AT503189A1

AT503189A1 - Methode zur 5-methylcytosin-detektion

Info

Publication number: AT503189A1
Application number: AT0017006A
Authority: AT
Original assignee: Univ Linz
Priority date: 2006-02-03
Filing date: 2006-02-03
Publication date: 2007-08-15
Also published as: WO2007087653A1; AT503189B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Detektion und Messung von methylierten Poly- oder Oligonukleotiden.
Die DNA-Methylierung spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Gen-Expression (1) , welche eine starke Auswirkung auf die Gewebsentwicklung (2), die Alterung (3-4) und einige Krankheiten (5-7) hat. Bei vielen Krebsarten gibt es eine Korrelation mit einer abnormalen DNA-Methylierung, einschliesslich einer Genom-weiten Hypo ethylierung (8) und einer Stellen-spezifischen Hypermethylierung (9), die einige Krebs-Suppressor-Gene oder DNA-Reparatur-Gene ausschaltet.

Daher ist die Detektion des Methylierungsmusters von Gen-Promotoren für die Diagnose und die Grundlagenforschung von grosser Bedeutung (10-12).
Zu den bekannten Techniken zählen das Restriktions-"Landmark^-Genom-Scanning, die Repräsentative Differenz-Analyse ("representational difference analysis"), die ethylierungssensitive willkürlich geprimte PCR ("methylation-sensitive arbitrarily primed PCR") und die Amplifikation methylierter CpG-Inseln ("methylated CpG islands amplification") , COBRA (35) und MethyLight (11-12) . Derzeitige Techniken auf Chip-Basis, wie die MethyLight (12) -Technik beruhen auf der PCR und ergeben infolge von Kreuzreaktivitäten keine Hochauflösungs-Methylierungs-Information ("high-resolution methylation Information") und zielen nur auf ein relativ geringfügiges Vorherrschen von DNA-Methylierungsmustern ab.

Der methylierungssensitive Restriktionsenzym-Verdau, gefolgt von PCR, ist für falsch-positive Ergebnisse anfällig, da selbst geringe Mengen eines falschen unvollständigen Verdaus in spaltungsresistenten DNA-Abschnitten zu einem PCR-Produkt führen können. Andere Probleme, wie unvollständiges Schneiden, normale Zeil-Kontamination und der Bedarf an beträchtlichen Mengen an DNA zur Analyse sind weitere Nachteile. Das unsachgemässe Designen von PCR-Primern, die an jede Methylierungsstelle (von beispielsweise 50 Millionen CpG-Stellen im humanen Haploid-Genom) angepasst werden müssen, kann auch zu einer falsch positiven m<5>CIdentifizierung bei der Bisulfit-Methode führen, worin Cytosin in Uracil übergeführt wird, und m<5>C nicht-reaktiv bleibt (11) .

Das Bisulfit-Verfahren erfordert auch eine DNA-Behandlung bei einem sauren pH-Wert (¯p H5) über eine lange Zeit, was zu apurinen Stellen führen kann.
Verfahren auf PCR-Basis haben auch den Nachteil von verzerrten PCR-Amplifikations-Produkten ("biased PCR amplification

<EMI ID=2.1>
HT RNA (23-24); Zellen (25) usw., unter Verwendung der Rasterkraftmikroskopie ("atomic force microscopy", AFM) , Laserpinzette ("laser tweezers"), optischer Fallen ("optical traps") oder Biomembram-Kraft-Sonde ("biomembrane force probe") (26, 27) .

Die Kraftmessungen können die Wechselwirkung quantifizieren und weitere Informationen liefern, wie die Dissoziationsrate, Energielandschaft ("energy landscape") , Konturlänge, Persistenz-Länge und strukturelle Informationen, jedoch wurden Antikörper bisher noch nicht bei SMFS- oder AFM-Techniken zur Analyse von Nukleinsäuren, insbesondere der Methylierung von Nukleinsäuren, oder umgekehrt, verwendet.
Die 5-Methylcytosin-spezifischen Bindungs-Teile sind vorzugsweise 5-Methylcytosin-spezifische Antikörper, die im Allgemeinen im Stand der Technik bekannt und derzeit bei FluoreszenzTests zur Detektion von ethylierter DNA (30-32, WO 2004/104582) verwendet werden und im Handel erhältlich sind (beispielsweise von Serotec) . 5-Methylcytosin (m<5>C) wird auch einfach als Methylcytosin bezeichnet und ist in biologischer, methylierter DNA vorhanden.

Der 5-Methylcytosin-spezifische Bindungs-Teil ist im Allgemeinen auch für 5-Methylcytosidin spezifisch (z.B. der von Serotec entwickelte Antikörper) . Beispielsweise wurde der Antikörper-Klon 33D3 von Serotec entwickelt, um zwischen der modifizierten Base m<5>C und dem normalen Gegenstück Cytosin zu unterscheiden. Antikörper können sowohl von monoklonalen als auch von polyklonalen Stammlösungen erhalten werden, vorzugsweise nach einer Immunaffinitäts-Selektion für eine Optimierung. Für die vorliegende Erfindung kann jeder (jedes) 5-Methylcytosin-spezifische Antikörper oder Antikörper-Fragment verwendet werden, vorzugsweise Fab- (Antigen-bindendes Fragment), Fab ' oder scFv- ( Single chain variable fragment) -Fragmente .

