TWI477282B

TWI477282B - 致熱原性外毒素ｂ胜肽疫苗

Info

Publication number: TWI477282B
Application number: TW101118374A
Authority: TW
Inventors: Chih Feng Kuo; Nina Tsao
Original assignee: Univ Ishou
Priority date: 2012-05-23
Filing date: 2012-05-23
Publication date: 2015-03-21
Also published as: US20130315946A1; US8709438B2; TW201347770A

Description

致熱原性外毒素B胜肽疫苗

本發明係關於一種A群鏈球菌之胜肽疫苗，特別是關於一種A群鏈球菌之致熱原性外毒素B的胜肽疫苗。

A群鏈球菌(Streptococcus pyogenes )是重要的人類致病菌，感染後會對生物體造成侵襲性感染症。A群鏈球菌所引發的侵襲性感染，主要係由於A群鏈球菌的致熱原性外毒素B(Streptococcal pyrogenic exotoxin B，簡稱SPE B)將免疫系統中的備解素(Properdin)及補體(Complement)分解後，特別係將補體C3分解，導致補體系統的下游防禦機制無法被活化，因此下游的殺菌作用(如嗜中性球)無法被啟動，生物體無法對抗外來病原菌，生物體受到A群鏈球菌的嚴重侵襲，而破壞組織甚至導致生物體死亡。

SPE B是由398個胺基酸所構成，其分子量約為42KDa，其中該SPE B之N端14KDa為prosegment，其餘28KDa則為具活性的蛋白水解酶(mSPE B)，幾乎所有的A群鏈球菌都具有speB 基因，目前統計至少有89種speB alleles。

目前醫學研究上曾嘗試將SPE B於第192位的胺基酸(Cys)進行點突變(C192S)，使SPE B不具有水解蛋白的活性，而能夠維持其3D構形做為抗原，誘導生物體內產生抗體，使生物體能夠在下一次接觸到SPE B時，仍可以啟動補體的活化機制，抵禦外來的病原菌。

以該經點突變之整段SPE B胜肽片段做為抗原，雖然能夠誘導個體產生SPE B抗體，然而，實驗族群中卻有70%的個體會因該經點突變之SPE B胜肽片段而導致自體免疫反應，發生腎絲球腎炎及風濕性心臟病。因此，以整段SPE B片段做為抗原，對生物體造成自體免疫反應的機率甚高，而導致生物體發生腎絲球腎炎或風濕性心臟病，因而無法將SPE B實際應用於臨床治療。

本發明之主要目的係提供一種SPE B胜肽疫苗，係有效誘導個體產生對抗SPE B之抗體者。

本發明之次一目的係提供一種SPE B胜肽疫苗，係不會使個體發生腎炎或風濕性心臟病者。

為達到前述發明目的，本發明所運用之技術內容包含有：

一種致熱原性外毒素B胜肽疫苗，係包含：一段源自於A群鏈球菌之致熱性外毒素B的C端胜肽片段；及一醫藥學上可接受之佐劑。

其中，該致熱性外毒素B的C端胜肽片段可以選自由如SEQ ID NO：2、6、8及9所示之胺基酸序列所組成之群組；或者該致熱性外毒素B的C端胜肽片段係可以選擇包含如SEQ ID NO：6及8所示之胺基酸序列。

其中，該C端部份胜肽片段與該佐劑的比例為1微克：1微升。

其中，該佐劑可以選擇為福氏完全佐劑或福氏不完全佐劑。

其中，該A群鏈球菌為M49型或emm1型。

其中，該C端胜肽片段與一鑰孔血藍蛋白結合。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：

本發明之SPE B胜肽疫苗，係包含一段源自A群鏈球菌之SPE B的C端胜肽片段，及一醫藥學上可接受之佐劑。更詳言之，該C端胜肽片段係SPE B與補體結合的主要活性片段，其係能夠誘導生物體產生對抗SPE B的抗體，使生物體之免疫系統記憶該活性片段，以備二次接觸該SPE B時，生物體內能夠及時反應產生抗體，抑制SPE B中用以結合補體C3的活性位置，如此，可避免生物體的補體免疫機制不會受到SPE B的抑制，並且藉由剔除SPE B中非活性結合片段之部分，達到減低SPE B對生物體產生自體免疫反應的副作用。

