AT503189B1 - Methode zur 5-methylcytosin-detektion - Google Patents

Description

2 AT 503 189 B1

Die vorliegende Erfindung betrifft die Detektion und Messung von methylierten Poly- oder Oligo-nukleotiden.

Die DNA-Methylierung spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Gen-Expression (1), welche eine starke Auswirkung auf die Gewebsentwicklung (2), die Alterung (3-4) und einige Krankheiten (5-7) hat. Bei vielen Krebsarten gibt es eine Korrelation mit einer abnormalen DNA-Methylierung, einschließlich einer Genom-weiten Hypomethylierung (8) und einer Stellenspezifischen Hypermethylierung (9), die einige Krebs-Suppressor-Gene oder DNA-Reparatur-Gene ausschaltet. Daher ist die Detektion des Methylierungsmusters von Gen-Promotoren für die Diagnose und die Grundlagenforschung von großer Bedeutung (10-12).

Zu den bekannten Techniken zählen das Restriktions-"Landmark"-Genom-Scanning, die “Repräsentative Differenz-Analyse („representational difference analysis“), die methylierungssensitive willkürlich geprimte PCR („methylation-sensitive arbitrarily primed PCR“) und die Amplifikation methylierter CpG-lnseln („methylated CpG Islands amplification“), COBRA (35) und Methy-Light (11-12). Derzeitige Techniken auf Chip-Basis, wie die MethyLight (12)-Technik beruhen auf der PCR und ergeben infolge von Kreuzreaktivitäten keine Hochauflösungs-Methylierungs-Information („high-resolution methylation Information“) und zielen nur auf ein relativ geringfügiges Vorherrschen von DNA-Methylierungsmustern ab. Der methylierungssensitive Restriktions-enzym-Verdau, gefolgt von PCR, ist für falsch-positive Ergebnisse anfällig, da selbst geringe Mengen eines falschen unvollständigen Verdaus in spaltungsresistenten DNA-Abschnitten zu einem PCR-Produkt führen können. Andere Probleme, wie unvollständiges Schneiden, normale Zell-Kontamination und der Bedarf an beträchtlichen Mengen an DNA zur Analyse sind weitere Nachteile. Das unsachgemäße Designen von PCR-Primern, die an jede Methylierungsstelle (von beispielsweise 50 Millionen CpG-Stellen im humanen Haploid-Genom) angepasst werden müssen, kann auch zu einer falsch positiven m5C-ldentifizierung bei der Bisulfit-Methode führen, worin Cytosin in Uracil übergeführt wird, und m5C nicht-reaktiv bleibt (11). Das Bisulfit-Verfahren erfordert auch eine DNA-Behandlung bei einem sauren pH-Wert (~p H5) über eine lange Zeit, was zu apurinen Stellen führen kann.

Verfahren auf PCR-Basis haben auch den Nachteil von verzerrten PCR-Amplifikations-Produkten („biased PCR amplification artifacts“). Dasselbe Primer-Paar kann vorzugsweise entweder die methylierte oder die unmethylierte Sequenz amplifizieren, obwohl die Sequenz, an die die Primer anlagern, und die Längen der PCR-Produkte identisch sind.

Alle diese im Stand der Technik beschriebenen Verfahren zum Analysieren der Methylierung von Nukleinsäuren weisen Nachteile auf, weil sie sich nicht auf das einzelne Molekül als Informationsbeschaffer beziehen, sondern hauptsächlich auf Analysen mit hohem Durchsatz oder auf Verfahren auf Basis von Bisulfit-PCR beruhen.

Die US 2003/0186311 A1 betrifft die Messung von molekularen Interaktionen mittels eines AFM-Arrays. Unter anderem können dabei Protein-Nukleinsäure-Interaktionen gemessen werden. Als Bindungs-Charakteristika werden Reaktions-Parameter zwischen den an der AFM-Sonde und am Array gebundenen Bindungsparter gemessen, wie z.B. die Loslösungskraft.

Stroh et al. (Biophys J. 87(3) (2004): 1981-9) beschreiben Interaktionen zwischen Lysozym, das auf einen Träger immobilisiert wird mit einem Antikörper der gegen Lysozym gerichtet ist an einer AFM-Spitze. Bei dieser Methode wird die AFM-Spitze im oszillierenden Modus über den Träger gescannt.

In der US 5 372 930 wird eine Anordnung beschrieben, um mittels einer AFM-Interaktion zwischen Molekülen zu messen. Komplementäre Nukleinsäureinteraktionen werden zwischen Nukleinsäuren an der AFM-Spitze und und einem Träger untersucht.

Die EP 1 233 259 A1 beschreibt eine AFM-Sonde, an der ein Monolayer angebracht wurde. An 3 AT 503 189 B1 diesem Monolayer kann beispielsweise eine Vielzahl von Nukleotiden befestigt werden, wie z.B. Thymin oder Guanin, mit denen komplementäre Basen an einer immobilisierten DNA-Probe detektiert werden können. Beispielsweise wurde an einer 30-bp DNA 8 Cytosine detektiert.

Gemäß Boland et al. (Proc Natl Acad Sei U S A 92(12) (1995): 5297-301) wurden Schichten von Nukleotiden mittels einer AFM-Sonde, die mit einem komplementären Nukleotid beschichtet wurde untersucht. Dabei wurden Wasserstoffbrücken zwischen den Nukleotiden durch Tast-und Loslöseverfahren analysiert.

Die Publikation von Kienberger et al. (Acc Chem Res. 39(1) (2006): 29-36) betrifft die Messung von molekularen Interaktionen mittels AFM, wobei die Messung der Interaktionspaare Avidin-Biotin und RanGDP/GTP-lmportin-beta untersucht wurde.

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, neue Mittel zum Analysieren von Nukleinsäure-Methylierungsmustern mit großer Präzision (vorzugsweise auf Einzelbasen-Auflösung) vorzusehen.

Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zur Detektion von 5-Methylcytosin vor, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass jeweils ein Bindungspartner eines 5-Methylcytosin-spezifi-schen Bindungspaares, bestehend aus einem 5-Methylcytosin-spezifischem Bindungs-Teil und einem 5-Methylcytosin enthaltenden Nukleotid-Analyt, an der Spitze einer Einzelmolekül-Kraftspektroskopie („single molecule force spectroscopy“, SMFS)-Sonde, der jeweils andere Teil des Paares an einem Träger befestigt wird, wobei die SMFS-Sonde in Kontakt mit dem Träger gebracht und losgelöst wird und die Loslösekraft durch ein SMFS-Detektionsmittel gemessen wird, und zwei oder mehr 5-Methylcytosin-spezifische Bindungs-Teile vorgesehen sind, die zwei oder mehr 5-Methylcytosine binden können.

An der Spitze der SMFS-Sonde oder des Trägers ist (sind) vorzugsweise ein oder mehrere einzelne 5-Methylcytosin-spezifische Bindungsmoleküle gebunden. Ein 5-Methylcytosin-umfassender Analyt und der 5-Methylcytosin-spezifische Teil haben nach dem Kontakt starke molekulare Anziehungskräfte, die mittels SMFS gemessen werden können. Die gemessene Kraft oder das Kraft-Profil der Loslösungs-Reaktion kann zur Detektion und zur Unterscheidung einzelner 5-Methylcytosin-Nukleotide verwendet werden. Dieses Ergebnis war vollkommen überraschend, da infolge von Spezifitätsproblemen in Verbindung mit üblichen 5-Methylcytosin-spezifischen Bindungs-Teilen nicht erwartet worden war, eine spezifische Unterscheidung auf Basis von Einzelmolekül-Messungen zu erzielen.

Die Kraftspektroskopie wird in großem Umfang zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen biologischen Molekülen oder innerhalb derselben verwendet, wie Ligand und Rezeptor (13-15), Antikörper und Antigen (16), Einzelproteine (17), DNA (18-22), RNA (23-24); Zellen (25) usw., unter Verwendung der Rasterkraftmikroskopie („atomic force microscopy“, AFM), Laserpinzette („laser tweezers“), optischer Fallen („optical traps“) oder Biomembram-Kraft-Sonde („biomembrane force probe“) (26, 27). Die Kraftmessungen können die Wechselwirkung quantifizieren und weitere Informationen liefern, wie die Dissoziationsrate, Energielandschaft („energy landscape“), Konturlänge, Persistenz-Länge und strukturelle Informationen, jedoch wurden Antikörper bisher noch nicht bei SMFS- oder AFM-Techniken zur Analyse von Nukleinsäuren, insbesondere der Methylierung von Nukleinsäuren, oder umgekehrt, verwendet.

Die 5-Methylcytosin-spezifischen Bindungs-Teile sind vorzugsweise 5-Methylcytosin-spezifische Antikörper, die im Allgemeinen im Stand der Technik bekannt und derzeit bei Fluoreszenz-Tests zur Detektion von methylierter DNA (30-32, WO 2004/104582) verwendet werden und im Handel erhältlich sind (beispielsweise von Serotec). 5-Methylcytosin (m5C) wird auch einfach als Methylcytosin bezeichnet und ist in biologischer, methylierter DNA vorhanden. Der 5-Methylcytosin-spezifische Bindungs-Teil ist im Allgemeinen auch für 5-Methylcytosidin spezifisch (z.B. der von Serotec entwickelte Antikörper). Beispielsweise wurde der Antikörper-Klon 33D3 von 4 AT 503 189 B1

Serotec entwickelt, um zwischen der modifizierten Base m5C und dem normalen Gegenstück Cytosin zu unterscheiden. Antikörper können sowohl von monoklonalen als auch von polyklona-len Stammlösungen erhalten werden, vorzugsweise nach einer Immunaffinitäts-Seiektion für eine Optimierung. Für die vorliegende Erfindung kann jeder (jedes) 5-Methylcytosin-spezifische Antikörper oder Antikörper-Fragment verwendet werden, vorzugsweise Fab- (Antigenbindendes Fragment), Fab'- oder scFv- (single Chain variable fragment)-Fragmente. Es kann auch die für die Antigenbindung bestimmende Region alleine, die für 5-Methylcytosin spezifisch ist (vorzugsweise in einer geeigneten Gerüst-Verankerung („scaffold anchoring“)) verwendet werden. Diese Fragmente können mittels allgemeiner rekombinanter Techniken, Protein-Engineering erzeugt werden oder käuflich erworben werden.

Bei bevorzugten Ausführungsformen ist die SMFS eine Rasterkraftmikroskopie (AFM), wobei vorzugsweise das Detektionsmittel ein Laser-Ablenkungsmittel, am meisten bevorzugt, ein Cantilever ist. Beispielsweise wird ein Laser vom Cantilever abgelenkt, und die Reflexion ist gegenüber einer geringen Positionsveränderung empfindlich, die von einer molekularen Wechselwirkung zwischen den an der Sonde und den am Träger befestigten Molekülen bewirkt wird. Vorzugsweise ist die AFM ein Kontakt- oder ein dynamisches Kraftmikroskopie(„dynamic force microscopy“, DFM)-Verfahren, wobei die Sondenspitze über dem Probenträger hin- und herbewegt wird.

Eine andere bevorzugte SMFS ist das Optikpinzetten-Verfahren, auch Laserpinzette oder optische Fallen-Methode genannt. Für diese Spektroskopie wird der Träger in Form eines Kügelchens in eine optische Falle gebracht. Durch Kontaktieren des Trägers mit der Sonde werden die Kräfte zwischen den befestigten Molekülen am Träger und an der Sonde über die Fallen-Konstante (33) gemessen. Sowohl Standard-AFM als auch optische Pinzette sind für die Detektion der Wechselwirkung der an der Sonde und am Träger befestigten Teile besonders bevorzugt. Über beide Techniken wird in (34) ein gründlicher Überblick gegeben und sie können für die vorliegende Erfindung routinemäßig adaptiert werden.