Es kann auch die für die Antigenbindung bestimmende Region alleine, die für 5-Methylcytosin spezifisch ist (vorzugsweise in einer geeigneten Gerüst-Verankerung ("scaffold anchoring")) verwendet werden. Diese Fragmente können mittels allgemeiner rekombinanter Techniken, Protein-Engineering erzeugt werden oder käuflich erworben werden.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist die SMFS eine Rasterkraftmikroskopie (AFM) , wobei vorzugsweise das Detektionsmittel ein Laser-Ablenkungsmittel, am meisten bevorzugt, ein Cantilever ist. Beispielsweise wird ein Laser vom Cantilever abgelenkt, und die Reflexion ist gegenüber einer geringen Positionsveränderung empfindlich, die von einer molekularen Wechselwirkung zwischen den an der Sonde und den am Träger befestigten Molekülen bewirkt wird.

Vorzugsweise ist die AFM ein Kontakt- oder ein dynamisches Kraftmikroskopie ("dynamic force microscopy", DFM) -Verfahren, wobei die Sondenspitze über dem Probenträger hin- und herbewegt wird.
Eine andere bevorzugte SMFS ist das Optikpinzetten-Verfahren, auch Laserpinzette oder optische Fallen-Methode genannt. Für diese Spektroskopie wird der Träger in Form eines Kügelchens in eine optische Falle gebracht. Durch Kontaktieren des Trägers mit der Sonde werden die Kräfte zwischen den befestigten Molekülen am Träger und an der Sonde über die Fallen-Konstante (33) gemessen.

Sowohl Standard-AFM als auch optische Pinzette sind für die Detektion der Wechselwirkung der an der Sonde und am Träger befestigten Teile besonders bevorzugt. Über beide Techniken wird in (34) ein gründlicher Überblick gegeben und sie können für die vorliegende Erfindung routinemässig adaptiert werden.
Eine andere bevorzugte SMFS-Technik ist die Verwendung eines Kraftapparates ("force apparatus") . Hier sind die SMFS-Sonde und der Träger einander gegenüberliegende Oberflächen, die jeweils mehrere Moleküle von entweder dem Analyten oder vom 5-Methylcytosin-spezifischen Bindungs-Teil an der entsprechenden Oberfläche befestigt haben. Die Wechselwirkung und die Loslösungskräfte werden mittels Standard-Techniken, z.B. Laser-Ablenkung, gemessen.
Ein weiteres SMFS-Verfahren ist das Biomembran-Kraft-SondenVerfahren.

Bei diesem Verfahren ist die Sonde eine Biomembran, z.B. von einem Erythrozyten oder ein ganzer Erythrozyt, welcher als Feder-Cantilever ähnlich der Standard-AFM verwendet wird (26, 27) .
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der 5-Methylcytosin-spezifische Bindungs-Teil an die SMFS-Sonde gebunden, vorzugsweise durch einen Linker, am meisten bevorzugt, durch einen Glycosid-Linker . Im Falle eines Antikörpers ist der Linker beispielsweise der Fc-Teil des Antikörpers, der gebunden sein kann, beispielsweise durch seine Lysin-Reste oder durch seine Glycosylierungs-Strukturen. Die Immobilisierung über Glycosylierungs-Strukturen ist besonders bevorzugt, da dadurch eine optimale räumliche Symmetrie und Flexibilität erreicht werden.

T Andere chemische oder biologische Linker können ebenso zur Immobilisierung des 5-Methylcytosin-spezifischen Bindungs-Teils verwendet werden, wobei die Linker-Moleküle verzweigt, länglich ("prolate") oder kugelförmig sein können. Insbesondere bevorzugt ist ein Linker mit gut definierter Verzweigung, z.B. zwei- oder dreizweigige Linker. Solche Linker können auch hintereinander verwendet werden, das zu mehrfachen definierten Verzweigungen führt, z.B. 4-fach oder 9-fach oder jegliche Kombination. An jedem Ende ist vorzugsweise ein 5-Methylcytosin-spezifischer Bindungs-Teil befestigt. Die Verzweigung ist vorzugsweise eine baumartige Verzweigung (Fig. 4 und 6) , die durch chemische Standard-Synthese, z.B. durch Amid-Bindung zwischen den sich verzweigenden Monomeren, erleichtert werden kann.
Der Träger ist vorzugsweise ein fester Träger, insbesondere ein Glas-Träger.

Vorzugsweise ist der Träger ein Aldehyd-GlasTräger. Aldehyd-Glas wird vorzugsweise zum Immobilisieren von Biomolekülen, wie Proteinen oder Nukleotiden, verwendet, die an einem Ende aminiert sein können. Die Nukleotid-Analyten können beispielsweise RNA oder DNA, doppel- oder einzelsträngig, sein und werden vorzugsweise vor der SMSF-Messung denaturiert. Die Denaturierung ist vorzugsweise eine chemische Denaturierung, z.B. unter Verwendung von Lysolecithin.
Vorzugsweise ist der Nukleotid-Analyt in Spots auf dem Träger immobilisiert. Dies ermöglicht eine systematische Messung von vielen Analyten auf einem Träger und dessen leichte Handhabung.
Weiters bevorzugt ist das Verfahren, bei welchem der Nukleotid-Analyt auf dem Träger - vor dem Kontaktieren und dem Loslösen mit der SMFS-Sonde - mit einem Fluoreszenz-spezifischen 5Methylcytosin-Test analysiert wird.

Mit diesem Verfahren wird zuerst, vor der zeitaufwändigen SMFS-Messung, eine raschere Screening-Technik angewandt. Nachdem das Vorhandensein von 5-Methylcytosin bestätigt worden ist, z.B. mittels Standard-Tests, liefert die SMFS-Messung weitere Informationen, wie die Bindungskräfte (und gegebenenfalls die Bindungslänge (n) ) der befestigten Moleküle. Kleine DNA-Abschnitte, die Basenpaare an zumindest einem Teil der Sequenz bilden, können durch die Zugkraft an der SMFS-Sonde entwirrt werden. Dieses Verhalten kann selektiv an Spots mit 5-Methylcytosin gemessen werden.

