ES2959649T3 - Detección temprana del cáncer de pulmón mediante fenotipación por metilación del ADN de células derivadas del esputo - Google Patents
Detección temprana del cáncer de pulmón mediante fenotipación por metilación del ADN de células derivadas del esputo Download PDFInfo
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Abstract
En determinadas realizaciones, esta solicitud divulga métodos para detectar cáncer de pulmón. El método incluye la caracterización de células extraídas del esputo humano, que es un valioso sustituto de tejido y fuente de células de las vías respiratorias superiores que se vuelven cancerosas en las primeras etapas del proceso de desarrollo del cáncer de pulmón. El método incluye la tinción de células extraídas con indicadores fluorescentes que producen un patrón específico en los núcleos de las células marcadas, que puede hacerse visible mediante microscopía óptica. El patrón es relevante para un tipo de codificación epigenética del ADN conocida como metilación del ADN, que cambia en células específicas del pulmón durante el desarrollo del cáncer, en comparación con las células respiratorias normales. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Detección temprana del cáncer de pulmón mediante fenotipación por mutilación del ADN de células derivadas del esputo
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitudreivindica prioridad de Solicitud de la Patente Provisional de los Estados Unidos No. 62/043,346, presentada el 28 de agosto de 2014.
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general al diagnóstico, pronóstico y tratamiento del cáncer, y especialmente del cáncer de pulmón.
Antecedentes
La siguiente descripción incluye información que puede ser útil para comprender la presente invención. No es una admisión de que la información proporcionada en este documento sea técnica anterior o relevante para la invención actualmente reivindicada.
Los métodos tradicionales de cribado del cáncer de pulmón incluyen la mediastinoscopia y métodos radiográficos, tales como la tomografía computarizada (CT) y la tomografía por emisión de positrones (PET). Desafortunadamente, estos métodos son costosos y/o requieren exponer a los pacientes a radiaciones ionizantes potencialmente dañinas. Además, las exploraciones no son confiables para detectar cáncer de pulmón en estadio temprano, que puede ser demasiado pequeño para detectarlo mediante métodos radiográficos, pero que, no obstante, representa un peligro significativo para el paciente. Esto es especialmente relevante, porque la detección del cáncer de pulmón en estadio temprano se asocia con un pronóstico mucho más favorable que la detección en estadio tardío.
Arens et al., 2005 investigan si las lesiones hiperplásicas y neoplásicas de la mama difieren con respecto a la distancia entre las áreas heterocromáticas de los cromosomas I y 16 dentro de los núcleos. Arens et al. hibridaron muestras de ADN marcadas con fluorescencia de manera diferente, específicas para las regiones heterocromáticas de los cromosomas 1 y 16, con secciones de tejido fijadas con formalina. Arens et al. concluyeron que existe una mayor frecuencia de señales intranucleares pareadas específicas de los cromosomas 1 y 16 en lesiones neoplásicas (hiperplasia ductal atípica, carcinoma ductal in situ) en comparación con la hiperplasia ductal y el epitelio glandular normal. La tinción con el anticuerpo específico de metilación reveló una tinción más débil en las lesiones neoplásicas en comparación con las lesiones hiperplásicas y las células normales.
Capoa et al., divulgan un enfoque cuantitativo en la evaluación de los niveles de metilación en linfocitos primarios humanos y muestran que se produce una desmetilación grave de eucromatina y heterocromatina en los linfocitos de CLL. Capoa et al. se centran en el uso de un anticuerpo específico para SmC junto con la enzima peroxidasa para impulsar una reacción colorimétrica a través de un enfoque de inmunomarcaje secuencial que consiste en teñir primero la muestra con anti-CD3 o anti-CD22 para distinguir los linfocitos T de los linfocitos B, y luego teñir con un anti-SmC.
El documento US 2010/0304380 A1 divulga un método que usa inmunofluorescencia, imágenes de alta resolución y análisis de imágenes 3D para cuantificar la distribución espacial de metilcitosina (MeC) en el ADN global en núcleos celulares individuales, para la caracterización de células y tejidos en base a sus patrones de distribución nuclear de MeC.
Existe claramente la necesidad en la técnica de un método seguro, relativamente económico y sensible para detectar el cáncer de pulmón, especialmente en un estadio temprano.
Sumario de la invención
El alcance de la invención reivindicada está definido por las reivindicaciones independientes. Las realizaciones preferidas se establecen en las reivindicaciones dependientes.
En un aspecto de la invención, se proporciona un método para determinar si una célula es cancerosa o precancerosa, que comprende:
determinar un contenido de 5-metilcitosina (5mC) y codistribución nuclear espacial del contenido de SmC y ADN global (ADNg) en un núcleo de la célula, en el que el contenido de SmC se determina después de que la célula se haya sometido a (a) tinción por inmunofluorescencia y luego, la codistribución nuclear espacial del contenido de SmC y el ADNg se determina después de que la célula haya sido sometida a (b) contratinción, en la que la determinación de la codistribución nuclear espacial del contenido de SmC y ADNg comprende generar un diagrama de dispersión del contenido de SmC y el contenido de ADNg para el núcleo; y
determinar que la célula es cancerosa o precancerosa si el contenido de SmC es significativamente menor, y/o un ángulo de la línea de regresión del diagrama de dispersión es menor que los de una célula de referencia no cancerosa o no precancerosa y/o una población de células de referencia no cancerosas o no precancerosas, cuando el contenido de ADNg define el eje x, el contenido de SmC define el eje y, y el ángulo de la línea de regresión es con el eje x del diagrama de dispersión, o
determinar que la célula no es cancerosa ni precancerosa si el contenido de SmC y la codistribución nuclear espacial del contenido de SmC y el ADNg no son significativamente diferentes de los de una célula de referencia no cancerosa o no precancerosa y/o una población de células de referencia no cancerosas o no precancerosas.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un método que comprende:
obtener una muestra biológica de un sujeto, en el que la muestra biológica comprende una célula;
determinar un contenido de 5-metilcitosina (5mC) y codistribución nuclear espacial del contenido de SmC y ADN global (ADNg) en un núcleo de la célula, en el que el contenido de SmC se determina después de que la célula se haya sometido a (a) tinción por inmunofluorescencia y luego, la codistribución nuclear espacial del contenido de SmC y ADNg se determina después de que la célula haya sido sometida a (b) contratinción, en la que la determinación de la codistribución nuclear espacial del contenido de SmC y ADNg comprende generar un diagrama de dispersión del contenido de SmC y contenido de ADNg para el núcleo;
determinar que la célula es cancerosa o precancerosa si el contenido de SmC es significativamente menor, y/o un ángulo de línea de regresión del diagrama de dispersión es menor que aquellos en una célula de referencia no cancerosa o no precancerosa y/o población de células no cancerosas o no precancerosas, cuando el contenido de ADNg define el eje x, el contenido de SmC define el eje y, y el ángulo de la línea de regresión es con el eje x del diagrama de dispersión; y
determinar que el sujeto tiene un alto riesgo de desarrollar cáncer clínicamente verificable o ha desarrollado cáncer clínicamente verificable, si se determina que la célula es cancerosa o precancerosa.
En diversas realizaciones, la invención enseña un método para determinar si una célula es cancerosa o precancerosa, que incluye: determinar un contenido global de 5-metilcitosina (5mC) y/o una codistribución nuclear espacial de SmC y ADN global (ADNg) en un núcleo de la célula; y determinar que la célula es cancerosa o precancerosa si el contenido global de SmC y/o la codistribución nuclear espacial de SmC y ADNg en el núcleo de la célula es significativamente diferente de una célula de referencia no cancerosa o no precancerosa y/o una población de células de referencia no cancerosas o no precancerosas, o determinar que la célula no es cancerosa ni precancerosa si el contenido global de SmC nuclear y/o la codistribución nuclear espacial de SmC y ADNg no son significativamente diferentes de los de una célula de referencia no cancerosa o no precancerosa y/o una población de células de referencia no cancerosas o no precancerosas. En algunas realizaciones, se determina que la célula es cancerosa o precancerosa si el contenido global de 5mC es significativamente menor que la célula de referencia no cancerosa o no precancerosa y/o la población de células de referencia no cancerosas o no precancerosas. En determinadas realizaciones, la célula se obtiene de una muestra biológica. En algunas realizaciones, la muestra biológica incluye esputo. En determinadas realizaciones, el esputo incluye células respiratorias. En determinadas realizaciones, la célula cancerosa o la célula precancerosa tiene origen en cáncer de pulmón. En algunas realizaciones, la muestra biológica se obtiene de un sujeto que tiene antecedentes de fumar cigarrillos. En algunas realizaciones, la muestra biológica se obtiene de un sujeto que no tiene antecedentes de fumar cigarrillos. En algunas realizaciones, la muestra biológica se obtiene de un sujeto que tiene cáncer de pulmón y no ha sido tratado por cáncer de pulmón. En determinadas realizaciones, la muestra biológica se obtiene de un sujeto que ha recibido un tratamiento de cáncer de pulmón seleccionado del grupo que consiste en: radioterapia, quimioterapia, cirugía y combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, los contenidos globales de SmC y ADNg se determinan con un microscopio después de que la célula se haya sometido a (a) tinción por inmunofluorescencia con un anticuerpo específico para 5mC y (b) contratinción con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). En determinadas realizaciones, la codistribución nuclear espacial de SmC y ADNg se determina con un microscopio después de que la célula se haya sometido a (a) tinción por inmunofluorescencia con un anticuerpo específico para 5mC, y (b) contratinción con 4',6-diamidino- 2-fenilindol (DAPI). En algunas realizaciones, la muestra de esputo se obtuvo de un sujeto mediante un método que incluye administrar solución salina hipertónica en el tracto respiratorio del sujeto; y recoger una cantidad de esputo que se expulsa del sujeto como resultado de la inhalación de dicha solución salina hipertónica. En algunas realizaciones, la solución salina hipertónica se administra mediante un nebulizador. En determinadas realizaciones, la solución salina hipertónica es NaCl al 3-5 %. En determinadas realizaciones, el microscopio es un microscopio de barrido confocal con una resolución igual o inferior a 500 nanómetros.
En diversas realizaciones, la invención enseña un método que incluye obtener una muestra biológica de un sujeto, en el que la muestra biológica incluye una célula; determinar un contenido global de 5-metilcitosina (5mC) y/o una codistribución nuclear espacial de SmC y ADN global (ADNg) en un núcleo de la célula; determinar que la célula es cancerosa o precancerosa si el contenido global de SmC y/o la codistribución nuclear espacial de SmC y ADNg en el núcleo de la célula es significativamente diferente de una célula de referencia no cancerosa o no precancerosa y/o población de células no cancerosas o no precancerosas; y determinar que el sujeto tiene un alto riesgo de desarrollar cáncer clínicamente verificable, si se determina que la célula es cancerosa o precancerosa. En algunas realizaciones, el método también incluye tratar al sujeto contra el cáncer, si se determina que el sujeto tiene un alto riesgo de desarrollar cáncer clínicamente verificable, o si se determina que el sujeto ha desarrollado cáncer clínicamente verificable. En algunas realizaciones, la muestra biológica incluye esputo. En algunas realizaciones, el esputo incluye células respiratorias. En algunas realizaciones, la célula cancerosa o la célula precancerosa tiene origen en cáncer de pulmón. En determinadas realizaciones, el sujeto tiene antecedentes de fumar cigarrillos. En algunas realizaciones, el sujeto no tiene antecedentes de fumar cigarrillos.
