석(high-content analysis)을 위해 개발된 전용 알고리즘을 적용하여 수행할 수 있다(문헌[Gertych A, et al. Automated quantification of DNA demethylation effects in cells via 3D mapping of nuclear signatures and population homogeneity assessment. Cytometry A 2009; 75:569-83]; [Gertych A, et al. Measuring topology of low-intensity DNA methylation sites for high-throughput assessment of epigenetic drug-induced effects in cancer cells. Exp Cell Res 2010; 316:3150-60]; [Gertych A, et al. (2010). Homogeneity assessment of cell populations for high-content screening platforms. In: Information Technology in Biomedicine. Vol. 2. Advances in intelligent and soft computing, Vol. 69. Ewa Pietka and Jacek Kawa, Editors, Springer Verlag, Heidelberg, Germany; and Tajbakhsh J, (2012). 3-D Quantitative DNA Methylation Imaging for Chromatin Texture Analysis in Pharmacoepigenomics and Toxicoepigenomics. In Epigenomics: From Chromatin Biology to Therapeutics. K. Appasani, editor. Cambridge University Press, Cambridge, United Kingdom]; 이들 문헌은 각각 본원에 완전히 개시된 것처럼 그 전체가 본원에 참고로 인용된다).
일부 구현예에서, 이미지 분석 툴은 다음과 같은 3단계로 동작한다: 1) 모든 세포(이미징된 집단 내)를 3D 세분화를 위해 처리한다; 2) 핵 내에 존재하는 형광 신호를 (a) 전체 핵의 5-메틸시토신 부하를 결정하기 위해, (b) 5mC 신호 및 전체 핵 DNA(DAPI에 의해 가시화됨)의 공-분포 맵(산포도)을 생성하기 위해, c) 2개의 첫 번째 5mC 특성에 관한 가변성/이질성을 위해 측정한다. DNA 메틸화 부하의 유사성 분석을 수행하고 각 표본 내의 모든 세포 중에서 2D 다이어그램을 작성하고 세포 집단 균질성을 결정한다.
유사성 분석과 관련하여, 통상적으로 적용되는 유사성 측정은 객체 표현법: (a) 유클리드(Euclidean) 거리 및 민코우스키(Minkowski) 거리를 포함한 점(point)-기반, (b) 자카드(Jaccard), 타니모토(Tanimoto) 및 다이스(Dice) 지수를 포함한 세트(set)-기반, (c) 바타카리야(Bhattacharyya), 쿨백-라이블러(Kullback-Leibler) 및 상관-기반 마할라노비스(Mahalanobis) 거리에 따라 3개의 그룹으로 구성할 수 있다(문헌[Dice LR. Measures of the amount　of ecological association between species. J Ecology　1945;26:297-302; Bhattacharyya A. On a measure of divergence between two statistical populations　defined by probability distributions. Bull Calcutta Math Soc 1943;35:99-109; Mahalanobis PC. On the generalized distance in statistics. Proc Nat Inst Scien India　1936;2:49-55; 　Kullback　S,　Leibler　RA.　(1951), "On Information and Sufficiency".　 Annals of Mathematical Statistics 　22　(1): 79-86; Jaccard　P.　(1912), "The distribution of the flora in the alpine zone",　New Phytologist　11: 37-50; Rogers DJ, Tanimoto TT. (1960), "A Computer Program for Classifying Plants".　 Science 　132　(3434): 1115-1118; Elena Deza & Michel Marie Deza (2009)　Encyclopedia of Distances, page 94, Springer; Levandowsky M, Winter D. (1971), "Distance between sets",　Nature　234　(5): 34-35] 참조; 이들 문헌은 모두 본원에 완전히 개시된 것처럼 그 전체가 본원에 참고로 인용된다).
전술한 바와 같이, 하나의 비-제한적인 예에서, 견고한 기하학적 형상 및 위치를 갖지 않는 핵 표적의 분석에 매우 적합한 것으로 밝혀진 수학적 연산의 쿨백-라이블러(KL) 발산 측정법이 사용될 수 있다(문헌[Gertych A, et al. Automated quantification of DNA demethylation effects in cells via 3D mapping of nuclear signatures and population homogeneity assessment. Cytometry A 2009; 75:569-83] 참조; 이 문헌은 본원에 완전히 개시된 것처럼 그 전체가 본원에 참고로 인용된다). KL 발산법은 개별 핵의 표준화된 산포도와 세포의 개체군 내 평가를 위한 참조 산포도 사이의 유사성 척도로서 적용될 수 있다. KL 값을 보다 이해하기 쉽게하기 위해, 소프트웨어에 4개의 소프트-한정자를 도입하여 전체 세포 집단에 대한 세포의 유사성 정도를 정의할 수 있다. 이러한 정도는 예를 들어 유사함 KL ∈ [0,0.5), 거의 유사함 KL ∈ [0.5,2), 유사성 적음 KL ∈ [2,4.5), 및 비유사 KL ∈ [4.5, ∞)와 같은 KL 발산의 특정 범위와 관련될 수 있다(도 3).