Eine andere bevorzugte SMFS-Technik ist die Verwendung eines Kraftapparates („force appa-ratus“). Hier sind die SMFS-Sonde und der Träger einander gegenüberliegende Oberflächen, die jeweils mehrere Moleküle von entweder dem Analyten oder vom 5-Methylcytosin-spezifischen Bindungs-Teil an der entsprechenden Oberfläche befestigt haben. Die Wechselwirkung und die Loslösungskräfte werden mittels Standard-Techniken, z.B. Laser-Ablenkung, gemessen.

Ein weiteres SMFS-Verfahren ist das Biomembran-Kraft-Sonden-Verfahren. Bei diesem Verfahren ist die Sonde eine Biomembran, z.B. von einem Erythrozyten oder ein ganzer Erythrozyt, welcher als Feder-Cantilever ähnlich der Standard-AFM verwendet wird (26, 27).

Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der 5-Methylcytosin-spezifische Bindungs-Teil an die SMFS-Sonde gebunden, vorzugsweise durch einen Linker, am meisten bevorzugt, durch einen Glycosid-Linker. Im Falle eines Antikörpers ist der Linker beispielsweise der Fc-Teil des Antikörpers, der gebunden sein kann, beispielsweise durch seine Lysin-Reste oder durch seine Glycosylierungs-Strukturen. Die Immobilisierung über Glycosylierungs-Strukturen ist besonders bevorzugt, da dadurch eine optimale räumliche Symmetrie und Flexibilität erreicht werden. Andere chemische oder biologische Linker können ebenso zur Immobilisierung des 5-Methylcytosin-spezifischen Bindungs-Teils verwendet werden, wobei die Linker-Moleküle verzweigt, länglich („prolate“) oder kugelförmig sein können. Insbesondere bevorzugt ist ein Linker mit gut definierter Verzweigung, z.B. zwei- oder dreizweigige Linker. Solche Linker können auch hintereinander verwendet werden, das zu mehrfachen definierten Verzweigungen führt, z.B. 4-fach oder 9-fach oder jegliche Kombination. An jedem Ende ist vorzugsweise ein 5-Methylcytosin-spezifischer Bindungs-Teil befestigt. Die Verzweigung ist vorzugsweise eine baumartige Verzweigung (Fig. 4 und 6), die durch chemische Standard-Synthese, z.B. durch Amid-Bindung zwischen den sich verzweigenden Monomeren, erleichtert werden kann. 5 AT 503 189 B1

Der Träger ist vorzugsweise ein fester Träger, insbesondere ein Glas-Träger. Vorzugsweise ist der Träger ein Aldehyd-Glas-Träger. Aldehyd-Glas wird vorzugsweise zum Immobilisieren von Biomolekülen, wie Proteinen oder Nukleotiden, verwendet, die an einem Ende aminiert sein können. Die Nukleotid-Analyten können beispielsweise RNA oder DNA, doppel- oder einzel-strängig, sein und werden vorzugsweise vor der SMSF-Messung denaturiert. Die Denaturierung ist vorzugsweise eine chemische Denaturierung, z.B. unter Verwendung von Lysolecithin.

Vorzugsweise ist der Nukleotid-Analyt in Spots auf dem Träger immobilisiert. Dies ermöglicht eine systematische Messung von vielen Analyten auf einem Träger und dessen leichte Handhabung.

Weiters bevorzugt ist das Verfahren, bei welchem der Nukleotid-Analyt auf dem Träger - vor dem Kontaktieren und dem Loslösen mit der SMFS-Sonde - mit einem Fluoreszenzspezifischen 5-Methylcytosin-Test analysiert wird. Mit diesem Verfahren wird zuerst, vor der zeitaufwändigen SMFS-Messung, eine raschere Screening-Technik angewandt. Nachdem das Vorhandensein von 5-Methylcytosin bestätigt worden ist, z.B. mittels Standard-Tests, liefert die SMFS-Messung weitere Informationen, wie die Bindungskräfte (und gegebenenfalls die Bindungslängein)) der befestigten Moleküle. Kleine DNA-Abschnitte, die Basenpaare an zumindest einem Teil der Sequenz bilden, können durch die Zugkraft an der SMFS-Sonde entwirrt werden. Dieses Verhalten kann selektiv an Spots mit 5-Methylcytosin gemessen werden. Daher befindet sich vorzugsweise mehr als ein Nukleotid-Analyten-Spot auf dem Träger und wird die SMFS-Messung für die Spots durchgeführt, die im Fluoreszenz-Test 5-Methylcytosin-positiv waren.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform verwendet das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung auch ein „Recognition Imaging“ (28, 29).

Am meisten bevorzugt weist die SMFS-Sonde zwei oder mehr 5-Methylcytosin-spezifische Bindungs-Teile auf und kann zwei oder mehr 5-Methylcytosine am Nukleotid-Analyten binden. Zwei solche Teile, z.B. Antikörper-Fab-Teile, können zwei 5-Methylcytosine an einen Nukleotid-Analyten binden, welcher vorzugsweise ein Oligo- oder Polynukleotid-Molekül ist. Durch das Rasterkraft-Profil ist es mit der SMFS möglich, den Abstand dieser (mindestens) zwei 5-Methylcytosine zu messen. Daher sieht die vorliegende Erfindung auch das Verfahren vor, bei welchem durch das gemessene SMFS-Kraft-Profil der Abstand der zwei oder mehr 5-Methylcytosine am Nukleotid-Analyten auf Einzel-Basen-Ebene detektiert wird.