Breve descripción de los dibujos
En las figuras referenciadas se ilustran realizaciones de ejemplo. Se pretende que las realizaciones y figuras divulgadas en este documento se consideren ilustrativas en lugar de restrictivas.
La figura 1 demuestra, de acuerdo con una realización de la invención, el flujo de trabajo de imágenes de metilación de ADN cuantitativas 3D (3D-qDMI) incluye tres etapas: (1) preparación/tinción de muestras citológicas, (2) imágenes 3D de muestras y (3) análisis computacional de imágenes/datos para la caracterización de muestras.
La figura 2 demuestra, de acuerdo con una realización de la invención, el flujo de trabajo del análisis de imágenes tridimensionales (el ejemplo se muestra con células de cáncer de próstata humano DU145). Se cargan pilas de imágenes confocales 2D de los dos canales de 5-metilcitosina (5mC) y 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). DAPI representa el ADN nuclear global (ADNg). Los patrones nucleares extraídos de 5mC/DAPI se muestran como diagramas de dispersión de densidad 2D de intensidades de vóxel de los dos canales. Se muestran patrones de ejemplo para dos núcleos seleccionados. El patrón de codistribución SmC/DAPI de toda la población se crea mediante la superposición de patrones de todos los núcleos individuales que podrían ser distintos en apariencia/estadísticas que representan una codistribución altamente diferencial de señales nucleares SmC y DAPI. Las unidades indicadas en los ejes de los diagramas de dispersión son unidades de intensidad arbitraria.
La figura 3 demuestra, de acuerdo con una realización de la invención, el resultado de diagnóstico de 3D-qDMI (izquierda): caracterización de la población de células de esputo basada en características de textura de 5mC (verde) y ADNg/DAPI (azul) (fenotipos de metilación de ADN) en la imagen de fluorescencia. Las células se pueden clasificar en diferentes grados de similitud mediante "calificadores suaves" que abarcan rangos de valores crecientes asociados con códigos de color (derecha). El software 3D-qDMI usa esta codificación para convertir la imagen de fluorescencia original (en todas las capas de imagen confocal) en un mapa de color y una pantalla tabular correspondiente para una mejor visualización e interpretación de los datos resultantes. Los datos conducen a la identificación y enumeración de los diferentes tipos de células para determinar la heterogeneidad de los fenotipos de metilación del ADN en poblaciones de células.
La figura 4 demuestra, de acuerdo con una realización de la invención, el parénquima normal y la región tumoral de una sección marcada con fluorescencia de un cáncer de pulmón recién diagnosticado y resecado quirúrgicamente. Los núcleos celulares (azul) en los lóbulos (A) normales y la subárea (B) del recuadro ampliada muestran un mayor grado de metilación del ADN (SmC, verde) en comparación con los núcleos gravemente hipometilados en las regiones ductales del tumor (C) y la subárea (D) del recuadro ampliada en la misma sección; se usó citoqueratina 8 (roja) como marcador para delimitar los compartimentos epiteliales.
Las figuras 5A y 5B demuestran, de acuerdo con una realización de la invención, el fenotipado de metilación global del ADN de células y tejidos con 3D-qDMI. El método pudo distinguir con éxito entre los diferentes tipos de células basándose en patrones de distribución diferenciales de SmC/DAPI (gráficos de dispersión): calculados y mostrados como los gráficos de dispersión de mapas de calor individuales (DAPI = eje x, 5mC = eje y) para todo la población de células como el gráfico de referencia, así como para cada núcleo como se muestra para los núcleos seleccionados N1 y N2 para cada categoría de células. Las líneas celulares de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) A549 y H157 muestran una reducción en SmC global en comparación con las células respiratorias epiteliales inmortalizadas (BEAS-2B). Las células H157, que según se informa tienen más potencial metastásico que las células A549, están aún más hipometiladas (curva más plana). La misma relación comparativa se puede encontrar en el tejido extirpado quirúrgicamente de un paciente con cáncer de pulmón y el tejido pulmonar normal adyacente y también al comparar muestras de esputo del paciente con cáncer de pulmón versus las de una persona sana (sin cáncer): Las firmas citométricas de SmC/DAPI encontradas en células de esputo sanas son muy similares a los patrones observados en células en el área fenotípicamente normal (véase, la figura 3 para una imagen real) y células BEAS-2B. Por el contrario, se puede observar una hipometilación grave en un pequeño número de células del esputo (tipo N2) -en el fondo de un mayor número de células con fenotipo 5mC normal (tipo N1)- del paciente con cáncer que coincide con las firmas de las células. de la región tumoral y la línea celular H157, más agresiva (mayor potencial metastásico). En otras palabras, las raras células de esputo con fenotipo aberrante 5mC tienen un gran parecido con células cancerosas agresivas bien caracterizadas (en tumores y líneas celulares derivadas de tumores). La línea de regresión (amarilla discontinua) y los límites de señal superior e inferior ML1 y ML2 son característicos y determinan los cuatro ángulos a, p, y y 6 para cada tipo de célula prototípica. El factor resultante F = [(a/y) x (p/6)] es específico de cada tipo de célula. Todas las poblaciones de células muestran una alta homogeneidad: es decir, un alto grado de similitud del fenotipo 5mC entre las células, a juzgar por los respectivos mapas de categorías, y la similitud entre los gráficos de dispersión de los núcleos individuales (N1 y N2) en comparación con el gráfico de toda la población respectiva. Las unidades indicadas en los ejes de los diagramas de dispersión de las figuras 5A y 5B son unidades de intensidad arbitraria.
La figura 6 demuestra, de acuerdo con una realización de la invención, una imagen microscópica de campo brillante de células epiteliales humanas relativamente planas, derivadas de esputo inducido. (A) Las células se aislaron de la fracción de moco-líquido del esputo y se capturaron en un portaobjetos de vidrio utilizando técnicas de cultivo. Unos pocos mililitros de esputo pueden contener de cientos a miles de células. (B) La ampliación de un área revela la subestructura relativa de las células en capas que son mononucleares.
La figura 7 muestra, de acuerdo con una realización de la invención, imágenes confocales de células humanas derivadas de esputo marcadas con fluorescencia. El citoplasma está delineado por el marcador de células epiteliales citoqueratina 19 (CK19, en rojo), los núcleos celulares están delineados por DAPI (en azul) y la metilación global del ADN nuclear se visualiza mediante un anticuerpo específico para SmC (en verde). El esputo de individuos sanos (control) contiene una abrumadora mayoría de células altamente metiladas (tipo 1, columna izquierda) y esporádicamente algunas células hipometiladas positivas para CK19 (tipo 2, columna izquierda). Se supone que la hipometilación es facultativa en el estadio temprano después de la división celular. Por el contrario, el esputo de un paciente con cáncer de pulmón contiene además un número significativo de células redondas casi sin citoplasma (tipo 2, columna derecha). Estas células son CD34/CD45 negativas, lo que indica que no son de naturaleza hematopoyética y/o leucocítica. Los respectivos patrones de codistribución nuclear de 5mC/DAPI, presentados como diagramas de dispersión, muestran que las células normalmente metiladas (tipo 1) en ambos grupos de donantes de esputo muestran una línea de regresión pronunciada (d > 45°), mientras que las células hipometiladas (tipo 2) producen una línea de regresión mucho más plana (d << 45°). Además, una firma típica de las células redondeadas específicas del cáncer de pulmón es la codistribución estrecha y mucho menos dispersa de SmC y DAPI. Las unidades indicadas en los ejes de los diagramas de dispersión son unidades de intensidad arbitraria.
Descripción de la divulgación
A menos que se definan de otra manera, los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Allen et al., Remington: The Science and Practice of Pharmacy 22nd ed., Pharmaceutical Press (15 de septiembre de 2012); Hornyak et al., Introduction to Nanoscience and Nanotechnology, CRC Press (2008); Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed., revised ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2006); Smith, March's Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 7th ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2013); Singleton, Dictionary of DNA and Genome Technology 3rd ed., Wiley-Blackwell (28 de noviembre de 2012); and Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012), proporcionan a los expertos en la técnica una guía general de muchos de los términos usados en la presente solicitud. Para obtener referencias sobre cómo preparar anticuerpos, véase Greenfield, Antibodies A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor NY, 2013); Kohler and Milstein, Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion, Eur. J. Immunol. 1976 Jul, 6(7):511-9; Queen and Selick, Humanized immunoglobulins, Patente de los Estados Unidos No. 5,585,089 (1996 Dec); y Riechmann et al., Reshaping human antibodies for therapy, Nature 1988 Mar 24, 332(6162):323-7.
Un experto en la técnica reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento, que podrían usarse en la práctica de la presente divulgación. De hecho, la presente divulgación no se limita de ninguna manera a los métodos y materiales descritos. Para los fines de la presente divulgación, determinados términos se definen a continuación.
"Condiciones" y "condiciones de enfermedad", como se usa en este documento, pueden incluir, pero de ninguna manera se limitan a, aquellas afecciones que están asociadas con el cáncer o precáncer, incluyendo, pero sin limitarse a, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza o cuello, cáncer del tracto aerodigestivo superior, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de uretra, cáncer de vejiga y cáncer colorrectal.
"Mamífero", como se usa en este documento, se refiere a cualquier miembro de la clasemamífero,incluyendo, sin limitación, humanos y primates no humanos tales como chimpancés y otras especies de simios y monos; animales de granja tales como ganado vacuno, ovino, porcino, caprino y equino; mamíferos domesticados, tales como perros y gatos; animales de laboratorio, incluidos roedores tales como ratones, ratas y cobayas, y similares. El término no denota una edad o sexo en particular. De este modo, se pretende incluir dentro del ámbito de aplicación de este término a los sujetos adultos y recién nacidos, ya sean hombres o mujeres. Si bien el cáncer o el precáncer se pueden detectar en humanos según los métodos de la invención descritos en este documento, la detección de cáncer en cualquier mamífero según los métodos de la invención está dentro del alcance de la divulgación.
Los términos "5mC global" y "contenido de SmC" se usan en este documento indistintamente y en cada caso pueden definirse como la cantidad total de moléculas de 5-metilcitosina presentes en un núcleo celular.
El término "ADN global (ADNg)", como se usa en este documento, significa la cantidad total de ADN presente en el núcleo de una célula.
El término "cáncer clínicamente verificable" como se usa en este documento significa cáncer que es verificable mediante medios tradicionales de detección de cáncer, que incluyen, entre otros, mediastinoscopia mínimamente invasiva, métodos radiográficos no invasivos, tales como tomografía computarizada (CT), tomografía por emisión de positrones (PET), imágenes por resonancia magnética (MRI) y similares.
