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Querverweis(e) auf verwandte Anmeldungen
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Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der südafrikanischen provisorischen Patentanmeldung Nr.
2019/02511 , die am 23. April 2019 eingereicht wurde und die hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist.
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Technisches Gebiet der Erfindung
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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und ein System zum Visualisieren kolokalisierter Fluoreszenzsignale in einem Bild einer Probe, etwa einer biologischen Probe. Die Fluoreszenzsignale können für gewöhnlich durch Fluoreszenzmikroskopie erhalten werden.
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Hintergrund der Erfindung
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Fluoreszenzmikroskopie ist eine wichtige Triebfeder der modernen Biologie und Medizin. Die Bildgebung von Fluoreszenzsignalen wird für gewöhnlich in Biowissenschaften ausgeführt, um eine Lokalisation von Proteinen, Rezeptoren, Organellen, Zellen, usw. zu untersuchen. Forscher müssen häufig feststellen, ob sich zwei Moleküle von Interesse in demselben Bereich befinden (d. h., ob sie kolokalisiert sind). Kolokalisation kann als das Vorhandensein von zwei oder mehr unterschiedlichen Molekülen in nahen räumlichen Positionen in einer Probe definiert werden. Für gewöhnlich wird Kolokalisation als gemeinsame geometrische Verteilung von zwei Fluoreszenzfarbkanälen (auch als Signale bezeichnet) angesehen, die für gewöhnlich durch Fluoresziersonden erzeugt werden. Die Kolokalisationsbildgebung stellt wichtige Informationen bereit, die angeben, ob zwei Strukturen von Interesse zusammenhängen. Dies ist wichtig für das Verständnis von biologischen Prozessen und Zellfunktionen. Jedoch besteht das Ziel der Kolokalisationsbildgebung für gewöhnlich nicht nur darin, die räumliche Überlappung von zwei Farbkanälen zu betrachten, da dies auch eine zufällige Überlappung umfassen würde. Stattdessen ist es viel wichtiger, die Korrelation, oder die proportionale Überlappung, von zwei Farbkanälen in und zwischen Strukturen zu betrachten. Daher ist es für viele Kolokalisationsanwendungen wünschenswert, den Kolokalisationsgrad in der Probe genau zu quantifizieren, sowie die Position und Intensität davon eindeutig einzuschätzen. Ein gebräuchlicher Ansatz zum Quantifizieren einer Kolokalisation ist die Berechnung mehrerer Kolokalisationskennzahlen, von denen jede einen bestimmten Aspekt der Kolokalisation und eine Signalverteilung in der gesamten Probe hervorhebt. Unter diesen Kennzahlen sind einige der bekanntesten und verwendeten der Pearson-Korrelationskoeffizient (PCC, Pearson correlation coefficient), der Manders-Overlap-Koeffizient (MOC, Manders Overlap coefficient) und der Manders-Korrelationskoeffizient (MCC, Manders correlation coefficient). Obwohl diese Messwerte effektiv für den Vergleich von Kolokalisation zwischen Proben sind, insbesondere wenn diese mit einer Auswahl eines Bereichs von Interesse (ROI, region of interest) gekoppelt sind, eignen sie sich weniger dazu, räumliche Informationen zu vermitteln. Da Probenuntersuchungen häufig ein Verständnis darüber erfordern, wie sich ein Fluoreszenzsignal durch intrazelluläre Bereiche verteilt, ist ein weiterer häufig genutzter Ansatz in der Analyse von Kolokalisation der mittels Visualisierung. Dies wird häufig erreicht, indem zwei Fluoreszenzkanalbilder übereinander gelegt werden und Überlappungsbereiche beobachtet werden. Im Fall einer Rot- und Grün-Kanalkombination werden die überlappenden Bereiche beispielsweise gelb visualisiert. Obwohl dieser Ansatz einen schnellen Überblick über potenziell kolokalisierte Signale bereitstellt, hängt die Fähigkeit, derartige gelbe Bereiche zu beobachten, stark von der relativen Signalintensität jedes Kanals ab. Das ist problematisch, da die Intensitätsdynamiken selten über unterschiedliche, mittels Fluoreszenzmikroskopie erfasste Proben ähnlich sind. Ein weiterer gebräuchlicher Ansatz besteht darin, die kolokalisierte Signalverteilung mittels einer als einzelne Farbe (häufig weiß) direkt auf die Probe gelegte Binärmaske zu visualisieren. Bei diesem Visualisierungsansatz wird lediglich die Position der Kolokalisation visualisiert. Es wird kein oder nur ein begrenzter Hinweis auf die zugrundeliegenden Intensitäten, die die beobachtete Kolokalisation zur Folge haben, oder über das Ausmaß der Kolokalisation zwischen den Kanälen bereitgestellt. Ferner wird eine Visualisierung räumlicher Kolokalisation am häufigsten zweidimensional (2D) ausgeführt, und es wurden bisher lediglich eine begrenzte Forschungsarbeiten dahingehend unternommen, eine Visualisierung im dreidimensionalen (3D-) Raum zu ermöglichen.
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Mehrere bestehende Ansätze betrachten die räumliche Quantifizierung der Kolokalisationsinteraktion in einer Probe, wobei jeder dazu entworfen ist, einen bestimmten Aspekt der Kolokalisation hervorzuheben.
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Mit dem Ziel der Verbesserung der Identifizierung von kolokalisierten Strukturen auf einer subzellulären Ebene wurde ein Ansatz vorgeschlagen, der eine erweiterte Kolokalisationsvisualisierung unter Verwendung einer spezifisch entworfenen Dualkanal-Nachschlagtabelle (LUT, look-up table), die Fluoreszenzkanalvisualisierungen von Texas Red zu Magenta und Fluoresceinisothiocyanat (FITC) zu Cyan abbildet, verwendet. Rot wurde dazu verwendet, kolokalisierte Voxel anzuzeigen, die eine größere Intensität in dem Texas-Red-Kanal aufweisen, Grün wurde dafür verwendet, kolokalisierte Voxel anzuzeigen, die größere Intensitäten in dem FITC-Kanal aufweisen, und Gelb wurde dazu verwendet, wenn beide Intensitäten gleich waren. Auf diese Weise konnten die relativen Intensitäten der Fluoreszenzkanäle in dem kolokalisierten Voxel besser unterschieden werden.
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Aufbauend auf dieser Arbeit wurden zwei darauffolgende Verfahren zur Kolokalisationsvisualisierung vorgestellt, wobei jedes derselben den Vorteil hat, sich nicht auf die ausgeglichene Einfärbung von Zellen zu verlassen, um ähnliche Fluoreszenzsignalintensitäten in beiden Kanälen sicherzustellen. Diese Verfahren wurden als Kovarianzverfahren, was eine räumliche Darstellung von PCC ist, und Multiplikationsverfahren bezeichnet, was eine räumliche Darstellung von MOC ist. Pixel mit dem größten Einfluss auf die Kennzahlen werden identifiziert, indem lediglich diejenigen visualisiert werden, die in die 99. Perzentile fallen. Ähnlich können mehrere Kolokalisationskennzahlen sowie das Produkt der PCC- und MOC-Raumkarten in der sogenannten gemischten Karte visualisiert werden. Die gemischte Karte wird in einem iterativen Klassifizierungsprozess verwendet, um eine Kolokalisationskarte zu erzeugen, die eine bessere Annäherung der echten Kolokalisation ist, im Gegensatz zu der zufälligen Kolokalisation, wodurch die Visualisierung von falsch positiven Ergebnissen minimiert wird.
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Ein aktuell sehr bekannter Ansatz für die Visualisierung von Kolokalisation stellt eine räumliche Darstellung der Kolokalisation zwischen zwei Fluoreszenzsignalen dar, ähnlich zu der räumlichen Darstellung von PCC durch die oben beschriebenen Verfahren. Für jedes Pixel in der Probe wird eine Größe berechnet, die als normalisiertes mittleres Abweichungsprodukt (nMDP, normalized mean deviation product) bezeichnet wird. Das nMDP ist wie folgt definiert:
wobei x
i und y
i die Fluoreszenzintensitäten der zwei Farbkanäle für das i-te Pixel in dem Probenbild darstellen,
x und
y die mittleren Kanalintensitäten darstellen und x
pmax und y
pmax die maximalen Kanalintensitäten darstellen.
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Um die in Gleichung 1 erforderlichen mittleren und maximalen Kanalintensitäten zu berechnen, wird ein Sobel-Filter auf jeden Farbkanal des Bildes angewendet, um eine Auswahl eines Bereiches von Interesse (ROI, region of interest) zu treffen. Auf diese Weise werden Hintergrundintensitäten auf unabhängige Weise für jeden Farbkanal des Bildes entfernt. Im Zähler von Gleichung 1 wird das Produkt der Abweichungen von dem Mittelwert in dem ROI für die Fluoreszenzkanäle x und y berechnet. Dieses Produkt wird dann um das Produkt der Abweichungen der maximalen Intensitäten von den jeweiligen Mittelwerten über das gesamte Bild hinweg normalisiert. Unter Verwendung dieser Gleichung wird ein neues Pseudo-Farbbild erzeugt, das den Grad darstellt, mit dem Kolokalisation oder Nicht-Kolokalisation bei jedem Pixel auftritt. Der nMDP-Wert kann entweder positiv oder negativ sein, basierend auf der Intensität des Pixels relativ zu dem Mittelwert. Auf diese Weise geben positive Werte an, dass das Pixel kolokalisiert ist, und negative Werte geben an, dass dasselbe dies nicht ist.
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Alle der vorhergehenden Verfahren zielen darauf ab, die räumliche Analyse von Kolokalisation dadurch zu verbessern, dass die standardmäßige Visualisierung der Überlappung zwischen zwei Fluoreszenzkanälen in deren ursprünglichen Farben erweitert wird. Einige versuchen, eine visuelle Darstellung der Korrelation zwischen Kanälen in die Visualisierung einzufügen, indem jedem Voxel eine Farbe zugewiesen wird, auf der Basis seines individuellen Beitrages zu dem PCC. Dies kann jedoch Inkonsistenzen in die Interpretation der Visualisierung einfügen.
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Die vorstehende Erörterung des Hintergrundes der Erfindung dient dazu, ein Verständnis der vorliegenden Erfindung zu erleichtern. Es ist zu beachten, dass die Erörterung keine Bestätigung oder kein Eingeständnis dahingehend darstellt, dass das Material, auf das Bezug genommen wird, zum Prioritätsdatum der Anwendung Teil des allgemeinen Fachwissens war.
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Kurzdarstellunq der Erfindung
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Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein computerimplementiertes Verfahren zum Visualisieren kolokalisierter Fluoreszenzsignale bei einer Fluoreszenzmikroskopie einer Probe bereitgestellt, das folgende Schritte aufweist: Zugreifen auf Fluoreszenzdaten in dreidimensionaler Form, die Signalintensitätsdaten für einen ersten Fluoreszenzkanal und einen zweiten Fluoreszenzkanal umfassen, welche jedem Voxel eines Bildes zugeordnet sind; Berechnen einer Regression an den Fluoreszenzdaten, um einen Regressionsparameter zu erzeugen, der einem Korrelationsgrad zwischen den Signalintensitätsdaten entspricht, die aus dem ersten und zweiten Fluoreszenzkanal erhalten werden; Abbilden der Signalintensitätsdaten für jedes Voxel auf den Regressionsparameter; Zuweisen eines Farbkartenwertes zu jedem Voxel auf der Basis der Abbildung; und Rendern der Voxel in dem Bild in Farben, die sich auf die zugewiesenen Farbkartenwerte beziehen, wodurch sich eine Visualisierung einer Kolokalisation der Fluoreszenzdaten in dem Bild ergibt.