請參照第1表所示，本發明之較佳實施例中，該C端胜肽片段可以選自由如SEQ ID NO：2、6、8或9所示之胺基酸序列所組成之群組，其中，又以如SEQ ID NO：6或8所示之胺基酸序列係SPE B與補體結合的主要活性片段，因此本發明較佳係以包含如SEQ ID NO：6或8所示之胺基酸序列做為抗原，係能夠有效引發生物體產生對抗 SPE B的抗體。

本發明之SPE B胜肽疫苗較佳係選擇以一醫藥上可接受之佐劑，該佐劑可以選擇如福氏完全佐劑或福氏不完全佐劑等。本發明較佳係該C端部份胜肽片段之重量與該佐劑之體積的比例為1：1，舉例而言，係以50微克之SPE B胜肽疫苗之C端部份胜肽片段與50微升之佐劑混合而製得的SPE B胜肽疫苗，該SPE B胜肽疫苗係能夠有效引發生物體對SPE B產生免疫反應，使生物體內產生抗SPE B之抗體。

本發明之C端胜肽片段特別係能夠針對M49型或emm1型A群鏈球菌之SPE B產生抗體，達到有效保護生物體受M49型或emm1型A群鏈球菌所產生的皮膚潰爛情形，且提高受到M49型或emm1型A群鏈球菌感染的生物體存活率之功效。

為證實本發明所揭示之C端胜肽片段確實與補體C3之間具有較佳的結合能力，且該C端胜肽片段確實能夠有效誘導生物體產生抗SPE B之抗體，且不會使生物體發生如腎炎等副作用，遂進行以下試驗(A)至(C)。

(A)補體C3結合力試驗

為證實本發明之C端胜肽片段確實與補體C3具有良好結合力，本實施例係取3段SPE B中不同胜肽片段，第A1組之胜肽片段係SPE B的整段胜肽片段，其第192位為C192S之點突變，第A2組之胜肽片段係SPE B中第1~268位之胺基酸序列，第A3組係如SEQ ID NO：2之胜肽片段，以ELISA分析各組胜肽片段與補體C3之結合量。

舉例而言，本實施例係將第A1至A3組胜肽片段之相對應鹼基序列，構築於一表現載體(本實施例係選擇但不限定以pET24a expression vector作為合成該等胜肽片段之表現載體)，並轉殖到一大腸桿菌中，使大腸桿菌表現出第A1至A3組胜肽片段，再利用蛋白質層析法(Fast protein liquid chromatography，簡稱FPLC)純化出各組之胜肽片段。

取0.2μg之各組胜肽片段附著於ELISA之96孔盤中，加入以GVB/MgEGTA稀釋的血清進行反應後，加入抗補體C3之一級抗體，再和連接HRP之二級抗體作用後，以TMB呈色，並量測各組的吸光值OD₆₅₀ 變化，吸光值越高代表其與血清中補體的結合能力越高。

由第1圖可知，SPE B與補體C3的主要結合片段確實係如SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列。據此，本實施例如SEQ ID NO：2所示之C端胜肽片段確實能夠與補體C3結合，可作為誘導生物體對SPE B產生免疫反應之抗原。

請參照第2表及第2圖所示，本實施例再將該第 269~398位之胜肽片段分成6小段，各小段胜肽片段可選擇以人工合成方式，或將各小段構築於一表現載體(本實施例係選擇但不限定以pET42a expression vector作為合成該等胜肽片段之表現載體，其於各小段胜肽片段上結合一GST標籤蛋白，以便後續純化)，並轉殖到一大腸桿菌中，使大腸桿菌表現出第A2-1至A2-6組胜肽片段，再純化出各組之胜肽片段；本實施例較佳係以人工方式獲得該A2-1至A2-6之胜肽片段。更進一步確認第A2-1至A2-6組之胜肽片段與補體C3的結合強度。

由第2圖可知，以第A2-0組之OD₆₅₀ 為基準，本實施例之第A2-4及A2-6組的胜肽序列與補體C3的相對結合強度較其他組為高，可達到50%以上，因此選擇分別以SEQ ID NO：6及8之胜肽片段製成胜肽疫苗，進行後續(B)小鼠感染試驗。

(B)背部氣囊感染試驗

為證實本發明之SPE B部分胜肽片段係能夠有效誘導生物體產生抗A群鏈球菌之SPE B的抗體，而達到緩解生物體在感染到A群鏈球菌後的皮膚潰爛症狀，並增加生物體的存活率。本實施例係將如SEQ ID NO：6及8所示之胺基酸序列，分別製備成試驗疫苗，以該二試驗疫苗分別免疫實驗小鼠後，以背部氣囊感染模式注射一定量之A群鏈球菌，觀察小鼠的背部組織病變及存活率。

