CN107002125A - 通过唾液来源细胞的dna甲基化表型分型进行早期肺癌检测 - Google Patents
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Abstract
在某些实施方案中，本申请公开了用于检测肺癌的方法。所述方法包括表征从人唾液提取的细胞，所述唾液是有价值的组织替代品和在肺癌发展过程的早期变为癌性的上呼吸细胞的来源。所述方法包括使用荧光报道基因对提取的细胞染色，所述荧光报道基因在所标记的细胞的所述细胞核中产生特定图案，所述图案可通过光学显微镜观察。所述图案与称为DNA甲基化的DNA的表观遗传学编码类型相关，与正常呼吸细胞相比，在癌症发展期间所述肺的特定细胞中，所述DNA甲基化发生变化。
Description
相关申请的交叉引用
本专利申请根据35U.S.C.§119(e)要求提交于2014年8月28日的当前待审的美国临时专利申请No.62/043,346的优先权，该专利申请的内容以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本发明整体涉及癌症特别是肺癌的诊断、预后和治疗。
背景技术
以下描述包括可以用于理解本发明的信息。并非承认本文提供的任何信息是现有技术，或与要求保护的本发明相关。
筛选肺癌的传统方法包括纵隔镜检查和射线成像法，诸如计算机断层成像(CT)和正电子发射断层成像(PET)。不幸的是，这些方法是昂贵的和/或需要使患者暴露于潜在有害的电离辐射中。此外，扫描用于检测早期肺癌是不可靠的，因为早期肺癌太小以至于不能通过射线成像法检测，但会对患者造成显著威胁。这是特别相关的，因为早期肺癌检测与预后明显好于晚期检测相关。
本领域明显需要安全、相对便宜和灵敏的用于检测肺癌特别是早期肺癌的方法。
发明概述
在各种实施方案中，本发明教导了确定细胞是否为癌性的或癌前期的方法，包括：确定细胞的细胞核中的全局(global)5-甲基胞嘧啶(5mC)含量和/或5mC和全局DNA(gDNA)的细胞核空间联合分布；以及如果细胞的细胞核中的全局5mC含量和/或5mC和gDNA的细胞核空间联合分布与非癌性的或非癌前期的参考细胞和/或非癌性的或非癌前期的参考细胞群显著不同，则确定该细胞为癌性的或癌前期的，或如果全局细胞核5mC含量和/或5mC和gDNA的细胞核空间联合分布与非癌性的或非癌前期的参考细胞和/或非癌性的或非癌前期的参考细胞群的那些无显著不同，则确定该细胞为非癌性的或非癌前期的。在一些实施方案中，如果全局5mC含量显著低于非癌性的或非癌前期的参考细胞和/或非癌性的或非癌前期的参考细胞群，则该细胞被确定为癌性的或癌前期的。在某些实施方案中，该细胞从生物样品获得。在一些实施方案中，该生物样品包括唾液。在某些实施方案中，该唾液包括呼吸细胞。在某些实施方案中，该癌性的细胞或癌前期的细胞是肺癌来源的。在一些实施方案中，该生物样品从具有吸烟史的受试者获得。在一些实施方案中，该生物样品从不具有吸烟史的受试者获得。在一些实施方案中，该生物样品从患有肺癌且未经受肺癌治疗的受试者获得。在某些实施方案中，该生物样品从已接受肺癌治疗的受试者获得，该肺癌治疗选自：放疗、化疗、外科手术及其组合。在一些实施方案中，全局5mC和gDNA含量在细胞经受(a)使用对5mC有特异性的抗体进行免疫荧光染色和(b)使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行复染之后通过显微镜确定。在某些实施方案中，5mC和gDNA的细胞核空间联合分布在细胞经受(a)使用对5mC有特异性的抗体进行免疫荧光染色和(b)使用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行复染之后通过显微镜确定。在一些实施方案中，该唾液样品通过包括以下步骤的方法从受试者获得：将高渗盐水施用于受试者的呼吸道；以及收集一定量的由于受试者吸入所述高渗盐水而排出的唾液。在一些实施方案中，该高渗盐水通过喷雾器施用。在某些实施方案中，该高渗盐水是3–5％NaCl。在某些实施方案中，该显微镜是共聚焦扫描显微镜，其分辨率等于或小于500纳米。
在各种实施方案中，本发明教导了包括以下步骤的方法：从受试者获得生物样品，其中该生物样品包括细胞；确定细胞的细胞核中的全局5-甲基胞嘧啶(5mC)含量和/或5mC和全局DNA(gDNA)的细胞核空间联合分布；如果细胞的细胞核中的全局5mC含量和/或5mC和gDNA的细胞核空间联合分布与非癌性的或非癌前期的参考细胞和/或非癌性的或非癌前期的细胞群显著不同，则确定该细胞为癌性的或癌前期的；以及如果确定该细胞为癌性的或癌前期的，则确定该受试者具有发展临床上可检验的癌症的高风险。在一些实施方案中，该方法还包括如果确定受试者具有发展临床上可检验的癌症的高风险，或如果确定受试者已发展临床上可检验的癌症，则治疗受试者的癌症。在一些实施方案中，该生物样品包括唾液。在一些实施方案中，该唾液包括呼吸细胞。在一些实施方案中，该癌性的细胞或癌前期的细胞是肺癌来源的。在某些实施方案中，该受试者具有吸烟史。在一些实施方案中，该受试者不具有吸烟史。
附图简述
在参照图中说明了示例性实施方案。预期本文所公开的实施方案和附图将被认为是说明性的而非限制性的。
图1示出了根据本发明的实施方案3D定量DNA甲基化成像(3D-qDMI)的流程包括三个步骤：(1)细胞学样本制备/染色，(2)样本的3D成像，以及(3)计算机图像/数据分析以进行样本表征。
图2示出了根据本发明的实施方案3-D图像分析流程(实例示出了DU145人前列腺癌细胞)。加载5-甲基胞嘧啶(5mC)和4’,6-二眯基-2-苯基吲哚(DAPI)两个通道的共聚焦2D图像堆栈。DAPI表示全局细胞核DNA(gDNA)。细胞核5mC/DAPI的提取图案以两个通道的体素强度的2D密度散点图显示。示出了两个所选细胞核的示例性图案。整个群的5mC/DAPI联合分布图案通过外观/统计可为不同的所有单个细胞核的图案叠加创建，表示细胞核5mC和DAPI信号是高度差异化联合分布的。散点图的轴上表示的单位为任意强度单位。
图3示出了根据本发明的实施方案3D-qDMI的诊断输出(左)：在荧光图像中基于5mC(绿色)和gDNA/DAPI(蓝色)纹理特征(DNA甲基化表型)的唾液细胞群的表征。细胞可由跨越不断增加的色码相关数值范围的“软限定符”分为不同的相似度(右)。3D-qDMI软件使用该代码将初始荧光图像(在所有共聚焦图像层上)转换为色彩图和对应的列表显示，以便更好地显示和解释所得的数据。该数据可进行不同类型细胞的鉴定和计数，以确定细胞群中DNA甲基化表型的不均一性。
图4示出了根据本发明的实施方案新诊断、手术切除的肺癌的荧光标记切片的正常实质和肿瘤区域。与相同切片上肿瘤的小管区域中严重低甲基化的细胞核(C)和放大方框分区(D)相比，正常小叶(A)和放大方框分区(B)中的细胞核(蓝色)显示出较高程度的DNA甲基化(5mC，绿色)；细胞角蛋白8(红色)用作表示上皮隔室的标记物。
图5A和5B示出了根据本发明的实施方案使用3D-qDMI进行的细胞和组织的全局DNA甲基化表型分型。该方法能够根据差异化的5mC/DAPI分布图案(散点图)成功区分不同的细胞类型：对于作为参考图的整个细胞群，以及对于如每个细胞类别的所选细胞核N1和N2所示的每个细胞核，进行计算并以单个热图散点图(DAPI＝x轴、5mC＝y轴)显示。与永生化的上皮呼吸细胞(BEAS-2B)相比，非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系A549和H157显示出全局5mC减少。H157细胞被报道为转移潜力比A549细胞更强，甚至低甲基化程度更高(曲线更平缓)。相同的比较关系可见于从肺癌患者手术移除的组织和相邻的正常肺组织，并且与肺癌患者比对健康人(不患癌症)的唾液样品相匹配：健康唾液细胞中存在的细胞分析5mC/DAPI标记非常类似于可见于表型正常区域中的细胞(参见图3的真实图像)和BEAS-2B细胞的图案。相比之下，在癌症患者的少量唾液细胞(N2型)中(在大量正常5mC表型细胞(N1型)的背景下)可观察到严重低甲基化，这与肿瘤区域的细胞和更具浸润性的H157细胞系(转移潜力更高)的标记相匹配。换句话讲，5mC表型异常的罕见唾液细胞非常类似于充分表征的浸润性癌细胞(在肿瘤和肿瘤来源的细胞系中)。回归线(黄色虚线)和上、下信号边界ML1和ML2表征和确定了每种原型细胞类型的四个角度α、β、γ和δ。所得的因子F＝[(α/γ)(β/δ)]是每种细胞类型特异性的。所有细胞群显示出高均一性：即细胞之间的5mC表型的高度相似性，如相应的类别图所确定的那样，以及与相应的整个群的图相比，单个细胞核(N1和N2)的散点图之间的相似性。图5A和5B中的散点图的轴上表示的单位为任意强度单位。