전술한 다양한 방법 및 기술은 본 발명을 수행하기 위한 다수의 방법을 제공한다. 물론, 기술된 모든 목적 또는 이점이 반드시 여기에 기술된 임의의 특정 구현예에 따라 달성될 수 있는 것은 아님을 이해해야 한다. 따라서, 예를 들어, 당업자는 본원에서 교시되거나 제안된 다른 목적 또는 이점을 반드시 달성하지 않으면서 본원에서 교시된 바와 같은 이점 또는 이점들의 그룹을 달성하거나 최적화하는 방식으로 방법을 수행할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 본원에는 다양한 대안이 언급되어 있다. 일부 바람직한 구현예는 하나, 다른 또는 몇몇 특징을 구체적으로 포함하는 반면, 다른 것은 특히 하나, 다른 또는 몇몇 특징을 배제하는 반면, 또 다른 것들은 하나, 다른 또는 몇몇 유리한 특징을 포함함으로써 특정 특징을 경감시킨다.
또한, 당업자는 상이한 구현예들로부터의 다양한 특징들의 적용 가능성을 인식할 것이다. 유사하게, 각각의 이러한 요소, 특징 또는 단계에 대한 다른 공지된 등가물뿐만 아니라, 전술한 다양한 요소, 특징 및 단계는 당업자에 의해 다양한 조합으로 채용되어 본원에 기술된 원리에 따른 방법을 수행할 수 있다. 다양한 요소들, 특징들 및 단계들 중 일부는 구체적으로 포함될 것이고 다른 것들은 다양한 구현예들에서 구체적으로 배제될 것이다.
본원은 특정 구현예 및 실시예와 관련하여 개시되었지만, 당업자는 본원의 구현예가 구체적으로 개시된 구현예를 넘어 다른 대안적인 구현예 및/또는 용도 및 이들의 변형 및 등가물로 확장된다는 것을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 본원의 특정 구현예를 기술하는 맥락에서 (특히 이하의 청구범위의 특정 맥락에서) 사용된 단수형 용어 및 이와 유사한 용어는 단수형 및 복수형 둘 모두를 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 본원에서의 값의 범위를 기술하는 것은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 참조하는 단축된 방법으로서 제공하기 위한 것이다. 본원에서 별도로 지시하지 않는 한, 각각의 개별 값은 본원에 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 포함된다. 본원에 기술된 모든 방법은 본원에서 달리 지시되지 않는 한 그렇지 않으면 문맥에 명백하게 부인되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원의 특정 구현예와 관련하여 제공되는 임의의 및 모든 실시예 또는 예시적인 용어(예를 들어, "~ 같은")의 사용은 단지 그 용도를 보다 잘 나타내도록 의도된 것이며, 다르게 청구된 용도의 범주를 제한하지 않는다. 명세서의 어떠한 용어도 본원의 실행에 필수적인 청구되지 않은 어떤 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원의 바람직한 구현예는 본원에 기술되어 있으며, 출원을 수행하기 위해 본 발명자들에게 공지된 최선의 형태를 포함한다. 상기 바람직한 구현예에 대한 변형은 전술한 개시내용을 읽음으로써 당업자에게 명백해질 것이다. 당업자는 이러한 변형을 적절히 사용할 수 있으며, 본원에 구체적으로 기술된 것 이외의 것으로도 실시될 수 있음이 고려된다. 따라서, 본원의 많은 구현예들은 적용가능한 법률에 의해 허용되는 바와 같이 본원에 첨부된 청구항들에 열거된 주제의 모든 수정 및 등가물들을 포함한다. 또한, 본원에서 달리 지시되지 않는 한 또는 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않는 한, 모든 가능한 변형에서 상기 언급된 요소들의 임의의 조합이 본원에 포함된다.
본원에 언급된 모든 특허, 특허 출원, 특허 출원의 공개 및 기사, 서적, 명세서, 출판물, 문서, 물질 등 이와 유사한 기타 자료는 모든 목적을 위해 이들 인용 문헌을 전체적으로 본원에 포함하며, 단, 이와 관련한 모든 기소 파일 기록, 본원과 일치하지 않거나 충돌하는 것 또는 본원과 관련된 현재 또는 이후의 청구 범위의 가장 넓은 범위에 대해 제한적인 영향을 줄 수 있는 동일 내용의 문서는 제외한다. 예를 들어, 인용된 임의의 자료와 본원과 관련된 설명, 정의 및/또는 용어의 사용 간에 모순이나 충돌이 있는 경우에는 본원에서의 설명, 정의 및/또는 용어의 사용이 우선한다.