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Das computerimplementierte Verfahren kann folgende Schritte aufweisen: Abbilden der Signalintensitätsdaten auf den Regressionsparameter, Zuweisen von Farbkartenwerten zu den Voxeln auf der Basis der abgebildeten Signalintensitätsdaten, wobei Farbkartenwerte von Voxeln, die schlecht korrelierte Signalintensitätsdaten verkörpern, reduziert werden, und Rendern eines Bildes, das die Voxel aufweist, wobei die Voxel gemäß deren Farbkartenwerten gefärbt werden, um eine Kolokalisation der Bilddaten zu visualisieren.
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Das Zuweisen eines Farbkartenwertes zu jedem Voxel kann ferner folgende Schritte umfassen: Zuweisen eines Farbkartenwertes auf der Basis eines Pegels von kombinierten Kanalsignalintensitäten, um größere Signalintensitäten hervorzuheben; und Begrenzen des Zuweisens von Farbkartenwerten zu Voxeln, wo beide Kanalsignalintensitäten über definierten jeweiligen Kanalintensitätsschwellen liegen.
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Das Abbilden kann eine senkrechte Projektion der Signalintensitätsdaten für ein Voxel auf dem Regressionsparameter anwenden; und wobei das Zuweisen eines Farbkartenwertes zu jedem Voxel folgende Schritte umfasst: Zuweisen eines Farbkartenwertes auf der Basis einer Position entlang der Regressionsparameters; und Dämpfen des Farbkartenwertes auf der Basis einer erhöhten Entfernung der Projektion, um positiv korrelierte Intensitäten hervorzuheben.
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Das Zuweisen eines Farbkartenwertes zu jedem Voxel kann ferner folgenden Schritt umfassen: Ausschließen des Zuweisens von Farbkartenwerten zu Ausreißern in den Daten, wobei Ausreißer Signalintensitätsdaten sind, die größer als eine vorbestimmte Entfernungsschwelle von dem Regressionsparameter sind. Das Abbilden kann ein statistisches Filter umfassen, das dazu dient, eine Projektionsentfernungsschwelle anzuwenden, um eine statistische Population von Voxeln mit Intensitäten über definierten jeweiligen Kanalintensitätsschwellen zu erfassen.
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Bei einem Ausführungsbeispiel kann die Regression eine Fehler-in-den-Variablen-Regression sein und Werte des Regressionsparameters können durch eine Kurve der besten Anpassung von Punkten auf einem Diagramm dargestellt werden, wobei Achsen die Signalintensitätswerte des ersten und des zweiten Fluoreszenzkanals darstellen, wobei Farbkartenwerte entlang der Regressionsparametergeraden variieren. Beispielsweise kann die Fehler-in-den-Variablen-Regression eine Deming-Regression sein, und die Deming-Regression kann eine orthogonale Regression sein.
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Der Regressionsparameter kann eine Obergrenze, die einer Maximalsignalintensität des ersten und/oder des zweiten Fluoreszenzkanals entspricht, und eine Untergrenze aufweisen, die einer Minimalsignalintensität des ersten und/oder des zweiten Fluoreszenzkanals entspricht, und wobei das Zuweisen von Farbkartenwerten linear zwischen der Parameterobergrenze und -untergrenze entlang des Regressionsparameters angewendet wird. Die zugewiesenen Farbkartenwerte können zwischen einem oberen Schwellwert und einem unteren Schwellwert liegen, der obere Schwellwert kann beispielsweise 1 sein und der untere Schwellwert kann 0 sein, so dass allen abgebildeten Signalintensitätsdaten ein Farbkartenwert zwischen 0 und 1 zugewiesen wird. Signalintensitätsdaten mit einem abgebildeten Wert, der die Obergrenze des Regressionsparameters überschreitet, kann ein Farbkartenwert zugewiesen werden, der dem oberen Schwellwert entspricht, und Signalintensitätsdaten mit einem abgebildeten Wert, der kleiner ist als die Untergrenze des Regressionsparameters, kann ein Farbkartenwert zugewiesen werden, der dem unteren Schwellwert entspricht.
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Das Verfahren kann außerdem folgenden Schritt umfassen: Anwenden eines Schwellfilters, um Signalintensitätsdaten auszuschließen, die Hintergrundrauschen oder nicht-korrelierten Signalintensitätsdaten entsprechen; wobei Hintergrundrauschen Signalintensitätsdaten unter einem Schwellfiltermindestwert aufweist, und nicht-korrelierte Signalintensitätsdaten Daten aus dem ersten und/oder zweiten Fluoreszenzkanal aufweisen, die unter einem Schwellfiltermindestwert liegen. Unterschiedliche Schwellfilter können auf die ersten Fluoreszenzkanaldaten und die zweiten Fluoreszenzkanaldaten angewendet werden, alternativ dazu kann dasselbe Schwellfilter auf die ersten Fluoreszenzkanaldaten und die zweiten Fluoreszenzkanaldaten angewendet werden, und das Schwellfilter kann manuell bestimmt oder automatisch bestimmt werden.
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Weitere Merkmale sehen vor, dass das Verfahren ein Ausschließen von Ausreißern in den Daten davon, diese in dem gerenderten Bild zu visualisieren, umfasst, dass die Ausreißer Signalintensitätsdaten sind, die größer als eine vorbestimmte Entfernungsschwelle von dem Regressionsparameter sind, dass die vorbestimmte Entfernungsschwelle zwischen 50 % und 100 % der Signalintensitätsdaten entspricht, die größer als die Schwellfilter des ersten und des zweiten Fluoreszenzkanals sind, etwa 99 % der Signalintensitätsdaten, die größer als die Schwellfilter sind, und dass die vorbestimmte Entfernungsschwelle automatisch bestimmt wird oder manuell bestimmt wird.
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Weitere Merkmale sehen vor, dass die Farbkartenwerte von Voxeln, die schlecht korrelierte Signalintensitätsdaten verkörpern, im Verhältnis zu deren Entfernung von dem Regressionsparameter reduziert werden, dass die Signalintensitätsdaten aller Voxel um einen Faktor d x tan θ reduziert werden, wobei d die Entfernung des Voxels von dem Regressionsparameter ist und 0 < θ < 90 gilt.
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Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Computersystem vorgesehen, das folgende Merkmale aufweist: einen Prozessor und einen Speicher, der dazu konfiguriert ist, dem Prozessor Computerprogrammanweisungen bereitzustellen, um Funktionen von Komponenten auszuführen: eine Zugriffskomponente zum Zugreifen auf Fluoreszenzdaten in dreidimensionaler Form, die Signalintensitätsdaten für einen ersten Fluoreszenzkanal und einen zweiten Fluoreszenzkanal umfassen, welche jedem Voxel eines Bildes zugeordnet sind; eine Regressionsberechnungskomponente zum Berechnen einer Regression an den Fluoreszenzdaten, um einen Regressionsparameter zu erzeugen, der einem Korrelationsgrad zwischen den Signalintensitätsdaten entspricht, die aus dem ersten und zweiten Fluoreszenzkanal erhalten werden; eine Abbildungskomponente zum Abbilden der Signalintensitätsdaten für jedes Voxel auf den Regressionsparameter; eine Farbkartenwertzuweisungskomponente zum Zuweisen eine Farbkartenwertes zu jedem Voxel auf der Basis der Abbildung; und eine Renderkomponente zum Rendern der Voxel in dem Bild zur Anzeige auf einer Computeranzeige in Farben, die sich auf die zugewiesenen Farbkartenwerte beziehen wodurch sich eine Visualisierung einer Kolokalisation der Fluoreszenzdaten in dem Bild ergibt.
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Die Farbkartenwertzuweisungskomponente kann Folgendes umfassen: Zuweisen eines Farbkartenwertes auf der Basis eines Pegels von kombinierten Kanalsignalintensitäten; und Begrenzen des Zuweisens von Farbkartenwerten zu Voxeln, wo beide Kanalsignalintensitäten über definierten jeweiligen Kanalintensitätsschwellen liegen. Die Farbkartenwertzuweisungskomponente kann ferner Folgendes umfassen: Zuweisen von Farbkartenwerten mit Ausnahme von Ausreißern in den Daten, wobei Ausreißer Signalintensitätsdaten sind, die größer als eine vorbestimmte Entfernungsschwelle von dem Regressionsparameter sind. Die Abbildungskomponente kann ein statistisches Filter umfassen, das dazu dient, eine Projektionsentfernungsschwelle anzuwenden, um eine statistische Population von Voxeln mit Intensitäten über definierten jeweiligen Kanalintensitätsschwellen zu erfassen.
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Das System kann außerdem eine Schwellfilterkomponente umfassen, die dazu dient, Signalintensitätsdaten auszuschließen, die Hintergrundrauschen oder nicht-korrelierten Signalintensitätsdaten entsprechen, wobei Hintergrundrauschen Signalintensitätsdaten unter einem Schwellfiltermindestwert aufweist, und nicht-korrelierte Signalintensitätsdaten Daten aus dem ersten und/oder zweiten Fluoreszenzkanal aufweisen, die unter einem Schwellfiltermindestwert liegen.
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Weitere Merkmale sehen vor, dass das System eine Schwellanwendungskomponente umfasst zum Anwenden eines Schwellfilters auf die Daten, um Voxel auszuschließen, die Signalintensitätsdaten zugeordnet sind, welche Hintergrundrauschen oder nicht-korrelierten Signalintensitätsdaten entsprechen, dass Hintergrundrauschen Signalintensitätsdaten unter einem Schwellfiltermindestwert aufweist, und dass nicht-korrelierte Signalintensitätsdaten aus dem ersten und/oder zweiten Fluoreszenzkanals aufweisen, die unter einem Schwellfiltermindestwert liegen, dass die Schwellanwendungskomponente unterschiedliche Schwellfilter auf die ersten Fluoreszenzkanaldaten und die zweiten Fluoreszenzkanaldaten anwendet, alternativ dazu dasselbe Schwellfilter auf die ersten Fluoreszenzkanaldaten und die zweiten Fluoreszenzkanaldaten, und dass das Schwellfilter manuell bestimmt wird, dass das Schwellfilter alternativ dazu automatisch bestimmt wird.
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Weitere Merkmale sehen vor, dass das System eine Ausschlusskomponente umfasst zum Ausschließen von Ausreißern in den Daten davon, in dem gerenderten Bild visualisiert zu werden, dass die Ausreißer die Signalintensitätsdaten sind, die größer sind als eine vorbestimmte Entfernungsschwelle zu dem Regressionsparameter, dass die vorbestimmte Entfernungsschwelle zwischen 50 % und 100 % der Signalintensitätsdaten entspricht, die größer sind als die Schwellfilter des ersten und des zweiten Fluoreszenzkanals, etwa 99 % der Signalintensitätsdaten, die größer sind als die Schwellfilter, und dass die vorbestimmte Entfernungsschwelle automatisch bestimmt wird oder manuell bestimmt wird.