舉例而言，本實施例係取30隻BALB/c小鼠(係購自國家實驗研究院實驗動物中心，簡稱NLAC)，分成三組，其中第B1組為未進行免疫的控制組，第B2組為施打包含如SEQ ID NO：6所示之試驗疫苗之實驗組，第B3組為施打包含如SEQ ID NO：8所示之試驗疫苗之實驗組。

請參照第3表，本實施例如SEQ ID NO：6所示胺基酸序列(以下簡稱SPE B_346~360 片段)及如SEQ ID NO：8所示胺基酸序列(以下簡稱SPE B_376~398 片段)係分別與鑰孔血藍蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，簡稱KLH)結合，以提高其抗原性，分別以包含有KLH之SPE B_346~360 片段及包含有KLH之SPE B_376~398 片段作為免疫動物的抗原，並將該包含有KLH之SPE B_346~360 片段及SPE B_376~398 片段分別與福氏完全佐劑(簡稱CFA佐劑)或福氏不完全佐劑(簡稱IFA佐劑)混合，進行後續免疫程序。

本實施例的免疫程序，共進行3次免疫注射，舉例而言，本實施例第B2組之免疫程序係於第1次注射時，施打50μg之KLH-SPE B_346~360 (其與CFA佐劑混合)，隔2週追加施打25μg之KLH-SPE B_346~360 (其與IFA佐劑混合)，共追加注射2次，完成免疫程序後，確認第B2組之平均效價上升至10000(如第3圖所示)，隨即進行背部氣囊感染步驟。本實施例之第B3組之免疫程序與前述第B2組之免疫程序相同，僅將免疫用的胜肽片段換成KLH-SPE B_376~398 。

本實施例係於每隻實驗小鼠施予2~3×10⁸ cfu之A群鏈球菌，施打於第B1至B3組之小鼠背部，該A群鏈球菌係由成功大學吳俊忠教授提供之M49型NZ131菌株，並紀錄3天內各小鼠施打菌液的背部組織潰爛面積，以及14天內各組的存活率。

由第4圖可知，本實施例第B2及B3組之背部平均潰爛面積明顯低於第B1組，代表包含SPE B_346~360 或SPE B_376~398 之試驗疫苗，確實能夠有效減緩受A群鏈球菌感染的患部潰爛程度。

由第5圖可知，本實施例第B1組在第4天已全數死亡，而第B2及B3組到第14天皆存活，其存活率達100%，代表包含SPE B_346~360 或SPE B_376~398 之試驗疫苗，確實能夠提高生物的存活率。

本實施例另取4組BALB/c小鼠(各實驗組為9隻，其中未免疫組別為5隻)，以第4表所示之條件進行免疫，再分別施與兩株侵襲型的A型鏈球菌-A1菌株及A20菌株(皆由成功大學吳俊忠教授提供之emm1型A群鏈球菌)，每隻實驗小鼠施予1×10⁸ cfu之A1菌株或A20菌株，並記錄3天內的背部潰爛情形及14天內的存活率。

請參照第6(a)至6(f)圖，本實施例第B1-2及B2-2組之背部潰爛情形較第B1-1及B2-1組緩和，代表本發明第376~398位胜肽片段確實對受感染的局部組織具有保護作用；請參照第7圖，係本實施例各組之存活率，其中第B1-2及B2-2組之存活率也較第B1-1及B2-1組高，至少在第14天時實驗組的存活率還能達到40%。

另外，本實施例再另取4組BALB/c小鼠(各組5隻) 施打本發明第346~360位胜肽片段，再進行背部氣囊感染試驗，請參照第8圖，在第14天時的存活率約為25%。

由此可知，本發明之C端胜肽片段確實能夠提高免疫動物的存活率以及背部的潰爛情形，能夠抑制受A型鏈球菌侵襲之進程。

(C)腎臟切片鏡檢

根據羅月霞等人於2007年Kidney international期刊發表「Streptococcal pyrogenic exotoxin B antibodies in a mouse model of glomerulonephritis」之內容可知，以SPE B整段胜肽片段(C192S)對小鼠進行免疫後，實驗小鼠均產生腎炎的副作用。本實施例係將試驗(B)結束後的第B1-1組(正常小鼠)及第B1-2組實驗小鼠犧牲，取得其腎臟切片，並以伊紅染色進行鏡檢，比較第9(a)及9(b)圖之腎臟切片的發炎情形，明顯看出正常小鼠及以KLH-SPE B_376~398 誘導免疫小鼠的腎臟沒有發炎現象。