마지막으로, 본원에 개시된 용도의 구현예는 본원의 구현예들의 원리를 예시하는 것으로 이해되어야 한다. 사용될 수 있는 다른 변형은 본원의 범주 내에 있을 수 있다. 따라서, 예를 들면, 비-제한적으로, 본원의 교시내용에 따라 본원의 구현예의 대안적인 구성이 사용될 수 있다. 따라서, 본원의 구현예들은 도시되고 기술된 바와 같이 정확하게 한정되지 않는다.

Claims (23)

  1. 세포가 암성인지 또는 전암성(precancerous)인지를 결정하는 방법으로서,
    세포의 핵에서 전체(global) 5-메틸시토신(5mC) 함량 및/또는 5mC 및 전체 DNA(gDNA)의 공간적 핵 공-분포(spatial nuclear co-distribution)를 결정하는 단계; 및
    세포의 핵에서 전체 5mC 함량 및/또는 5mC 및 gDNA의 공간적 핵 공-분포가 비-암성 또는 비-전암성 참조 세포 및/또는 비-암성 또는 비-전암성 참조 세포 집단과 현저히 상이한 경우에 상기 세포가 암성이거나 또는 전암성인 것으로 결정하는 단계, 또는 전체 핵 5mC 함량 및/또는 5mC 및 gDNA의 공간적 핵 공-분포가 비-암성 또는 비-전암성 참조 세포 및/또는 비-암성 또는 비-전암성 참조 세포 집단과 현저히 상이하지 않은 경우에 상기 세포가 암성이 아니거나 또는 전암성이 아닌 것으로 결정하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 전체 5mC 함량이 상기 비-암성 또는 비-전암성 참조 세포 및/또는 비-암성 또는 비-전암성 참조 세포 집단보다 현저히 낮은 경우에 상기 세포가 암성이거나 전암성인 것으로 결정하는, 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 세포가 생물학적 샘플로부터 얻어지는, 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 객담(sputum)을 포함하는, 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 객담이 호흡기 세포를 포함하는, 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 암성 세포 또는 전암성 세포가 폐암 기원인, 방법.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 담배를 피운 병력이 있는 대상체로부터 얻어지는, 방법.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 담배를 피운 병력이 없는 대상체로부터 얻어지는, 방법.
  9. 청구항 5에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 폐암을 갖고 폐암 치료를 받지 않은 대상체로부터 얻어지는, 방법.
  10. 청구항 5에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 방사선 요법, 화학 요법, 수술 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 폐암 치료를 받은 대상체로부터 얻어지는, 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 세포를 (a) 5mC에 특이적인 항체로 면역형광 염색시키고, 그리고 (b) 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 대조 염색시킨 후, 전체 5mC 및 gDNA 함량을 현미경으로 측정하는, 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 세포를 (a) 5mC에 특이적인 항체로 면역형광 염색시키고, 그리고 (b) 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 대조 염색시킨 후, 5mC 및 gDNA의 공간적 핵 공-분포를 현미경으로 측정하는, 방법.
  13. 청구항 5에 있어서, 상기 객담 샘플은,
    상기 대상체의 호흡 기관에 고장성(hypertonic) 염수를 투여하는 단계;
    상기 고장성 염수를 흡입한 결과 상기 대상체로부터 방출된 객담의 양을 수집하는 단계,
    를 포함하는 방법에 의해 상기 대상체로부터 얻어지는, 방법.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 고장성 염수는 분무기를 통해 투여되는, 방법.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 고장성 염수는 3% 내지 5% NaCl인, 방법.
  16. 청구항 11 또는 12에 있어서, 상기 현미경은 500 나노미터 이하의 분해능을 갖는 공초점 주사 현미경(confocal scanning microscope)인, 방법.
  17. 대상체로부터 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    상기 세포의 핵에서 전체 5-메틸시토신(5mC) 함량 및/또는 5mC 및 전체 DNA(gDNA)의 공간적 핵 공분포를 측정하는 단계;
    상기 세포의 핵에서 상기 전체 5mC 함량 및/또는 5mC 및 gDNA의 공간적 핵 공분포가 비-암성 또는 비-전암성 참조 세포 및/또는 비-암성 또는 비-전암성 세포 집단과 현저히 상이한 경우에 상기 세포가 암성 또는 전암성인 것으로 결정하는 단계; 및
    상기 세포가 암성 또는 전암성인 것으로 결정되는 경우, 상기 대상체가 임상적으로 검증가능한 암이 발병할 위험이 높은 것으로 결정하는 단계
    를 포함하는 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 대상체에 임상적으로 검증가능한 암이 발병할 위험이 높다고 결정되는 경우 또는 상기 대상체에 임상적으로 검증가능한 암이 발병했다고 결정되는 경우에, 상기 대상체를 암에 대해 치료하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 객담을 포함하는, 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 객담이 호흡기 세포를 포함하는, 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 암성 세포 또는 전암성 세포가 폐암 기원인, 방법.
  22. 청구항 19에 있어서, 대상체는 담배를 피운 병력이 있는, 방법.
  23. 청구항 19에 있어서, 대상체는 담배를 피운 병력이 없는, 방법.
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