图6示出了根据本发明的实施方案来源于诱导唾液的相对平缓的人上皮细胞的亮视野显微图。(A)细胞从唾液的粘液部分分离，并且使用培养技术捕集于载玻片上。几毫升唾液可包含几百至几千个细胞。(B)放大区域显示了单核层叠细胞的相对子结构。
图7示出了根据本发明的实施方案荧光标记的唾液来源人细胞的共聚焦图像。细胞质以上皮细胞标记物细胞角蛋白19(CK19，红色)表示，细胞核以DAPI(蓝色)表示，并且全局细胞核DNA甲基化通过对5mC有特异性的抗体(绿色)可视化。健康个体的唾液(对照)包含大部分高度甲基化的细胞(类型1，左列)和零星几个CK19阳性低甲基化的细胞(类型2，左列)。假设低甲基化在细胞分裂之后的早期是兼性的。相比之下，肺癌患者的唾液另外包含大量几乎无细胞质的圆形细胞(类型2，右列)。这些细胞是CD34/CD45阴性的，表明它们不具有造血和/或白细胞性质。以散点图表示的相应的细胞核5mC/DAPI联合分布图案显示，两个唾液供体组中的正常甲基化的(类型1)细胞显示出陡峭的回归线而低甲基化的细胞(类型2)则产生更平缓的回归线此外，肺癌特异性圆形细胞的典型标记分散程度较低，并且5mC和DAPI的联合分布窄。散点图的轴上表示的单位为任意强度单位。
发明详述
本文引用的所有参考文献通过引用整体并入，就如同完全阐述一般。除非另外定义，否则本文所使用的技术和科技术语具有如本发明所属技术领域的一般技术人员通常所理解的相同含义。Allen等人，Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第22版，Pharmaceutical Press(2012年9月15日)；Hornyak等人，Introduction toNanoscience and Nanotechnology，CRC Press(2008)；Singleton和Sainsbury，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，第3版，修订版，J.Wiley&Sons(New York,NY 2006)；Smith，March’s Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure，第7版，J.Wiley&Sons(New York,NY 2013)；Singleton，Dictionary of DNA and Genome Technology，第3版，Wiley-Blackwell(2012年11月28日)；以及Green和Sambrook，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第4版，ColdSpring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,NY 2012)提供给本领域技术人员关于本申请中所用的许多术语的一般指导。关于如何制备抗体的参考文献，参见Greenfield，Antibodies A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press(ColdSpring Harbor NY,2013)；和Milstein，Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion，Eur.J.Immunol.1976年7月，6(7):511-9；Queen和Selick，Humanized immunoglobulins，美国专利No.5,585,089(1996年12月)；以及Riechmann等人，Reshaping human antibodies for therapy，Nature1988年3月24日，332(6162):323-7。
本领域技术人员将认识到类似于或等同于本文所描述的那些的许多方法和材料，它们可以用于本发明的实践中。实际上，本发明不以任何方式限于所描述的方法和材料。出于本发明的目的，某些术语的定义如下文所述。
本文所用的“病症”和“疾病状况”可包括但绝不限于与癌症或癌前期，包括但绝不限于肺癌、头颈癌、上呼吸消化道癌、宫颈癌、卵巢癌、尿道癌、膀胱癌和结肠直肠癌相关的那些病症。
本文所用的“哺乳动物”是指哺乳动物纲(Mammalia)的任何成员，包括但不限于人和非人灵长类诸如黑猩猩和其他猿类和猴类物种；家畜诸如牛、绵羊、猪、山羊和马；驯养哺乳动物诸如狗和猫；实验动物，包括啮齿动物诸如小鼠、大鼠和豚鼠等等。该术语不表示具体的年龄或性别。因此，无论雄性还是雌性的成体和新生受试者均旨在包括在该术语的范围内。虽然可根据本文所述的本发明的方法检测人体中的癌症或癌前期，但根据本发明的方法检测任何哺乳动物中的癌症在本发明的范围之内。
术语“全局5mC”和“5mC含量”在本文中可互换使用，在每种情况下可定义为细胞核中存在的5-甲基胞嘧啶分子的总量。
本文所用的术语“全局DNA(gDNA)”意指细胞核中存在的DNA总量。
本文所用的术语“临床上可检验的癌症”意指可通过传统癌症检测方式，包括但不限于微创性纵隔镜检查、非创性射线成像法诸如计算机断层成像(CT)、正电子发射断层成像(PET)、磁共振成像(MRI)等等检验的癌症。
通过另外的背景，越来越明显的是，在衰老期间和在疾病诸如癌症加速的情况下，以及同时存在和甚至不同时存在遗传突变的情况下，表观遗传学机制诸如DNA甲基化，在健康维持方面和结构和功能下降方面，对多细胞系统的发育具有强烈的影响。因此，测定DNA甲基化的方法对于理解这些机制在与癌症斗争和确保健康衰老中的努力是重要的。毫无疑问，成像以及分子技术对于细胞和组织中DNA甲基化的差异化定量具有不可替代的作用。
测定DNA甲基化的变化是有价值的，因为它与癌症发生和肿瘤进行中的早期事件相关，并且可用作早期诊断和治疗监测中的标记。在这个意义上，如本文的某些实施方案中所述，发明人的将定量DNA甲基化成像用于肺癌的早期检测的方法回溯了以下观点：脱落的呼吸细胞中的表观遗传学特征诸如DNA甲基化的原位测定可用于其表征，用于逐个细胞的病理诊断。
在大约1990年代末引入的用于组织表征的DNA甲基化成像，与同时代开发的分子方法(包括基于PCR、基于阵列的测序、高压液相色谱(HPLC)和质谱)相比，未得到普及，有两个原因：(i)它与放射性标记或酶报道基因组合应用用于检测，缺乏灵敏度、复用能力或影响分析的可重复性/一致性，(ii)由于图像分辨率低，不能提供具有足够显著性的差异化结果。最近几年高分辨率成像和计算能力的巨大改善支持了用于基于细胞的分析的更复杂工具的开发，这些工具可应用于生物医学研究和临床诊断。这也是开发3D-qDMI以重新审视通过表观遗传学报道基因进行的染色质高级结构的大规模改变诸如全局DNA甲基化的无损成像概念的先决条件。
简而言之，本文所述的3D-qDMI方法是特别有利的，因为它允许(1)5-甲基胞嘧啶(5mC)和全局DNA(gDNA)的高分辨率成像，以及(2)作为早期肺癌检测的诊断标记的三个5mC相关特征的数字提取：(i)5mC加载量(含量)、(ii)5mC和gDNA的细胞核空间联合分布和(iii)基于前两个5mC特征的细胞群不均一性的测定，以表征唾液样品中的呼吸上皮细胞(图2)。
与目前的分子方法以及平均一大群细胞中的5mC测定值或仅测定细胞核中的平均5mC强度值的少数先前的基于低分辨率成像的尝试相比，3D-qDMI通过考虑在整个细胞转化特别是gDNA的低甲基化中出现的DNA甲基化不平衡的次级效应，平衡了差异化的5mC相关信息的提取。具体地讲，后一个机制引发了细胞核内的基因组重构，影响了细胞核结构。此现象在基本细胞生物学研究中进行了详细描述，但并未很好地用于癌症病理学。应用于本发明方法的一些实施方案的图像分析填补了这个空隙，显示出随反映所述现象的两种类型信号的强度分布而变化的相关变化：(a)通过免疫荧光靶向创建的5mC信号，以及(b)由相同细胞的后续复染生成的DAPI信号所表示的gDNA，因为DAPI插入高度重复和压缩的异染色质序列的主要成分富含AT的DNA。总之，该方法产生代表具有一系列差异化DNA甲基化表型(5mC/DAPI纹理特征)的唾液细胞图谱的图像，该DNA甲基化表型与细胞形态(上皮和间充质细胞表型)和生长行为(高增殖性癌细胞、适度生长的正常细胞和生长停滞的衰老细胞)相关。
虽然肺癌细胞是可根据本文所述的方法检测的一种类型癌细胞，但5mC含量和/或5mC和gDNA细胞核空间联合分布分析可用于检测任何癌细胞。
正是由于另外的背景，下文中描述某些特定的非限制性实施方案。