Daher befindet sich vorzugsweise mehr als ein Nukleotid-Analyten-Spot auf dem Träger und wird die SMFS-Messung für die Spots durchgeführt, die im Fluoreszenz-Test 5-Methylcytosin-positiv waren.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform verwendet das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung auch ein "Recognition Imaging" (28, 29) .
Am meisten bevorzugt weist die SMFS-Sonde zwei oder mehr 5Methylcytosin-spezifische Bindungs-Teile auf und kann zwei oder mehr 5-Methylcytosine am Nukleotid-Analyten binden. Zwei solche Teile, z.B. Antikörper-Fab-Teile, können zwei 5-Methylcytosine an einen Nukleotid-Analyten binden, welcher vorzugsweise ein Oligo- oder Polynukleotid-Molekül ist. Durch das RasterkraftProfil ist es mit der SMFS möglich, den Abstand dieser (mindestens) zwei 5-Methylcytosine zu messen.

Daher sieht die vorliegende Erfindung auch das Verfahren vor, bei welchem durch das gemessene SMFS-Kraft-Profil der Abstand der zwei oder mehr 5-Methylcytosine am Nukleotid-Analyten auf Einzel-Basen-Ebene detektiert wird.
Die Kraft-Spektroskopie wurde verwendet, um die Abstand-Information von Methylcytosinen bei Einzelstrang-DNA (singlestranded DNA, ssDNA) zu erhalten. Beispielsweise können zwei Fab-Domänen eines anti-Methylcytosin-Antikörpers zwei Methylcytosine in einer ssDNA binden. Wenn ein Ende der DNA an einem festen Träger fixiert ist und an der Fc-Domäne des Antikörpers gezogen wird, werden die Fab-Domänen von der DNA eine nach der anderen getrennt, mit einem Abstand gleich der Kontur-Länge von Nukleotiden zwischen zwei Methylcytosinen.

Auf diese Weise kann der Abstand zwischen Methylcytosinen in der DNA gemessen werden.
Vorzugsweise ist der Nukleotid-Analyt ein Polynukleotid, das an die SMFS-Sonde oder den Träger durch Basen-Paarung mit einem Oligonukleotid, welches an der SMFS-Sonde oder am Träger (woran der Nukleotid-Analyt befestigt werden soll) immobilisiert ist, gebunden ist; vorzugsweise ist die Basenpaarung durch ein Nukleotid-Interkalationsmittel verstärkt, welches vorzugsweise Psoralen ist. Der Nukleotid-Analyt kann ein Nukleinsäure-Molekül aus einer Probe eines Patienten sein, von welchem man vermutet, dass er eine Krankheit hat, die mit einer abnormen Methylierung (z.B. einer abnormen Methylierung der chromosomalen DNA) verbunden ist.

Der Nukleinsäure-Analyt kann auch eine Nukleinsäure mit einem oder mehreren 5-Methylcytosin-Resten sein (z.B. zum Analysieren des Methylierungsgrades und/oder zum Analysieren der Po sition der methylierten Reste innerhalb dieses Nukleinsäure-Moleküls) . Der Nukleinsäure-Analyt ist in den meisten Fällen DNA, vorzugsweise DNA, die aus biologischen Quellen extrahiert ist, insbesondere aus humanen Gewebeproben oder aus Proben humaner Körperflüssigkeiten (welche Zellen enthalten) . Der Analyt ist an der Sonde oder am Träger über ein kurzes Oligonukleotid, beispielsweise einen unspezifischen poly-T- oder poly-A-Abschnitt, befestigt. So befestigt, kann der Nukleotid-Analyt durch denaturierende Mittel leicht entfernt werden, und ein anderer Analyt kann wiederum am Oligonukleotid an der Sondenspitze oder am Träger befestigt werden.

Für kurze Nukleotide kann die Basenpaarung verstärkt werden, um während der Kontaktierungs- und LoslöseSchritte der SMFS-Messung eine Stabilität zu erzielen. Ein Verstärkungsmittel ist beispielsweise das Interkalationsmittel Psoralen, welches durch UV-Licht reaktiv aktiviert werden kann. Das Oligonukleotid wirkt als Linker am Nukleotid-Analyten mittels Doppelhelix-Bildung. Der Analyt kann vom Oligonukleotid nach der SMFS-Messung durch denaturierende Bedingungen, z.B. Spülen mit Wasser und Formamid, losgelöst werden.
In einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung auch eine Einzelmolekül-Kraftmikroskopie (SMFS) -Sonde vor, umfassend einen 5-Methylcytosin-spezifischen Bindungs-Teil, der an der SMFS-Sonde befestigt ist, vorzugsweise durch einen Linker-Teil. Der Linker ist beispielsweise der Fc-Teil eines Antikörpers oder ein polyvalenter Crosslinker.