由此可知，本發明之C端胜肽片段確實不會使生物體發生自體免疫而導致腎臟發炎。

綜上所述，本發明之SPE B胜肽疫苗係藉由主要與補體C3結合之C端胜肽片段做為一有效抗原，提高生物體對二次感染A群鏈球菌的免疫反應，產生對抗A群鏈球菌SPE B之抗體，以保護生物體的皮膚潰爛情形及提高受感染個體的存活率，且該C端胜肽片段不會使生物體產生自體免疫反應而發生腎炎等副作用。

藉此，本發明之SPE B胜肽疫苗，係能夠藉由源自於SPE B之C端胜肽片段，有效誘導個體產生對抗SPE B之抗體，而達到有效保護生物體不受到A群鏈球菌侵襲之功效。

本發明之SPE B胜肽疫苗，係已去除可能誘導生物體產生自體免疫反應之胜肽片段，達到降低個體發生腎炎或風濕性心臟病的風險之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

第1圖：本實施例第A1至A3組以ELISA測量吸光值OD₆₅₀ 之長條圖。

第2圖：本實施例第A2-0至A2-6組與補體C3之相對結合強度長條圖。

第3圖：本實施例第B1至B3組之免疫效價XY分布圖。

第4圖：本實施例第B1至B3組之背部潰爛面積XY分布圖。

第5圖：本實施例第B1至B3組之存活率折線圖。

第6(a)圖：本實施例第B1-1組之背部潰爛照片。

第6(b)圖：本實施例第B1-2組之背部潰爛照片(一)。

第6(c)圖：本實施例第B1-2組之背部潰爛照片(二)。

第6(d)圖：本實施例第B2-1組之背部潰爛照片。

第6(e)圖：本實施例第B2-2組之背部潰爛照片(一)。

第6(f)圖：本實施例第B2-2組之背部潰爛照片(二)。

第7圖：本實施例第B1-1、B1-2、B2-1及B2-2組之存活率折線圖。

第8圖：本實施例第B3-1、B3-2、B4-1及B4-2組之存活率折線圖。

第9(a)圖：本實施例第B1-1組之腎臟切片鏡檢照片。

第9(b)圖：本實施例第B1-2組之腎臟切片鏡檢照片。

<110> 義守大學

<120> 致熱原性外毒素B胜肽疫苗

<160> 9

<210> 1

<211> 398

<212> PRT

<213>Streptococcus pyogenes

<220> 人工序列

<400> SEQUENCE：1

<210> 2

<211> 130

<212> PRT

<213>Streptococcus pyogenes

<220> 人工序列

<400> SEQUENCE：2

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213>Streptococcus pyogenes

<220> 人工序列

<400> SEQUENCE：3

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213>Streptococcus pyogenes

<220> 人工序列

<400> SEQUENCE：4

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213>Streptococcus pyogenes

<220> 人工序列

<400> SEQUENCE：5

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213>Streptococcus pyogenes

<220> 人工序列

<400> SEQUENCE：6

<210> 7

<211> 20

<212> PRT

<213>Streptococcus pyogenes

<220> 人工序列

<400> SEQUENCE：7

<210> 8

<211> 23

<212> PRT

<213>Streptococcus pyogenes

<220> 人工序列

<400> SEQUENCE：8

<210> 9

<211> 54

<212> PRT

<213>Streptococcus pyogenes

<220> 人工序列

<400> SEQUENCE：9

Claims

一種致熱原性外毒素B胜肽疫苗，係包含：一段源自於A群鏈球菌之致熱性外毒素B的C端胜肽片段；及一醫藥學上可接受之佐劑；其中，該致熱性外毒素B的C端胜肽片段係選自由如SEQ ID NO：6及8所示之胺基酸序列所組成之群組。
如申請專利範圍第1項所述之致熱原性外毒素B胜肽疫苗，其中，該C端部份胜肽片段與該佐劑的比例為1微克：1微升。
如申請專利範圍第1項所述之致熱原性外毒素B胜肽疫苗，其中，該佐劑為福氏完全佐劑或福氏不完全佐劑。
如申請專利範圍第1項所述之致熱原性外毒素B胜肽疫苗，其中，該A群鏈球菌為M49型或emm1型。
如申請專利範圍第1項所述之致熱原性外毒素B胜肽疫苗，其中，該C端胜肽片段與一鑰孔血藍蛋白結合。