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Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Computerprogrammprodukt vorgesehen, das das ein computerlesbares Medium aufweist, auf dem computerlesbarer Programmcode zum Ausführen der folgenden Schritte gespeichert ist: Zugreifen auf Fluoreszenzdaten in dreidimensionaler Form, die Signalintensitätsdaten für einen ersten Fluoreszenzkanal und einen zweiten Fluoreszenzkanal umfassen, welche jedem Voxel eines Bildes zugeordnet sind; Berechnen einer Regression an den Fluoreszenzdaten, um einen Regressionsparameter zu erzeugen, der einem Korrelationsgrad zwischen den Signalintensitätsdaten entspricht, die aus dem ersten und zweiten Fluoreszenzkanal erhalten werden; Abbilden der Signalintensitätsdaten für jedes Voxel auf den Regressionsparameter; Zuweisen eines Farbkartenwertes zu jedem Voxel auf der Basis der Abbildung; und Rendern der Voxel in dem Bild in Farben, die sich auf die zugewiesenen Farbkartenwerte beziehen, wodurch sich eine Visualisierung einer Kolokalisation der Fluoreszenzdaten in dem Bild ergibt.
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Weitere Merkmale sehen vor, dass das computerlesbare Medium ein nicht-flüchtiges computerlesbares Medium ist, und dass der computerlesbare Programmcode durch eine Verarbeitungsschaltung ausführbar ist.
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Ausführungsbeispiele der Erfindung werden im Folgenden lediglich beispielhaft unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben.
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Figurenliste
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- 1 ist ein schematisches Diagramm, das ein beispielhaftes System (100) zum Visualisieren einer Kolokalisation in Fluoreszenzbilddaten gemäß der vorliegenden Offenbarung darstellt.
- 2 ist ein Flussdiagramm, das ein Beispielverfahren (200) zum Visualisieren einer Kolokalisation in Fluoreszenzbilddaten gemäß der vorliegenden Offenbarung darstellt.
- 3 ist ein Diagramm, das eine Abbildung von Signalintensitätsdaten auf einen Regressionsparameter darstellt. Eine Kolokalisationsintensität qi wird auf einen durch einen Vektor p definierten 1D-Teilraum abgebildet. Eine Abbildung auf einen Punkt po entspricht einem Farbkartenwert von 0, eine Abbildung auf einen Punkt p1 entspricht einem Farbkartenwert von 1, und Zwischenabbildungen entsprechen einem Farbkartenwert, der linear zwischen diesen Werten variiert.
- 4 ist eine Veranschaulichung der Wirkung des Verfahrens der vorliegenden Offenbarung auf mögliche Kolokalisationsintensitäten. Unter Verwendung von 3 als Referenz ist eine Regressionsgerade (gezeigt als Strichlinie) mit β̂1 = 1:5 und β̂0 = 0 veranschaulicht. Visualisiert ist der Farbkartenwert (Ci), der für jede mögliche Kolokalisationsintensität qi = (xi; yi) unter Verwendung der Magma-Farbkarte berechnet, wobei Schwarz Ci = 0 entspricht und Hellgelb Ci = 1 entspricht. Zur Verdeutlichung sind beide Schwellfilter Tch1 und Tch2 bei diesem Beispiel null. A: Die Farbkartenwerte Ci unter Verwendung von Gleichung 13. B: Die Farbkartenwerte unter Verwendung von Gleichung 15, mit θ = 60°. C: Die finalen Farbkartenwerte Ci unter Verwendung von Gleichung 17, mit dt = 0,2 und xpmax = 0,8/max.
- 5 ist eine Veranschaulichung eines Effektes vom Anwenden von Farbkartenschwellen unter Verwendung eines synthetisch erzeugten Streudiagramms, wobei eine Farbkartenhelligkeit eine Frequenz von Voxeln mit einer gegebenen Kolokalisationsintensität angibt. Eine Regressionsgerade ist rot gezeigt, wobei zwei beispielhafte Intensitätspaare, qi und qj, orange gezeigt sind. Ein Unterdrückungsfaktor θ wird angewendet, wenn qi und qj auf die Regressionsgerade abgebildet werden. Nur Probendaten über den Kanalschwellen, Tch1 and Tch2, werden berücksichtigt, wenn die Entfernungsschwelle dt, die weiß gezeigt ist, bestimmt wird. Jeglichen Kolokalisationsintensitäten qi über einem Maximalpunkt pmax wird ein Farbkartenwert von 1 zugewiesen. Gleichermaßen wird jeglichen qi unter einem Mindestpunkt po ein Farbkartenwert von 0 zugewiesen. Diese Schwellen sind mit zwei grünen Geraden an den jeweiligen Punkten angezeigt. dt und pmax werden unabhängig voneinander bestimmt, damit 99 % der Daten enthalten sind, wodurch Ausreißer aus einer Visualisierung der Voxel ausgeschlossen werden. Ein finaler Farbkartenwert Ci variiert linear zwischen 0 und 1 von po zu pmax.
- 6 A-C: veranschaulichen die Ergebnisse vom Anwenden einer standardmäßigen Farbkarte auf die in 4A-4C dargestellten Daten; D: veranschaulicht eine visuelle Darstellung, die eine Ableitung einer alternativen Farbkarte zeigt, die bei dem Verfahren und System der vorliegenden Offenbarung verwendet werden kann; und E-G: veranschaulichen die Ergebnisse vom Anwenden der Farbkarte aus 6D auf die in 4A-4C dargestellten Daten.
- 7 ist ein Blockdiagramm, das beispielhafte Komponenten eines Systems gemäß der vorliegenden Offenbarung zum Visualisieren einer Kolokalisation in Fluoreszenzbilddaten veranschaulicht.
- 8 veranschaulicht Beispiel einer Rechenvorrichtung, in der unterschiedliche Aspekte der Offenbarung implementiert sein können.
- 9 ist eine Visualisierung synthetischer Daten unter Verwendung von 3D-Bildern und Maximalintensitätsprojektionen (MIP). A: die überlappenden Fluoreszenzkanalintensitäten B: alle Voxel über den Kolokalisationsschwellen, und daher als kolokalisiert betrachtet, sind in weiß überlagert. C: das Ergebnis einer Anwendung des nMDP. D: das Ergebnis einer Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Offenbarung (als „RACC“ bezeichnet). E: die Differenz zwischen dem Verfahren der vorliegenden Offenbarung und dem nMDP-Verfahren. Magenta stellt Bereiche dar, die nMDP als nicht-kolokalisiert betrachtet, die jedoch das Verfahren der vorliegenden Offenbarung als kolokalisiert betrachtet, während gelb Bereiche darstellt, die nMDP als kolokalisiert betrachtet, die jedoch das Verfahren der vorliegenden Offenbarung nicht als kolokalisiert betrachtet. F: Streudiagramme für die 3D- und MIP-Datensätze, wobei dieselben die Frequenz jeder Fluoreszenz zeigen, mit der Intensitätskombination auftritt. Die durch das Verfahren der vorliegenden Offenbarung berechnete Regressionsgerade ist rot gezeigt. Die Maximal- und Entfernungsschwellen für das vorliegende Verfahren sind orange bzw. weiß gezeigt. Die rote Markierung stellt die durchschnittlichen Intensitäten pro Kanal dar, die von den nMDP-Berechnungen verwendet werden und um die die vier Quadranten getrennt sind.
- 10 ist eine Reihe von Bildern, die eine Visualisierung von α/β-Tubulin (rot) und Acetyltubulin (grün) zeigen. Die Struktur der Figur ähnelt der von 9, jedoch werden in diesem Fall biologische Proben und nicht synthetische Daten betrachtet.
- 11 ist eine Reihe von Bildern, die eine Visualisierung einer Fusion von Autophagosom (grün) und Lysosom (rot) veranschaulichen. Die Struktur der Figur ähnelt der von 9, jedoch werden in diesem Fall biologische Proben und nicht synthetische Daten betrachtet.
- 12 ist eine Reihe von Bildern, die eine Visualisierung von Autophagasom und Tubulin veranschaulichen. Die Struktur der Figur ähnelt der aus 9, jedoch werden in diesem Fall biologische Proben und nicht synthetische Daten betrachtet.
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Ausführliche Beschreibung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen
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Die vorliegende Erfindung schafft ein computerimplementiertes Verfahren, ein System und ein Computerprogrammprodukt zum Visualisieren einer Kolokalisation in Fluoreszenzbilddaten. Bei dem beschriebenen Verfahren, System und Produkt werden Fluoreszenzbilddaten, die in zwei Fluoreszenzkanälen erhalten werden (die jeweils einem anderen Fluorophor in der Probe entsprechen) manipuliert, um ein Rendern eines 3D-Bildes zu ermöglichen, das die Form, den Ort und die Intensität von Kolokalisationspunkten anzeigt. Die Bilddaten werden vorzugsweise in Form eines dreidimensionalen (3D) z-Stapels erhalten, der einer Kombination von gestapelten 2D-Bildern entspricht, die entlang einer z-Achse der Probe aufgenommen werden. Die Bilddaten enthalten einen Fluoreszenzsignalintensitätswert für jeden Kanal in jedem Voxel (einem 3D-Volumenpixel), aus denen das gerenderte Bild besteht.
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Bei der Untersuchung einer Kolokalisation ist üblicherweise die Korrelation und nicht nur das gemeinsame Auftreten von Fluoreszenzkanalintensitäten von Interesse. Die Intensität eines Fluoreszenzkanals eines Bildes hängt hauptsächlich von der Häufigkeit des Fluorochroms (oder Fluorophors) in diesem Bereich der Zelle ab. Deshalb weisen, wenn zwei Proteine oder Strukturen von Interesse sich miteinander verbinden, die Fluoreszenzsignale derselben üblicherweise ähnliche Intensitäten in denselben Voxeln des Bildes auf. Die vorliegende Offenbarung schafft ein Mittel zum räumlichen Visualisieren der Korrelation zwischen den zwei Fluoreszenzkanalintensitäten, insbesondere das Ausmaß, in dem kolokalisierte Voxel positiv korreliert sind.
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Die Fluoreszenzintensitäten für jedes Voxel können durch zwei Zufallsvariablen X und Y dargestellt sein, die diskret sein und Werte zwischen 0 und 255 aufweisen können. Für ein gegebenes Voxel i in dem Bild kann dieses Paar von Intensitäten als die Kolokalisationsintensität qi bezeichnet und als eine Funktion von xi, den Intensitätswerten eines ersten Fluoreszenzkanals, und yi, den Intensitätswerten eines zweiten Fluoreszenzkanals, definiert sein. Eine Abbildung, die die zwei Kanalintensitäten verwendet, wird angewendet und den Bildvoxeln eine Farbe zugewiesen.
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1 ist ein schematisches Diagramm, das ein beispielhaftes System (100) zum Visualisieren einer Kolokalisation in Fluoreszenzbilddaten gemäß der vorliegenden Offenbarung darstellt. Das System (100) kann einen Prozessor (102) und einen Speicher (104) umfassen, der dazu konfiguriert ist, dem Prozessor (102) Computerprogrammanweisungen (106) bereitzustellen, um Funktionen von Komponenten des Systems (100) auszuführen. Das System (100) kann durch eine oder mehrere Hardware- oder Softwareeinheiten bereitgestellt sein. In manchen Fällen kann das System durch eine Rechenvorrichtung (108) bereitgestellt sein. Das System (100) kann ein Verfahren zum Visualisieren einer Kolokalisation in Fluoreszenzbilddaten und zum Rendern der Daten einschließlich der Kolokalisationsvisualisierung auf einer Computeranzeige implementieren.