在各种实施方案中，本发明教导了用于确定细胞是否为癌性的或癌前期的方法。在一些实施方案中，该方法包括以下步骤、由以下步骤组成或基本上由以下步骤组成：确定细胞的细胞核中的5-甲基胞嘧啶(5mC)含量和/或5mC和全局DNA(gDNA)的细胞核空间联合分布；以及如果细胞的细胞核中的5mC含量和/或5mC和gDNA的细胞核空间联合分布与非癌性的或非癌前期的参考细胞和/或非癌性的或非癌前期的参考细胞群显著不同，则确定该细胞为癌性的或癌前期的，或如果5mC含量和/或5mC和gDNA的细胞核空间联合分布与非癌性的或非癌前期的参考细胞和/或非癌性的或非癌前期的参考细胞群的那些无显著不同，则确定该细胞为非癌性的或非癌前期的。在该上下文中，显著的差异定义为5mC含量等于或大于25％和/或回归线(也称为趋势线)的角度(本文称为δ或)等于或大于20度，从而癌性的或癌前期的细胞表现出与参考非癌性的或非癌前期的细胞或非癌性的或非癌前期的细胞群相比，5mC含量较少和/或5mC/DAPI联合定位散点图的回归线角度较小：此时DAPI值定义x轴，5mC值定义y轴。在一些实施方案中，25-99％或30-80％或40-60％的5mC含量差异具有显著性。在一些实施方案中，20-90度或30-80度或40-70度或50-60度的回归线角度具有显著性。在某些实施方案中，如果5mC含量显著低于非癌性的或非癌前期的参考细胞和/或非癌性的或非癌前期的参考细胞群，则该细胞被确定为癌性的或癌前期的。在某些实施方案中，该细胞从生物样品获得。在一些实施方案中，该生物样品包括唾液。在某些实施方案中，该唾液包括呼吸细胞。在一些实施方案中，癌性的细胞或癌前期的细胞的来源是上呼吸消化道，其包括与任何解剖结构或从肺至唇或鼻孔的路径中的结构组相关的细胞。这可包括但绝不限于肺、气管、食道、嘴、鼻和窦的细胞。在一些实施方案中，该癌性的细胞或癌前期的细胞是肺癌来源的。在一些实施方案中，该癌性的细胞或癌前期的细胞是肺部肿瘤来源的。在一些实施方案中，该癌性的细胞或癌前期的细胞是食道来源的。在某些实施方案中，该生物样品从具有吸烟史的受试者获得。在一些实施方案中，该生物样品从不具有吸烟史的受试者获得。在各种实施方案中，该生物样品从接受肺癌治疗的受试者获得，所述肺癌治疗可包括但绝不限于放疗、化疗、外科手术及其组合。在一些实施方案中，该生物样品从未接受肺癌治疗的受试者获得。在某些实施方案中，单个细胞核的全局5mC和gDNA含量，以及5mC和gDNA的细胞核空间联合分布在细胞经受(a)使用对5mC有特异性的抗体进行免疫荧光染色和(b)使用4’,6-二眯基-2-苯基吲哚(DAPI)进行复染之后通过显微镜确定。
对5mC有特异性的任何市售的单克隆抗体均可结合本文所述的本发明的方法使用。例如，5mC抗体可从诸如Aviva Systems Biology,Corp.(San Diego,CA)、GeneTex,Inc.(Irvine,CA)、Active Motif,Inc.(Carslbad,CA)和Diagenode,Inc.(Denville,NJ)等等的供应商获得。在一些实施方案中，5mC抗体是Reynaud C,Bruno C,Boullanger P,Grange J,Barbesti S,Niveleau A.Monitoring of urinary excretion of modified nucleosidesin cancer patients using a set of six monoclonal antibodies.Cancer Lett，1992年3月31日；63(1):81所描述的抗体，该文献据此以引用的方式整体并入本文，就如同完全阐述一般。
在某些实施方案中，单个唾液来源细胞的表型在细胞经受使用抗体针对细胞类型特异性标记物进行免疫荧光染色之后通过显微镜确定。这些抗体包括但不限于对细胞角蛋白和细胞表面分子有特异性的抗体。
在一些实施方案中，上述唾液样品通过包括以下步骤的方法从受试者获得：将高渗盐水施用于受试者的呼吸道；以及收集一定量的由于受试者吸入所述高渗盐水而排出的唾液。在某些实施方案中，该高渗盐水通过超声喷雾器或非超声喷雾器施用。在一些实施方案中，该高渗盐水是3-5％NaCl。
在其中需要5mC含量、gDNA和/或5mC和gDNA的细胞核空间联合分布的可视化和/或定量的本发明的实施方案中，这些特征可通过使用光学成像系统可视化和/或定量，该光学成像系统诸如宽视野落射荧光显微镜和扫描仪、共聚焦显微镜和扫描仪、多光子显微镜和扫描仪和超分辨率显微镜(纳米显微镜)和扫描仪及其组合形式。在一些实施方案中，使用显微镜进行可视化和/或定量。在某些实施方案中，该显微镜是共聚焦扫描显微镜。在一些实施方案中，该共聚焦扫描显微镜具有在100–200nm范围内的横向分辨率(沿x和y轴)和大约500nm的垂直分辨率(沿z轴)
在各种实施方案中，本发明教导了包括以下步骤、由以下步骤组成或基本上由以下步骤组成的方法：从受试者获得生物样品，其中该生物样品包括细胞；确定细胞核中的5-甲基胞嘧啶(5mC)含量和/或5mC和全局DNA(gDNA)的细胞核空间联合分布；如果细胞的细胞核中的5mC含量和/或5mC和gDNA的细胞核空间联合分布与非癌性的或非癌前期的参考细胞和/或非癌性的或非癌前期的细胞群显著不同，则确定该细胞为癌性的或癌前期的；以及如果确定该细胞为癌性的或癌前期的，则根据本文所述的任何方法治疗该受试者的癌症。在一些实施方案中，如果受试者被确定为患有癌性的或癌前期的病症，则监测该受试者的疾病发展，而不是实施治疗。在一些实施方案中，该癌性的细胞或癌前期的细胞来源于呼吸消化道，如本文所述的那样。在某些实施方案中，该生物样品包括唾液。在一些实施方案中，该唾液包括呼吸细胞。在某些实施方案中，该癌性的细胞或癌前期的细胞是肺癌来源的。在一些实施方案中，该受试者之前经受过包括本文所述的任何癌症类型的癌症治疗。在一些实施方案中，该受试者之前未经受过包括本文所述的任何癌症类型的癌症治疗。在一些实施方案中，该受试者具有吸烟史。在某些实施方案中，该受试者不具有吸烟史。
在各种实施方案中，本发明教导了用于确定包括多种细胞的生物样品中存在或不存在癌性的细胞或癌前期的细胞的方法。在一些实施方案中，该方法包括：利用高分辨率成像确定生物样品中多种细胞的每种的5-甲基胞嘧啶(5mC)加载量/含量和/或5mC和全局DNA(gDNA)的细胞核空间联合分布；以及任选地根据所述MeC加载量和5mC和gDNA的细胞核空间联合分布确定所述多种细胞的细胞群不均一性。在某些实施方案中，如果生物样品中的任何细胞中的5mC加载量和/或5mC和gDNA的细胞核空间联合分布与非癌性的或非癌前期的参考细胞群显著不同，和/或与生物样品中可视化的整个细胞群的全局图案相比，生物样品中的任何细胞的5mC加载量和/或5mC和gDNA的细胞核空间联合分布显著不同，则确定癌性的细胞或癌前期的细胞存在于生物样品中。在一些实施方案中，如果5mC加载量和/或5mC和gDNA的细胞核空间联合分布与非癌性的或非癌前期的参考细胞群的那些无显著不同，和/或与生物样品中整个细胞群的全局图案相比，生物样品中的细胞的5mC加载量和/或5mC和gDNA的细胞核空间联合分布无显著不同，则确定癌性的细胞或癌前期的细胞不存在于生物样品中。在一些实施方案中，该生物样品包括唾液。在某些实施方案中，该唾液包括呼吸细胞。在一些实施方案中，所检测/确定的癌性的细胞或癌前期的细胞与肺癌相关。在某些实施方案中，所检测/确定的癌性的细胞或癌前期的细胞与非小细胞肺癌(NSCLC)相关。在某些实施方案中，该方法可用于根据生物样品中存在的癌性的细胞诊断患有肺癌，包括任何分期的NSCLC受试者。在某些实施方案中，该唾液从具有吸烟史的受试者获得。在一些实施方案中，该唾液从接受任何肺癌治疗的受试者获得，所述肺癌治疗包括但绝不限于放疗、化疗、外科手术及其组合。在一些实施方案中，该唾液从未接受一种或多种上述癌症治疗的受试者获得。在一些实施方案中，该唾液从未接受癌症治疗的受试者获得。在一些实施方案中，该唾液从未诊断为癌症的个体获得。在某些实施方案中，5mC图案在对5mC有特异性的抗体的免疫荧光染色之后可视化。在一些实施方案中，gDNA在4’,6-二眯基-2-苯基吲哚(DAPI)的复染之后可视化。
在某些实施方案中，本发明教导了对通过上述测试方法的实施鉴定为癌性的或癌前期的样品中细胞的数量进行定量，以及将癌性的或癌前期的细胞的数量与患有癌症或癌前期的个体中癌性的或癌前期的细胞的参考数量进行比较，和/或将测试样品与未患有癌症或癌前期的个体中癌性的或癌前期的细胞的参考数量进行比较。
在某些实施方案中，本文所述的本发明的方法包括从受试者获得唾液样品。在一些实施方案中，该唾液样品通过以下步骤获得：将高渗盐水施用于受试者的呼吸道；以及收集一定量的由于受试者吸入所述高渗盐水而排出的唾液。在某些实施方案中，该高渗盐水通过超声喷雾器施用。在一些实施方案中，该高渗盐水为约3至5％NaCl。在一些实施方案中，该超声喷雾器具有约1至2mL/分钟的输出。在一些实施方案中，吸入盐水溶液约5至20分钟的时间。在一些可供选择的实施方案中，该唾液样品通过使用手持喷雾器将高渗盐水分配至受试者的呼吸道来获得。在一些实施方案中，该高渗盐水在上述NaCl的范围内。在一些实施方案中，该高渗盐水在上述范围内分配一段时间。
虽然高渗盐水的施用是一种诱导唾液的方法，但可易于理解也可本发明的方法一起使用的可供选择的诱导唾液的方法可用于获得样品。仅通过非限制性实例，也可使用支气管镜检查法和支气管肺泡灌洗法。