Die Kraft-Spektroskopie wurde verwendet, um die Abstand-Information von Methylcytosinen bei Einzelstrang-DNA (single-stranded DNA, ssDNA) zu erhalten. Beispielsweise können zwei Fab-Domänen eines anti-Methylcytosin-Antikörpers zwei Methylcytosine in einer ssDNA binden. Wenn ein Ende der DNA an einem festen Träger fixiert ist und an der Fc-Domäne des Antikörpers gezogen wird, werden die Fab-Domänen von der DNA eine nach der anderen getrennt, mit einem Abstand gleich der Kontur-Länge von Nukleotiden zwischen zwei Methylcytosinen. Auf diese Weise kann der Abstand zwischen Methylcytosinen in der DNA gemessen werden.

Vorzugsweise ist der Nukleotid-Analyt ein Polynukleotid, das an die SMFS-Sonde oder den Träger durch Basen-Paarung mit einem Oligonukleotid, welches an der SMFS-Sonde oder am Träger (woran der Nukleotid-Analyt befestigt werden soll) immobilisiert ist, gebunden ist; vorzugsweise ist die Basenpaarung durch ein Nukleotid-Interkalationsmittel verstärkt, welches vorzugsweise Psoralen ist. Der Nukleotid-Analyt kann ein Nukleinsäure-Molekül aus einer Probe eines Patienten sein, von welchem man vermutet, dass er eine Krankheit hat, die mit einer abnormen Methylierung (z.B. einer abnormen Methylierung der chromosomalen DNA) verbunden ist. Der Nukleinsäure-Analyt kann auch eine Nukleinsäure mit einem oder mehreren 5-Methylcytosin-Resten sein (z.B. zum Analysieren des Methylierungsgrades und/oder zum Analysieren der Position der methylierten Reste innerhalb dieses Nukleinsäure-Moleküls). Der Nukleinsäure-Analyt ist in den meisten Fällen DNA, vorzugsweise DNA, die aus biologischen Quellen extrahiert ist, insbesondere aus humanen Gewebeproben oder aus Proben humaner 6 AT 503 189 B1 Körperflüssigkeiten (welche Zellen enthalten). Der Analyt ist an der Sonde oder am Träger über ein kurzes Oligonukleotid, beispielsweise einen unspezifischen poly-T- oder poly-A-Abschnitt, befestigt. So befestigt, kann der Nukleotid-Analyt durch denaturierende Mittel leicht entfernt werden, und ein anderer Analyt kann wiederum am Oligonukleotid an der Sondenspitze oder am Träger befestigt werden. Für kurze Nukleotide kann die Basenpaarung verstärkt werden, um während der Kontaktierungs- und Loslöse-Schritte der SMFS-Messung eine Stabilität zu erzielen. Ein Verstärkungsmittel ist beispielsweise das Interkalationsmittel Psoralen, welches durch UV-Licht reaktiv aktiviert werden kann. Das Oligonukleotid wirkt als Linker am Nukleotid-Analyten mittels Doppelhelix-Bildung. Der Analyt kann vom Oligonukleotid nach der SMFS-Messung durch denaturierende Bedingungen, z.B. Spülen mit Wasser und Formamid, losgelöst werden.

In einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung auch eine Einzelmolekül-Kraftmikroskopie(SMFS)-Sonde vor, umfassend zwei oder mehr 5-Methylcytosin-spezifische Bindungs-Teile, die an der SMFS-Sonde befestigt sind, vorzugsweise durch einen Linker-Teil. Der Linker ist beispielsweise der Fc-Teil eines Antikörpers oder ein polyvalenter Crosslinker. Polyvalente Crosslinker zur (spezifischen) mehrfachen Molekülbefestigung sind im Allgemeinen im Stand der Technik bekannt und umfassen kleine Polymere, Glycoside und Amide.

Vorzugsweise umfasst die SMFS-Sonde zwei oder mehr 5-Methylcytosin-spezifische Bindungs-Teile. Wie oben erwähnt, hat dies den Vorteil, dass der Abstand zwischen Methylcytosinen gemessen werden kann. Vorzugsweise umfasst die Sonde 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder 9 5-Methylcytosin-spezifische Bindungs-Teile. Diese Teile sind vorzugsweise an der Sondenspitze durch einen (mehrzweigigen) Linker, wie oben erwähnt, befestigt.

Vorzugsweise ist die SMFS-Sonde eine AFM-Sonde, vorzugsweise ein mit einer Spitze versehener Cantilever.

Gemäß einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung auch eine SMFS-Vorrichtung, z.B. Standard-AFM-Vorrichtung, mit einer SMFS-Sonde mit dem 5-Methylcytosin-spezifischen Bindungs-Teil und einem Träger vor, vorzugsweise ist der Träger ein Chip. Der Chip hat am meisten bevorzugt viele Spots oder Stellen für die Immobilisierung von Nukleotid-Analyten. Der Chip ist austauschbar für eine automatisierte Messung von vielen Analyten, einschließlich ein 5-Methylcytosin-Screening, z.B. mit Fluoreszenz-Methoden, und die SMFS-Messung an den 5-Methylcytosin-positiven Stellen zum Analysieren der Methylierungs-Eigenschaften, z.B. den Abständen zwischen 5-Methylcytosinen, aus welchen die 5-Methylcytosin-Dichte abgeleitet werden kann. Der gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendende Chip ist vorzugsweise ein Chip, auf welchem Nukleinsäuren immobilisiert sind (oder immobilisierbar sind), die eine wichtige Rolle bei der Methylierung spielen, z.B. humane Suppressor-Gene.

Die vorliegende Erfindung ist durch die folgenden Figuren und Beispiele weiter veranschaulicht, ohne auf diese eingeschränkt zu sein.