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Ein beispielhaftes computerimplementiertes Verfahren (200) ist in dem Flussdiagramm von 2 zum Visualisieren von kolokalisierten Fluoreszenzsignalen bei der Fluoreszenzmikroskopie einer Probe darstellt. Das Verfahren (200) kann ein Zugreifen (202) auf Fluoreszenzdaten in dreidimensionaler Form umfassen, die Signalintensitätsdaten für einen ersten Fluoreszenzkanal und einen zweiten Fluoreszenzkanal umfassen, welche jedem Voxel eines Bildes zugeordnet sind. Die Signalintensitätsdaten können typischerweise sowohl aus einem ersten Fluoreszenzkanal als auch einem zweiten Fluoreszenzkanal erhalten werden, wobei jeder Fluoreszenzkanal Fluoreszenzsignalen entspricht, die durch einen anderen Fluorophor in der Probe emittiert werden. Die Signalintensitätsdaten jedes Fluoreszenzkanals können typischerweise mit unterschiedlichen Wellenlängen aufgezeichnet werden, so dass die Signale von den Kanälen voneinander unterschieden werden können. Die Signalintensitätsdaten können Voxeln in einem Bild zugewiesen sein, beispielsweise einem 3D-z-Stapelbild, so dass jedem Voxel Signalintensitätswerte von jedem des ersten und des zweiten Fluoreszenzkanals zugewiesen sind.
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Das Verfahren kann ein Berechnen (204) eines Regressionsfaktors an den Signalintensitätsdaten umfassen, um einen Regressionsparameter zu erzeugen. Der Regressionsparameter kann einem Ausmaß der Korrelation zwischen den Signalintensitätsdaten entsprechen, die von dem ersten und zweiten Fluoreszenzkanal erhalten werden, und kann in Form einer Kurve der besten Anpassung erzeugt werden, beispielsweise als Gerade, obwohl die Kurve der besten Anpassung bei manchen Ausführungsbeispielen gekrümmt oder wellenähnlich sein kann. Der Regressionsfaktor kann eine lineare Beziehung zwischen den zwei Fluoreszenzkanalintensitäten beschreiben. Eine einfache lineare Regression ist für diese Aufgabe unter Umständen nicht geeignet, da begleitende Annahmen einer gewöhnlichen Anpassung der kleinsten Quadrate möglicherweise nicht für Kolokalisationsintensitäten zutreffen. Insbesondere ist eine Annahme, dass eine Variable (die abhängige Variable) aus einer anderen (der unabhängigen Variable) vorhergesagt werden kann und somit die unabhängige Variable eine feste bekannte Konstante ist, möglicherweise nicht zutreffend. Stattdessen können beide Fluoreszenzintensitäten abgetastet werden und können für Beobachtungsfehler anfällig sein. Deshalb kann der Regressionsfaktor ein Fehler-in-den-Variablen-Regressionsfaktor sein, bei dem Fehler bei den Messungen des ersten und zweiten Fluoreszenzkanals berücksichtigt werden. Die Fehler-in-den-Variablen-Regression kann eine Deming-Regression sein, und bei manchen Ausführungsbeispielen kann die Deming-Regression eine orthogonale Deming-Regression sein. Bei der Deming-Regression ist der Regressionsparameter eine Kurve der besten Anpassung, die wie folgt beschrieben werden kann:
wobei x und y die wahren Werte der zwei Fluoreszenzkanalintensitäten sind und wobei β
0 und β
1 der Achsenabschnitt bzw. die Steigung der Regressionsgeraden sind. Da die gemessenen Intensitäten x̂ und ŷ jedoch zugeordnete Messfehler εi und ηi aufweisen, werden die wahren Werte mit den Messungen wie folgt in Beziehung gesetzt:
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Bei der Deming-Regression wird davon ausgegangen, dass das Verhältnis der Varianzen dieser beiden Fehler bekannt ist, und dasselbe wird wie folgt definiert:
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Da die Messungen der zwei Kanalintensitäten typischerweise unter denselben Bedingungen erfolgen, kann angenommen werden, dass die Varianzen der zwei Fehler ähnlich sind und somit
und λ ≈ 1 ist. Das Verfahren kann deshalb λ = 1 verwenden, was einem besonderen Fall einer Deming-Regression entspricht, der als orthogonale Regression bekannt ist. Um β
1 zu schätzen, müssen zunächst der Probenmittelwert und die Kovarianz der Zufallsvariablen X und Y (die Signalintensitätsdaten von jedem Fluoreszenzkanal entsprechen) wie folgt berechnet werden:
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Anschließend können β
0 und β
1 gemäß der Gleichung geschätzt werden:
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Da
im Allgemeinen zwei Lösungen hat, kann die Lösung mit demselben Vorzeichen wie die Kovarianz s
xy ausgewählt werden. Falls die Fluoreszenzkanalintensitäten positiv korreliert sind, ist die Kovarianz und damit
ebenfalls positiv. In einigen seltenen Fällen kann die Kovarianz jedoch negativ sein, beispielsweise wenn die Fluoreszenzkanalintensitäten nicht korreliert sind oder die kolokalisierten Intensitäten sehr gering sind. Das Verfahren wählt für
positive Lösungen aus, was eine positive Steigung für die Regressionsgerade sicherstellt, wodurch Voxel hervorgehoben werden, für die beide Fluoreszenzintensitäten hoch sind.
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Das Verfahren kann ein Anwenden (206) eines Schwellfilters umfassen, um Voxel auszuschließen, die Signalintensitätsdaten zugeordnet sind, die Hintergrundrauschen bzw. nicht-korrelierten Signalintensitätsdaten entsprechen. Das Schwellfilter kann auf jeden des ersten und zweiten Fluoreszenzsignalkanals angewendet werden. Hintergrundrauschen kann Signalintensitätsdaten unter einem Schwellfiltermindestwert für jeden Kanal (Tch1, Tch2) aufweisen. Nicht-korrelierte Signalintensitätsdaten können Daten aus dem ersten und/oder zweiten Fluoreszenzkanal aufweisen, die unter dem Schwellfiltermindestwert (Tch1, Tch2) für diesen Kanal liegen. Auf die Daten des ersten Fluoreszenzkanals und des zweiten Fluoreszenzkanals können unterschiedliche Schwellfilter angewendet werden, alternativ kann dasselbe Schwellfilter sowohl auf die Daten des ersten Fluoreszenzkanals als auch des zweiten Fluoreszenzkanals angewendet werden. Bei einigen Ausführungsbeispielen kann das Schwellfilter manuell bestimmt werden, und bei anderen alternativen Ausführungsbeispielen kann das Schwellfilter automatisch bestimmt werden. Unter Berücksichtigung einer Schwellfilterung können die Mittelwerte und Kovarianzen von Gleichung (5) bis (9) berechnet werden, indem lediglich die Kolokalisationsintensitäten qi über den Schwellfiltern verwendet werden.
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Das Verfahren kann ein Abbilden (208) oder Projizieren der Signalintensitätsdaten auf den Regressionsparameter umfassen. Der Regressionsparameter, der eine Regressionsgerade sein kann, kann mit einem 1D-Teilraum gleichgesetzt werden, auf den die Kolokalisationsintensitäten qi abgebildet werden können. 3 stellt dar, wie die Signalintensitätsdaten auf den Regressionsparameter abgebildet werden können. Um das Abbilden durchzuführen, kann der Regressionsparameter als Vektor p dargestellt sein, der durch zwei Punkte p0 und p1 verläuft, die eine Obergrenze und eine Untergrenze des Regressionsparameters in dem 1D-Teilraum darstellen. Die Obergrenze kann eine Maximalsignalintensität des ersten und/oder zweiten Fluoreszenzkanals darstellen. Bei dem in 3 gezeigten Ausführungsbeispiel entspricht die Obergrenze einem Maximalsignalintensitätswert des ersten Fluoreszenzkanals (Kanal 1). In ähnlicher Weise kann die Untergrenze einer Minimalsignalintensität des ersten und/oder zweiten Fluoreszenzkanals entsprechen, und bei dem in 3 dargestellten Ausführungsbeispiel entspricht dies der Untergrenze des ersten Fluoreszenzkanals (Kanal 1).
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Der Schnittpunkt p
0 des Regressionsparameters kann wie folgt berechnet werden:
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In ähnlicher Weise bezeichnet p
1 den Schnittpunkt zwischen der Regressionsgeraden und der maximal möglichen Fluoreszenzintensität I
max und kann wie folgt berechnet werden:
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Die Kolokalisationsintensität jedes Voxels q
i kann senkrecht auf den Regressionsparameter p abgebildet (projiziert) werden, was zu einem Punkt p
i führt. Um dieses Abbilden zu erzielen, kann der Vektor von p
0 zu q
i als q definiert werden (
2), woraus sich Folgendes ergibt:
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Das Verfahren kann ein Zuweisen (210) von Farbkartenwerten (Ci) zu den Voxeln auf Basis der abgebildeten Signalintensitätsdaten umfassen. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Farbkarte“ auf ein Spektrum von Farben, bei dem jede Farbe einem numerischen Wert zugeordnet ist. Die Farbkartenwerte, die den Voxeln zugewiesen sind, bestimmen die Farbe derselben, wenn dieselben in einem Bild gerendert werden, um eine Kolokalisation der Daten anzuzeigen. Ein Zuweisen (210) eines Farbkartenwerts zu jedem Voxel auf der Basis der Abbildung umfasst ein Zuweisen eines Farbkartenwerts auf der Basis eines Pegels von kombinierten Kanalsignalintensitäten, um größere Signalintensitäten hervorzuheben und ein Zuweisen von Farbkartenwerten zu Voxeln zu beschränken, wenn beide Kanalsignalintensitäten über definierten jeweiligen Kanalintensitätsschwellen liegen.
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Die zugewiesenen Farbkartenwerte (C
1) können zwischen einem oberen Schwellwert und einem unteren Schwellwert liegen, abhängig von einer linearen Position von p
i entlang p. Bei einigen Ausführungsbeispielen kann der obere Schwellwert 1 sein und der untere Schwellwert kann 0 sein, so dass alle abgebildeten Signalintensitätsdaten einem Farbkartenwert zwischen 0 und 1 zugewiesen sind. Jedoch können die Farbkartenwerte einen angemessenen Bereich aufweisen. Der Farbkartenwert kann dazu verwendet werden, den Voxeln mittels einer Farbkarte eine Farbe zuzuweisen. Manche Signalintensitätsdaten können die Obergrenze des Regressionsparameters überschreiten, beispielsweise wenn p
1 nicht genau der Intensität (I
max; I
max) entspricht. Diese Signalintensitätsdaten können mit einem Farbkartenwert als Schwellwert versehen werden, der dem oberen Schwellwert entspricht, der bei einigen Ausführungsbeispielen 1 sein kann. In ähnlicher Weise können einige Signalintensitätsdaten einen abgebildeten Wert (p
i) aufweisen, der kleiner als die Untergrenze des Regressionsparameters ist (d. h. p
0 in
3), was bewirkt, dass p
i unter p
0 liegt. Dies kann beispielsweise der Fall sein, wenn p
0 nicht genau der Intensität (T
ch1; T
ch2) entspricht. Diese Signalintensitätsdaten können einem Farbkartenwert zugewiesen sein, der dem unteren Schwellwert entspricht, der bei einigen Ausführungsbeispielen 0 sein kann. Auf diese Weise können alle abgebildeten Signalintensitätswerte einem Farbkartenwert innerhalb des Farbkartenwertbereichs zugewiesen sein. Die Farbkartenwerte C
i können gemäß der folgenden Gleichung berechnet werden (bei einem Ausführungsbeispiel, bei dem der Farbkartenwertbereich zwischen 0 und 1 liegt):
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Die Auswirkung von Gleichung 13 auf die Voxel in einer Probe kann visualisiert werden, indem die Farbkartenintensität Ci grafisch dargestellt wird, die für jede mögliche Kolokalisationsintensität qi für einen bestimmten Regressionsparameter verwendet werden würde. Das Ergebnis dieser grafischen Darstellung ist in 4A dargestellt, die zeigt, dass Voxeln mit hohen Fluoreszenzintensitäten für x und y ein hoher Wert für Ci zugewiesen wird, während niedrigen Fluoreszenzintensitäten niedrigere Werte für Ci zugewiesen werden. Gleichung 13 erfüllt damit eine Aufgabe, Voxel mit größeren kombinierten Fluoreszenzintensitäten hervorzuheben. Jedoch werden Voxel, die nicht positiv korreliert sind, damit nicht unterdrückt. Stattdessen wird derselbe Farbkartenwert allen Kolokalisationsintensitäten zugewiesen, die auf einer zu dem Regressionsparameter senkrechten Linie liegen ist, ohne Ausreißer zu entfernen.