A modo de antecedente adicional, cada vez resulta más evidente que mecanismos epigenéticos tales como la metilación del ADN tienen una fuerte influencia en el desarrollo de los sistemas multicelulares, en su mantenimiento saludable y en su declive estructural y funcional durante el envejecimiento y a un ritmo acelerado. tasa por enfermedades tales como el cáncer, junto con e incluso sin la coexistencia de mutaciones genéticas. Por lo tanto, los métodos para medir la metilación del ADN son vitales para comprender estos mecanismos en los esfuerzos por combatir el cáncer y asegurar un envejecimiento saludable. No hay duda de que la imagen, junto con las técnicas moleculares, está jugando un papel indispensable en la cuantificación diferencial de la metilación del ADN en células y tejidos.
Medir los cambios en la metilación del ADN es valioso, ya que se correlaciona con eventos tempranos en la carcinogénesis y la progresión tumoral, y puede servir como una firma en el diagnóstico temprano y el seguimiento terapéutico. En este sentido, el enfoque de los inventores, como se describe en determinadas realizaciones en este documento, para aplicar imágenes cuantitativas de metilación del ADN para la detección temprana del cáncer de pulmón revive la idea de medir características epigenéticasin situtales como la metilación del ADN en células respiratorias exfoliadas para su caracterización, para un diagnóstico patológico basado en célula por célula.
Las imágenes de metilación del ADN, que se introdujeron para la caracterización de tejidos a finales de la década de 1990, no ganaron mucha popularidad en comparación con los métodos moleculares desarrollados contemporáneamente, incluidos los basados en PCR, la secuenciación basada en matrices, la cromatografía líquida de alta presión (HPLC) y espectrometría de masas, por dos razones: (i) se aplicó en combinación con reporteros enzimáticos o radiomarcados para la detección, que carecen ya sea de sensibilidad, capacidad de multiplexación o afectan la repetibilidad/consistencia del ensayo, y (ii) no proporcionaron suficiente significancia en los resultados diferenciales debido a la baja resolución de la imagen. Las enormes mejoras en imágenes de alta resolución y capacidad computacional en los últimos años han apoyado el desarrollo de herramientas más sofisticadas en ensayos basados en células que pueden aplicarse a la investigación biomédica y al diagnóstico clínico. Este también fue un requisito previo para el desarrollo de 3D-qDMI para revisar el concepto de imágenes no destructivas de cambios a gran escala en la estructura de la cromatina de orden superior por parte de informadores epigenéticos, como la metilación global del ADN.
En resumen, el enfoque 3D-qDMI descrito en este documento es especialmente ventajoso porque permite (1) obtener imágenes de alta resolución de 5-metilcitosina (5mC) y ADN global (ADNg), y (2) extracción digital de tres características relevantes de 5mC. como firmas diagnósticas para la detección temprana del cáncer de pulmón: (i) la carga de SmC (contenido), (ii) la codistribución nuclear espacial de SmC y ADNg, y (iii) medición de la heterogeneidad de la población de células basada en las dos primeras características de SmC, para caracterizar las células epiteliales respiratorias en muestras de esputo (Figura 2).
En comparación con los enfoques moleculares actuales y algunos intentos anteriores basados en imágenes de baja resolución que ya sea promedian las mediciones de SmC en una gran población de células o únicamente miden los valores medios de intensidad de SmC en los núcleos celulares, 3D-qDMI aprovecha la extracción de información diferencial relevante para 5mC. al considerar los efectos secundarios de los desequilibrios de metilación del ADN que ocurren durante la transformación celular, especialmente la hipometilación del ADNg. En particular, este último mecanismo provoca la reorganización del genoma dentro de los núcleos celulares, afectando la arquitectura nuclear. Este fenómeno está bien descrito en la investigación biológica celular básica, pero aún no se ha explotado bien en la patología del cáncer. El análisis de imágenes aplicado en algunas realizaciones del método inventivo cubre este vacío y muestra los cambios relevantes como distribución de intensidad de los dos tipos de señales que reflejan dichos fenómenos: (a) Señales SmC creadas mediante inmunofluorescencia y (b) ADNg representado por señales DAPI que se generan mediante contratinción posterior de las mismas células, ya que DAPI se intercala en ADN rico en AT, el componente principal de las secuencias heterocromáticas compactas y altamente repetitivas. En general, el método da como resultado imágenes que representan mapas de células de esputo con un espectro de fenotipos diferenciales de metilación del ADN (características de textura SmC/DAPI) que se correlacionan con la morfología celular (fenotipos de células epiteliales y mesenquimales) y el comportamiento de crecimiento (células cancerosas de alta proliferación, células normales de crecimiento moderado y células senescentes con crecimiento detenido).
Aunque las células de cáncer de pulmón son un tipo de células cancerosas que podrían detectarse según los métodos descritos en este documento, el análisis del contenido de SmC y/o la codistribución nuclear espacial de SmC y ADNg podría usarse para detectar cualquier célula cancerosa.
Teniendo en cuenta los antecedentes adicionales anteriores, a continuación se describen determinados ejemplos específicos no limitantes.
En diversas realizaciones, la invención enseña un método para determinar si una célula es cancerosa o precancerosa. En algunas realizaciones, el método comprende, consiste o consiste esencialmente en determinar el contenido de 5-metilcitosina (5mC) y/o la codistribución nuclear espacial de SmC y ADN global (ADNg) en un núcleo de la célula; y determinar que la célula es cancerosa o precancerosa si el contenido de SmC y/o la codistribución nuclear espacial de SmC y ADNg en el núcleo de la célula es significativamente diferente de una célula de referencia no cancerosa o no precancerosa y/o una población de células de referencia no cancerosas o no precancerosas, o determinar que la célula no es cancerosa ni precancerosa si el contenido de SmC y/o la codistribución nuclear espacial de SmC y ADNg no son significativamente diferentes de los de una población de células no cancerosas o no precancerosas. -célula de referencia precancerosa y/o una población de células de referencia no cancerosas o no precancerosas. En este contexto, una diferencia significativa se define como igual o mayor que el 25 % en el contenido de SmC, y/o igual o mayor que 20 grados en el ángulo de la línea de regresión (también llamada línea de tendencia) en este documento denominada o 8 o d, mediante la cual las células cancerosas o precancerosas exhiben menos contenido de SmC y/o un ángulo de línea de regresión más pequeño del diagrama de dispersión de colocalización de SmC/DAPI, en comparación con una célula de referencia no cancerosa o no precancerosa o población de células no cancerosas o no precancerosas: cuando los valores DAPI definen el eje x y los valores SmC definen el eje y. En algunas realizaciones, una diferencia del 25-99 %, o del 30-80 %, o del 40-60 % en el contenido de SmC es significativa. En algunas realizaciones, 20-90 grados, o 30-80 grados, o 40-70 grados, o 50-60 grados en el ángulo de la línea de regresión son significativos. En determinadas realizaciones, se determina que la célula es cancerosa o precancerosa si el contenido de SmC es significativamente menor que la célula de referencia no cancerosa o no precancerosa y/o la población de células de referencia no cancerosas o no precancerosas. En determinadas realizaciones, la célula se obtiene de una muestra biológica. En algunas realizaciones, la muestra biológica incluye esputo. En determinadas realizaciones, el esputo incluye células respiratorias. En algunas realizaciones, el origen de la célula cancerosa o célula precancerosa es del tracto aerodigestivo superior, que incluye una célula asociada con cualquier estructura anatómica o conjunto de estructuras en la ruta desde los pulmones hasta los labios o las fosas nasales. Esto puede incluir, pero no se limita en modo alguno a las células de los pulmones, la tráquea, el esófago, la boca, la nariz y los senos nasales. En algunas realizaciones, la célula cancerosa o la célula precancerosa tiene origen en cáncer de pulmón. En algunas realizaciones, la célula cancerosa o la célula precancerosa tiene un origen tumoral de pulmón. En algunas realizaciones, la célula cancerosa o la célula precancerosa es de origen esofágico. En determinadas realizaciones, la muestra biológica se obtiene de un sujeto que tiene antecedentes de fumar cigarrillos. En algunas realizaciones, la muestra biológica se obtiene de un sujeto que no tiene antecedentes de fumar cigarrillos. En diversas realizaciones, la muestra biológica se obtiene de un sujeto que ha recibido un tratamiento para el cáncer de pulmón que puede incluir, pero no se limita a, radioterapia, quimioterapia, cirugía y combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, la muestra biológica se obtiene de un sujeto que no ha recibido tratamiento para el cáncer de pulmón. En determinadas realizaciones, los contenidos globales de SmC y ADNg de los núcleos celulares individuales, así como la codistribución nuclear espacial de SmC y ADNg, se determinan con un microscopio después de que la célula se haya sometido a (a) tinción por inmunofluorescencia con un anticuerpo específico para 5mC, y (b) contratinción con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
Cualquier anticuerpo monoclonal disponible comercialmente específico para SmC podría usarse junto con los métodos de la invención descritos en este documento. Por ejemplo, el anticuerpo SmC podría obtenerse de proveedores tales como Aviva Systems Biology, Corp. (San Diego, CA), GeneTex, Inc. (Irvine, CA), Active Motif, Inc. (Carslbad, CA) y Diagenode, Inc. (Denville, Nueva Jersey), por nombrar algunos. En algunas realizaciones, el anticuerpo SmC es el anticuerpo descrito Reynaud C, Bruno C, Boullanger P, Grange J, Barbesti S, Niveleau A. Monitoring of urinary excretion of modified nucleosides in cancer patients using a set of six monoclonal antibodies. Cancer Lett 31 de marzo de 1992; 63 (1): 81.
En determinadas realizaciones, los fenotipos de células individuales derivadas de esputo se determinan con un microscopio después de que las células se hayan sometido a tinción por inmunofluorescencia con anticuerpos contra marcadores específicos de tipo celular. Estos incluyen, entre otros, anticuerpos específicos para citoqueratinas y moléculas de la superficie celular.
En algunas realizaciones, la muestra de esputo descrita anteriormente se obtuvo de un sujeto mediante un método que incluye la administración de solución salina hipertónica en el tracto respiratorio del sujeto; y la recogida de una cantidad de esputo que se expulsa del sujeto como resultado de la inhalación de dicha solución salina hipertónica. En determinadas realizaciones, la solución salina hipertónica se administra mediante un nebulizador ultrasónico o un nebulizador no ultrasónico. En algunas realizaciones, la solución salina hipertónica es NaCl del 3 al 5 %.
En las realizaciones de la invención en las que se requiere visualización y/o cuantificación del contenido de SmC, ADNg y/o codistribución nuclear espacial de SmC y ADNg, estas características pueden visualizarse y/o cuantificarse mediante el uso de sistemas de imágenes ópticas tales como microscopios y escáneres de epifluorescencia de campo amplio, microscopios y escáneres confocales, microscopios y escáneres multifotónicos, y microscopios y escáneres de superresolución (nanoscopios), así como modalidades combinatorias de los mismos. En algunas realizaciones, se usa un microscopio para esta visualización y/o cuantificación. En determinadas realizaciones, el microscopio es un microscopio de barrido confocal. En algunas realizaciones, el microscopio de barrido confocal tiene una resolución lateral (en los ejes x e y) en el intervalo de 100-200 nm y una resolución vertical (en el eje z) de aproximadamente 500 nm.