Figuren:

Fig. 1: Anti-Methylcytosin-Antikörper ist über PEG-Crosslinker an die Cantilever-Spitze konjugiert. ssDNA, die mehrere Methylcytosine enthält, ist an Aldehyd-Glas über eine Amino-Gruppe an ihrem 3'-Ende konjugiert. Zwei Fab-Domänen des Antikörpers können mit zwei Methylcytosinen der DNA binden. Ziehen an den Fc-Domänen trennt zwei Fab-Domänen nacheinander von der DNA, was zwei Losbindungs-Peaks in der Kraft-Abstand-Kurve bewirkt, mit welcher der Abstand zwischen zwei Methylcytosinen gemessen werden kann.

Fig. 2. Beispiel Kraft-Abstand-Kurven mit zwei Losbindungs-Ereignissen, gemessen an der ersten DNA-Probe (mit 9 Methylcytosinen, getrennt durch 6 Nukleotide, Gruppe A) und der zweiten DNA-Probe (mit 5 Methylcytosinen, getrennt durch 4 Nukleotide, Gruppe B) sind mit 7 AT 503 189 B1

Pfeilen gezeigt, die Positionen von Losbindungs-Ereignissen andeuten. Die Skizzen zeigen die mögliche Bindungsposition von Antikörper an DNA mit dem gemessenen Abstand zwischen zwei Losbindungs-Ereignissen. Rote Stäbe in den Skizzen sind Methylcytosine, wogegen blaue andere Nukleotide sind. Die statistische Verteilung des gemessenen Abstandes zwischen zwei Losbindungs-Ereignissen von 150 Kraft-Abstand-Kurven von der ersten DNA-Probe (C) und von 259 Kurven von der zweiten DNA-Probe (D) zeigen quasi-äquidistante Peaks, deren Positionen in Tabelle 1 angeführt sind, die mit dem Abstand zwischen den durch Fab-Domänen gebundenen Methylcytosinen übereinstimmen.

Fig. 3. Die dritte DNA-Probe hat sechs Methylcytosine, getrennt durch 3, 8, 1, 8 und 3 Nukleotide. Der Abstand zwischen den Methylcytosinen kann 1, 3, 8, 9, 11, 12, 17, 20 oder 23 Nukleotide sein. Aus 298 Kraft-Abstand-Kurven mit zwei Losbindungs-Ereignissen wird eine Abstandverteilung mit acht Peaks erhalten, entsprechend 3, 8, 9, 11, 12, 17, 20 bzw. 23 Nukleotiden.

Fig. 4. Schematische Darstellung eines mehrfach verzweigten Linkers mit 9 Methylcytosinspezifischen Proteinen an einem AFM-Cantilever, an methylierte DNA gebunden. Die ssDNA am Gen-Chip wirkt als Anker für die Analyten-DNA.

Fig. 5. Schematische Darstellung eines SMFS-Aufbaus, worin ein Polynukleotid-Analyt an der Sondenspitze immobilisiert ist und eine Vielzahl von Methylcytosin-spezifischen Antikörper-Fragmenten am Träger über eine Lipid-Membran immobilisiert ist.

Fig. 6. Schematische Darstellung eines SMFS-Aufbaus, wobei ein verzweigter Linker vier Methylcytosin-spezifische Antikörper-Fragmente an die Sondenspitze bindet und der Polynukleotid-Analyt am Träger immobilisiert ist.

Beispiele:

Kraft-Spektroskopie-Messungen unter Verwendung von mit anti-Methylcytosin-Antikörper angebundenen Cantilever an Einzelstrang-DNA mit Methylcytosinen, die an Aldehyd-Glas konjugiert sind, zeigte, dass zwei Fab-Domänen des Antikörpers an zwei Methylcytosine in der DNA binden konnten. Ziehen an der Fc-Domäne trennte die Fab-Domänen eine nach der anderen von der DNA mit einem Abstand, der mit der Kontur-Länge von Nukleotiden zwischen zwei Methylcytosinen identisch war. Das System wirkt wie ein flexibler molekularer Tastzirkel („callipers“), der den Abstand zwischen zwei bestimmten Basen messen kann.

Beispiel 1. DNA-Proben

Drei ssDNA-Proben wurden untersucht. Die erste hat neun Methylcytosine, getrennt durch sechs Nukleotide, die zweite hat fünf Methylcytosine, getrennt durch vier Nukleotide, während die dritte sechs Methylcytosine mit unterschiedlichen Abständen hat. Die Sequenz der DNA (5'-3') ist: AXT AT GTXT ATGTXT AT GTXT AT GTXTAT GTXTATGTXTAT GTXTAT GTXA (synthetisiert von Metabion) für die erste Probe, ATXGATXGATXGATXGATXGTCCAGGAGCGCCC (VBC-Genomics) für die zweite, AT GTXTTXT AT GAT GXXT AT G ATGXTGXTG ATG AT GAT G (Metabion) für die dritte, wobei X Methylcytosin ist und das 3'-Ende der DNA mit einer Aminogruppe modifiziert ist, die an eine Aldehyd-Gruppe auf einem Glas-Träger gekoppelt werden kann.

Beispiel 2. Verfahren zur Konjugation von DNA an Aldehyd-Glas

Die DNA wurde auf eine Konzentration von 50 μΜ in SSC-Puffer (150mM NaCI, 15 mM Tri-natriumcitrat, pH 7) mit 2,5% Glycerin verdünnt. Natriumcyanoborhydrid wurde zur DNA-Lösung mit einer Konzentration von 10 mM zugegeben. Die DNA-Lösung wurde auf das Aldehyd-Glas ge"spottet" und in einer Feuchtigkeitskammer mit einer Argon-Atmosphäre 6 Stunden lang inkubiert. Die nicht umgesetzten Aldehyd-Gruppen auf dem Glas wurden durch Zugabe von Tris 8 AT 503 189 B1 in die Reaktionslösung mit einer Konzentration von 50 mM inaktiviert. Nach 30 min wurde die Probe mit 100 mM NaHC03 (pH 8,2), 0,1% SDS in 2xSSC (pH 7) bzw. 0,1% SDS in 0,2xSSC (pH 7) gewaschen, mit Wasser gespült und in Argon gelagert. Gemäß den Fluoreszenz-Daten war die Oberflächendichte der konjugierten DNA auf dem Aldehyd-Glas etwa 200 Molekü- le/pm2.