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Das Verfahren kann deshalb ein Reduzieren (212) von zugewiesenen Farbkartenwerten von Voxeln umfassen, die ungenügend korrelierte Signalintensitätsdaten bzw. Signalintensitätsdaten verkörpern, die im Verhältnis zu ihrer Abweichung von dem Regressionsparameter am stärksten von dem Regressionsparameter abweichen, um die Visualisierung derartiger Voxel in dem gerenderten Bild zu unterdrücken. Bei einigen Ausführungsbeispielen können die zugewiesenen Farbkartenwerte aller abgebildeten Signalintensitätsdaten im Verhältnis zu einem Ausmaß der Abweichung von dem Regressionsparameter reduziert werden. Auf diese Weise können die Farbkartenwerte von Voxeln, die ungenügend korrelierten Signalintensitätsdaten entsprechen, in einem stärkeren Ausmaß unterdrückt (gedämpft) werden als die von Voxeln, die gut korrelierten Signalintensitätsdaten entsprechen. Dies kann zu einer verbesserten Visualisierung der Korrelation zwischen dem ersten und zweiten Fluoreszenzkanal in einem gerenderten Bild der Voxel führen. Um ungenügend korrelierte Voxel zu unterdrücken, kann eine normalisierte senkrechte Entfernung d zwischen dem Signalintensitätswert q
i und dem Regressionsparameter p berechnet werden, und die Farbkartenwerte können gemäß der Größe von d angepasst werden. Diese normalisierte Entfernung d kann wie folgt angegeben werden:
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Die Normalisierung durch I
max stellt sicher, dass 0 < d < 1. Der Farbkartenwert C
i, der durch Gleichung 13 berechnet wird, kann linear mit der Entfernung d unterdrückt werden. Dies kann erreicht werden, indem jede Kolokalisationsintensität q
i auf den Regressionsparameter mit einem Winkel θ zu der Senkrechten projiziert oder abgebildet wird, wie in
5 dargestellt ist. Der Wert eines Unterdrückungsfaktors θ kann deshalb das Ausmaß bestimmen, in dem der Farbkartenwert C
i unterdrückt wird, während d zunimmt. Eine Unterdrückung kann unter Verwendung der folgenden Gleichung erzielt werden, bei der 0 < θ < 90 ist:
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Ein Unterdrückungsfaktor von 0° entspricht keiner Dämpfung des Farbkartenwerts und somit ist
während Faktoren in der Nähe von, jedoch ohne 90° einer maximalen Dämpfung entsprechen, wodurch effektiv C
1 = 0 wird, und alle Voxel, für die q
i nicht mit dem Regressionsparameter zusammenfällt, vollständig unterdrückt werden. Die Auswirkung von Gleichung 15 auf alle möglichen Kolokalisationsintensitäten q
i kann in
4B für θ = 60° visualisiert sein. Der Unterdrückungsfaktor θ kann wählbar sein, alternativ kann derselbe automatisch bestimmt werden. Bei einigen bevorzugten Ausführungsbeispielen ist θ = 45°.
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Das Verfahren kann ein Ausschließen (214) von Ausreißern in den Daten davon, diese in dem gerenderten Bild zu visualisieren, umfassen. Die Ausreißer können Signalintensitätsdaten sein, die größer als eine vorbestimmte Entfernungsschwelle von dem Regressionsparameter sind. Bei einigen Ausführungsbeispielen kann die vorbestimmte Entfernungsschwelle zwischen 50 % und 100 % der Signalintensitätsdaten betragen, beispielsweise 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 % oder 99,9 % der Signalintensitätsdaten über den Schwellfiltern. Lediglich Voxel, die Signalintensitätsdaten entsprechen, für die eine Entfernung d zwischen der Kolokalisationsintensität q
i und dem Regressionsparameter unter der vorbestimmten Entfernungsschwelle liegt, können visualisiert werden, wie in
5 dargestellt ist. Die Entfernungsschwelle d
t kann automatisch oder manuell bestimmt werden, um eine vorbestimmte Menge von Voxeln mit Intensitäten über den Kanalschwellfiltern T
ch1 und T
ch2 zu umfassen. Bei einigen bevorzugten Ausführungsbeispielen kann die vorbestimmte Menge von Voxeln 99 % aller Voxel mit Intensitäten über den Kanalschwellfiltern betragen, was ungefähr drei Standardabweichungen von einem Mittelwert der Intensitäten entsprechen kann, unter Annahme einer normalen Verteilung der Intensitäten. Eine Auswirkung des Anwendens einer Entfernungsschwelle d
t = 0,2 ist in
4C dargestellt. Der entsprechende Farbkartenwert kann unter Verwendung von Gleichung 16 berechnet werden:
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Wenn die meisten Voxel niedrige Intensitäten für beide Kanäle aufweisen, kann es zu einer ineffektiven Nutzung des Farbkartenspektrums und einer damit verbundenen beschränkten Variation der Visualisierung kommen. Um dem entgegenzuwirken, kann ein Punkt pmax = (xpmax; ypmax) auf dem Regressionsparameter definiert werden, um die maximalen dargestellten Intensitäten für das Bild anzugeben. Jedem abgebildeten Punkt pi, der über pmax hinausgeht, kann ein Farbkartenwert zugewiesen werden, der dem oberen Schwellwert entspricht, der bei einigen Ausführungsbeispielen 1 sein kann. Der Punkt pmax kann dahin gehend berechnet werden, dass derselbe einen vordefinierten Prozentsatz aller Probendaten über den Kanalschwellfiltern umfasst. Der vorbestimmte Prozentsatz kann zwischen 50% und 100% gewählt werden, beispielsweise 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 % oder 99,9 % aller Probendaten oberhalb der Kanalschwellfilter. Da alle Kolokalisationsintensitäten senkrecht auf den Regressionsparameter projiziert werden können, kann die Einführung von pmax zu einer Sättigung der Farbkarte für Voxel führen, deren abgebildete Intensitäten unter pmax fallen, was in 5 grün angegeben ist. Dadurch kann mehr von der Farbkarte für die Darstellung niedrigere Kolokalisationsintensitäten zur Verfügung stehen, wodurch eine klarere Dateninterpretation möglich wird. Dieses Neu-Skalieren der angewendeten Farbkarte kann durch Ersetzen von p1 mit pmax in Gleichung 13 erzielt werden.
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Unter der Voraussetzung, dass q
i und θ gegeben sind und die Parameter p
0, p
i und d aus den Gleichungen 10, 12 und 14 hervorgehen, kann Gleichung 13 in ihrer endgültigen Form wie folgt neu formuliert werden:
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Das Ergebnis von Gleichung 17 kann ein Farbkartenwert Ci zwischen dem oberen Schwellwert und dem unteren Schwellwert (in diesem Fall 1 bzw. 0) für jedes Paar von gemessenen Fluoreszenzintensitäten qi = (xi; yi) sein. Es ist jedoch vorgesehen, dass der Farbkartenwert Ci bei anderen Ausführungsbeispielen einen anderen Wertebereich aufweisen kann. Das Verfahren zum Abbilden von Fluoreszenzintensitäten kann bei diesen anderen Ausführungsbeispielen auf ähnliche Weise wie bei der Verwendung von Gleichung 17 erzielt werden.
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Das Verfahren kann ein Rendern (216) eines Bildes umfassen, das die Voxel aufweist. Die Voxel können gemäß ihren Farbkartenwerten eingefärbt sein, so dass eine Kolokalisation der Bilddaten visualisiert werden kann. Eine Korrelation zwischen Daten von dem ersten und dem zweiten Fluoreszenzkanal kann ebenfalls in dem gerenderten Bild visualisiert werden.
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Die Farbkartenwerte, beispielsweise im Bereich von 0 bis 1, können jedem geeigneten Farbspektrum entsprechen, in dem die Farben in der Lage sind, sich visuell voneinander zu unterscheiden. Bei einigen Ausführungsbeispielen kann eine Farbkarte mit sieben Abschnitten verwendet werden, die visuell leicht zu unterscheiden sind, obwohl jede andere geeignete Anzahl von Farben ebenfalls verwendet werden kann. Die Anwendung einer standardmäßigen Farbkarte auf die Intensitätswerte in 4A-C kann zu der Visualisierung führen, die 6A-C gezeigt ist.
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In 6D ist eine weitere beispielhafte Farbkarte gezeigt, die unter Verwendung ausgewählter Farben, beispielsweise dunkelblau, hellblau, grün, gelb, orange, rot und rosa, in Abschnitten sowie durch entweder lineares Erhöhen oder Verringern der roten (601), grünen (602) oder blauen (603) Intensitätswerte in jedem der Abschnitte erzeugt werden kann. Die resultierende regenbogenartige Farbkarte kann das Identifizieren von Bereichen mit ähnlicher Fluoreszenzintensität erleichtern. Die Anwendung der Farbkarte von 6D auf die Intensitätswerte in 4A-C kann zu der Visualisierung führen, die in 6E-G gezeigt ist.
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Verschiedene Komponenten können für die Implementierung des oben unter Bezugnahme auf 2 beschriebenen Verfahrens bereitgestellt sein. 7 ist ein Blockdiagramm, das beispielhafte Komponenten darstellt, die durch ein System zum Visualisieren der Kolokalisation in Fluoreszenzbilddaten bereitgestellt werden können.
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Das System (100) kann Folgendes aufweisen: eine Zugriffskomponente (110) zum Zugreifen auf Signalintensitätsdaten, eine Berechnungskomponente (112) zum Berechnen eines Regressionsfaktors an den Signalintensitätsdaten, um einen Regressionsparameter zu erzeugen, eine Abbildungskomponente (114) zum Abbilden der Signalintensitätsdaten auf den Regressionsparameter und eine Farbkartenwertzuweisungskomponente (116) zum Zuweisen von Farbkartenwerten zu den Voxeln, die den abgebildeten Signalintensitätsdaten zugeordnet sind. Das System (100) kann ferner Folgendes aufweisen: eine Renderkomponente (118) zum Rendern eines Bildes, das die Voxel aufweist, eine Schwellenanwendungskomponente (120) zum Anwenden eines Schwellfilters auf die Daten, um Voxel auszuschließen, die Hintergrundrauschen oder nicht-korrelierten Signalintensitätsdaten zugeordnet sind, und eine Ausschlusskomponente (122) zum Ausschließen von Ausreißern in den Daten davon, diese in dem gerenderten Bild zu visualisieren.