En diversos ejemplos, la divulgación enseña un método que comprende, consiste o consiste esencialmente en obtener una muestra biológica de un sujeto, en el que la muestra biológica incluye una célula; determinar un contenido de 5-metilcitosina (5mC) y/o una codistribución nuclear espacial de SmC y ADN global (ADNg) en un núcleo de la célula; determinar que la célula es cancerosa o precancerosa si el contenido de SmC y/o la codistribución nuclear espacial de SmC y ADNg en el núcleo de la célula es significativamente diferente de una célula de referencia no cancerosa o no precancerosa y/o población de células no cancerosas o no precancerosas; y tratar al sujeto contra el cáncer según cualquier método descrito en este documento si se determina que la célula es cancerosa o precancerosa. En algunos ejemplos, si se determina que un sujeto tiene una condición cancerosa o precancerosa, entonces se monitorea al sujeto para determinar la progresión de la enfermedad, en lugar de implementar el tratamiento. En algunos ejemplos, la célula cancerosa o la célula precancerosa se origina en el tracto aerodigestivo, como se describe en este documento. En determinadas realizaciones, la muestra biológica incluye esputo. En algunas realizaciones, el esputo incluye células respiratorias. En determinadas realizaciones, la célula cancerosa o la célula precancerosa tiene origen en cáncer de pulmón. En algunas realizaciones, el sujeto ha sido tratado previamente por cáncer, incluido cualquier tipo de cáncer descrito en este documento. En algunas realizaciones, el sujeto no ha sido tratado previamente por cáncer, incluido cualquier tipo de cáncer descrito en este documento. En algunas realizaciones, el sujeto tiene antecedentes de fumar cigarrillos. En determinadas realizaciones, el sujeto no tiene antecedentes de fumar cigarrillos.
En diversos ejemplos, la divulgación enseña un método para determinar la presencia o ausencia de una célula cancerosa o una célula precancerosa en una muestra biológica que incluye una pluralidad de células. En algunos ejemplos, el método incluye: usar imágenes de alta resolución para determinar la carga/contenido de 5-metilcitosina (5mC) y/o la codistribución nuclear espacial de SmC y ADN global (ADNg) para cada una de una pluralidad de células en la muestra biológica; y opcionalmente determinar la heterogeneidad de la población de células para la pluralidad de células basándose en dicha carga de MeC y codistribución nuclear espacial de SmC y ADNg. En determinados ejemplos, se determina que una célula cancerosa o una célula precancerosa está presente en la muestra biológica si la carga de SmC y/o la codistribución nuclear espacial de SmC y ADNg en cualquier célula de la muestra biológica es significativamente diferente de una población de células de referencia no cancerosas o no precancerosas y/o cualquier célula en la muestra biológica es significativamente diferente con respecto a la carga de SmC y/o la codistribución nuclear espacial de SmC y ADNg en comparación con el patrón global de toda la población de células visualizada en la muestra biológica. En algunos ejemplos, se determina que una célula cancerosa o una célula precancerosa no está presente en la muestra biológica si la carga de SmC y/o la codistribución nuclear espacial de SmC y ADNg no son significativamente diferentes de las de una población de células de referencia no cancerosas o no precancerosas y/o ninguna célula en la muestra biológica es significativamente diferente con respecto a la carga de SmC y/o la codistribución nuclear espacial de SmC y ADNg en comparación con el patrón global de toda la población de células en la muestra biológica. En algunas realizaciones, la muestra biológica incluye esputo. En determinadas realizaciones, el esputo incluye células respiratorias. En algunas realizaciones, la célula cancerosa o la célula precancerosa detectada/determinada está asociada con el cáncer de pulmón. En determinados ejemplos, la célula cancerosa o la célula precancerosa detectada/determinada está asociada con el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). En determinadas realizaciones, el método se puede usar para diagnosticar un sujeto con cáncer de pulmón, incluido NSCLC, en cualquier estadio, basándose en la presencia de una célula cancerosa en la muestra biológica. En determinadas realizaciones, el esputo se obtiene de un sujeto que tiene antecedentes de fumar cigarrillos. En algunas realizaciones, el esputo se obtiene de un sujeto que ha recibido algún tratamiento para el cáncer de pulmón que incluye, pero sin limitarse a, radioterapia, quimioterapia, cirugía y combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, el esputo se obtiene de un sujeto que no ha recibido uno o más de los tratamientos contra el cáncer descritos anteriormente. En algunas realizaciones, el esputo se obtiene de un sujeto que no ha recibido tratamiento para el cáncer. En algunas realizaciones, el esputo se obtiene de un individuo al que nunca se le ha diagnosticado cáncer. En determinadas realizaciones, los patrones de 5mC se visualizan después de la tinción por inmunofluorescencia con un anticuerpo específico para 5mC. En algunas realizaciones, el ADNg se visualiza después de contratinción con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
En determinados ejemplos, la divulgación enseña a cuantificar el número de células en la muestra que han sido identificadas como cancerosas o precancerosas mediante la implementación de los métodos de prueba anteriores, y comparar ese número de células cancerosas o precancerosas con un número de referencia de células cancerosas o precancerosas en individuos que tiene cáncer o precáncer, y/o comparar la muestra analizada con un número de referencia de células cancerosas o precancerosas en individuos que no tienen cáncer o precáncer.
En determinadas realizaciones, los métodos de la invención descritos en este documento incluyen la obtención de la muestra de esputo del sujeto. En algunas realizaciones, la muestra de esputo se obtiene administrando solución salina hipertónica en el tracto respiratorio del sujeto; y recogiendo una cantidad de esputo que se expulsa del sujeto como resultado de la inhalación de dicha solución salina hipertónica. En determinadas realizaciones, la solución salina hipertónica se administra mediante un nebulizador ultrasónico. En algunas realizaciones, la solución salina hipertónica es aproximadamente del 3 al 5 % de NaCl. En algunas realizaciones, el nebulizador ultrasónico tiene una salida de aproximadamente 1 a 2 mL/minuto. En algunas realizaciones, la solución salina se inhala durante un período de aproximadamente 5 a 20 minutos. En algunas realizaciones alternativas, la muestra de esputo se obtiene usando un nebulizador portátil para dispensar solución salina hipertónica en el tracto respiratorio del sujeto. En algunas realizaciones, la solución salina hipertónica está dentro de un intervalo de NaCl descrito anteriormente. En algunas realizaciones, la solución salina hipertónica se dispensa durante un período de tiempo dentro de un intervalo descrito anteriormente.
Si bien la administración de solución salina hipertónica es un método para inducir esputo, se apreciaría fácilmente que también podrían usarse métodos alternativos de inducción de esputo para obtener una muestra que podría usarse con los métodos de la invención. Simplemente a modo de ejemplos no limitativos, también se podrían usar la broncoscopia y el lavado broncoalveolar.
En diversos ejemplos, la divulgación enseña un método para tratar a un sujeto al que se le ha diagnosticado cáncer o una afección precancerosa según uno o más de los métodos descritos en este documento. En algunos ejemplos, el método comprende, consiste o consiste esencialmente en administrar quimioterapia y/o radioterapia y/o realizar cirugía para resecar todo o una parte de un tumor en el sujeto, en el que al sujeto se le diagnosticó cáncer o una afección precancerosa mediante cualquier método descrito en este documento. En algunos ejemplos, al sujeto se le ha diagnosticado cáncer de pulmón.
Aunque los métodos anteriores están destinados a detectar cáncer de pulmón y lesiones precancerosas en un sujeto, como se indicó anteriormente también sería posible usar los mismos principios básicos de los métodos de la invención descritos en este documento para analizar muestras y detectar cáncer o lesiones precancerosas de distintos orígenes. Simplemente a modo de ejemplos no limitantes, se podrían analizar la saliva y/o las secreciones mucosas para determinar la presencia o ausencia de cáncer de cabeza y/o cuello; se podrían analizar las secreciones de colon y/o rectales para determinar la presencia o ausencia de cáncer de colon y/o recto; se podrían analizar las secreciones cervicales para determinar la presencia o ausencia de cáncer de cuello uterino; Se podrían analizar las secreciones vaginales y/o cervicales para determinar la presencia o ausencia de cáncer de ovario, y se podrían analizar los fluidos de la uretra para determinar la presencia o ausencia de cáncer de uretra, vejiga o riñón.
Además, aunque las pruebas que implican 5mC son el enfoque principal de los ejemplos descritos en este documento, un experto en la técnica apreciaría fácilmente que otras variaciones de citosina, tales como 3-metilcitosina, 5-hidroximetilcitosina, 5-formilcitosina y 5-carboxilcitosina también podrían ser usadas como base para distinguir entre células cancerosas (o precancerosas) y no cancerosas, aplicando esencialmente los mismos métodos de detección y análisis descritos en este documento. Por lo tanto, se pretende que la evaluación de cualquier metilación de citosina, mediante el uso de los métodos descritos en este documento, esté dentro del alcance de la presente solicitud. Además, aunque las pruebas descritas en los ejemplos específicos expuestos en este documento implican DAPI como colorante primario para delinear el ADNg así como el volumen nuclear, un experto en la técnica también apreciaría que otros colorantes, que se unen al ADN bicatenario de forma no específica para la secuencia y pueden usarse para la cuantificación de ADNg. Estos pueden incluir, entre otros, yoduro de propidio, los colorantes Hoechst (incluidos Hoechst 33258 y Hoechst 33342), bromuro de etidio, SYBR Green, SYBR Gold, Pico Green, los colorantes SYTOX (incluidos SYTOX Green, SYTo X Blue y SYTOX Orange), los colorantes SYTO, las familias de colorantes YOYO y T<o>TO (incluidos YOYO, TOTO, JO<j>O, BOBO, POPO, YO-PRO y PO-PRO), así como actinomicina D y 7-aminoactinomicina D (7-AAD), que también podrían usarse para los mismos fines.