Polyvalente Crosslinker zur (spezifischen) mehrfachen Molekülbefestigung sind im Allgemeinen im Stand der Technik bekannt und umfassen kleine Polymere, Glycoside und Amide.
Vorzugsweise umfasst die SMFS-Sonde zwei oder mehr 5-Methylcytosin-spezifische Bindungs-Teile. Wie oben erwähnt, hat dies den Vorteil, dass der Abstand zwischen Methylcytosinen gemessen werden kann. Vorzugsweise umfasst die Sonde 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder 9 5-Methylcytosin-spezifische Bindungs-Teile. Diese Teile sind vorzugsweise an der Sondenspitze durch einen (mehrzweigigen) Linker, wie oben erwähnt, befestigt.
Vorzugsweise ist die SMFS-Sonde eine AFM-Sonde, vorzugsweise ein mit einer Spitze versehener Cantilever.
Gemäss einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung auch eine SMFS-Vorrichtung, z.B.

Standard-AFM-Vorrichtung, mit einer SMFS-Sonde mit dem 5-Methylcytosin-spezifischen Bindungs Teil und einem Träger vor, vorzugsweise ist der Träger ein Chip. Der Chip hat am meisten bevorzugt viele Spots oder Stellen für die Immobilisierung von Nukleotid-Analyten. Der Chip ist austauschbar für eine automatisierte Messung von vielen Analyten, einschliesslich ein 5-Methylcytosin-Screening, z.B. mit Fluoreszenz-Methoden, und die SMFS-Messung an den 5-Methylcytosin-positiven Stellen zum Analysieren der Methylierungs-Eigenschaften, z.B. den Abständen zwischen 5-Methylcytosinen, aus welchen die 5-Methylcytosin-Dichte abgeleitet werden kann.

Der gemäss der vorliegenden Erfindung zu verwendende Chip ist vorzugsweise ein Chip, auf welchem Nukleinsäuren immobilisiert sind (oder immobilisierbar sind) , die eine wichtige Rolle bei der Methylierung spielen, z.B. humane Suppressor-Gene .
Die vorliegende Erfindung ist durch die folgenden Figuren und Beispiele weiter veranschaulicht, ohne auf diese eingeschränkt zu sein.
Figuren :
Fig. 1: Anti-Methylcytosin-Antikörper ist über PEG-Crosslinker an die Cantilever-Spitze konjugiert. ssDNA, die mehrere Methylcytosine enthält, ist an Aldehyd-Glas über eine Amino-Gruppe an ihrem 3' -Ende konjugiert. Zwei Fab-Domänen des Antikörpers können mit zwei Methylcytosinen der DNA binden.

Ziehen an den Fc-Domänen trennt zwei Fab-Domänen nacheinander von der DNA, was zwei Losbindungs-Peaks in der Kraft-Abstand-Kurve bewirkt, mit welcher der Abstand zwischen zwei Methylcytosinen gemessen werden kan .
Fig. 2. Beispiel Kraft-Abstand-Kurven mit zwei LosbindungsEreignissen, gemessen an der ersten DNA-Probe (mit 9 Methylcytosinen, getrennt durch 6 Nukleotide, Gruppe A) und der zweiten DNA-Probe (mit 5 Methylcytosinen, getrennt durch 4 Nukleotide, Gruppe B) sind mit Pfeilen gezeigt, die Positionen von Losbindungs-Ereignissen andeuten. Die Skizzen zeigen die mögliche Bindungsposition von Antikörper an DNA mit dem gemessenen Abstand zwischen zwei Losbindungs-Ereignissen. Rote Stäbe in den Skizzen sind Methylcytosine, wogegen blaue andere Nukleotide sind.

Die statistische Verteilung des gemessenen Abstandes zwischen zwei Losbindungs-Ereignissen von 150 Kraft-Abstand-Kurven von der ersten DNA-Probe (C) und von 259 Kurven von der zweiten DNA-Probe (D) zeigen quasi-äquidistante Peaks, deren Positionen in Tabelle 1 angeführt sind, die mit dem Abstand zwischen den durch Fab-Domänen gebundenen Methylcytosinen übereinstimmen.
Fig. 3. Die dritte DNA-Probe hat sechs Methylcytosine, getrennt durch 3, 8, 1, 8 und 3 Nukleotide. Der Abstand zwischen den Methylcytosinen kann 1, 3, 8, 9, 11, 12, 17, 20 oder 23 Nukleotide sein. Aus 298 Kraft-Abstand-Kurven mit zwei LosbindungsEreignissen wird eine Abstandverteilung mit acht Peaks erhalten, entsprechend 3, 8, 9, 11, 12, 17, 20 bzw. 23 Nukleotiden.
Fig. 4.

Schematische Darstellung eines mehrfach verzweigten Linkers mit 9 Methylcytosin-spezifischen Proteinen an einem AFMCantilever, an methylierte DNA gebunden. Die ssDNA am Gen-Chip wirkt als Anker für die Analyten-DNA.
Fig. 5. Schematische Darstellung eines SMFS-Aufbaus, worin ein Polynukleotid-Analyt an der Sondenspitze immobilisiert ist und eine Vielzahl von Methylcytosin-spezifischen AntikörperFragmenten am Träger über eine Lipid-Membran immobilisiert ist.
Fig. 6.

Schematische Darstellung eines SMFS-Aufbaus, wobei ein verzweigter Linker vier Methylcytosin-spezifische Antikörper-Fragmente an die Sondenspitze bindet und der PolynukleotidAnalyt am Träger immobilisiert ist.
B e i s p i e l e :
Kraft-Spektroskopie-Messungen unter Verwendung von mit antiMethylcytosin-Antikörper angebundenen Cantilever an Einzelstrang-DNA mit Methylcytosinen, die an Aldehyd-Glas konjugiert sind, zeigte, dass zwei Fab-Domänen des Antikörpers an zwei Methylcytosine in der DNA binden konnten. Ziehen an der Fc-Domäne trennte die Fab-Domänen eine nach der anderen von der DNA mit einem Abstand, der mit der Kontur-Länge von Nukleotiden zwischen zwei Methylcytosinen identisch war. Das System wirkt wie ein flexibler molekularer Tastzirkel ("callipers" ) , der den Abstand zwischen zwei bestimmten Basen messen kann.
Beispiel 1.