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8 stellt ein Beispiel einer Rechenvorrichtung (300) dar, bei der unterschiedliche Aspekte der Offenbarung implementiert sein können. Die Rechenvorrichtung (300) kann als beliebige Form einer Datenverarbeitungsvorrichtung verkörpert sein, einschließlich einer Personalcomputers (z. B. Laptop oder Desktopcomputer), eines Servercomputers (der in sich geschlossen, physisch über eine Anzahl von Standorten verteilt sein kann), eines Clientcomputers oder einer Kommunikationsvorrichtung, beispielsweise ein Mobiltelefon (z. B. Handy), ein Satellitentelefon, ein Tabletcomputer, ein persönlicher digitaler Assistent oder dergleichen. Unterschiedliche Ausführungsbeispiele der Rechenvorrichtung können die Einbeziehung oder den Ausschluss verschiedener Komponenten oder Teilsysteme, die unten beschrieben werden, vorschreiben.
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Die Rechenvorrichtung (300) kann dazu geeignet sein, einen Computerprogrammcode zu speichern und auszuführen. Die verschiedenen Teilnehmer und Elemente in den zuvor beschriebenen Systemdiagrammen können eine geeignete Anzahl von Teilsystemen oder Komponenten der Rechenvorrichtung (300) verwenden, um die hierin beschriebenen Funktionen zu ermöglichen. Die Rechenvorrichtung (300) kann Teilsysteme oder Komponenten umfassen, die über eine Kommunikationsinfrastruktur (305) (beispielsweise einen Kommunikationsbus, ein Netzwerk usw.) miteinander verbunden sind. Die Rechenvorrichtung (300) kann einen oder mehrere Prozessoren (310) und zumindest eine Speicherkomponente in Form von computerlesbaren Medien umfassen. Der eine oder die mehreren Prozessoren (310) können einen oder mehrere der Folgenden umfassen: CPUs, grafische Verarbeitungseinheiten (GPUs), Mikroprozessoren, feldprogrammierbare Gate-Arrays (FPGAs), anwendungsspezifische integrierte Schaltungen (ASICs) und dergleichen. Bei einigen Implementierungen kann eine Anzahl von Prozessoren bereitgestellt und dahingehend angeordnet sein, Berechnungen gleichzeitig auszuführen. Bei einigen Implementierungen können verschiedene Teilsysteme oder Komponenten der Rechenvorrichtung (300) über eine Anzahl von physischen Standorten verteilt sein (z. B. in einer verteilten, einer Clusterumgebung oder einer cloudbasierten Rechenkonfiguration), und geeignete Softwareeinheiten können so angeordnet sein, dass dieselben im Namen von entfernten Geräten Daten verwalten und/oder verarbeiten.
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Die Speicherkomponenten können einen Systemspeicher (315) umfassen, der einen Festwertspeicher (ROM) und einen Direktzugriffsspeicher (RAM) umfassen kann. Ein Basis-Eingabe-/Ausgabesystem (BIOS) kann in dem ROM gespeichert sein. In dem Systemspeicher (315) kann Systemsoftware, einschließlich Betriebssystemsoftware, gespeichert sein. Die Speicherkomponenten können außerdem einen sekundären Speicher (320) umfassen. Der sekundäre Speicher (320) kann eine Festplatte (321), beispielsweise ein Festplattenlaufwerk, und optional eine oder mehrere Speicherschnittstellen (322) zum Herstellen einer Schnittstelle zu Speicherkomponenten (323) umfassen, beispielsweise Wechselspeicherkomponenten (z. B. Magnetband, optische Disk, Flash-Speicherlaufwerk, externe Festplatte, herausnehmbarer Speicherchip usw.), an das Netzwerk angeschlossene Speicherkomponenten (z. B. NAS-Laufwerke), Fernspeicherkomponenten (z. B. cloudbasierter Speicher) oder dergleichen.
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Die Rechenvorrichtung (300) kann eine externe Kommunikationsschnittstelle (330) für den Betrieb der Rechenvorrichtung (300) in einer vernetzten Umgebung umfassen, die die Übertragung von Daten zwischen mehreren Rechenvorrichtungen (300) und/oder dem Internet ermöglicht. Die über die externe Kommunikationsschnittstelle (330) übertragenen Daten können in Form von Signalen vorliegen, bei denen es sich um elektronische, elektromagnetische, optische, Funk- und andere Signaltypen handeln kann. Die externe Kommunikationsschnittstelle (330) kann die Kommunikation von Daten zwischen der Rechenvorrichtung (300) und anderen Rechenvorrichtungen einschließlich Servern und externen Speichereinrichtungen ermöglichen. Webdienste können über die Kommunikationsschnittstelle (330) durch die und/oder von der Rechenvorrichtung (300) aus zugänglich sein. Die externe Kommunikationsschnittstelle (330) kann für die Verbindung mit drahtlosen Kommunikationskanälen (z. B. ein zellulares Telefonnetzwerk, ein drahtloses lokales Netzwerk (z. B. unter Verwendung von Wi-Fi™), ein Satellitentelefonnetzwerk, ein Satelliteninternetnetzwerk usw.) konfiguriert sein und ein zugehöriges drahtloses Übertragungselement wie beispielsweise eine Antenne und zugehörige Schaltungsanordnungen umfassen.
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Die computerlesbaren Medien in Form der unterschiedlichen Speicherkomponenten können die Speicherung von computerausführbaren Anweisungen, Datenstrukturen, Programmmodulen, Softwareeinheiten und anderen Daten ermöglichen. Ein Computerprogrammprodukt kann durch ein computerlesbares Medium bereitgestellt werden, auf dem computerlesbarer Programmcode gespeichert ist, der durch den zentralen Prozessor (310) ausgeführt werden kann. Ein Computerprogrammprodukt kann durch ein nicht-flüchtiges computerlesbares Medium bereitgestellt werden oder kann über ein Signal oder eine andere flüchtige Einrichtung über die Kommunikationsschnittstelle (330) bereitgestellt werden.
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Eine Verbindung über die Kommunikationsinfrastruktur (305) ermöglicht es dem einen oder den mehreren Prozessoren (310), mit jedem Teilsystem oder jeder Komponente zu kommunizieren und die Ausführung von Anweisungen von den Speicherkomponenten sowie den Austausch von Informationen zwischen Teilsystem oder Komponenten zu steuern. Peripheriegeräte (beispielsweise Drucker, Scanner, Kameras und dergleichen) und Eingabe-/Ausgabe(E/A)-Vorrichtungen (beispielsweise Maus, Touchpad, Tastatur, Mikrofon, berührungsempfindliche Anzeige, Eingabetasten, Lautsprecher und dergleichen) können entweder direkt oder über eine E/A-Steuerung (335) mit der Rechenvorrichtung (300) gekoppelt oder integriert sein. Eine oder mehrere Anzeigen (345) (die berührungsempfindliche Anzeigen sein können) können über eine Anzeige (345) oder einen Videoadapter (340) mit der Rechenvorrichtung (300) gekoppelt oder integriert sein.
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Das beschriebene Verfahren und System befasst sich mit dem technischen Problem, die Korrelation von Fluoreszenzsignalen von zwei Fluoreszenzkanälen innerhalb und zwischen Strukturen in der Fluoreszenzmikroskopie einer Probe zu berücksichtigen, um das Ausmaß der Kolokalisation in der Probe genau zu bemessen, sowie den Ort und die Intensität zu bewerten. Herkömmlicherweise wird eine Kolokalisation in einem zweidimensionalen Raum durchgeführt und auf dreidimensionale Eingabedaten erweitert.
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Die bereitgestellten Lösungen schaffen eine Visualisierung einer Kolokalisation mit einer Regressionsanpassung auf Basis von Beziehungen zwischen Intensitäten von zwei Fluoreszenzkanälen. Das beschriebene Verfahren und System kann die zugrundeliegenden Kanalintensitäten und die Signalverteilung derselben berücksichtigen. Unter Verwendung von dreidimensionalen Rohdaten, bei denen sich das Kolokalisationssignal entlang der z-Achse unterscheiden kann, wird eine dreidimensionale spezielle Visualisierung einer Kolokalisation bereitgestellt. Zu den Vorteilen des beschriebenen Verfahrens und Systems gehört die Reduzierung von Variabilität, Unsicherheit und Mehrdeutigkeit, die sich aus einer forscherabhängigen Schwellwertbildung ergeben können. Dies führt zu einer geringeren Verzerrung und einer höheren Robustheit bei der Datenanalyse und -anzeige. Das Verfahren und System können in Bildanalysesoftwarepaketen als Kolokalisations-Plug-in-Anwendung eingesetzt werden, wie sie in biomedizinischen und naturwissenschaftlichen Disziplinen oder bei Molekularpathologen benötigt werden, wo die Diagnose oder Zellanalyse Kolokalisationsprofile umfasst. Diese können auch bei Bildanalyseabläufen mit hohem Durchsatz verwendet werden, die Gebieten wie beispielsweise der Diagnose, Arzneimittelentwicklung usw. zugeordnet sind.
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Beispiele
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Bei den folgenden Beispielen werden das Verfahren und das System angewendet und validiert, indem die Kolokalisation sowohl in synthetisch erzeugten Daten als auch in drei unterschiedlichen biologischen Proben sichtbar gemacht wird. Dies demonstriert die Vorteile, die das Verfahren und das System der vorliegenden Offenbarung bieten. Bei der ersten biologischen Probe wird die Kolokalisation zwischen α/β-Tubulin und acetyliertem Tubulin sichtbar gemacht. Bei der zweiten und dritten Probe wird die Kolokalisation zwischen zwei Organellen beziehungsweise zwischen einer Organelle und Tubulin sichtbar gemacht. Bei dem dritten Beispiel wird der fusionierte Zustand zwischen Lysosomen und Autophagosomen sowie zwischen Autophagosomen und Tubulin untersucht. Aufgrund der geringen Größe der Organellen und der Feinheit der filamentösen Tubulin-Strukturen ist es in der Regel schwierig, das Ausmaß der Kolokalisation zwischen denselben genau zu untersuchen. Diese Strukturen werden deshalb bewusst ausgewählt, um die Leistungsfähigkeit des vorliegenden Verfahrens und Systems in anspruchsvollen Szenarien zu demonstrieren. Die synthetischen Daten wurden entwickelt, um Aspekte dieser biologischen Proben zu imitieren und besser zu demonstrieren.
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Bei dem gesamten Beispiel wird das Verfahren der vorliegenden Offenbarung mit dem nMDP-Verfahren aus dem Stand der Technik verglichen, da nMDP derzeit das am weitesten verbreitete Verfahren zur räumlichen Visualisierung der Korrelation von kolokalisierten Voxeln unter Verwendung einer Farbkarte ist. Sowohl bei dem vorliegenden Verfahren als auch bei nMDP wurden alle Parameter über den gesamten 3D-z-Stapel berechnet. Zu Vergleichszwecken wurde eine manuelle Intensitätsschwellwertbildung verwendet, um bei beiden Verfahren die Hintergrundintensitäten zu entfernen. Diese Schwellwerte sind in den Streudiagrammen dargestellt, die die Figuren begleiten. Teil des Entwurfs des vorliegenden Verfahrens ist die automatische Anpassung des maximalen Farbkartenwerts, um eine optimale Verwendung des verfügbaren Spektrums sicherzustellen. Bei nMDP ist es jedoch gängige Praxis, die Minimal- und Maximalwerte auf -1,0 bzw. 1,0 festzulegen. Dies ist jedoch nicht immer optimal, zumal nMDP Werte jenseits dieser Grenzen erzeugen kann. Um die beste Visualisierung für jeden Bildsatz zu gewährleisten, wurden deshalb die Minimal- und Maximalwerte der nMDP-Farbkarte manuell angepasst. Diese Werte sind auf den nMDP-Farbbalken in den Figuren angegeben. In ähnlicher Weise wird der Unterdrückungsfaktor θ, der für jede Probe verwendet wurde, auf dem Farbbalken gezeigt.