Dada la diferencia significativa en la carga nuclear global de 5mC y la distribución entre las células precancerosas o cancerosas y sus contrapartes normales, estas diferencias se pueden visualizar y medir utilizando microscopía óptica de manera rápida y paralela con resolución unicelular para la caracterización de miles de células dentro de muestras biológicas. En algunos ejemplos, se analiza el contenido nuclear global y la distribución relativa de 5mC frente al ADNg global (delineado por DAPI) en células derivadas de esputo y poblaciones de células. Estas entidades nucleares no son estáticas y se reorganizan durante la transformación celular de células sanas normales en células precancerosas y cancerosas. En este contexto, un aspecto poderoso de los diagramas de dispersión es su capacidad para representar modelos mixtos de relaciones simples entre variables. Estas relaciones pueden reflejar patrones celulares como firmas específicas, en las que las variables pueden ser estructuras nucleares, como se muestra en el caso de los patrones nucleares de 5mC frente al ADNg teñido con DAPI (Tajbakhsh J, Wawrowsky KA, Gertych A, Bar-Nur O, Vishnevsky E, Lindsley EH, Farkas DL). Caracterización de células tumorales y células madre mediante imágenes de metilación nuclear diferencial. En: Farkas DL, Nicolau DV, Leif RC, editors. Proceedings Vol. 6859 Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues VI 2008. p 68590F). Se ha demostrado que tales reorganizaciones pueden monitorearse dinámicamente mediante gráficos de dispersión de las distribuciones de señales de 5mC y ADNg globales, y su distribución diferencial se vuelve visible como cambios en los patrones trazados. En otras palabras, los diagramas de dispersión 2D representan codistribuciones de frecuencia de señal de las dos entidades nucleares objetivo, y los diagramas de codistribución pueden considerarse como firmas específicas de cada célula (véase Tajba khsh J, Wawrowsky KA, Gertych A, Bar-Nur O, Vishnevsky E, Lindsley EH, Farkas DL). Caracterización de células tumorales y células madre mediante imágenes de metilación nuclear diferencial. En: Farkas DL, Nicolau DV, Leif RC, editors. Proceedings Vol. 6859 Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues VI 2008. p 68590F); Gertych A, et al. Automated quantification of DNA demethylation effects in cells via 3D mapping of nuclear signatures and population homogeneity assessment. Cytometry A 2009; 75:569-83; Gertych A, et al.. Measuring topology of low-intensity DNA methylation sites for high-throughput assessment of epigenetic drug-induced effects in cancer cells. Exp Cell Res 2010; 316(19):3150-60; Oh JH, et al. Nuclear DNA methylation and chromatin condensation phenotypes are distinct between normally proliferating/aging, rapidly growing/immortal, and senescent cells. Oncotarget 2013; 4:474-93. En algunos ejemplos, estas firmas de codistribución de 5mC/ADNg junto con el contenido global de 5mC y ADNg son los tres parámetros/biomarcadores que se consideran en la caracterización de células individuales y poblaciones de células derivadas de esputo para la identificación de células precancerosas y cancerosas.
Un experto en la técnica reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento, que podrían usarse en la práctica de la presente divulgación. De hecho, la presente divulgación no se limita de ninguna manera a los métodos y materiales descritos.
Ejemplos
Ejemplo 7
Antecedentes adicionales
Cáncer de pulmón y estado actual del diagnóstico
En el año 2010, se informaron más de 200,000 nuevos casos de cáncer de pulmón en los Estados Unidos, lo que representa el 15 % de todos los casos nuevos de cáncer. El número estimado de muertes por cáncer de pulmón en el mismo período fue de aproximadamente 160,000, lo que representa aproximadamente ~28 % de todas las muertes relacionadas con el cáncer. Desafortunadamente, debido a las limitadas opciones de tratamiento, el cáncer de pulmón es la causa más común de mortalidad relacionada con el cáncer. Si esta enfermedad se diagnostica en un estadio temprano, una resección quirúrgica completa del tumor ofrece una posibilidad favorable de curación. Por lo tanto, la detección temprana de esta enfermedad ha sido el foco de muchos intentos en las últimas décadas. Varios ensayos que usan técnicas radiográficas, incluidas radiografías de tórax, tomografía computarizada (CT) de tórax y tomografías por emisión de positrones (PET), han mostrado resultados mixtos con beneficios clínicos poco claros y costes muy altos. Como se indicó anteriormente, los métodos radiográficos para la detección temprana del cáncer de pulmón, incluidas las tomografías CT, implican una dosis alta de radiación, que por sí sola impone un mayor riesgo de desarrollar neoplasias malignas secundarias si se usa con frecuencia. Como resultado, el uso frecuente de tomografías CT para detectar el cáncer de pulmón probablemente no sea seguro ni económico.
Es importante destacar que ensayos anteriores han usado la citología del esputo para la detección temprana del cáncer de pulmón, pero dependían principalmente de la evaluación de cambios morfológicos de las células respiratorias epiteliales exfoliadas, y ninguno de ellos logró detectar casos de cáncer de pulmón hasta el punto de que podrían mostrar una ventaja clínica significativa.
Por otro lado, la evaluación del estado de metilación de determinados genes en muestras de esputo de pacientes de alto riesgo ha tenido éxito en la detección temprana de lesiones de cáncer de pulmón. Desafortunadamente, el cáncer de pulmón es un grupo heterogéneo de enfermedades y no se identifica ninguna anomalía uniforme en todos los casos. Igualmente importante es que el análisis de muestras de células que promedian el estado de metilación de genes en una gran cantidad de células puede ocultar la importante información sutil que es específica de un subgrupo más pequeño de células cancerosas en el esputo y, por lo tanto, sesgar los resultados del análisis. Por lo tanto, confiar en las anomalías de un subconjunto de genes en todas las células del esputo para detectar tumores de pulmón probablemente únicamente cubra un subgrupo de casos. Después de considerar las deficiencias de los métodos de diagnóstico disponibles anteriormente, los inventores intentaron analizar el estado global de metilación del ADN de las células respiratorias exfoliadas en el esputo, célula por célula, como herramienta para la detección temprana del cáncer de pulmón.
Metilación del ADN en el diagnóstico del cáncer
El perfecto equilibrio epigenético de las células normales se altera sustancialmente cuando las células se transforman. Las alteraciones epigenéticas resultantes a nivel del ADN se dividen en dos categorías: (i) hipermetilación específica de genes de CpG en promotores de genes en regiones genómicas ricas en genes denominadas islas CpG, y (ii) hipometilación de todo el genoma, un gran porcentaje de la cual ocurre en elementos repetitivos del ADN. Los patrones aberrantes de metilación están asociados con varios tipos de cáncer. La hipometilación de todo el genoma es muy paralela al grado de malignidad y es un hallazgo ubicuo. El análisis de la hipometilación del ADN ha permanecido en gran medida sin explotar. Las líneas celulares cancerosas, ampliamente usadas como modelos de investigación, exhiben una gran variación en la desmetilación de todo el genoma, lo que refleja la especificidad del tejido y resultados poco probables de procedimientos estocásticos. Una célula maligna puede contener entre un 20 y un 60 % menos de metilcitosina genómica que su contraparte normal. La pérdida de grupos metilo se logra principalmente por hipometilación de secuencias repetitivas de ADN, que representan más del 90 % del genoma humano, incluidos elementos transponibles (~48 % del genoma) tales como elementos nucleares cortos y largos intercalados (SINES y LINES, respectivamente), adquiridos en gran medida como retrovirus a lo largo de la evolución. La metilación global también es clínicamente relevante, como lo demuestran las asociaciones entre el resultado clínico y los niveles de metilación global en una serie de tipos de cáncer. La hipometilación global parece estar relacionada con la progresión del cáncer, ya que la pérdida de metilación global tiende a volverse más pronunciada a medida que progresan las lesiones precancerosas. Hasta la fecha, el análisis diferencial de metilación del ADN se ha evaluado cuantitativamente principalmente mediante enfoques moleculares que incluyen tecnologías electroforéticas, cromatográficas, basadas en PCR, basadas en matrices y de secuenciación. A pesar de la enorme mejora en la especificidad, la sensibilidad y la resolución inherente de base única de estos métodos, siguen siendo técnicamente desafiantes en el análisis de alto rendimiento de células individuales. Estos incluyen la limitación de los enfoques basados en PCR en la multiplexación y los desafiantes problemas de sensibilidad y coste de la secuenciación del genoma completo, especialmente para la interrogación de elementos repetitivos. Alternativamente, y considerando la prevalencia y la carga de los desequilibrios de metilación del ADN, especialmente la hipometilación de elementos repetitivos, la evaluación basada en imágenes de los patrones nucleares globales de 5mC proporciona una herramienta poderosa para analizar y caracterizar simultáneamente una gran cantidad de células, ya que los procedimientos moleculares subyacentes implican una reorganización de la cromatina a gran escala visible mediante microscopía óptica.
Importancia de las imágenes cuantitativas de metilación del ADN
Como se demuestra en este documento, se ha desarrollado y aplicado al cáncer de pulmón un método de obtención de imágenes cuantitativas de metilación del ADN (3D-qDMI). Este método no destructivo implica la medición cuantitativa paralela de la carga de 5-metilcitosina y la distribución nuclear espacial, para caracterizar células y tejidos (Véase Tajbakhsh J, et al. Characterization of tumor cells and stem cells by differential nuclear methylation imaging. En: Farkas DL, Nicolau DV, Leif RC, eds. Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues. San Jose, CA: Proceedings of the SPIE 2008; 6856:6859F1-10; Gertych A, et al. Automated quantification of DNA demethylation effects in cells via 3D mapping of nuclear signatures and population homogeneity assessment. Cytometry A 2009; 75:569-83; Gertych A, et al. Measuring topology of low-intensity DNA methylation sites for highthroughput assessment of epigenetic drug-induced effects in cancer cells. Exp Cell Res 2010; 316:3150-60; Gertych A, et al. Homogeneity assessment of cell populations for high-content screening platforms. In: Information Technology in Biomedicine. Vol. 2. Advances in intelligent and soft computing, Vol. 69. Ewa Pietka and Jacek Kawa, Editors, Springer Verlag, Heidelberg, Alemania; Tajbakhsh, J. et al. (2012). 3-D Quantitative DNA Methylation Imaging for Chromatin Texture Analysis in Pharmacoepigenomics and Toxicoepigenomics. En Epigenomics: From Chromatin Biology to Therapeutics. K. Appasani, editor. Cambridge University Press, Cambridge, Reino Unido). El flujo de trabajo de una realización de 3D-qDMI se ilustra en la figura 1.
Dado el gran intervalo dinámico en la carga y distribución de SmC, 3D-qDMI permite la caracterización rápida, paralela, morfométrica y de resolución unicelular de miles de células dentro de muestras de esputo heterogéneas. A continuación se destacan algunas de las ventajas de 3D-qDMI aplicables al uso de sustitutos no invasivos, tales como muestras de esputo, en el diagnóstico del cáncer de pulmón y la toma de decisiones clínicas: (i) 3D-qDMI no requiere enriquecimiento celular mediante métodos de separación propensos a errores; (ii) el método no requiere extracción y amplificación de ADN que requieren mucho tiempo, (iii) 3D-qDMI proporciona análisis célula por célula; (iv) el método permite la evaluación de la heterogeneidad de poblaciones de células, incluida la frecuencia de diferentes tipos de células con respecto a las características de metilación del ADN; (v) las células irrelevantes pueden identificarse y excluirse del análisis, lo que evitaría que los datos se sesguen debido a la impureza de la muestra al infiltrarse en células hematopoyéticas; (vi) el enfoque citométrico rentable puede automatizarse y es escalable, por lo que puede desarrollarse e implementarse fácilmente en entornos clínicos. El enfoque citométrico se puede aplicar a imágenes simultáneas de alto contenido multicolor. Por tanto, las células de interés y/o las células hematopoyéticas infiltrantes pueden marcarse adicionalmente para marcadores específicos de células. Posteriormente, se pueden identificar celdas irrelevantes en los datos de salida y eliminarlas antes del análisis de los datos. Adicionalmente, el método es compatible con el uso de portaobjetos microscópicos y microplacas en formato de la Sociedad de Ciencias Biomoleculares (SBS) como soporte para la deposición de células derivadas del esputo. Por lo tanto, el método tiene potencial para su implementación en el entorno clínico y de diagnóstico de alto rendimiento, es decir, la aplicación rutinaria de dichos formatos para el diagnóstico del cáncer. En detalle, las tres etapas de preparación, tinción y escaneo de muestras se pueden automatizar con instrumentos de alto rendimiento disponibles comercialmente. El análisis de imágenes y datos son procedimientos computarizados que naturalmente se realizan de forma automatizada y únicamente están limitados por la capacidad computacional.