在各种实施方案中，本发明教导了用于治疗根据本文所述的一种或多种方法诊断为癌症或癌前期的病症的受试者的方法。在一些实施方案中，该方法包括以下步骤、由以下步骤组成或基本上由以下步骤组成：施加化疗和/或放疗和/或进行外科手术切除受试者的所有或一部分肿瘤，其中该受试者通过本文所述的任何方法诊断为癌症或癌前期的病症。在一些实施方案中，该受试者诊断为肺癌。
虽然上述方法的目的是检测受试者中的肺癌和癌前期的病灶，但如上所述，利用本文所述的本发明的方法的相同基本原理分析样品和检测不同来源的癌症或癌前期的病灶也是可能的。仅通过非限制性实例，可分析唾液和/或粘液分泌，以确定存在或不存在头和/或颈癌；可分析结肠和/或直肠分泌，以确定存在或不存在结肠癌和/或直肠癌；可分析子宫颈分泌，以确定存在或不存在宫颈癌；可分泌阴道和/或子宫颈分泌，以确定存在或不存在卵巢癌，并且可分析来自尿道的流体，以确定存在或不存在尿道癌、膀胱癌或肾癌。
另外，虽然涉及5mC的测试主要集中于本文所述的实例，但本领域的技术人员可易于理解，通过应用基本上相同的本文所述的检测和分析方法，其他胞嘧啶变型，诸如3-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶也可用作区分癌性的(或癌前期的)和非癌性的细胞的碱基。因此，使用本文所述的方法评估任何胞嘧啶甲基化旨在在本专利申请的范围内。此外，虽然本文阐述的具体实例中描述的测试涉及作为表示gDNA以及细胞核容量的主要染料DAPI，但本领域的技术人员还将理解，以非序列特异性的方式结合双链DNA的其他染料也可用于gDNA定量。这些染料可包括但不限于：碘化丙啶、Hoechst染料(包括Hoechst 33258和Hoechst 33342)、溴化乙啶、SYBR Green、SYBR Gold、Pico Green、SYTOX染料(包括SYTOX Green、SYTOX Blue和SYTOX Orange)、SYTO染料、YOYO和TOTO家族染料(包括YOYO、TOTO、JOJO、BOBO、POPO、YO-PRO和PO-PRO)以及放线菌素D和7-氨基放线菌素D(7-AAD)(它也可用于相同的目的)。
假设癌前期的或癌性的细胞及其正常对应物之间的全局细胞核5mC加载量和分布存在显著的差异，这些差异可使用光学显微镜以迅速、平行的方式在单细胞分辨率下可视化和测定，用于表征生物样品中的几千个细胞。在一些实施方案中，分析唾液来源细胞和细胞群中的5mC的全局细胞核含量和相对分布比对全局gDNA(以DAPI表示)。这些细胞核实体是非静电的，并且在正常健康细胞转化为癌前期的和癌性的细胞期间重新组织。在该上下文中，散点图的强大之处在于它们能够表示变量之间简单关系的混合模型。这些关系可将细胞图案映射为特定的标记，其中该变量可以是细胞核5mC图案比对DAPI染色gDNA的情况下所示的细胞核结构(Tajbakhsh J,Wawrowsky KA,Gertych A,Bar-Nur O,Vishnevsky E,Lindsley EH,Farkas DL)。Characterization of tumor cells and stem cells bydifferential nuclear methyl-ation imaging.载于：Farkas DL,Nicolau DV,Leif RC编Proceedings，第6859卷，Imaging,Manipulation,and Analysis of Biomolecules,Cells,and Tissues VI 2008，第68590F页)。我们已示出，此类重新组织可通过散点图动态监测，该散点图描绘了全局5mC和gDNA的信号分布，随着所描绘图案的变化，它们的差异分布变为可见的。换句话讲，2D散点图表示所靶向的两个细胞核实体的信号频率联合分布，并且该联合分布图可视为细胞特异性标记(参见Tajbakhsh J,Wawrowsky KA,Gertych A,Bar-NurO,Vishnevsky E,Lindsley EH,Farkas DL)。Characterization of tumor cells andstem cells by differential nuclear methyl-ation imaging.载于：Farkas DL,Nicolau DV,Leif RC编Proceedings，第6859卷，Imaging,Manipulation,and Analysis ofBiomolecules,Cells,and Tissues VI 2008，第68590F页)；Gertych A等人，Automatedquantification of DNA demethylation effects in cells via 3D mapping ofnuclear signatures and population homogeneity assessment.Cytometry A 2009，75:569-83；Gertych A等人，Measuring topology of low-intensity DNA methylationsites for high-throughput assessment of epigenetic drug-induced effects incancer cells.Exp Cell Res 2010，316(19):3150-60；Oh JH等人，Nuclear DNAmethylation and chromatin condensation phenotypes are distinct betweennormally proliferating/aging,rapidly growing/immortal,and senescentcells.Oncotarget 2013，4:474-93。在一些实施方案中，这些5mC/gDNA联合分布标记与全局5mC和gDNA的含量一起被视为表征唾液来源的单个细胞和细胞群，以鉴定癌前期的和癌性的细胞的三个参数/生物标记物。
本领域技术人员将认识到类似于或等同于本文所描述的那些的许多方法和材料，它们可以用于本发明的实践中。实际上，本发明不以任何方式限于所描述的方法和材料。
实施例
实施例1
另外的背景
肺癌和诊断的当前状态
在2010年，美国报道的肺癌新病例超过200,000例，占所有癌症新病例的15％。同期预计的肺癌死亡数量为大约160,000，代表所有癌症相关死亡的～28％。不幸的是，由于治疗选项有限，肺癌是癌症相关死亡的最常见原因。如果该疾病在早期诊断，则肿瘤的完全外科手术切除提供了有利的治愈机会。因此，该疾病的早期检测在过去几十年里是很多尝试的焦点。许多试验利用射线成像技术，包括胸部X射线、胸部计算机断层成像(CT)和正电子发射断层成像(PET)扫描，这些试验显示出临床有益效果不明和暗含非常高成本的混合结果。如上文所述，用于肺癌的早期检测的射线成像方法，包括胸部CT扫描，涉及高辐射剂量，如果频繁使用，则其本身会施加发展继发性恶性肿瘤的高风险。因此，胸部CT扫描频繁用于筛选肺癌很可能是不安全或不经济的。
重要的是，先前试验利用唾液细胞学进行肺癌的早期检测，但它们主要依赖于脱落的上皮呼吸细胞的形态变化评估，并且每个试验不能检测肺癌病例，以达到可显示出有意义的临床优点。
在另一个方面，高风险患者的唾液样品中某些基因的甲基化状态评估已成功用于肺癌病灶的早期检测。不幸的是，肺癌是不均一的疾病组，在所有病例中均未鉴定出一致的异常。同样重要的是，在大量细胞中平均基因甲基化状态的细胞样品的分析可隐藏重要的微妙信息，该信息是唾液中更小的癌性的细胞亚组特异性的，因此会对分析结果造成偏差。因此，根据所有唾液细胞中基因的子集的异常检测肺肿瘤很可能只涵盖了病例的亚组。在考虑此前可用的诊断方法的不足之后，发明人寻求以逐个细胞的方式分析唾液中脱落的呼吸细胞的全局DNA甲基化状态，作为肺癌早期检测的工具。
癌症诊断中的DNA甲基化
当细胞被转化时，正常细胞的完美表观遗传学平衡基本上改变。所得的在DNA水平的表观遗传学改变落入两个类别：(i)富含基因的基因组区域即CpG岛中的基因启动子中CpG的基因特异性超甲基化，以及(ii)全基因组低甲基化，其大部分出现于重复DNA元件。异常甲基化图案与许多癌症类型相关。全基因组低甲基化密切平行于恶性肿瘤的程度，是普遍存在的发现。DNA低甲基化的分析在很大程度上仍然是未利用的。癌细胞系广泛用作研究模型，表现出全基因组脱甲基化的大量变化，这反映了组织特异性，并且不可能来自随机过程。恶性细胞可包含比其正常对应物少20–60％的基因组甲基胞嘧啶。甲基基团的丧失主要由重复DNA序列的低甲基化实现，这占超过90％的人基因组，包括可转座元件(～48％的基因组)，诸如短和长散在核元件(分别为SINE和LINE)，大部分在进化过程中以逆转录病毒获得。全局甲基化也是临床相关的，如许多癌症类型中临床结果和全局甲基化水平之间的关系所示出的那样。全局低甲基化似乎与癌症进行有关，因为全局甲基化的丧失随着癌前期的病灶进行而趋于越来越明显。迄今为止，差异DNA甲基化分析大部分通过分子方法定量评估，该分子方法包括电泳、色谱、基于PCR的、基于阵列的和测序技术。尽管这些方法的特异性、灵敏度和固有的单碱基分辨率有巨大的改善，但它们仍然是单个细胞的高通量分析中的技术挑战。这些方法包括基于PCR的方法在全基因组测序的复用和挑战灵敏度和成本问题中的限制，特别是重复元件的查询。作为另外一种选择，并且考虑DNA甲基化不平衡的普遍度和加载量，特别是重复元件的低甲基化，全局细胞核5mC图案的基于成像的评估提供了同时分析和表征大量细胞的强大工具，因为基本分子工序涉及在光学显微镜下可见的大规模染色质重新组织。