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Drei Sätze von synthetischen Daten sind in Abschnitt I, II und III von 9 gezeigt. Abschnitt I zeigt zwei perfekt überlappende Zylinder derselben Größe. Diese modellieren die Überlappung zwischen α/β-Tubulin und acetyliertem Tubulin, die in den biologischen Proben zu sehen sein wird. Abschnitt II zeigt zwei teilweise überlappende Kugeln, die eine idealisierte Darstellung der Autophagosom-Lysosom-Fusion sind. Abschnitt III zeigt schließlich eine leichte Überlappendung eines Zylinders und einer Kugel, die die Autophagosom-Tubulin-Interaktion darstellen. Dieses Szenario ähnelt dem Beginn der Autophagosom-Lysosom-Fusion, die mit zwei leicht überlappenden kugelförmigen Strukturen modelliert wurde. Bei allen synthetischen Bildern tritt die höchste Farbintensität in der Mitte der Kugeln und Zylinder auf und nimmt zu der Oberfläche dieser Strukturen hin ab. Dies spiegelt die beobachten Fluoreszenzintensitäten in den biologischen Proben wider. Darüber hinaus ist es im Fall der synthetischen Daten oft aufschlussreich, die maximale Intensitätsprojektion (MIP) zu betrachten, die eine Innenperspektive der 3D-Datensätze bietet. Dies ist nützlich, da die meisten Schwankungen der Fluoreszenzintensität im Inneren des Volumens und nicht an der Oberfläche auftreten.
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9A zeigt die Kolokalisation zwischen roten und grünen Kanälen in Gelb, und 9B zeigt dieselben kolokalisierten Voxel in Weiß. Dies sind die gebräuchlichsten Arten der Visualisierung einer Kolokalisation. Daher sollte eine Kolokalisationsfarbkarte nur den Voxeln in Weiß einen Farbkartenwert zuweisen. Dieser Wert muss mit den Kanalintensitäten der kolokalisierten Voxel in ähnlicher Weise variieren, wie in 9A zu sehen ist. Bei der Betrachtung von 9C ist zu beachten, dass nMDP kolokalisierte Voxel in Rot- bis Gelbtönen visualisiert, während nicht-kolokalisierte Voxel in Blautönen dargestellt werden. Betrachtet man die Abschnitte II und III von 9C, so wird deutlich, dass das nMDP allen Voxeln, für die einer der beiden Fluoreszenzkanäle vorhanden ist, einen Farbkartenwert zuweist, und nicht nur denjenigen, die normalerweise als kolokalisiert gelten würden (in 9B als weiß dargestellt). Da die Mittelwerte der Kanäle (in 9F durch einen roten Punkt gekennzeichnet) in der Regel größer als der Schnittpunkt der beiden Kanalschwellwerte sind, werden Voxel mit geringerer Intensität nicht aus der Visualisierung entfernt. 9D zeigt, dass das Verfahren der vorliegenden Offenlegung nur Voxeln, die als kolokalisiert gelten, Farben zuweist und Voxel, die nicht kolokalisiert sind, nicht visualisiert. Dies liegt daran, dass das vorliegende Verfahren nur für Voxel berechnet wird, bei denen beide Fluoreszenzintensitäten über den Kanalschwellwerten liegen, während es bei nMDP ausreicht, wenn ein einzelner Fluoreszenzkanal über dem jeweiligen Kanalschwellwert liegt. 9E visualisiert diesen Unterschied, indem Bereiche in Gelb gezeigt werden, die durch nMDP als kolokalisiert gekennzeichnet werden, durch das vorliegende Verfahren jedoch nicht, und Bereiche, für die das Gegenteil zutrifft, in Magenta.
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Bei den perfekt überlappenden Zylindern (91) sind beide Fluoreszenzkanäle perfekt korreliert. Zunächst nimmt nMDP von einer hohen Intensität in der Mitte des Zylinders zu der Peripherie hin ab. Bei niedrigeren Fluoreszenzintensitäten wird jedoch wieder ein Anstieg beobachtet, was zu einer nicht-intuitiven Interpretation der Korrelation bei der Kolokalisation führt. Dieser Anstieg ist darauf zurückzuführen, dass bei der nMDP-Berechnung lediglich die Abweichung von dem Mittelwert und nicht die Größe der Intensität berücksichtigt wird. Das vorliegende Verfahren zeigt eine lineare Abnahme von den hohen Fluoreszenzintensitäten in der Mitte des Zylinders zu den niedrigeren Intensitäten an der Peripherie desselben, wodurch Volumina mit höherer Fluoreszenz hervorgehoben werden, die typischerweise einer höheren Konzentration der Fluoreszenzmarkierung entsprechen. Da die x- und y-Werte aller Kolokalisationsintensitäten dieselben sind und eine Linie auf dem Streudiagramm in 9F bilden, ist festzustellen, dass der Unterdrückungsfaktor θ keine Auswirkung auf die Visualisierung hat.
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Betrachtet man die teilweise überlappenden Kugeln (9II), so sind die Fluoreszenzintensitäten in der Mitte des überlappenden Volumens stark korreliert, wobei die Korrelation zu den Rändern des überlappenden Bereichs hin abnimmt. Dies ist in der Visualisierung, die dem Verfahren der vorliegenden Offenbarung entspricht, in Spalte F leicht zu erkennen. Es ist außerdem festzustellen, dass die linke und rechte Seite der Visualisierung des vorliegenden Verfahrens aufgrund der Entfernungsschwelle (Gleichung 16), die Ausreißer entfernt, leicht abgeschnitten sind. Des Weiteren wird, da der Maximalpunkt so berechnet wird, dass derselbe 99 % der Voxel einschließt (in 9F durch die orangefarbene Linie gekennzeichnet), das gesamte Spektrum der Farbkarte für die Visualisierung verwendet. Andererseits ist die nMDP-Visualisierung stärker mehrdeutig, da der Bereich nahe der Oberfläche der Kugeln die Mehrheit der kolokalisierten Voxel zu enthalten scheint, während es in diesem Bereich tatsächlich keine Kolokalisation gibt, wie in Spalte B angegeben ist. Außerdem zeigt das nMDP das gesamte überlappende Volumen nicht korrekt als kolokalisiert an, wobei das überlappende Volumen weiter weg von dem Zentrum als nicht-kolokalisiert gezeigt wird.
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Betrachtet man die leichte Überlappung von Kugel und Zylinder (9III), so gibt es nur einen kleinen Bereich, in dem eine Kolokalisation stattfindet. Da die Intensitäten der beiden Kanäle in dem kolokalisierten Bereich ähnlich sind, sollten sie recht gut korreliert sein. Dieser Aspekt spiegelt sich intuitiv wider, wenn das vorliegende Verfahren verwendet wird, bei dem die Bereiche mit ähnlicher Fluoreszenzintensität in der Mitte des überlappenden Bereichs hervorgehoben werden. Wie im Fall der teilweise überlappenden Kugeln werden auch hier Bereiche mit geringerer Kanalintensität in der Nähe der Oberfläche durch das nMDP fälschlicherweise als kolokalisiert gekennzeichnet. Außerdem visualisiert das nMDP das überlappende Volumen nicht merklich anders als die umgebende Struktur. Dies führt zu einer Visualisierung, die schwer zu interpretieren sein könnte.
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Das nMDP wurde und wird bei vielen Studien in den Biowissenschaften eingesetzt, bei denen die genaue räumliche Analyse der Kolokalisation von besonderer Bedeutung ist. Dazu gehören die Bewertung molekularer Interaktionen an der neuromuskulären Nahtstelle, die Analyse vesikulärer Strukturen, die Teil des endosomalen Kompartiments sind, die Charakterisierung filamentöser Aktin- oder Tubulin-Netzwerkstrukturen und die Lokalisierung und Bewertung des Ausmaßes der Proteininteraktion auf subzellularer Ebene. In den meisten dieser Studien ist die Quantifizierung der Kolokalisation auf Basis einer Farbkarte begrenzt, und die Schlussfolgerungen basieren in erster Linie auf dem Vergleich von Kolokalisationsmetriken wie der PCC. Das vorliegende Verfahren kann neue Perspektiven eröffnen, indem die Analyse auf die kolokalisierten Voxel beschränkt und eine robustere Identifizierung der Intensitätskorrelation bei kolokalisierten Voxeln ermöglicht wird. Im Folgenden werden sowohl nMDP als auch das vorliegende Verfahren auf eine Teilmenge von biologischen Proben mit ähnlicher Komplexität angewandt und die Ergebnisse verglichen.
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Zellkultur und Transfektionen
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Embryonale Mausfibroblasten (MEFs) sowie GFP-LC3 stabil exprimierende MEFs wurden mit Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM), 1% Penicillin/Streptomycin (PenStrep) (Life Technologies, 41965062 und 15140122) und 10 % fötalem Rinderserum (FBS) (Scientific Group, BC/50615-HI) ergänzt und in einem befeuchteten Inkubator (SL SHEL LAB CO2 Humidified Incubator) in Anwesenheit von 5 % CO2 bei 37 °C inkubiert. Gegebenenfalls wurden Zellen, wie zuvor gezeigt, mikrostrukturiert, um Strukturen in hochdefinierten geometrischen Grenzen besser hervorzuheben. Die Zellen wurden zu Versuchszwecken entweder in eine 8-Kammer-Gleitschale mit Deckel (Nunc, Lab-Tek, 155411) oder in einen Objektträger mit Mikrostruktur zum Keimen gebracht.
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Immunfluoreszenz und superauflösende strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SR-SIM)
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MEF-Zellen wurden mit einem 1:1-Verhältnis von 4% Formaldehyd (Sigma-Aldrich, USA) und DMEM für 10 Minuten bei 37 °C fixiert und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Die Zellen wurden 10 Minuten lang mit 0,2 % Triton-x permeabel gemacht und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) blockiert. Danach wurden die Zellen über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen α/β-Tubulin (Cell Signaling, #2148), acetyliertes Tubulin (SC-23950, Santa Cruz) und LysoTracker Red (Life Technologies, #L-7528) inkubiert, gefolgt von einem Waschschritt und einer 90-minütigen Inkubation mit den sekundären Antikörpern Alexa-488 und Alexa-561. SR-SIM- und konfokale Mikrofotografien wurden mit Hilfe von ELYRA PS.1 Station (Carl Zeiss Microimaging; Deutschland) aufgenommen. Mit dem Mikroskop, das mit einer Andor EM-CCD-Kamera (iXon DU 885) ausgestattet ist, wurden dünne (0,1 µm) Z-Stapel hochauflösender Bilder in 3 Rotationen aufgenommen. Die Bilder wurden mit der ZEN-Software (schwarze Edition, 2011, Version 7.04.287) auf der Grundlage eines strukturierten Beleuchtungsalgorithmus rekonstruiert.