Análisis de muestras
El software 3D-qDMI implementado en determinados ejemplos descritos en este documento fue diseñado para realizar un sofisticado análisis de imágenes en 3-D de células individuales (a diferencia del análisis colectivo y la salida de resultados) dentro de un marco de imagen, permitiendo de este modo una eliminación y combinación flexible de células para estadísticas variables. En algunos ejemplos, el resultado del patrón de colocalización SmC/DAPI se puede representar como un diagrama de dispersión (véase la figura 2). Sin embargo, un experto en la técnica apreciará fácilmente que existen muchas otras formas de representar este tipo de datos.
Como se demuestra en la figura 2, las características de SmC, tales como los patrones de colocalización de SmC/DAPI, pueden variar entre células dentro de una población. Por lo tanto, la evaluación de la heterogeneidad de la población de células es una característica valiosa para determinar la composición de las células, es decir, el grado de variación fenotípica importante para la identificación de un número bajo de células que pueden mostrar fenotipos MeC aberrantes similares a las células cancerosas agresivas. La homogeneidad se puede evaluar mediante la comparación de la similitud estructural dentro de una población de células completa expresando una relación entre un patrón nuclear individual de 5mC/DAPI y el patrón global de toda la población de células, que representa la suma de todos los patrones nucleares individuales (patrón de referencia).
Estudios de esputo
Los inventores exploraron patrones nucleares 3D de 5mC en células de las vías respiratorias superiores humanas derivadas del esputo de un individuo sano (no fumador sin antecedentes de cáncer), así como células de esputo de un paciente con cáncer de pulmón (fumador) y una muestra de tejido compatible, así como tres líneas celulares humanas. Las líneas celulares incluyeron la línea celular epitelial humana normal inmortalizada (BEAS-2B) y las líneas NSCLC A549 (células epiteliales basales alveolares) y H157 (células de carcinoma de pulmón altamente invasivas). La figura 4 muestra el parénquima normal y la región tumoral de una sección marcada con fluorescencia de un cáncer de pulmón recién diagnosticado y resecado quirúrgicamente. Los inventores observaron patrones globales comunes de metilación del ADN entre células sanas que difieren significativamente de los patrones SmC/DAPI de células cancerosas y células de esputo anormales del paciente con cáncer (Figura 5) que estaban significativamente hipometiladas globalmente. Todas las poblaciones de las tres líneas celulares diferentes y células derivadas de esputo, así como el tejido normal, mostraron un alto grado de homogeneidad (visualizada a través de mapas de categorías KL) en términos de sus codistribuciones 5mC/DAPI, mostradas como diagramas de dispersión en el nivel de población de células y para núcleos representativos individuales.
Los inventores han introducido un descriptor medible de cada tipo de célula (Figura 5): la línea de regresión del gráfico y los límites de señal superior e inferior ML1 y ML2 son característicos y determinan los cuatro ángulos a, p, y y 6 para cada tipo de célula prototípica. El factor diferencial resultante F = [(a/y) x (p/6)] es específico de cada tipo de célula: 0.54 (BEAS-2B), 0.42 (A549), 0.12 (H157), 0.78 (células típicas de tejido normal), 0.45 (células de esputo normal), 0.44 (mayoría de células de tipo N1 en el esputo de un paciente con cáncer), 0.01 (Células tipo N2 en el esputo de un paciente con cáncer) y 0.05 (células típicas de tejido canceroso). Esta medida subraya el poder diferenciador de los patrones de metilación global para la detección de células normales y malignas. Especialmente la semejanza entre las firmas celulares (tipo N2) en el esputo de pacientes con cáncer y las células típicas del tejido tumoral puede desempeñar un papel central en la detección de células anormales en muestras de esputo, en las primeras etapas del procedimiento de tumorigénesis. Las observaciones demostraron en las figuras 4 y 5 que los patrones de metilación del ADN nuclear tridimensional sirven como un nuevo biomarcador para la detección no invasiva de células malignas del tracto respiratorio. En algunos aspectos, el método inventivo usa 3D-qDMI para determinar patrones globales diferenciales de metilación del ADN de células respiratorias exfoliadas en una muestra de esputo de individuos con mayor riesgo de desarrollar cáncer de pulmón. En concreto, cada población de células de esputo puede caracterizarse mediante estadísticas de determinados factores F que proporcionan una estimación de la composición celular, lo que podría facilitar la detección de células malignas.
Ejemplo 2
Métodos
Preparación de muestras de células
La inducción del esputo se puede realizar mediante la inhalación de solución salina hipertónica (3 a 5 % de NaCl). Usando un nebulizador se pueden generar aerosoles con una salida de 1.5 mL/min. Los sujetos inhalan aerosoles de solución salina durante un período de hasta 20 min. Se anima a los sujetos a expectorar esputo después de enjuagarse la boca con agua del grifo cada 5 minutos. Las células exfoliadas de las vías respiratorias superiores se aíslan y se fijan en portaobjetos/cubreobjetos o en pocillos de microplacas. Las muestras que se recolectaron en un recipiente de plástico se mantienen a 4°C hasta su procesamiento. Las muestras se diluyen con solución salina regulada con fosfato (PBS), que contiene ditiotreitol (DTT) al 0.1 %, comúnmente conocida como solución de esputolisina al 10 %, y se incuban durante 20 minutos antes de la centrifugación a 300-1500 x g durante 5-10 minutos a temperatura ambiente para separar las fases celular y fluida (moco). Este procedimiento se repite hasta que la suspensión celular parezca homogénea y clara. Luego, las pellas celulares se vuelven a suspender en PBS y las células se filtran a través de una malla de nailon de 40-100 pm (colador celular) para eliminar la mucosidad y los desechos residuales. Posteriormente, las células se centrifugan a 300-1500 x g durante 5-10 minutos. Las pellas celulares (que contienen todas las células recolectadas) se vuelven a suspender en 1-2 microlitros de medio de células epiteliales, se transfieren a un cubreobjetos de vidrio microscópico y se cultivan durante 16-48 horas a 37 °C y 5 % de CO<2>para que las células se adhieran al cubreobjetos. En algunos ejemplos, los recuentos celulares se realizan en muestras centrifugadas (citospin) y la muestra celular se extiende sobre un portaobjetos/cubreobjetos de microscopio o en un pocillo de microplaca. Posteriormente, las células se fijan en paraformaldehído al 4 % durante 15-45 minutos y se mantienen en PBS a 4 °C. Luego, la caracterización de las células fijadas se logra mediante imágenes de metilación de ADN cuantitativas en 3D (3D-qDMI), como se describe en este documento.
Como alternativa al método de procesamiento del esputo de las vías respiratorias descrito anteriormente, el esputo de las vías respiratorias puede procesarse mediante cualquier método conocido en la técnica. Meramente a modo de ejemplo, el procesamiento del esputo de las vías respiratorias se puede realizar de acuerdo con cualquier método descrito o al que se hace referencia en Hamid et al. Eur Respir J 2002; 20 Suppl. 37, 19s-23s.
Bioquímica
El análisis de la muestra se logra mediante la combinación de tinción por inmunofluorescencia para la visualización de patrones de metilcitosina superpuestos con un anticuerpo monoclonal de ratón específico (clon 33D3) contra la 5-metilcitosina en los núcleos celulares y contratinción con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para la delineación del ADN nuclear global. Si bien existen numerosos protocolos disponibles públicamente para la tinción para la visualización de 5-metilcitosina y ADNg, en algunos ejemplos se usan protocolos de las siguientes referencias: Tajbakhsh J, et al. Characterization of tumor cells and stem cells by differential nuclear methylation imaging. En: Farkas DL, Nicolau DV, Leif RC, eds. Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues. San Jose, CA: Proceedings of the SPIE 2008; 6856:6859F1-10;33. Gertych A, et al. Automated quantification of DNA demethylation effects in cells via 3D mapping of nuclear signatures and population homogeneity assessment. Cytometry A 2009; 75:569-83; Gertych A, et al. Measuring topology of low-intensity DNA methylation sites for high-throughput assessment of epigenetic druginduced effects in cancer cells. Exp Cell Res 2010; 316:3150-60; Gertych A, et al. Homogeneity assessment of cell populations for high-content screening platforms. En: Information Technology in Biomedicine. Vol. 2. Advances in intelligent and soft computing, Vol. 69, 2010; Gertych A, et al. 3-D DNA methylation phenotypes correlate with cytotoxicity levels in prostate and liver cancer cell models. BMC Pharmacol Toxicol. 2013 Feb 11;14:1; Tajba-khsh J, et al. Early In Vitro Differentiation of Mouse Definitive Endoderm is Not Correlated with Progressive Maturation of Nuclear DNA Methylation Patterns. PLoS ONE 2011;6(7):e21861; Tajbakhsh J. Covisualization of methylcytosine, global DNA, and protein biomarkers for In Situ 3D DNA methylation phenotyping of stem cells. Methods Mol Biol. 2013; 1052:77-88; ; Oh JH, et al. Nuclear DNA methylation and chromatin condensation phenotypes are distinct between normally proliferating/aging, rapidly growing/immortal, and senescent cells. Oncotarget 2013; 4:474-93; Tajbakhsh J, et al. Dynamic heterogeneity of DNA methylation and hydroxymethylation in embryonic stem cell populations captured by single-cell 3D high-content analysis. Exp Cell Res. 2015; 332:190-201). El anticuerpo SmC usado para la tinción puede ser el descrito en (wwwdotnc-bi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Rey-naud%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=1739950) Boullanger P, Grange J, Barbesti S, Niveleau A. Monitoring of urinary excretion of modified nucleosides in cancer patients using a set of six monoclonal antibodies. Cancer Lett 1992 Mar 31;63(1):81. La especificidad del anticuerpo anti-5mC se puede confirmar utilizando una micromatriz de ADN que incluye variantes de citosina y experimentos de control estándar en combinación con inmunocitoquímica. Para excluir células hematopoyéticas y especialmente glóbulos blancos (leucocitos) en análisis aguas abajo, las muestras se pueden coinmunofenotipificar con anticuerpos anti-CD34 y anti-CD45. En algunos ejemplos, los inventores también usan anticuerpos contra citoqueratinas tales como, pero no se limitan a, CK8, CK18 y CK19 para comarcar marcadores de células epiteliales. Sin embargo, las células respiratorias malignas se encuentran dispersas entre una gran cantidad de células epiteliales normales (en un portaobjetos). Por lo tanto, los marcadores epiteliales pueden no ser útiles para distinguir entre células normales y anormales.