Beispiel 3. Verfahren zum Konjugieren von Antikörper durch seinen Lysin-Rest an eine Cantilever-Spitze

Anti-Methylcytosin-Antikörper (Serotec) wurde auf die Cantilever (Thermomikroskope, beschichtete spitze Microlever)-Spitze durch die Reaktion zwischen etwas Lysin-Rest am Antikörper und einer Aldehyd-Gruppe eines Cantilever-gebundenen Polyethylenglykol-(PEG)-Crosslinkers konjugiert. Für diese Umsetzung wurde der Antikörper in einem Puffer A (100 mM NaCI, 50 mM NaH2P04, 1 mM EDTA, pH 7,5) auf eine Konzentration von 0,2 mg/ml verdünnt. Natriumcyano-borhydrid wurde zur Antikörperlösung wie oben beschrieben zugegeben. Die Cantilever-Spitze wurde 1 Stunde lang in die Antikörperlösung eingetaucht. Nach der Inkubation wurden die nicht umgesetzten Aldehyd-Gruppen an der Cantilever-Spitze durch Zugabe von Ethanolamin in die Reaktionslösung mit einer Konzentration von 50 mM inaktiviert. Nach 30 min wurde der Cantilever mit Puffer A gewaschen. Die auf diese Weise präparierten Cantilever-Spitzen wurden verwendet, um die DNA-Probe mit 9 oder 5 Methylcytosinen zu messen (Fig. 2 im Bericht).

Beispiel 4. Verfahren zum Konjugieren von Antikörper durch seinen Kohlehydrat-Rest an eine Cantilever-Spitze 10 μΙ 1 mg/ml Antimethylcytosin-Antikörper (Serotec) wurden mit einem Mini-Dialyseschlauch (Pierce) gegen 800 ml 100 mM Natriumacetat (pH 5,5) bei 4°C 8 Stunden lang und gegen die zweiten 800 ml 100 mM Natriumacetat (pH 5,5) bei 4°C 12 Stunden lang dialysiert. Die Antikörperlösung (etwas mehr als 60 pl) wurde aus dem Dialyseschlauch in ein 0,5 ml-Röhrchen gesammelt. 6 μΙ 100 mM Nal04 (in Wasser frisch zubereitet) und 3 μΙ 300 mM SPDP-Hydrazid (Molecular Bioscience) in DMSO wurden auf die Antikörperlösung aufgetragen. Die Umsetzung wurde 80 min lang bei 4°C im Dunkeln gehalten und danach 10 min lang mit 6 μΙ 5% Glycerin in Wasser gequencht. Danach wurden 7,5 μΙ 0,5M DTT 10 min lang aufgebracht, um das Disulfid zu spalten. Die Lösung wurde in denselben Mini-Dialyseschlauch transferiert und 9,5 Stunden lang bei 0°C unter Argon-Schutz gegen 500 ml Puffer A dialysiert. Danach wurde die Dialyse 14,5 Stunden lang in reinem Puffer A fortgesetzt. Etwa 130 μΙ Antikörperlösung wurden aus dem Dialyseschlauch gesammelt. Nun hat der Antikörper eine reaktive Thiol-Gruppe am Ende seines Kohlehydrat-Rests an der Fc-Domäne. Die Kupplung zwischen Antikörpern und Cantilever-Spitzen mit PEG-PDP erfolgte 1 Stunde lang unter Argon-Schutz bei Raumtemperatur und danach 20 Stunden lang bei 4°C. Danach wurden die Cantilever in Puffer A gewaschen. Auf diese Weise präparierte Cantilever-Spitzen wurden verwendet, um die DNA-Probe mit 6 Methylcytosinen zu messen (Fig. 3).

Beispiel 5. Rasterkraftmikroskopie (AFM) AFM-Cantilever-Spitzen mit durch Lysin-Rest konjugiertem Antikörper wurden zur Messung in Fig. 2 verwendet, wogegen Cantilever-Spitzen mit durch Kohlehydrat-Rest konjugiertem Antikörper als Linker zur Messung in Fig. 3 verwendet wurden.

Die Kraft-Spektroskopie wurde mit einem Rasterkraftmikroskop (Molecular Imaging) in PBS (150 mM NaCI, 5 mM Na2HP04, pH 7,5) durchgeführt, enthaltend 30 pg/ml Lysolecithin (Sigma), welches verwendet wurde, um die unspezifische Bindung zwischen dem Antikörper und der Glas-Oberfläche (16) zu verhindern. Die Feder-Konstante von Cantilever liegt im Bereich von 0,01 bis 0,03 N/m. Der Scan-Bereich für die Kraft-Abstand-Kurvenmessung wurde auf 200 nm fixiert, während die Zyklus-Zeit 0,25-4s war. Die Menge der Daten-Punkte für einen Zyklus ist 1000 für Fig. 2 und 2000 für Fig. 3. 9 AT503 189 B1