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Analyse der Überlappung von α/β-Tubulin und acetyliertem Tubulin
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Das Tubulinnetzwerk in einer Zelle ist durch dynamische Veränderungen wie die Acetylierung gekennzeichnet, die sich auf die Eigenschaften desselben wie Steifigkeit und Funktion auswirken. Hier wurde das Ausmaß der Acetylierung im Verhältnis zu dem gesamten Tubulinnetzwerk durch eine Kolokalisationsanalyse bewertet. Da Mikrotubuli empfindliche filamentöse Strukturen sind, ist ihre Überlappung sehr schwierig zu analysieren. Für die Analyse der Kolokalisation wurden spezifische ROI-Auswahlen an der Zellperipherie (Zeile II in 10) getroffen sowie ein Querschnitt entlang der z-Achse im perinukleären Bereich (Zeile III in 10) ausgewählt. Dieser Querschnitt wurde eingefügt, um auch die Kolokalisation im Inneren des Tubulins sichtbar zu machen, wo die Korrelation zwischen den Fluoreszenzkanälen am stärksten ist. Auf diese Weise konnte die Kolokalisation in Bereichen mit hoher und niedriger Fluoreszenzkanalintensität genau analysiert werden. Wo sich diese Bereiche befinden, ist auf dem MIP in Zeile IV von 10 gezeigt. In Zeile II der nMDP-Darstellung in 10C ist der zentrale Bereich deutlich als kolokalisiert hervorgehoben. Da jedoch allen Voxeln, für die ein Fluoreszenzkanal vorhanden ist, ein Farbkartenwert zugewiesen wird, ist es nicht möglich, das Ausmaß dieser Kolokalisation klar zu erkennen. Das Verfahren der vorliegenden Offenbarung hebt den zentralen Bereich in ähnlicher Weise als kolokalisiert hervor (Zeile II in 10D). Sie zeigt jedoch auch, dass die Kolokalisation in diesem Bereich stärker ausgeprägt ist. Bereiche mit geringerer Intensität und einer schwächeren Korrelation zwischen den Fluoreszenzkanälen werden bei Verwendung des vorliegenden Verfahrens beibehalten und in dunkleren Blautönen als kolokalisiert dargestellt, während nMDP diese Bereiche als nicht-kolokalisiert meldet. Darüber hinaus grenzt nMDP mehrere Bereiche an den Rändern der Probe fälschlicherweise als kolokalisiert ab, in 10E gelb dargestellt, was zu einer Visualisierung führt, die von den tatsächlich kolokalisierten Bereichen ablenkt. In Zeile III von 10D wurde ein auffälliger Tubulinstrang aus der Probe isoliert. Hier zeigt das nMDP keine Kolokalisation an, während das vorliegende Verfahren in der Lage ist, dieses Volumen als kolokalisiert zu kennzeichnen, und es ermöglicht, den unterschiedlichen Grad der Korrelation zu erkennen.
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Analyse der Autophagosom- und Lysosomfusion
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Der Proteinabbau durch Makroautophagie spielt eine entscheidende Rolle in der zellularen Homöostase, im Stoffwechsel und bei Krankheiten. Sie ist dadurch gekennzeichnet, dass Autophagosomen zu Lysosomen transportiert werden, wo nach der Fusion ein Autolysosom gebildet wird und ein hydrolytischer Abbau stattfindet. Um die Funktion und Fehlfunktion der Autophagie besser zu verstehen, ist es von großem Interesse, den Beitrag der Zwischenprodukte auf dem Weg zur Gesamtgröße des intrazellularen Vesikelpools, d. h. der Autophagosomen, Autolysosomen und Lysosomen, zu ermitteln. Die Visualisierung der Fusionszone zwischen Autophagosomen und Lysosomen ist daher von entscheidender Bedeutung und wird hier als zweites Beispiel für den Vergleich zwischen dem vorliegenden Verfahren und nMDP verwendet (11). Aufgrund der geringen Größe dieser Organellen ist es schwierig, das Ausmaß der stattgefundenen Fusion sichtbar zu machen. Es ist festzustellen, dass diese Fusion dem entspricht, was in den synthetischen Daten mit Hilfe von teilweise überlappenden Kugeln modelliert wurde. Wie bereits in den synthetischen Daten dargestellt, zeigte das nMDP fälschlicherweise Bereiche in der Nähe der Kugeloberfläche als kolokalisiert an. Eine ähnliche Beobachtung kann im Fall der Autophagosom/Lysosom-Fusion in 11C gemacht werden. Dies kann die tatsächliche Interaktion zwischen den Organellen und damit die korrekte Interpretation der Kolokalisationsdaten beeinträchtigen. Dies spiegelt sich auch in dem in 11E gezeigten erheblichen Unterschied zwischen nMDP und dem vorliegenden Verfahren wider.
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Das vorliegende Verfahren zeigt lediglich die kolokalisierten Voxel, so dass sowohl die kolokalisierten Bereiche mit einer starken Korrelation der Fluoreszenzkanäle (hohe Intensitäten der Farbkarte des vorliegenden Verfahrens) als auch Bereiche mit geringerer Korrelation (dunklere blaue Bereiche) deutlich zu erkennen sind. Dies ist am besten in den Zeilen II und III von 11D zu erkennen. Durch Isolierung eines kleinen Bereichs der Zelle, wie in Zeile III dargestellt, zeigt das vorliegende Verfahren, welche dieser Kolokalisationen auf eine nahezu vollständige Fusion zwischen den Organellen und damit auf das Ausmaß der Autophagieprogression hinweisen.
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Analyse der Interaktion zwischen Autophagosom und Tubulin
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Der autophagosomale Transport wird durch das Mikrotubuli-Netzwerk erleichtert. Daher ist die Interaktion zwischen diesen beiden Strukturen und ihre genaue Visualisierung von großem Interesse. Eine solche Interaktion zwischen Autophagosom und Tubulin ist in 12 gezeigt. Da die Autophagosomen entlang des Tubulin-Netzwerks transportiert werden, gibt es nur sehr wenige Überlappungen zwischen denselben und folglich auch nur wenige kolokalisierte Voxel. Daher wurden zwei ROIs untersucht, um die Interaktion genauer zu erforschen. Diese ROIs sind in den Zeilen II und III von 12 dargestellt, und ihre Lage innerhalb der gesamten Probe ist auf dem MIP in Zeile IV angegeben.
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Wie bei Autophagosomen und Lysosomen (11C) zeigt das nMDP in 12C nicht eindeutig die Korrelation der Kolokalisation zwischen den Fluoreszenzkanälen. Dies ist hauptsächlich darauf zurückzuführen, dass Voxel am Rand der Strukturen nicht korrekt als kolokalisiert identifiziert werden. Ein ähnliches Ergebnis wurde auch für die synthetischen Daten beobachtet, die aus teilweise überlappenden Kugeln bestehen. Die magentafarbenen Bereiche in Zeile III von 12E, die aufgrund der umgebenden gelben Voxel rot erscheinen, entsprechen auch den Strukturen, die das vorliegende Verfahren in 12D als kolokalisiert identifiziert. Dies deutet darauf hin, dass nMDP nicht geeignet ist, die wirklich kolokalisierten Bereiche, die in 12B in Weiß dargestellt sind, präzise und korrekt zu visualisieren. Da das vorliegende Verfahren nur kolokalisierte Voxel anzeigt, kann es in Verbindung mit den überlappenden Fluoreszenzkanälen (11A und B) zu einem besseren Verständnis der Interaktion zwischen Autophagosom und Tubulin führen. Auch das qualitative Ausmaß dieser Kolokalisationsereignisse lässt sich stärker intuitiv bestimmen.
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Die vorstehende Beschreibung wurde zu Veranschaulichungszwecken präsentiert; sie erhebt weder einen Anspruch auf Vollständigkeit oder noch beschränkt sie die Erfindung auf die offenbarten präzisen Formen. Fachleute auf dem relevanten Gebiet der Technik können erkennen, dass viele Modifikationen und Variationen im Lichte der obigen Offenbarung möglich sind.
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Jeder der hier beschriebenen Schritte, Vorgänge, Komponenten oder Prozesse kann mit einer oder mehreren Hardware- oder Softwareeinheiten allein oder in Kombination mit anderen Vorrichtungen durchgeführt oder implementiert werden. Bei einem Ausführungsbeispiel ist eine Softwareeinheit mit einem Computerprogrammprodukt implementiert, das ein nicht-flüchtiges computerlesbares Medium aufweist, das Computerprogrammcode enthält, der durch einen Prozessor ausgeführt werden kann, um einen oder alle der beschriebenen Schritte, Vorgänge oder Prozesse durchzuführen. Die in dieser Anwendung beschriebenen Softwareeinheiten oder -funktionen können als Computerprogrammcode unter Verwendung einer beliebigen geeigneten Computersprache, wie z. B. Java™, C++ oder Perl™, implementiert werden, wobei z. B. konventionelle oder objektorientierte Techniken verwendet werden können. Der Computerprogrammcode kann als eine Reihe von Anweisungen oder Befehlen auf einem nicht-flüchtigen computerlesbaren Medium gespeichert werden, z. B. auf einem Direktzugriffsspeicher (RAM), einem Festwertspeicher (ROM), einem magnetischen Medium wie einer Festplatte oder einem optischen Medium wie einer CD-ROM. Jedes dieser computerlesbaren Medien kann sich auch auf oder in einem einzelnen Rechenapparat befinden und kann auf oder in verschiedenen Rechenapparaten innerhalb eines Systems oder Netzwerks vorhanden sein.
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Flussdiagramm-Veranschaulichungen und Blockdiagramme von Verfahren, Systemen und Computerprogrammprodukten gemäß Ausführungsformen werden hierin verwendet. Jeder Block der Flussdiagramme und/oder Blockdiagramme sowie Kombinationen von Blöcken in den Flussdiagrammen und/oder Blockdiagrammen können Funktionen bereitstellen, die durch computerlesbare Programmanweisungen implementiert werden können. Bei einigen alternativen Implementierungen können die durch die Blöcke identifizierten Funktionen in einer anderen Reihenfolge als in den Flussdiagramm-Veranschaulichungen gezeigt ablaufen.
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In einigen Teilen dieser Beschreibung werden die Ausführungsbeispiele der Erfindung in Form von Algorithmen und symbolischen Darstellungen von Vorgängen mit Informationen beschrieben. Diese algorithmischen Beschreibungen und Darstellungen werden üblicherweise von Fachleuten auf dem Gebiet der Datenverarbeitung verwendet, um anderen Fachleuten auf dem Gebiet den Inhalt ihrer Arbeit effektiv zu vermitteln. Diese Vorgänge werden zwar funktional, rechnerisch oder logisch beschrieben, aber sie werden durch Computerprogramme oder entsprechende elektrische Schaltungen, Mikrocode oder dergleichen implementiert. Die beschriebenen Vorgänge können in Software, Firmware, Hardware oder beliebigen Kombinationen davon verkörpert sein.
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Die in der Beschreibung verwendete Sprache wurde in erster Linie aus Gründen der Lesbarkeit und zu Instruktionszwecken gewählt, nicht jedoch, um den Erfindungsgegenstand abzugrenzen oder zu umschreiben. Es ist daher beabsichtigt, dass der Schutzumfang der Erfindung nicht durch diese ausführliche Beschreibung, sondern vielmehr durch alle Ansprüche beschränkt wird, die sich aus einer darauf basierenden Anmeldung ergeben. Dementsprechend ist die Offenbarung der Ausführungsbeispiele der Erfindung zur Veranschaulichung, aber nicht zur Begrenzung des Schutzumfangs der Erfindung gedacht, der in den folgenden Ansprüchen dargelegt ist. Schließlich ist in der gesamten Beschreibung und in den Ansprüchen, sofern der Inhalt nichts anderes erfordert, das Wort „aufweisen“ oder Abwandlungen wie „aufweist“ oder „aufweisend“ so zu verstehen, dass dasselbe die Einbeziehung einer genannten ganzen Zahl oder Gruppe von ganzen Zahlen bedeutet, nicht aber den Ausschluss einer anderen ganzen Zahl oder Gruppe von ganzen Zahlen. Die Erfindung wird nachfolgend anhand der folgenden, nicht-einschränkenden Beispiele ausführlicher beschrieben.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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