定量DNA甲基化成像的显著性
如本文所示，已开发了定量DNA甲基化成像的方法(3D-qDMI)并应用于肺癌。该无损方法需要5-甲基胞嘧啶加载量和细胞核空间分布的平行定量测定，以表征细胞和组织(参见Tajbakhsh J等人，Characterization of tumor cells and stem cells bydifferential nuclear methylation imaging.载于：Farkas DL,Nicolau DV,Leif RC编Imaging,Manipulation,and Analysis of Biomolecules,Cells,and Tissues.San Jose,CA:Proceedings of the SPIE 2008；6856:6859F1-10；Gertych A等人，Automatedquantification of DNAdemethylation effects in cells via 3D mapping of nuclearsignatures and population homogeneity assessment.Cytometry A2009，75:569-83；Gertych A等人，Measuring topology of low-intensity DNAmethylation sites forhigh-throughput assessment of epigenetic drug-induced effects in cancercells.Exp Cel Res2010；316:3150-60；Gertych A等人，Homogeneity assessment ofcell populations for high-content screening platforms.载于：InformationTechnology in Biomedicine.第2卷，Advances in intelligent and soft computing，第69卷，Ewa Pietka和Jacek Kawa编，Springer Verlag,Heidelberg,Germany；Tajbakhsh,J.等人(2012).3-D Quantitative DNA Methylation Imaging for Chromatin TextureAnalysis in Pharmacoepigenomics and Toxicoepigenomics.载于：Epigenomics:FromChromatin Biology to Therapeutics.K.Appasani编.Cambridge University Press,Cambridge,United Kingdom；每个文献均以引用的方式整体并入本文，就如同完全阐述一般)。3D-qDMI的实施方案的流程如图1所示。
假设5mC加载量和分布具有很大的动态范围，3D-qDMI允许进行不均一唾液样品内几千个细胞的迅速、平行、形态测定、单细胞分辨率表征。以下强调了3D-qDMI适于使用非创性替代品诸如唾液样品进行肺癌诊断和临床决策的一些优点：(i)3D-qDMI不需要通过易错的分离方法富集细胞；(ii)该方法不需要耗时的DNA提取和DNA扩增；(iii)3D-qDMI提供逐个细胞分析；(iv)该方法允许细胞群的不均一性评估，包括关于DNA甲基化特征的不同细胞类型的频率；(v)可鉴定不相关细胞并从分析排除，这可通过渗透造血细胞来防止样品杂质造成的数据偏移；(vi)有成本效益的细胞分析方法可自动化进行并且适于测量，因此可易于开发和在临床背景中实施。细胞分析方法可应用于同时多色高含量成像。因此，所关注的细胞和/或渗透造血细胞可另外地标记细胞特异性标记物。随后，可在输出数据中鉴定不相关细胞，并在数据分析之前剔除。此外，该方法与使用显微镜载玻片和生物分子科学学会(Society for Biomolecular Sciences(SBS))格式微板作为唾液来源细胞沉积的支撑物兼容。因此，该方法具有在高通量临床和诊断环境中实施，即将所述格式例行应用于癌症诊断的潜力。具体地讲，样品制备、染色和扫描的三个步骤可使用现有的市售的高通量仪器自动化进行。图像和数据分析是以自动化方式自然进行的计算机化过程，并且仅受到计算能力的限制。
样品的分析
在本文所述的某些实施方案中实施的3D-qDMI软件设计为执行图像帧内单个细胞(与汇总分析和结果输出相反)的复杂的3-D图像分析，从而允许用于变量统计的细胞的灵活消除和组合。在一些实施方案中，5mC/DAPI联合定位图案的结果可以散点图表示(参见图2)。然而，本领域的技术人员将易于理解有很多表示该类型数据的其他方式。
如图2所示，5mC特征诸如5mC/DAPI联合定位图案可在群内细胞之间变化。因此，细胞群不均一性评估在细胞的组成即表型变化程度的确定中是有价值的特征，该表型变化程度对于鉴定可显示出类似于浸润性癌细胞的异常MeC表型的少量细胞是重要的。均一性可通过表达单个细胞核5mC/DAPI图案和整个细胞群的全局图案(表示所有单个细胞核图案的总和(参考图案))之间的关系通过整个细胞群内的结构相似性比较来评估。
唾液研究
发明人探索了来源于健康个体(无癌症病史的非吸烟者)的唾液的人上呼吸细胞，以及来自肺癌患者(吸烟者)并匹配组织样本的唾液细胞，以及三种人细胞系的3D细胞核5mC图案。细胞系包括永生化的正常人上皮细胞系(BEAS-2B)以及NSCLC细胞系A549(肺泡基底上皮细胞)和H157(高浸润性肺癌细胞)。图4示出了新诊断、手术切除的肺癌的荧光标记切片的正常实质和肿瘤区域。发明人观察了健康细胞中的常见全局DNA甲基化图案，它与显著全局低甲基化的来自癌症患者的癌性的细胞和异常唾液细胞(图5)的5mC/DAPI图案显著不同。三种不同细胞系和唾液来源细胞以及正常组织的所有群体，就其5mC/DAPI联合分布而言，显示出高度均一性(通过KL类别图谱可视化)，以细胞群水平和单个代表性细胞核的散点图显示。
发明人引入了每种细胞类型的可测定描述符(图5)：曲线图的回归线和上、下信号边界ML1和ML2表征和确定了每种原型细胞类型的四个角度α、β、γ和δ。所得的差异因子F＝[(α/γ)(β/δ)]是对每种细胞类型特异性的：0.54(BEAS-2B)、0.42(A549)、0.12(H157)、0.78(典型正常组织细胞)、0.45(正常唾液的细胞)、0.44(癌症患者唾液中的大部分N1型细胞)、0.01(癌症患者唾液中的N2型细胞)和0.05(典型癌症组织细胞)。该测定值强调全局甲基化图案的不同强度，用于检测正常和恶性细胞。尤其是癌症患者唾液和典型肿瘤组织细胞中(N2型)细胞标记之间的相似性可在肿瘤发生过程早期的唾液样品中的异常细胞的检测发挥重要作用。图4和5的观察结果显示，3D细胞核DNA甲基化图案用作用于呼吸道的恶性细胞的非创性检测的新型生物标记物。在一些方面，本发明的方法利用3D-qDMI测定具有发展肺癌的高风险的个体的唾液样品中脱落的呼吸细胞的差异全局DNA甲基化图案。具体地讲，每种唾液细胞群可通过所测定的F因子的统计表征，该统计提供了细胞组成的评估，可有利于检测恶性细胞。
实施例2
方法
细胞样本的制备
唾液诱导可通过吸入高渗盐水(3至5％NaCl)进行。利用喷雾器以1.5mL/min输出可生成气雾。受试者吸入盐水溶液气雾最多20min的时间。在每5分钟用自来水漂洗口腔之后，促使受试者咳出唾液。分离脱落的上呼吸细胞并固定在载玻片/盖玻片上或微板孔中。使收集到塑料容器的样品保持在4℃下直到处理。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液稀释样品，该溶液包含通常称为10％sputolysin溶液的0.1％二硫苏糖醇(DTT)，并温育20分钟，然后在室温下以300–1500g离心5–10分钟，以分离细胞和流体(粘液)相。重复该过程，直到细胞悬浮液呈现出均匀和澄清。然后，将细胞沉积物重悬于PBS中，使细胞过滤通过40–100μm尼龙筛(细胞滤网)，以移除残留的粘液和沉淀。随后，以300–1500g离心细胞5–10分钟。将细胞沉积物(包含所有收集的细胞)重悬于1–2微升上皮细胞培养基中，转移到显微镜玻璃盖玻片上，在37℃和5％CO2下培养16–48小时，使细胞贴附到盖玻片。在一些实施方案中，对离心的样品进行细胞计数(cytospin)，并将细胞样品涂布到显微镜载玻片/盖玻片上或微板孔中。随后，将细胞在4％多聚甲醛中固定15–45分钟，并保持在4℃的PBS中。然后，3D定量DNA甲基化成像(3D-qDMI)实施固定细胞的表征，如本文所述的那样。