Die Losbindungskraft zwischen Methylcytosin und seinem Antikörper wurde als 58±13 pN bei einer Kraft-Ladegeschwindigkeit von 2 nN/s gemessen. Einige der Kraft-Abstand-Kurven zeigen nur ein Losbindungs-Ereignis, während einige Kurven zwei enthalten. Von 17 Cantilever ist der durchschnittliche Prozentsatz der Kurven, die zwei Losbindungs-Ereignisse enthalten, 2±1%. Der Prozentsatz der Kurven, die ein Losbindungs-Ereignis enthalten, ist typischerweise 33%. Einige Beispiel-Kurven mit zwei Losbindungs-Peaks sind in Fig. 2 gezeigt. Die Pfeile zeigen die Position von Losbindungs-Ereignissen an. Die Kurven in Fig. 2A stammen von Messungen an der ersten DNA-Probe, wogegen die Kurven in Fig. 2B von der zweiten Probe stammen. Die Skizze neben der Kurve veranschaulicht die mögliche Bindungs-Position von Antikörper an DNA. Bei der ssDNA ist die Kontur-Länge eines Nukleotids 0,59 nm für die C3-endo-Struktur, oder 0,70 nm für die C2-endo-Struktur (20). Da die erste DNA-Probe neun Methylcytosine mit der Trennung von 6 Nukleotiden hat, kann der gemessene Abstand zwischen zwei Methylcyto-sinen im Bereich von 3,5 nm bis 33,6 nm liegen. Aus 150 Kurven mit zwei Losbindungs-Ereignissen wird die statistische Verteilung des gemessenen Abstands zwischen zwei Losbindungs-Ereignissen in Fig. 2C erhalten. Es gibt 6 Peaks in der Verteilung, deren Position in Tabelle 1 angeführt ist. Aus der Peak-Position wurde die Kontur-Länge des einzelnen Nukleotids berechnet. Für 9 Methylcytosine sollten theoretisch 8 Peaks in der Verteilung sein. Nur 6 Peaks wurden im Versuch erhalten. Methylcytosine mit kürzerem Abstand könnten für zwei Fab-Domänen leichter zusammenbindbar sein. Sie haben eine größere Wahrscheinlichkeit auch einfach infolge einer größeren Anzahl der Paarung, z.B. haben zwei Methylcytosine mit einem Abstand von 6 Nukleotiden 8 Paare in der DNA, wogegen sie mit einem Abstand von 12 Nukleotiden nur 7 Paare haben, usw. Die berechnete durchschnittliche Konturlänge des einzelnen Nukleotids ist 0,59 nm bis 0,65 nm, was im angemessenen Vorhersagebereich liegt.

Die zweite DNA-Probe hat 5 Methylcytosine, getrennt durch 4 Nukleotide. Fig. 2D zeigt das statistische Resultat von Daten aus 259 Kurven mit zwei Losbindungs-Ereignissen, gemessen von 4 Cantilever-Spitzen. Die Position von Peak 2, 3 und 4 stimmt gut mit der Kontur-Länge von Nukleotiden zwischen Methylcytosinen überein. Aus der Position des ersten Peaks wurde jedoch die durchschnittliche Kontur-Länge eines Nukleotids als 0,88 nm berechnet, was viel länger ist als die Kontur-Länge eines C2-endo-Nukleotids. Die abnorm größere Länge könnte dadurch bewirkt sein, dass die Fab-Domäne des Antikörpers eine bestimmte Breite hat, so dass für die beiden Antigen-Bindungsstellen des Antikörpers, wenn sie nahe kommen, ein Mindest-abstand-Limit bestehen könnte. Die maximale Kontur-Länge von vier gestreckten Nukleotiden ist nur 2,8 nm. Jedoch ist die Ausrichtung von Cytosinen frei drehbar. Die Molecular Modelling-und Analyse-Software (Cs Chem3D pro, CambridgeSoft) zeigt, dass der Abstand zwischen zwei Methylgruppen, die durch vier Nukleotide getrennt sind, mehr als 4 nm sein kann, was groß genug sein könnte, damit zwei Antigen-Bindungsstellen des Antikörpers binden. Wenn der Antikörper von der DNA gezogen wird, werden das untere Methylcytosin und die Fab-Domäne so gezogen, dass sie sich der Ausrichtung der Zugkraft-Richtung annähern. Bevor dies jedoch erreicht wird, hat der Abstand zwischen zwei Antigen-Bindungsstellen des Antikörpers bereits das Minimum erreicht, so dass sich die untere Fab-Domäne vom Methylcytosin lösen muss, bevor sie die Ausrichtung der Zugkraft erreicht. Somit misst der Abstand zwischen zwei Losbindungs-Ereignissen in diesem Fall das Mindestabstands-Limit von zwei Epitopen des Antikörpers, was durch die Position des ersten Peaks in Fig. 2 D veranschaulicht ist.

Die dritte DNA-Probe hat 6 Methylcytosine, getrennt durch 3, 8, 1, 8 und 3 Nukleotide. Daher kann der Abstand zwischen Methylcytosinen 1, 3, 8, 9, 11, 12, 17, 20 oder 23 Nukleotide sein. Die Kraft-Kurven-Messungen zeigen, dass der Abstand zwischen zwei Losbindungs-Ereignissen eine Verteilung mit acht Peaks hat (Fig. 3, aus 298 Kraft-Abstand-Kurven mit zwei Losbindungs-Ereignissen, gemessen mit einer Cantilever-Spitze), deren Position gut mit der Kontur-Länge von Nukleotiden übereinstimmt (Tabelle 1), außer der Position von Peak 1, die dem Fall der zweiten DNA-Probe ähnlich ist. Zwei Methylcytosine, getrennt durch ein einziges Nukleotid, können aus der Kraft-Abstand-Kurve nicht direkt nachgewiesen werden. Aus der statistischen Verteilung kann jedoch der Abstand von 8 oder 11 Nukleotiden von 9 oder 12 Nukleotiden unterschieden werden, was die Einzel-Nukleotid-Auflösung dieses Verfahrens 1 0 AT 503 189 B1 beweist.