DNA-Proben
Drei ssDNA-Proben wurden untersucht. Die erste hat neun Methylcytosine, getrennt durch sechs Nukleotide, die zweite hat fünf Methylcytosine, getrennt durch vier Nukleotide, während die dritte sechs Methylcytosine mit unterschiedlichen Abständen hat. Die Sequenz der DNA (5' -3') ist: AXTATGTXTATGTXTATGTXTATGTXTATGTXTATGTXTATGTXTATGTXA (synthetisiert von Metabion) für die erste Probe, ATXGATXGATXGATXGATXGTCCAGGAGCGCCC (VBC-Genomics) für die zweite, ATGTXTTXTATGATGXXTATGATGXTGXTGATGATGATG (Metabion) für die dritte, wobei X Methylcytosin ist und das 3 ' -Ende der DNA mit einer Aminogruppe modifiziert ist, die an eine Aldehyd-Gruppe auf einem Glas-Träger gekoppelt werden kann.
Beispiel 2. Verfahren zur Konjugation von DNA an AldehydGlas
Die DNA wurde auf eine Konzentration von 50[mu]M in SSC-Puffer (150mM NaCI, 15mM Trinatriumcitrat, pH 7) mit 2,5% Glycerin verdünnt.

Natriumcyanoborhydrid wurde zur DNA-Lösung mit einer Konzentration von lOmM zugegeben. Die DNA-Lösung wurde auf das Aldehyd-Glas ge"spottet" und in einer Feuchtigkeitskammer mit einer Argon-Atmosphäre 6 Stunden lang inkubiert. Die nicht umgesetzten Aldehyd-Gruppen auf dem Glas wurden durch Zugabe von Tris in die Reaktionslösung mit einer Konzentration von 50mM inaktiviert. Nach 30 min wurde die Probe mit lOOmM NaHC03(pH 8,2), 0,1% SDS in 2xSSC (pH 7) bzw. 0,1% SDS in 0,2xSSC (pH 7) gewaschen, mit Wasser gespült und in Argon gelagert. Gemäss den Fluoreszenz-Daten war die Oberflächendichte der konjugierten DNA auf dem Aldehyd-Glas etwa 200 Moleküle/[mu]m<2>.
Beispiel 3.

Verfahren zum Konjugieren von Antikörper durch seinen Lysln-Rest an eine Cantilever- Spitze
Anti-Methylcytosin-Antikörper (Serotec) wurde auf die Cantilever (Thermomikroskope, beschichtete spitze Microlever) -Spitze durch die Reaktion zwischen etwas Lysin-Rest am Antikörper und einer Aldehyd-Gruppe eines Cantilever-gebundenen Polyethylenglykol- (PEG) -Crosslinkers konjugiert. Für diese Umsetzung wurde der Antikörper in einem Puffer A (lOOmM NaCI, 50mM NaH2P04, ImM EDTA, pH 7,5) auf eine Konzentration von 0,2 mg/ml verdünnt. Natriumcyanoborhydrid wurde zur Antikörperlösung wie oben beschrieben zugegeben. Die Cantilever-Spitze wurde 1 Stunde lang in die Antikörperlösung eingetaucht. Nach der Inkubation wurden die nicht umgesetzten Aldehyd-Gruppen an der Cantilever-Spitze durch Zugabe von Ethanolamin in die Reaktionslösung mit einer Konzentration von 50mM inaktiviert.

Nach 30 min wurde der Cantilever mit Puffer A gewaschen. Die auf diese Weise präparierten CantileverSpitzen wurden verwendet, um die DNA-Probe mit 9 oder 5 Methylcytosinen zu messen (Fig. 2 im Bericht) .
Beispiel 4. Verfahren zum Konjugieren von Antikörper durch seinen Kohlehydrat-Rest an eine Cantilever-Spitze
10 [mu]l 1 mg/ml Antimethylcytosin-Antikörper (Serotec) wurden mit einem Mini-Dialyseschlauch (Pierce) gegen 800 ml 100 mM Natriumacetat (pH 5,5) bei 4[deg.]C 8 Stunden lang und gegen die zwei ten 800 ml 100 mM Natriumacetat (pH 5,5) bei 4[deg.]C 12 Stunden lang dialysiert. Die Antikörperlösung (etwas mehr als 60 [mu]l) wurde aus dem Dialyseschlauch in ein 0,5 ml-Röhrchen gesammelt. 6 [mu]l lOOmM NaI04(in Wasser frisch zubereitet) und 3 [mu]l 300 mM SPDPHydrazid (Molecular Bioscience) in DMSO wurden auf die Antikörperlösung aufgetragen.

Die Umsetzung wurde 80 min lang bei 4[deg.]C im Dunkeln gehalten und danach 10 min lang mit 6 [mu]l 5% Glycerin in Wasser gequencht . Danach wurden 7,5 [mu]l 0,5M DTT 10 min lang aufgebracht, um das Disulfid zu spalten. Die Lösung wurde in denselben Mini-Dialyseschlauch transferiert und 9,5 Stunden lang bei 0[deg.]C unter Argon-Schutz gegen 500 ml Puffer A dialysiert. Danach wurde die Dialyse 14,5 Stunden lang in reinem Puffer A fortgesetzt. Etwa 130 [mu]l Antikörperlösung wurden aus dem Dialyseschlauch gesammelt. Nun hat der Antikörper eine reaktive Thiol-Gruppe am Ende seines Kohlehydrat-Rests an der Fc-Domäne. Die Kupplung zwischen Antikörpern und Cantilever-Spitzen mit PEG-PDP erfolgte 1 Stunde lang unter Argon-Schutz bei Raumtemperatur und danach 20 Stunden lang bei 4[deg.]C. Danach wurden die Cantilever in Puffer A gewaschen.