作为上述气管唾液处理方法的替代，可通过本领域已知的任何方法处理气管唾液。仅通过举例，气管唾液处理可根据Hamid等人，Eur Respir J 2002；20，增补37，19s-23s所述或提及的任何方法进行。
生物化学
样品分析通过以下步骤实现：使免疫荧光染色(用于重叠甲基胞嘧啶图案的可视化)与针对细胞核中5-甲基胞嘧啶的特定小鼠单克隆抗体(克隆33D3)组合，并且用4’,6-二眯基-2-苯基吲哚(DAPI)(用于表示全局细胞核DNA)复染。虽然存在很多可公开获得的、用于5-甲基胞嘧啶和gDNA可视化的染色方案，但在一些实施方案中，使用以下参考文献的方案：Tajbakhsh J等人，Characterization of tumor cells and stem cells bydifferential nuclear methylation imaging.载于：Farkas DL,Nicolau DV,Leif RC编Imaging,Manipulation,and Analysis of Biomolecules,Cells,and Tissues.San Jose,CA:Proceedings of the SPIE2008；6856:6859F1-10；33；Gertych A等人，Automatedquantification of DNAdemethylation effects in cells via 3D mapping of nuclearsignatures and population homogeneity assessment.Cytometry A 2009，75:569-83；Gertych A等人，Measuring topology of low-intensity DNA methylation sites forhigh-throughput assessment of epigenetic drug-induced effects in cancercells.Exp Cel Res 2010，316:3150-60；Gertych A等人，Homogeneity assessment ofcell populations for high-content screening platforms.载于：InformationTechnology in Biomedicine.第2卷，Advances in intelligent and soft computing，第69卷，2010；Gertych A等人，3-D DNA methylation phenotypes correlate withcytotoxicity levels in prostate and liver cancer cell models.BMC PharmacolToxicol.2013年2月11日；14:1；Tajbakhsh J等人，Early In Vitro Differentiation ofMouse Definitive Endoderm is Not Correlated with Progressive Maturation ofNuclear DNA Methylation Patterns.PLoS ONE 2011；6(7):e21861；TajbakhshJ.Covisualization of methylcytosine,global DNA,and protein biomarkers for InSitu 3D DNA methylation phenotyping of stem cells.Methods Mol Biol.2013；1052:77-88；Oh JH等人，Nuclear DNA methylation and chromatin condensation phenotypesare distinct between normally proliferating/aging,rapidly growing/immortal,and senescent cells.Oncotarget 2013；4:474-93；Tajbakhsh J等人。Dynamicheterogeneity of DNA methylation and hydroxymethylation in embryonic stemcell populations captured by single-cell 3D high-content analysis.Exp CellRes.2015；332:190-201，每个文献均以引用的方式整体并入本文，就如同完全阐述一般)。用于染色的5mC抗体可如(wwwdotncbi.nlm.nih.gov/pubmed/？term＝Reynaud％20C％5BAuthor％5D&cauthor＝true&cauthor_uid＝1739950)Boullanger P,Grange J,Barbesti S,Niveleau A.Monitoring of urinary excretion of modified nucleosidesin cancer patients using a set of six monoclonal antibodies.Cancer Lett，1992年3月31日；63(1):81所述。抗5mC抗体的特异性可使用包括胞嘧啶变体的DNA微阵列以及标准对照实验与免疫细胞化学组合确定。在下游分析中排除造血细胞特别是白血细胞(白细胞)，样本可使用抗CD34和抗CD45抗体进行共免疫表型分型。在一些实施方案中，发明人还使用针对细胞角蛋白的抗体，诸如但不限于CK8、CK18和CK19来共标记上皮细胞标记物。然而，恶性呼吸细胞分散于许多正常上皮细胞中(在载玻片上)。因此，上皮标记物对于从异常细胞中区分正常细胞是没有帮助的。
免疫荧光法(IF)
以下非限制性方案用于对18mm圆形玻璃盖玻片(1号)上捕集的唾液来源细胞进行简便处理以及在12孔微板中进行的处理。对于其他细胞支撑物和反应室，需要调整试剂体积。
第1天
(a)组织切片的固定
1)在室温下4％多聚甲醛(PFA)/PBS中固定唾液来源细胞30–45分钟，然后在室温下用PBS洗涤3次3–5分钟。未立即进行进一步处理细胞应保持在2-8℃的0.002％NaN3/PBS中。
(b)细胞的IF预处理
2)在PBS(2ml)中洗涤细胞5分钟。
3)在室温下用0.5％皂草苷/0.5％Triton X-100/PBS(5ml)透化细胞20min，并在室温下用PBS(2ml)洗涤3次3–5分钟。
4)在37℃下用100μg/ml RNA酶A/PBS(0.2ml)处理细胞30分钟，并在室温下用PBS(2ml)洗涤3次3–5分钟。
5)在37℃下用3％牛血清白蛋白(BSA)/PBS(1ml)封闭组织30分钟(在施加一抗之前)。
(c)第一免疫荧光
6)在2–8℃下使用溶于3％BSA/PBS(0.7ml)的一抗或用于细胞表型分型的相容抗体混合物(例如兔抗CK19多克隆抗体，Abcam目录号ab15463，1:1000稀释；绵羊抗CD34多克隆抗体，R&D Systems目录号AF7227，浓度1μg/ml；以及鸡抗CD45，GeneTex目录号GTX82139，1:500稀释)温育组织过夜。
第2天
7)在室温下用01％BSA/0.1％Tween 20/PBS(2ml)洗涤细胞4次5分钟。
8)在37℃下用二抗(例如驴抗山羊IgG(H+L)-Alexa 568，Invitrogen，A11057)(浓度为5μg/ml，各自溶于3％BSA/PBS(0.7ml)中)温育组织1小时。
9)在室温下用0.1％BSA/0.1％Tween 20/PBS(2ml)洗涤组织4次3–5分钟，并用0.1％BSA/PBS(2ml)洗涤一次。
10)在室温下4％PFA/PBS(1ml)中固定组织15min。用PBS洗涤细胞3次3–5分钟。
11)在室温下用2N HCl(1ml)使细胞脱嘌呤恰好40min，并在室温下用PBS(2ml)洗涤3次3–5分钟。
12)在37C下用3％BSA/PBS(1ml)封闭细胞30分钟(在施加一抗之前)。
(d)第二免疫荧光
13)在2–8℃下用一抗(例如小鼠抗MeC，克隆33D3mAb，Aviva Systems Biology，目录号AMM99021)(浓度为1–2μg/ml，溶于3％BSA/PBS(0.7ml))温育细胞过夜。