Inmunofluorescencia (IF)
El siguiente protocolo no limitante es para el procesamiento conveniente de células derivadas de esputo que se capturan en cubreobjetos de vidrio redondos de 18 mm (No. 1) y se procesan en microplacas de 12 pocillos. Los volúmenes de reactivos deben ajustarse para otros soportes de celdas y cámaras de reacción.
Día 1
(a) Fijación de secciones de tejido.
1) Las células derivadas del esputo se fijan en paraformaldehído (PFA) al 4 %/PBS durante 30 a 45 minutos a temperatura ambiente, luego se lavan 3 veces con PBS durante 3 a 5 minutos a temperatura ambiente. Las células que no se procesen inmediatamente más se conservarán en NaN<3>al 0.002 %/PBS a 2-8 °C.
(b) Procesamiento previo de IF de las células.
2) Lavar las células durante 5 minutos en PBS (2 ml).
3) Permeabilizar las células con Saponina al 0.5 %/Triton al 0.5 % X-100/PBS (5 ml) durante 20 minutos a temperatura ambiente y lavar 3 veces con PBS (2 ml) durante 3-5 minutos a temperatura ambiente.
4) Tratar las células con 100 pg/ml de RNasa A/PBS (0.2 ml) durante 30 minutos a 37 °C y lavar 3 veces durante 3-5 minutos con PBS (2 ml) a temperatura ambiente.
5) Bloquear el tejido con albúmina sérica bovina (BSA) al 3 %/PBS (1 ml) durante 30 minutos a 37 °C (antes de aplicar el anticuerpo primario).
(c) Primera inmunofluorescencia
6) Incubar tejido con anticuerpo primario o cóctel de anticuerpos compatibles para el fenotipado celular (como, por ejemplo, anticuerpo policlonal anti-CK19 de conejo, Abcam Cat.# ab15463, en dilución 1:1000; anticuerpo policlonal anti-CD34 de oveja, R&D Systems Cat.# AF7227, a la concentración de 1 pg/ml; y anti-CD45 de pollo, GeneTex Cat.# GTX82139 a dilución 1:500) en BSA al 3 %/PBS (0.7 ml) durante la noche a 2-8 °C.
Dia 2
7) Lavar las células 4 veces durante 5 minutos con BSA al 0.1 %/Tween 20 al 0.1 %/PBS (2 ml) a temperatura ambiente.
8) Incubar tejido con anticuerpo secundario (por ejemplo, IgG anti-cabra de burro (H+L) -Alexa 568, Invitrogen, A11057) a una concentración de 5 jg/m l cada uno en BSA al 3 %/PBS (0.7 ml) durante 1 hora a 37 °C.
9) Lavar el tejido 4 veces con BSA al 0.1 %/Tween20 al 0.1 %/PBS (2 ml) durante 3 a 5 minutos a temperatura ambiente, y una vez con BSA al 0.1 %/PBS (2 ml).
10) Fijar el tejido en PFA al 4 %/PBS (1 ml) durante 15 min a temperatura ambiente. Lavar las células 3 veces durante 3-5 minutos con PBS.
11) Despurinar las células con HCl 2 N (1 ml) durante exactamente 40 min a temperatura ambiente y lavar 3 veces con PBS (2 ml) durante 3-5 minutos a temperatura ambiente.
12) Bloquear las células con BSA al 3 %/PBS (1 ml) durante 30 minutos a 37 °C (antes de aplicar el anticuerpo primario).
(d) Segunda inmunofluorescencia
13) Incubar las células con anticuerpo primario (por ejemplo anti-MeC de ratón, mAb clon 33D3, Aviva Systems Biology, cat. # AMM99021) a una concentración de 1-2 jg/m l en BSA al 3 %/PBS (0.7 ml) durante la noche a 2-8 °C.
Día 3
14) Lavar las células 4 veces durante 5 minutos con BSA al 0.1 %/Tween 20 al 0.1 %/PBS (2 ml) a temperatura ambiente, y una vez con BSA al 0.1 %/PBS (2 ml).
15) Incubar las células con anticuerpo secundario (por ejemplo, IgG anti-ratón de burro Alexa488 (H+L), Invitrogen A21202; e IgG anti-conejo de pollo (H+L)-Alexa 647, Invitrogen A21443), ambas a una concentración de 5 jg/m l al 3 % de BSA/PBS (0.2 ml) durante 2 horas a 37 °C.
16) Lavar el tejido 4 veces con BSA al 0.1 %/Tween 20 al 0.1 %/PBS (5 ml) durante 5 minutos y una vez con BSA al 0.1 %/PBS durante 5 minutos, a temperatura ambiente.
17) Incubar el tejido en 5 ml de solución DAPI/PBS (caliente a temperatura ambiente) durante 20 minutos a temperatura ambiente, luego enjuagar durante ~30 segundos en PBS para enjuagar la tinción DAPI no específica.
18) Sacar el cubreobjetos de la microplaca y dejar secar completamente a temperatura ambiente o en horno a 37 °C (10-30 min), en la oscuridad.
19) Transfiera 7-10 j l de solución de montaje (por ejemplo Prolong-Gold, Invitrogen) a una sección de portaobjetos de vidrio limpia y seca y coloque el cubreobjetos (con las células mirando hacia el portaobjetos de vidrio) sobre la gota de montaje (evite estrictamente las burbujas de aire).
Método molecular confirmatorio
Se puede realizar un método molecular de confirmación en el ADN extraído de células aisladas (de muestras de esputo seleccionadas) en paralelo para verificar los resultados de las características SmC de la imagen citométrica (3D-qDMI): (i) carga de SmC y (ii) hipometilación de clases repetitivas de elementos de ADN (Alu/LINE-1/Sata/Sat2), el principal causante de la hipometilación global del ADN, ambos pueden evaluarse mediante MethyLight de secuencia repetida (véase Weisenberger DJ et al. Analysis of repetitive element DNA methylation por MethyLight. Nucleic Acids Res. 2005 Dec 2;33(21):6823-36). Este método ha demostrado ser un sustituto preciso de la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o la electroforesis capilar de alto rendimiento (HPCE) en la medición de la carga de SmC, que se han usado convencionalmente para mediciones globales del contenido de SmC. Las mediciones de contenido de 5mC realizadas comparativamente por Repeat-Seq MethyLight y 3D-qDMI han arrojado correlaciones muy altas (0.86 -0.96), (Véase Gertych A, et al. 3-D d Na methylation phenotypes correlate with cytotoxicity levels in prostate and liver cancer cell models. BMC Pharmacol Toxicol. 11 de febrero de 2013;14:11).
Adquisición de imagen
La adquisición de imágenes se puede realizar usando microscopía de barrido confocal de alta resolución. En algunos ejemplos no limitantes, se usa el microscopio comercial TCS s Ps X Supercontinuum de Leica (Leica Microsystems). El sistema proporciona total libertad y flexibilidad en excitación y emisión, dentro del intervalo continuo de 470 a 670 nm, en incrementos de 1 nm. El microscopio se puede acoplar con una línea láser de diodo de 405 nm para excitar la fluorescencia DAPI. Las secciones ópticas en serie se pueden recolectar en incrementos de 200-300 nm con una lente de inmersión en aceite Plan-Apo 63X 1.4 y una unidad aireada de tamaño de orificio 1.0. Para evitar el traspaso, las imágenes de cada canal se pueden adquirir de forma secuencial. A modo de ejemplo no limitativo, el tamaño de imagen típico puede oscilar entre 1024 * 1024 y 2048 * 2048 con un tamaño de vóxel respectivo de alrededor de 116 nm * 116 nm * 230.5 nm (ejes x,y, y z)y resolución de 8-16 bits por píxel en todos los canales. El formato del archivo de salida puede ser una serie de imágenes TIFF que se pueden usar para el análisis de imágenes en 3D.
Análisis de imágenes 3D
El análisis de imágenes 3D se puede realizar mediante la aplicación de un algoritmo dedicado desarrollado para el reconocimiento de patrones y el análisis multiparamétrico de alto contenido, como se describe en Gertych A, et al. Automated quantification of DNA demethylation effects in cells via 3D mapping of nuclear signatures and population homogeneity assessment. Cytometry A 2009; 75:569-83; Gertych A, et al. Measuring topology of low-intensity DNA methylation sites for high-throughput assessment of epigenetic drug-induced effects in cancer cells. Exp Cell Res 2010; 316:3150-60; Gertych A, et al. (2010). Homogeneity assessment of cell populations for high-content screening platforms. In: Information Technology in Biomedicine. Vol. 2. Advances in intelligent and soft computing, Vol.69. Ewa Pietka and Jacek Kawa, Editors, Springer Verlag, Heidelberg, Alemania; and Tajbakhsh J, (2012). 3-D Quantitative DNA Methylation Imaging for Chromatin Texture Analysis in Pharmacoepigenomics and Toxicoepigenomics. En Epigenomics: From Chromatin Biology to Therapeutics. K. Appasani, editor. Cambridge University Press, Cambridge, Reino Unido.
En algunos ejemplos, la herramienta de análisis de imágenes opera en tres etapas: 1) todas las células (dentro de las poblaciones fotografiadas) se procesan para la segmentación 3D; 2) se miden las señales de fluorescencia que residen dentro de los núcleos para (a) determinar la carga de 5-metilcitosina de todo el núcleo, (b) para generar mapas de codistribución (diagramas de dispersión) de señales de 5mC y ADN nuclear global (visualizado por DAPI) y c) para la variabilidad/heterogeneidad con respecto a las dos primeras características de 5mC. Se realiza un análisis de similitud de la carga de metilación del ADN y se crean diagramas 2D entre todas las células dentro de cada muestra, y se determina la homogeneidad de la población de células.
Con respecto al análisis de similitud, las medidas de similitud comúnmente aplicadas se pueden organizar en tres grupos según la representación del objeto: (a) basada en puntos, incluidas las distancias euclidianas y de Minkowski, (b) basada en conjuntos, incluidos los índices de Jaccard, Tanimoto y Dice, y (c) probabilística con distancias de Bhattacharyya, Kullback-Leibler y Mahalanobis basadas en correlación, respectivamente (Véase Dice LR. Measures of the amount of ecological association between species. J Ecology 1945;26:297-302; Bhattacharyya A. Sobre una medida de divergencia entre dos poblaciones estadísticas definidas por distribuciones de probabilidad. Bull Calcutta Math Soc 1943;35:99-109; Mahalanobis PC. Sobre la distancia generalizada en la estadística. Proc Nat Inst Scien India 1936;2:49-55; Kullback S, Leibler RA. (1951), "On Information and Sufficiency". Annals of Mathematical Statistics 22 (1): 79-86; Jaccard P (1912), "The distribution of the flora in the alpine zone", New Phytologist 11: 37-50; Rogers DJ, Tanimoto TT (1960), "A Computer Program for Classifying Plants". Science 132 (3434): 1115-1118; Elena Deza & Michel Marie Deza (2009) Encyclopedia of Distances, página 94, Springer; Levandowsky M, Winter D. (1971), "Distance between sets", Nature 234 (5): 34-35).