Auf diese Weise präparierte Cantilever-Spitzen wurden verwendet, um die DNA-Probe mit 6 Methylcytosinen zu messen (Fig. 3) .
Beispiel 5. Rasterkraftmikroskopie (AFM )
AFM-Cantilever-Spitzen mit durch Lysin-Rest konjugiertem Antikörper wurden zur Messung in Fig. 2 verwendet, wogegen Cantilever-Spitzen mit durch Kohlehydrat-Rest konjugiertem Antikörper als Linker zur Messung in Fig. 3 verwendet wurden.
Die Kraft-Spektroskopie wurde mit einem Rasterkraftmikroskop (Molecular Imaging) in PBS (150 mM NaCI, 5 mM Na2HP04, pH 7,5) durchgeführt, enthaltend 30 [mu]g/ml Lysolecithin (Sigma) , welches verwendet wurde, um die unspezifische Bindung zwischen dem Antikörper und der Glas-Oberfläche (16) zu verhindern. Die FederKonstante von Cantilever liegt im Bereich von 0,01 bis 0,03 N/m.

Der Scan-Bereich für die Kraft-Abstand-Kurvenmessung wurde auf 200nm fixiert, während die Zyklus-Zeit 0,25-4s war. Die Menge der Daten-Punkte für einen Zyklus ist 1000 für Fig. 2 und 2000 für Fig. 3.
Die Losbindungskraft zwischen Methylcytosin und seinem Antikörper wurde als 58+-13 pN bei einer Kraft-Ladegeschwindigkeit von 2 nN/s gemessen. Einige der Kraft-Abstand-Kurven zeigen nur ein Losbindungs-Ereignis, während einige Kurven zwei enthalten. Von 17 Cantilever ist der durchschnittliche Prozentsatz der Kurven, die zwei Losbindungs-Ereignisse enthalten, 2+1%. Der Prozentsatz der Kurven, die ein Losbindungs-Ereignis enthalten, ist typischerweise 33%. Einige Beispiel-Kurven mit zwei LosbindungsPeaks sind in Fig. 2 gezeigt. Die Pfeile zeigen die Position von Losbindungs-Ereignissen an.

Die Kurven in Fig. 2A stammen von Messungen an der ersten DNA-Probe, wogegen die Kurven in Fig. 2B von der zweiten Probe stammen. Die Skizze neben der Kurve veranschaulicht die mögliche Bindungs-Position von Antikörper an DNA. Bei der ssDNA ist die Kontur-Länge eines Nukleotids 0,59 nm für die C3-endo-Struktur, oder 0,70 nm für die C2-endo-Struktur (20) . Da die erste DNA-Probe neun Methylcytosine mit der Trennung von 6 Nukleotiden hat, kann der gemessene Abstand zwischen zwei Methylcytosinen im Bereich von 3,5 nm bis 33,6 nm liegen. Aus 150 Kurven mit zwei Losbindungs-Ereignissen wird die statistische Verteilung des gemessenen Abstands zwischen zwei Losbindungs-Ereignissen in Fig. 2C erhalten. Es gibt 6 Peaks in der Verteilung, deren Position in Tabelle 1 angeführt ist. Aus der Peak-Position wurde die Kontur-Länge des einzelnen Nukleotids berechnet.

Für 9 Methylcytosine sollten theoretisch 8 Peaks in der Verteilung sein. Nur 6 Peaks wurden im Versuch erhalten. Methylcytosine mit kürzerem Abstand könnten für zwei Fab-Domänen leichter zusammenbindbar sein. Sie haben eine grössere Wahrscheinlichkeit auch einfach infolge einer grösseren Anzahl der Paarung, z.B. haben zwei Methylcytosine mit einem Abstand von 6 Nukleotiden 8 Paare in der DNA, wogegen sie mit einem Abstand von 12 Nukleotiden nur 7 Paare haben, usw. Die berechnete durchschnittliche Konturlänge des einzelnen Nukleotids ist 0,59 nm bis 0,65 nm, was im angemessenen Vorhersagebereich liegt.
Die zweite DNA-Probe hat 5 Methylcytosine, getrennt durch 4 Nukleotide. Fig. 2D zeigt das statistische Resultat von Daten aus 259 Kurven mit zwei Losbindungs-Ereignissen, gemessen von 4 Cantilever-Spitzen.

Die Position von Peak 2, 3 und 4 stimmt gut mit der Kontur-Länge von Nukleotiden zwischen Methylcytosinen überein. Aus der Position des ersten Peaks wurde jedoch die durchschnittliche Kontur-Länge eines Nukleotids als 0,88 nm berechnet, was viel länger ist als die Kontur-Länge eines C2-endoNukleotids. Die abnorm grössere Länge könnte dadurch bewirkt sein, dass die Fab-Domäne des Antikörpers eine bestimmte Breite hat, so dass für die beiden Antigen-Bindungsstellen des Antikör pers, wenn sie nahe kommen, ein Mindestabstand-Limit bestehen könnte. Die maximale Kontur-Länge von vier gestreckten Nukleotiden ist nur 2,8 nm. Jedoch ist die Ausrichtung von Cytosinen frei drehbar.