Tabelle 1. Peak-Position in Fig. 2 und 3 und durchschnittliche Kontur-Länge des Nukleotids

Peak Nr. Peak-Position (nm) Menge des Nukleotids Durchschnittliche Kontur-Länge des Nukleotids (nm) Fig. 2C 1 3,9 6 0,65 2 7,6 12 0,63 3 10,9 18 0,61 4 14,8 24 0,62 5 17,8 30 0,59 6 21,4 36 0,59 Fig. 2D 1 3,5 4 0,88 2 5,5 8 0,69 3 7,7 12 0,64 4 9,9 16 0,62 Fig. 3 1 3,5 3 1,17 2 4,8 8 0,60 3 5,6 9 0,62 4 6,8 11 0,62 5 7,8 12 0,65 6 9,7 17 0,57 7 11,5 20 0,57 8 13,6 23 0,59

Schließlich wurden die Abstand-Informationen von Methylcytosinen in ssDNA unter Verwendung der Antikörper-angebundenen Cantilever-Spitzen in einer Kraft-Spektroskopie erhalten. Die bei dieser Untersuchung entwickelte Methode ist weiters anwendbar, um Sequenz-Informationen bei DNA zu erhalten. Der Antikörper kann als ein 1:2-Crosslinker angesehen werden. Für die Sequenzierung kann man einen 1:N-Crosslinker (Fig. 4) verwenden. Am Ende jedes Crosslinkers kann ein Einzelketten-variables Fragment (single Chain variable fragment, scFv) oder ein Fab-Fragment eines anti-Methylcytosin-Antikörpers konjugiert sein. Die Cantilever-Spitze kann mit Hilfe eines Fluoreszenz-Mikroskops oder eines Rasterkraftmikroskops mit einer Erkennungs-Bildgebungs-Funktion („recognition imaging function“) (28, 29) zum spezifischen Spot bewegt werden. Daher kann die Sequenz-Information direkt auf Gen-Chips mit Einzelmolekül-Empfindlichkeit erhalten werden.

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Claims (27)

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35. Xiong et al., Nuc Ac Res 25(12) 2532-2534 (1997) Patentansprüche: 1. Verfahren zur Detektion von 5-Methylcytosin, dadurch gekennzeichnet, dass jeweils ein Bindungspartner eines 5-Methylcytosin-spezifischen Bindungspaares, bestehend aus einem 5-Methylcytosin-spezifischem Bindungs-Teil und einem 5-Methylcytosin enthaltenden Nukleotid-Analyt, an der Spitze einer Einzelmolekül-Kraftspektroskopie („single molecule force spectroscopy“, SMFS)-Sonde, der jeweils andere Teil des Paares an einem Träger befestigt wird, wobei die SMFS-Sonde in Kontakt mit dem Träger gebracht und losgelöst wird und die Loslösekraft durch ein SMFS-Detektionsmittel gemessen wird, und zwei oder mehr 5-Methylcytosin-spezifische Bindungs-Teile vorgesehen sind, die zwei oder mehr 5-Methylcytosine binden können. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die SMFS eine Rasterkraftmik-roskopie (atomic force microscopy, AFM) ist, wobei vorzugsweise das Detektionsmittel ein Laser-Ablenkungsmittel ist. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die SMFS ein Optikpinzetten-Verfahren ist. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die SMFS-Sonde und der Träger einen Kraftapparat bilden. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die SMFS ein Biomembran-Kraft-Sonden-Verfahren ist. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der 5-Methyl-cytosin-spezifische Bindungs-Teil ein - gegebenenfalls modifizierter - 5-Methylcytosin- 1 2 AT 503 189 B1 spezifischer Antikörper oder ein Antikörper-Fragment ist, vorzugsweise ein Fab-, Fab'- oder scFv-Fragment. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der 5-Methyl-cytosin-spezifische Bindungs-Teil an die SMFS-Sonde gebunden ist, vorzugsweise mit einem Linker, am meisten bevorzugt mit einem Glykosid-Linker. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ein Glas-Träger, vorzugsweise ein Aldehyd-Glas-Träger, ist. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Nukleo-tid-Analyt in Spots am Träger immobilisiert wird. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Nukleo-tid-Analyt am Träger vor der SMFS-Messung mit einem Fluoreszenz-spezifischen 5-Methylcytosin-Test analysiert wird. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass mehr als ein Nukleotid-Analyt-Spot am Träger ist und die SMFS-Messung für die Spots ausgeführt wird, die im Fluoreszenz-Test 5-Methyl-Cytosin-positiv waren. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass ein SMFS-Kraft-Profil der Loslösekraft gemessen wird, wobei vorzugsweise der Nukleotid-Analyt zwei oder mehr 5-Methyl-Cytosin pro Molekül aufweist. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass durch ein gemessenes SMFS-Kraft-Profil der Kontaktierung und der Loslösung von der SMFS-Sonde der Abstand der zwei oder mehr 5-Methylcytosine am Nukleotid-Analyten detektiert wird. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Nukleotid-Analyt ein Polynukleotid ist, das an die SMFS-Sonde oder den Träger durch Basen-Paarung mit einem Oligonukleotid, welches an der SMFS-Sonde oder am Träger immobilisiert ist, gebunden ist. 15. Einzelmolekül-Kraftmikroskopie (SMFS)-Sonde, umfassend zwei oder mehr 5-Methyl-cytosin-spezifische Bindungs-Teile, die an der SMFS-Sonde, vorzugsweise durch einen Linker-Teil, befestigt sind. 16. SMFS-Sonde nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der 5-Methylcytosin-spezifische Bindungs-Teil durch einen Linker an der SMFS-Sonde befestigt ist. 17. SMFS-Sonde nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker der Fc-Teil eines Antikörpers oder ein polyvalenter Crosslinker ist. 18. SMFS-Sonde nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass die SMFS-Sonde eine AFM-Sonde, vorzugsweise ein mit einer Spitze versehener Cantilever, ist. 19. SMFS-Vorrichtung, umfassend eine SMFS-Sonde nach einem der Ansprüche 15 bis 18 und einen Träger, der vorzugsweise ein Chip ist. Hiezu 4 Blatt Zeichnungen