Como se indicó anteriormente, en un ejemplo no limitante, se puede usar la medición de divergencia de Kullback-Leibler (KL), una operación matemática que se considera muy adecuada para el análisis de objetivos nucleares que no tienen forma ni posición geométrica rígida (Véase Gertych A, et al. Automated quantification of DNA demethylation effects in cells via 3D mapping of nuclear signatures and population homogeneity assessment. Cytometry A 2009; 75:569-83). La divergencia KL se puede aplicar como una medida de similitud entre los diagramas de dispersión normalizados de núcleos individuales y un diagrama de dispersión de referencia para permitir la evaluación de las células dentro de la población. Para que los valores de KL sean más descriptivos, se pueden introducir cuatro calificadores suaves en el software, que definen el grado de similitud de una célula frente a toda la población de células. Estos grados pueden asociarse con rangos particulares de divergencias KL tales como: similaresKL e[0, 0.5), probablemente similarKL e[0.5, 2), similar poco probableKL e[2, 4.5), y diferente paraKL e[4.5, ~) (Figura 3).
Los diversos métodos y técnicas descritos anteriormente proporcionan un número de formas de llevar a cabo la divulgación. Por supuesto, debe entenderse que no necesariamente todos los objetivos o ventajas descritos pueden lograrse de acuerdo con cualquier ejemplo particular descrito en este documento. De este modo, por ejemplo, los expertos en la técnica reconocerán que los métodos se pueden realizar de una manera que logre u optimice una ventaja o grupo de ventajas como se enseña en este documento sin necesariamente lograr otros objetivos o ventajas como se enseña o sugiere en este documento. En este documento se mencionan una variedad de alternativas. Debe entenderse que algunos ejemplos preferidos incluyen específicamente una, otra o varias características, mientras que otros excluyen específicamente una, otra o varias características, mientras que otros mitigan una característica particular mediante la inclusión de una, otra o varias características ventajosas.
Adicionalmente, el experto reconocerá la aplicabilidad de diversas características de diferentes ejemplos. De manera similar, los diversos elementos, características y etapas discutidos anteriormente, así como otros equivalentes conocidos para cada elemento, característica o paso, pueden ser empleados en varias combinaciones por un experto en esta técnica para realizar métodos de acuerdo con los principios descritos en este documento. Entre los diversos elementos, características y etapas, algunos se incluirán específicamente y otros se excluirán específicamente en diversos ejemplos.
Aunque la solicitud se ha divulgado en el contexto de determinados ejemplos y ejemplos, los expertos en la técnica entenderán que los ejemplos de la solicitud se extienden más allá de los ejemplos específicamente divulgados a otros ejemplos y/o usos alternativos y modificaciones y equivalentes de los mismos.
En algunos ejemplos, los términos "un" y "una" y "el" y referencias similares usadas en el contexto de describir ejemplos particulares de la solicitud (especialmente en el contexto de determinadas de las siguientes reivindicaciones) pueden interpretarse para cubrir tanto el singular y el plural. La enumeración de intervalos de valores en este documento simplemente pretende servir como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que cae dentro del intervalo. A menos que se indique lo contrario en este documento, cada valor individual se incorpora a la especificación como si se enumerara individualmente en este documento. Todos los métodos descritos en este documento se pueden realizar en cualquier orden apropiado a menos que se indique lo contrario en este documento o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje de ejemplo (por ejemplo, "tal como") proporcionado con respecto a determinados ejemplos en este documento tiene como objetivo simplemente iluminar mejor la solicitud y no plantea una limitación en el alcance de la solicitud que de otro modo se reivindica. Ningún lenguaje en la especificación debe interpretarse como indicando algún elemento no reivindicado esencial para la práctica de la solicitud.
En este documento se describen ejemplos preferidos de esta aplicación, incluido el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la aplicación. Las variaciones de esos ejemplos preferidos resultarán evidentes para los expertos en la técnica al leer la descripción anterior. Se contempla que los expertos en la técnica puedan emplear dichas variaciones según corresponda, y la aplicación se puede practicar de otra manera que la descrita específicamente en este documento. De acuerdo con lo anterior, muchos ejemplos de esta solicitud incluyen todas las modificaciones y equivalentes del tema mencionado en las reivindicaciones adjuntas al presente según lo permita la ley aplicable. Además, cualquier combinación de los elementos descritos anteriormente en todas sus posibles variaciones está abarcada por la solicitud a menos que se indique lo contrario en este documento o que el contexto lo contradiga claramente.
Para terminar, debe entenderse que los ejemplos de la solicitud divulgada en este documento son ilustrativos de los principios de los ejemplos de la solicitud. Otras modificaciones que pueden emplearse pueden estar dentro del alcance de la aplicación. De este modo, a modo de ejemplo, pero no de limitación, se pueden usar configuraciones alternativas de los ejemplos de la aplicación de acuerdo con las enseñanzas en este documento. De acuerdo con lo anterior, los ejemplos de la presente solicitud no se limitan a lo que se muestra y describe exactamente.
Claims (15)
1. Un método para determinar si una célula es cancerosa o precancerosa, que comprende:
determinar un contenido de 5-metilcitosina (5mC) y codistribución nuclear espacial del contenido de SmC y ADN global (ADNg) en un núcleo de la célula, en el que el contenido de SmC se determina después de que la célula se haya sometido a (a) tinción por inmunofluorescencia y luego, la codistribución nuclear espacial del contenido de SmC y ADNg se determina después de que la célula haya sido sometida a (b) contratinción, en la que la determinación de la codistribución nuclear espacial del contenido de SmC y ADNg comprende generar un diagrama de dispersión del contenido de SmC y el contenido de ADNg para el núcleo; y
determinar que la célula es cancerosa o precancerosa si el contenido de SmC es significativamente menor, y/o un ángulo de la línea de regresión del diagrama de dispersión es menor que los de una célula de referencia no cancerosa o no precancerosa y/o una población de células de referencia no cancerosas o no precancerosas, cuando el contenido de ADNg define el eje x, el contenido de SmC define el eje y, y el ángulo de la línea de regresión es con el eje x del diagrama de dispersión, o
determinar que la célula no es cancerosa ni precancerosa si el contenido de SmC y la codistribución nuclear espacial del contenido de SmC y el ADNg no son significativamente diferentes de los de una célula de referencia no cancerosa o no precancerosa y/o una población de células de referencia no cancerosas o no precancerosas.
2. El método de la reivindicación 1, en el que la célula se obtiene a partir de una muestra biológica, opcionalmente en el que la muestra biológica comprende esputo, preferiblemente en el que el esputo comprende células respiratorias.
3. El método de la reivindicación 2, en el que la célula cancerosa o célula precancerosa es de origen de cáncer de pulmón, opcionalmente en el que la muestra biológica se obtiene de un sujeto que tiene antecedentes de tabaquismo o que no tiene antecedentes de tabaquismo.
4. El método de la reivindicación 2, en el que la muestra biológica se obtiene de un sujeto que tiene cáncer de pulmón y no ha sido tratado por cáncer de pulmón.
5. El método de la reivindicación 2, en el que la muestra biológica se obtiene de un sujeto que ha recibido un tratamiento para el cáncer de pulmón seleccionado del grupo que consiste en: radioterapia, quimioterapia, cirugía y combinaciones de las mismas.
6. El método de la reivindicación 1, en el que los contenidos de SmC y ADNg se determinan con un microscopio después de que la célula haya sido sometida a (a) tinción por inmunofluorescencia con un anticuerpo específico para 5mC, y (b) contratinción con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), yoduro de propidio, colorante Hoechst, Hoechst 33258, Hoechst 33342, bromuro de etidio, SYBR Green, SYb R Gold, Pico Green, un colorante SYTOX, un colorante SYTO, YOYO, TOTO, JOJO, BOBO, POPO, YO- PRO, PO-PRO, actinomicina D o 7-aminoactinomicina D.
7. El método de la reivindicación 1, en el que la codistribución nuclear espacial del contenido de SmC y el ADNg se determina con un microscopio después de que la célula haya sido sometida a (a) tinción por inmunofluorescencia con un anticuerpo específico para 5mC, y (b) contratinción con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), yoduro de propidio, colorante Hoechst, Hoechst 33258, Hoechst 33342, bromuro de etidio, SYBR Green, SYBR Gold, Pico Green, un colorante SYTOX, un colorante SYTO, YOYO, TOTO, JOJO, BOBO, POPO, YO-PRO, PO-PRO, actinomicina D o 7-aminoactinomicina D.
8. El método de la reivindicación 7, en el que la célula se determina como cancerosa o precancerosa si el contenido de SmC es menor que el de la célula de referencia no cancerosa o no precancerosa y/o la población de células de referencia no cancerosas o no precancerosas en 25 % o más, y/o
en el que el ángulo de la línea de regresión del diagrama de dispersión es menor que el de la célula de referencia no cancerosa o no precancerosa y/o la población de células de referencia no cancerosas o no precancerosas en 20 grados o más.
9. El método de la reivindicación 2, en el que la muestra de esputo se obtuvo de un sujeto mediante un método que comprende:
administrar solución salina hipertónica en el tracto respiratorio del sujeto; y
recoger una cantidad de esputo que se expulsa del sujeto como resultado de la inhalación de dicha solución salina hipertónica.
10. El método de la reivindicación 9, en el que la solución salina hipertónica se administra mediante un nebulizador.
11. El método de la reivindicación 9, en el que la solución salina hipertónica es NaCl al 3-5 %.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en el que el microscopio es un microscopio de barrido confocal con una resolución igual o inferior a 500 nanómetros.
13. Un método que comprende:
en una muestra biológica obtenida de un sujeto, en el que la muestra biológica comprende una célula; determinación de un contenido de 5-metilcitosina (5mC) y codistribución nuclear espacial del contenido de SmC y ADN global (ADNg) en un núcleo de la célula, en el que el contenido de SmC se determina después de que la célula se haya sometido a (a) tinción por inmunofluorescencia y luego, la codistribución nuclear espacial del contenido de SmC y ADNg se determina después de que la célula haya sido sometida a (b) contratinción, en la que la determinación de la codistribución nuclear espacial del contenido de SmC y ADNg comprende generar un diagrama de dispersión del contenido de SmC y el contenido de ADNg para el núcleo;
determinar que la célula es cancerosa o precancerosa si el contenido de SmC es significativamente menor, y/o un ángulo de línea de regresión del diagrama de dispersión es menor que aquellos en una célula de referencia no cancerosa o no precancerosa y/o población de células no cancerosas o no precancerosas, cuando el contenido de ADNg define el eje x, el contenido de SmC define el eje y, y el ángulo de la línea de regresión es con el eje x del diagrama de dispersión; y determinar que el sujeto tiene un alto riesgo de desarrollar cáncer clínicamente verificable o ha desarrollado cáncer clínicamente verificable, si se determina que la célula es cancerosa o precancerosa.
14. El método de la reivindicación 13, en el que la muestra biológica comprende esputo, opcionalmente en el que el esputo comprende células respiratorias, preferiblemente en el que la célula cancerosa o la célula precancerosa es de origen de cáncer de pulmón.
15. El método de la reivindicación 13, en el que el método diagnostica al sujeto cáncer de pulmón.
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