Die Molecular Modelling- und Analyse-Software (Cs Chem3D pro, CambridgeSoft) zeigt, dass der Abstand zwischen zwei Methylgruppen, die durch vier Nukleotide getrennt sind, mehr als 4 nm sein kann, was gross genug sein könnte, damit zwei AntigenBindungsstellen des Antikörpers binden. Wenn der Antikörper von der DNA gezogen wird, werden das untere Methylcytosin und die Fab-Domäne so gezogen, dass sie sich der Ausrichtung der Zugkraft-Richtung annähern. Bevor dies jedoch erreicht wird, hat der Abstand zwischen zwei Antigen-Bindungsstellen des Antikörpers bereits das Minimum erreicht, so dass sich die untere FabDomäne vom Methylcytosin lösen muss, bevor sie die Ausrichtung der Zugkraft erreicht.

Somit misst der Abstand zwischen zwei Losbindungs-Ereignissen in diesem Fall das Mindestabstands-Limit von zwei Epitopen des Antikörpers, was durch die Position des ersten Peaks in Fig. 2 D veranschaulicht ist.
Die dritte DNA-Probe hat 6 Methylcytosine, getrennt durch 3, 8, 1, 8 und 3 Nukleotide. Daher kann der Abstand zwischen Methylcytosinen 1, 3, 8, 9, 11, 12, 17, 20 oder 23 Nukleotide sein. Die Kraft-Kurven-Messungen zeigen, dass der Abstand zwischen zwei Losbindungs-Ereignissen eine Verteilung mit acht Peaks hat (Fig. 3, aus 298 Kraft-Abstand-Kurven mit zwei Losbindungs-Ereignissen, gemessen mit einer Cantilever-Spitze) , deren Position gut mit der Kontur-Länge von Nukleotiden übereinstimmt (Tabelle 1), ausser der Position von Peak 1, die dem Fall der zweiten DNAProbe ähnlich ist.

Zwei Methylcytosine, getrennt durch ein einziges Nukleotid, können aus der Kraft-Abstand-Kurve nicht direkt nachgewiesen werden. Aus der statistischen Verteilung kann jedoch der Abstand von 8 oder 11 Nukleotiden von 9 oder 12 Nukleotiden unterschieden werden, was die Einzel-Nukleotid-Auflösung dieses Verfahrens beweist. Tabelle 1. Peak-Position in Fig Kontur-Länge des Nukleotids
2 und 3 und durchschnittliche
Peak Peak-Position Menge des Durchschnittliche KonturNr.

(nm) Nukleotids Länge des Nukleotids (nm)
Fig. 2C 1 3,9 6 0,65
2 7,6 12 0,63
3 10,9 18 0,61
4 14,8 24 0,62
5 17,8 30 0,59
6 21,4 36 0,59
Fig. 2D 1 3,5 4 0,88
2 5,5 8 0,69
3 7,7 12 0,64
4 9,9 16 0,62
Fig. 3 1 3,5 3 1,17
2 4,8 8 0,60
3 5,6 9 0,62
4 6,8 11 0,62
5 7,8 12 0,65
6 9,7 17 0,57
7 11,5 20 0,57
8 13,6 23 0,59
<EMI ID=14.1>

Schliesslich wurden die Abstand-Informationen von Methylcytosinen in ssDNA unter Verwendung der Antikörper-angebundenen Cantilever-Spitzen in einer Kraft-Spektroskopie erhalten. Die bei dieser Untersuchung entwickelte Methode ist weiters anwendbar, um Sequenz-Informationen bei DNA zu erhalten. Der Antikörper kann als ein 1 : 2-Crosslinker angesehen werden. Für die Sequenzierung kann man einen 1 :N-Crosslinker (Fig. 4) verwenden.

Am Ende jedes Crosslinkers kann ein Einzelketten-variables Fragment (single chain variable fragment, scFv) oder ein Fab-Fragment werden. eines anti-Methylcytosin-Antikörpers konjugiert sein. Die Cantilever-Spitze kann mit Hilfe eines Fluoreszenz-Mikroskops oder eines Rasterkraftmikroskops mit einer Erkennungs-BildgebungsFunktion ( "recognition imaging function" ) (28 , 29 ) zum spezifischen Spot bewegt "erden. Daher kann die Sequenz-Information direkt auf Gen-Chips mit Einzelmolekül-Empfindlichkeit erhalten
Literaturstellen :
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Claims

Patentansprüche :

1. Verfahren zur Detektion von 5-Methylcytosin, dadurch gekennzeichnet, dass entweder ein 5-Methylcytosin-spezifischer Bindungs-Teil oder ein Nukleotid-Analyt an der Spitze einer Einzelmolekül-Kraftspektroskopie ("single molecule force spectroscopy", SMFS) -Sonde befestigt wird, und das andere ausgewählt aus dem 5-Methylcytosin-spezifischen Bindungs-Teil oder dem Nukleotid-Analyten an einem Träger befestigt wird, wobei die SMFS-Sonde in Kontakt mit dem Träger gebracht und losgelöst wird und die Loslösekraft durch ein SMFS-Detektionsmittel gemessen wird, und die SMFS-Sonde zwei oder mehr 5-Methylcytosin-spezifische Bindungs-Teile aufweist und zwei oder mehr 5-Methylcytosine am Nukleotid-Analyten binden kann.

1 Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass . mehr als ein Nukleotid-Analyt-Spot am Träger ist und dxe SMFSMessung für die Spots ausgeführt wird, die im Fluoreszenz-Test 5-Methyl-Cytosin-positiv waren.