第3天
14)在室温下用01％BSA/0.1％Tween 20/PBS(2ml)洗涤细胞4次5分钟，并用0.1％BSA/PBS(2ml)洗涤一次。
15)在37℃下用二抗(例如驴抗小鼠Alexa488IgG(H+L)，Invitrogen A21202；和鸡抗兔IgG(H+L)-Alexa 647，Invitrogen A21443)(浓度均为5μg/ml，溶于3％BSA/PBS(0.2ml))温育细胞2小时。
16)在室温下，用0.1％BSA/0.1％Tween 20/PBS(5ml)洗涤组织4次5分钟，并用0.1％BSA/PBS洗涤一次5分钟。
17)在室温下的5ml DAPI/PBS溶液(加热至室温)中温育组织20min，然后在PBS中漂洗～30sec，以冲去非特异性DAPI染色。
18)从微板取下盖玻片，使其在暗处室温下或37℃烘箱中完全干燥(10–30min)。
19)将7–10μl封固溶液(例如Prolong-Gold，Invitrogen)转移到清洁和干燥的载玻片切片，并用盖玻片(细胞面向载玻片)盖住封固液滴(严格避免气泡)。
确认分子方法
确认分子方法可对从分离的细胞(来自所选唾液样品)提取的DNA平行进行，以检验图像细胞分析(3D-qDMI)5mC特征结果：(i)5mC加载量和(ii)重复DNA元件类别(Alu/LINE-1/Satα/Sat2)的低甲基化(全局DNA低甲基化的主要原因)均可通过重复序列MethyLight评估(参见Weisenberger DJ等人，Analysis of repetitive element DNAmethylation by MethyLight.Nucleic Acids Res.2005年12月2日；33(21):6823-36，该文献以引用的方式整体并入本文，就如同完全阐述一般)。在5mC加载量的测定中，该方法被证明是高效液相色谱(HPLC)或高效毛细管电泳(HPCE)的精确替代方法，所述高效液相色谱或高效毛细管电泳传统上用于全局5mC含量测定。通过Repeat-Seq MethyLight和3D-qDMI比较进行的5mC含量测定产生了非常高的相关性(0.86–0.96)，(参见Gertych A等人，3-DDNAmethylation phenotypes correlate with cytotoxicity levels in prostate andliver cancer cell models.BMC Pharmacol Toxicol.2013年2月11日；14:11，该文献以引用的方式整体并入本文，就如同完全阐述一般)。
图像采集
图像采集可利用高分辨率共聚焦扫描显微镜进行。在一些非限制性实施方案中，利用Leica的商业化TCS SP5X超连续显微镜(Leica Microsystems)。该系统提供了在470至670nm的连续范围内(以1nm递增)的激发和发射的完全自由和灵活性。显微镜可连接405nm二极管激光谱线，用于激发DAPI荧光。连续光学切面可通过Plan-Apo 63X1.4油浸透镜和1.0个艾里单位的针孔大小以200–300nm的增量收集。为避免渗出，可按顺序获取每个通道的成像。通过非限制性实例，典型图像大小可在1024×1024至2048×2048的范围内，相应的体素大小为约116nm×116nm×230.5nm(x、y和z轴)，所有通道的分辨率为8–16比特/像素。输出文件格式可以是可用于3D图像分析的一系列TIFF图像。
3D图像分析
3D图像分析可通过应用为图案识别和多参数高含量分析而开发的专用算法来进行，如Gertych A等人，Automated quantification of DNA demethylation effects incells via 3D mapping of nuclear signatures and population homogeneityassessment.Cytometry A 2009；75:569-83；Gertych A等人，Measuring topology oflow-intensity DNA methylation sites for high-throughput assessment ofepigenetic drug-induced effects in cancer cells.Exp Cell Res 2010；316:3150-60；Gertych A等人(2010).Homogeneity assessment of cell populations for high-content screening platforms.载于：Information Technology in Biomedicine.第2卷，Advances in intelligent and soft computing，第69卷，Ewa Pietka和Jacek Kawa编，Springer Verlag,Heidelberg,Germany；以及Tajbakhsh J，(2012).3-D QuantitativeDNA Methylation Imaging for Chromatin Texture Analysis in Pharmacoepigenomicsand Toxicoepigenomics.载于：Epigenomics:From Chromatin Biology toTherapeutics.K.Appasani编，Cambridge University Press,Cambridge,United Kingdom所述，每个文献均以引用的方式整体并入本文，就如同完全阐述一般。
在一些实施方案中，图像分析工具以三个步骤操作：1)处理所有细胞(在成像群内)以进行3D分割；2)测定细胞核内的荧光信号驻留，以进行(a)确定整个细胞核的5-甲基胞嘧啶加载量，(b)生成5mC信号和全局细胞核DNA的联合分布图(散点图)(通过DAPI可视化)以及c)关于两个第一5mC特征的波动/不均一性。进行DNA甲基化加载量的相似性分析，并生成每个样本中所有细胞的2D图，确定细胞群均一性。
就相似性分析而言，常用的相似性度量可根据对象表示组织为三组，分别为：(a)基于点，包括Euclidean和Minkowski距离，(b)基于组，包括Jaccard、Tanimoto和Dice距离，和(c)概率性Bhattacharyya、Kullback-Leibler以及基于关系Mahalanobis距离(参见DiceLR.Measures of the amount of ecological association between species.J Ecology1945；26:297–302；Bhattacharyya A.On a measure of divergence between twostatistical populations defined by probability distributions.Bull CalcuttaMath Soc 1943；35:99–109；Mahalanobis PC.On the generalized distance instatistics.Proc Nat Inst Scien India1936；2:49–55；Kullback S,Leibler RA.(1951),"On Information and Sufficiency".Annals of Mathematical Statistics 22(1):79–86；Jaccard P.(1912),"The distribution of the flora in the alpinezone",New Phytologist 11:37–50；Rogers DJ,Tanimoto TT.(1960),“A ComputerProgram for Classifying Plants”.Science 132(3434):1115–1118；Elena Deza&MichelMarie Deza(2009)Encyclopedia of Distances，第94页，Springer；Levandowsky M,Winter D.(1971),“Distance between sets”,Nature 234(5):34–35，所有文献均以引用的方式整体并入本文，就如同完全阐述一般)。
如上文所述，在一个非限制性实例中，可使用Kullback-Leibler(KL)趋异度测定，该数学运算非常适于非刚性几何形状和位置的细胞核靶标分析(参见Gertych A等人，Automated quantification of DNA demethylation effects in cells via 3D mappingof nuclear signatures and population homogeneity assessment.Cytometry A 2009；75:569-83，该文献以引用的方式整体并入本文，就如同完全阐述一般)。KL趋异度可用作单个细胞核的归一化散点图和参考散点图之间的相似性度量，以允许细胞的群内评估。为使KL值更具描述性，可将四个软限定符引入软件，定义细胞与整个细胞群的相似性程度。这些程度可与KL趋异度的具体范围相关，诸如：相似KL∈[0，0.5)、可能相似KL∈[0.5，2)、不可能相似KL∈[2，4.5)和相异KL∈[4.5，∞)(图3)。
上文描述的各种方法和技术提供了进行本发明的许多方式。当然，应当理解的是，根据本文所描述的任何特定实施方案并不一定能够实现所描述的所有目标或优点。因此，例如，本领域技术人员将认识到，可以以实现或优化如本文所教导的一个优点或一组优点而不一定实现如本文所教导或表明的其它目标或优点的方式来执行所述方法。本文中提及了多种替代方案。应该理解的是，一些优选的实施方案明确地包括一种、另一种或若干特征，而其它实施方案明确地排除一种、另一种或若干特征，而其它实施方案通过包括一种、另一种或若干有利特征而缓和一种具体特征。
此外，熟练的技术人员将认识到来自不同实施方案的各种特征的适用性。类似地，以上所讨论的不同的要素、特征和步骤以及对于每个此类要素、特征或步骤的其它已知等效物可以由本领域的普通技术人员以各种组合使用，以根据本文所述的原则执行方法。在不同的实施方案中，在不同的要素、特征和步骤之中，一些将明确地被包括，而其它明确地被排除。
虽然已经在某些实施方案和实施例的上下文中公开了本申请，但本领域技术人员应该理解，本申请的实施方案超出明确公开的实施方案而涵盖其它替代性实施方案和/或其用途和修改和等效物。
在一些实施方案中，术语“一个”和“一种”和“所述”以及用于描述本发明的具体实施方案的上下文(特别是在某些以下权利要求的上下文中)的类似引述可解释为涵盖单数和复数二者。本文中列举的值的范围仅旨在用作单独地提及落在该范围内的每个不同值的速写方法。除非本文另有指示，否则每个单独的值被并入本说明书中，就如同它在本文中被单独地列举一样。可以按照任何适当的顺序进行本文中描述的所有方法，除非本文中另外指示或显然与上下文矛盾。针对本文的某些实施方案所提供的任何和所有实例或示例性用语(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本申请，并且不对另外要求保护的本申请的范围构成限制。说明书中的用语不应理解为表示对本发明的实施重要的任何不受权利要求书保护的要素。
本文描述了本申请的优选实施方案，包括发明人已知的用于实施本申请的最佳模式。在阅读上述描述后，那些优选实施方案的变型对于本领域的普通技术人员将变得显而易见。预期熟练的技术人员可以视情况采用这些变型，并且本申请可以以除本文明确描述之外的方式来实践。因此，如适用法律所允许的，本申请的多个实施方案包括所附权利要求中列举的主题的所有修改物和等效物。此外，除非本文中另外指示或显然与上下文矛盾，否则在其所有可能变型中的上述要素的任何组合均包括在本申请中。
本文所参考的所有专利、专利申请、专利申请的公开以及其它材料如文章、书籍、说明书、出版物、文件、事物和/或类似物在此通过引用整体并入本文以用于所有目，除了与此有关的任何起诉文件历史、与本文件不一致或冲突的任何等同物、或对与本文件目前或以后相关的最广泛的权利要求范围可能具有限制性影响的任何等同物。举例来说，如果在与任何并入的材料相关和与本文件相关的术语的说明、定义和/或用途之间存在任何不一致或冲突，则应当以本文件中的说明、定义和/或用途为准。
最后，应当理解本文公开的本申请的实施方案是本申请的实施方案的原理示例。可以采用的其它修改可以在本申请的范围内。因此，通过举例，但不是限制，可以根据本文中的教导来利用本申请的实施方案的替代配置。因此，本申请的实施方案不限于精确地如所示出和描述的那些。
Claims (23)
1.一种用于确定细胞是否为癌性的或癌前期的方法，其包括：
确定所述细胞的细胞核中的全局5-甲基胞嘧啶(5mC)含量和/或5mC和全局DNA(gDNA)的细胞核空间联合分布；以及
如果所述细胞的所述细胞核中的所述全局5mC含量和/或5mC和gDNA的细胞核空间联合分布与非癌性的或非癌前期的参考细胞和/或非癌性的或非癌前期的参考细胞群显著不同，则确定所述细胞为癌性的或癌前期的，或如果所述全局细胞核5mC含量和/或5mC和gDNA的细胞核空间联合分布与非癌性的或非癌前期的参考细胞和/或非癌性的或非癌前期的参考细胞群的那些无显著不同，则确定所述细胞为非癌性的或非癌前期的。
2.根据权利要求1所述的方法，其中如果所述全局5mC含量显著低于所述非癌性的或非癌前期的参考细胞和/或非癌性的或非癌前期的参考细胞群，则所述细胞被确定为癌性的或癌前期的。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述细胞从生物样品获得。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述生物样品包括唾液。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述唾液包含呼吸细胞。
6.根据5所述的方法，其中所述癌性的细胞或癌前期的细胞是肺癌来源的。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述生物样品从具有吸烟史的受试者获得。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述生物样品从不具有吸烟史的受试者获得。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述生物样品从患有肺癌并且未经受肺癌治疗的受试者获得。
10.根据权利要求5所述的方法，其中所述生物样品从已接受肺癌治疗的受试者获得，所述肺癌治疗选自：放疗、化疗、外科手术及其组合。
11.根据权利要求1所述的方法，其中全局5mC和gDNA含量在所述细胞经受(a)使用对5mC有特异性的抗体进行免疫荧光染色和(b)使用4’，6-二眯基-2-苯基吲哚(DAPI)进行复染之后通过显微镜确定。
12.根据权利要求1所述的方法，其中5mC和gDNA的细胞核空间联合分布在所述细胞经受(a)使用对5mC有特异性的抗体进行免疫荧光染色和(b)使用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行复染之后通过显微镜确定。
13.根据权利要求5所述的方法，其中所述唾液样品通过包括以下步骤的方法从受试者获得：
将高渗盐水施用于所述受试者的呼吸道；以及
收集一定量的由于所述受试者吸入所述高渗盐水而排出的唾液。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述高渗盐水通过喷雾器施用。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述高渗盐水是3-5％NaCl。
16.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述显微镜是共聚焦扫描显微镜，分辨率等于或小于500纳米。
17.一种方法，其包括：
从受试者获得生物样品，其中所述生物样品包括细胞；
确定所述细胞的细胞核中全局5-甲基胞嘧啶(5mC)含量和/或5mC和全局DNA(gDNA)的细胞核空间联合分布；
如果所述细胞的所述细胞核中的所述全局5mC含量和/或5mC和gDNA的细胞核空间联合分布与非癌性的或非癌前期的参考细胞和/或非癌性的或非癌前期的细胞群显著不同，则确定所述细胞为癌性的或癌前期的；以及
如果确定所述细胞为癌性的或癌前期的，则确定所述受试者具有发展临床上可检验的癌症的高风险。
18.根据权利要求17所述的方法，其还包括如果确定所述受试者具有发展临床上可检验的癌症的高风险，或如果确定所述受试者已发展临床上可检验的癌症，则治疗所述受试者的癌症。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述生物样品包括唾液。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述唾液包含呼吸细胞。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述癌性的细胞或癌前期的细胞是肺癌来源的。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述受试者具有吸烟史。
23.根据权利要求19所述的方法，其中所述受试者不具有吸烟史。
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