1. Verfahren zur Detektion von 5-Methylcytosin, dadurch gekennzeichnet, dass entweder ein 5-Methylcytosin-spezifischer Bindungs-Teil oder ein Nukleotid-Analyt an der Spitze einer Einzelmolekül-Kraftspektroskopie ("Single molecule force spectroscopy", SMFS) -Sonde befestigt wird, und das andere von dem 5Methylcytosin-spezifischen Bindungs-Teil oder dem Nukleotid-Analyten an einem Träger befestigt wird, wobei die SMFS-Sonde in Kontakt mit dem Träger gebracht und losgelöst wird und die Loslösekraft durch ein SMFS-Detektionsmittel gemessen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die SMFS eine Rasterkraftmikroskopie (atomic force microscopy, AFM) ist, wobei vorzugsweise das Detektionsmittel ein Laser-Ablenkungsmittel ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die SMFS ein Optikpinzetten-Verfahren ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die SMFS-Sonde und der Träger einen Kraftapparat bilden.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die SMFS ein Biomembran-Kraft-Sonden-Verfahren ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der 5-Methylcytosin-spezifische Bindungs-Teil ein - gegebenenfalls modifizierter - 5-Methylcytosin-spezifischer Antikörper oder ein Antikörper-Fragment ist, vorzugsweise ein Fab-, Fab'- oder scFv-Fragment .

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der 5-Methylcytosin-spezifische Bindungs-Teil an die SMFS-Sonde gebunden ist, vorzugsweise mit einem Linker, am meisten bevorzugt mit einem Glykosid-Linker .

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ein Glas-Träger, vorzugsweise ein Aldehyd-Glas-Träger, ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ein Glas-Träger, vorzugsweise ein Aldehyd-Glas-Träger, ist. 9 verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Nukleotid-Analyt in Spots am Träger immobillsiert wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Nukleotid-Analyt in Spots am Träger immobilisiert wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Nukleotid-Analyt am Träger vor der SMFSMessung mit einem Fluoreszenz-spezifischen 5-Methylcytosin-Test analysiert wird.

10 verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet,dass der Nukieotid-Analyt am Träger vor der S FSMessung mit einem Fluoreszenz-spezifischen 5-Methylcytos[iota]n-Test analysiert wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass mehr als ein Nukleotid-Analyt-Spot am Träger ist und die SMFSMessung für die Spots ausgeführt wird, die im Fluoreszenz-Test 5-Methyl-Cytosin-positiv waren.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass ein SMFS-Kraft-Profil der Loslösekraft gemessen wird, wobei vorzugsweise der Nukleotid-Analyt zwei oder mehr 5-Methyl-Cytosin pro Molekül aufweist.

12 Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die SMFS-Sonde zwei oder mehr 5-Methylcytosin-spezifische Bindungs-Teile aufweist und zwei oder mehr 5Methylcytosine am Nukleotid-Analyten binden kann.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass durch ein gemessenes SMFS-Kraft-Profil der Kontaktierung und der Loslösung von der SMFS-Sonde der Abstand der zwei oder mehr 5-Methylcytosine am Nukleotid-Analyten detektiert wird.

13 Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass durch ein gemessenes SMFS-Kraft-Profil der Kontaktierung und der Loslösung von der SMFS-Sonde der Abstand der zwei oder mehr 5Methylcytosine am Nukleotid-Analyten detektiert wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Nukleotid-Analyt ein Polynukleotid ist, das an die SMFS-Sonde oder den Träger durch Basen-Paarung mit einem Oligonukleotid, welches an der SMFS-Sonde oder am Träger immobilisiert ist, gebunden ist.

14 Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Nukleotid-Analyt ein Polynukleotxd xst, das an die SMFS-Sonde oder den Träger durch Basen-Paarung mxt einem Oligonukleotid, welches an der SMFS-Sonde oder am Träger immobilisiert ist, gebunden ist.

15. Einzelmolekül-Kraftmikroskopie (SMFS) -Sonde, umfassend zwei oder mehr 5-Methylcytosin-spezifische Bindungs-Teile, die an der SMFS-Sonde, vorzugsweise durch einen Linker-Teil, befestigt sind.

15 Einzelmolekül-Kraftmikroskopie (SMFS) -Sonde, umfassend einen 5-Methylcytosin-sPezifischen Bindungs-Teil, der an der SMFS-Sonde, vorzugsweise durch einen Linker-Teil, befestxgt xst.

16. SMFS-Sonde nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der 5-Methylcytosin-spezifische Bindungs-Teil durch einen Linker an der SMFS-Sonde befestigt ist.

16 SMFS-Sonde nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der 5-Methylcytosin-spezifische Bindungs-Teil durch einen Lxnker an der SMFS-Sonde befestigt ist, wobei der Linker vorzugswexse der Fc_Tei[iota] eines Antikörpers oder ein polyvalenter Crosslxnker ist.

17. SMFS-Sonde nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker der Fc-Teil eines Antikörpers oder ein polyvalenter Crosslinker ist.

17. SMFS-Sonde nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass die SMFS-Sonde zwei oder mehr 5-Methylcytosin-spezifische Bindungs-Teile aufweist.

18. SMFS-Sonde nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass die SMFS-Sonde eine AFM-Sonde, vorzugsweise ein mit einer Spitze versehener Cantilever, ist.

19. SMFS-Vorrichtung, umfassend eine SMFS-Sonde nach einem der Ansprüche 15 bis 18 und einen Träger, der vorzugsweise ein Chip ist.